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Klasse : 6 f 18 ÖSTERREICHISCHES PATENTAMT
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Angemeldet am 2. August 1963 (A 8369/66) ; Priorität der Anmeldung in Grossbritannien vom 31. Dezember 1962 (No. 49 066/62) beansprucht.
Beginn der Patentdauer : 15. Juli 1968.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen, z. B. von Hefen, durch
Kultivieren auf Kohlenwasserstoffen. Die Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur teilweisen oder gänzlichen Entfernung geradkettiger Kohlenwasserstoffe aus Gemischen der genannten Kohlenwasserstof- fe mit andern Kohlenwasserstoffen.
5 Die Züchtung der Hefen auf Kohlenwasserstoffen und insbesondere auf Erdölkohlenwasserstoffen als
Kohlenstoff lieferndes Substrat ergibt gewöhnlich Hefen, die nach dem Waschen und Trocknen einen eigenartigenGeschmackaufweisen, der scharf und ranzig ist und der bei ihrer Verwendung in Nahrungs- mitteln für den menschlichen Genuss stören kann. Bei Verwendung von Hefen, die aus Melassen, kohle- hydrathaltigenRestflüssigkeiten oder Bisulfitlaugen gezüchtet werden, ergibt sich ebenfalls ein eigenar-
10 tiger Geschmack, der von dem der Hefen, die auf Kohlenwasserstoffen gezüchtet werden, verschieden ist. Bestimmte Verfahren wurden vorgeschlagen, um diesen Geschmack, insbesondere den bitteren Ge- schmack zu verringern, aber keines dieser Verfahren war vollkommen erfolgreich.
Es wurde nun gefunden, dass Hefen, wenn sie auf Kohlenwasserstoffen als einziger Kohlenstoffquelle gezüchtetwurden, einen deutlich höheren Lipoidgehalt aufweisen als Hefen, die auf bekannten Substra-
15 ten, wie z. B. Melassen, Restflüssigkeiten und Bisulfitlaugen gezogen worden sind. Die Lipoide bestehen im wesentlichen aus Fettsäuren, Estern (mit grösseren oder geringeren Oxydationsgraden) inklusive Fet- ten und Sterinen.
Es wurde gefunden, dass die vollständige oder teilweise Extraktion dieser Lipoide zu einer wesent- lichen Verringerung oder zur vollständigen Entfernung dieses charakteristischen Geschmackes der Hefen, 20 die auf Kohlenwasserstoffen kultiviert werden, führt.
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen, ferner be- trifft sie ein Verfahren zur Herstellung von Hefe. Ausserdem betrifft sie ein Verfahren zur vollständigen oder teilweisen Entfernung der geradkettigen Kohlenwasserstoffe aus Mischungen der genannten Kohlen- wasserstoffe mit andern Kohlenwasserstoffen. Weitere Erfindungsgedanken werden später beschrieben.
25 Einem Erfindungsgedanken entsprechend, ist ein Verfahren vorgesehen, welches darin besteht, dass ein Mikroorganismus kultiviert wird, der fähig ist auf einem Ausgangsmaterial, welches gänzlich oder teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht, zu wachsen, wobei der genannte Mikroorganis- mus in Gegenwart des genannten Ausgangsmaterials kultiviert und aus dem Produkt eine Fraktion, die den Mikroorganismus enthält, abgetrennt wird, worauf anschliessend die genannte Fraktion zur Entfer- 30 nung der Lipoide in der Extraktionsphase mit einem Lösungsmittel extrahiert wird.
Erfindungsgemässwerden geradkettige Kohlenwasserstoffe aus einer Erdölfraktion durch Assimilation
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eines Mikroorganismus entfernt, wobei das für das Wachstum des Mikroorganismus verwendete Ausgangs- material eine Erdölfraktion ist, die teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht und wobei aus dem Wachstumsprodukt des Mikroorganismus eine Erdölfraktion erhalten wird, deren Anteil an ge- radkettigen Kohlenwasserstoffen vermindert oder entfernt ist.
5 Das erfindungsgemässe Verfahren ist insbesondere für die gänzlich oder teilweise Entfernung von festen Paraffinen aus paraffinhaltigen Gasölen geeignet, wobei das Ausgangsmaterial ein paraffinhaltiges
Gasölist und aus dem Wachstumsprodukt des Mikroorganismus ein Gasöl mit einem verminderten Paraf- fingehalt gewonnen wird.
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verwendet werden.
Unter der Bezeichnung "Mikroorganismen", die hier verwendet wird, werden auch Mischungen von
Mikroorganismen verstanden.
15 Mikroorganismen, die wie hier beschrieben, kultiviert werden, können Hefen, Schimmelpilze oder
Bakterien sein, die fähig sind, auf geradkettigen Kohlenwasserstoffen zu wachsen.
Wenn Hefe verwendet wird. gehört sie vorzugsweise der Familie der Cryptococcaceae und insbeson- dere der Unterfamilie der Cryptococcoideae an. Jedoch können gegebenenfalls auch ascosporogene He- fen der Unterfamilie der Saccharomycoideae verwendet werden. Vorzugsweise verwendete Gattungen 20 der Unterfamilie derCryptococcoideae sind Torulopsis (auch als Torula bekannt) und Candida. Vorzug- weiseverwendeteHefestämmewerden nachstehend genannt. Insbesondere wird bevorzugt spezielles Ma- terial der angegebenen Nummer verwendet.
Diese Nummern beziehen sich auf das CBS-Material, das von dem Centraal Bureau vor Schimmelculture, Baarn, Holland, gehalten wird und auf das INRA-Ma- terial, das durch das Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, Frankreich, gehalten wird. 25 Candida
Candida
Candida
Candida
Candida 30 Torulopsis
Hansenula
Oidium
Mycoderma lipolytica CBS 599 pulcherrima CBS 610 utiles CBS 890 utiles, Variati major CBS 841 tropicalis CBS 2317 colliculosa CBS 133 anomala CBS 110 lactis cancoillote INRA ; STV 11
Von den oben genannten wird besonders Candida lipolytica bevorzugt.
35 Wenn es gewünscht ist, kann der Mikroorganismus auch ein Schimmelpilz sein. Ein geeigneter
Stamm ist Penicillium Expansum.
Gegebenenfalls kann der Mikroorganismus auch ein Bakterium sein. Geeigneterweise sind die Bak- terien aus einer der Ordnungen Eubacteriales und Actinomycetales bzw. sind sie Pseudomonasarten.
Vorzugsweise stammen die verwendeten Bakterien aus den Familien der Bacillaceae und Pseudo-
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nosa. Andere Stämme, die angewendet werden können, sind :
Bacillus amylobacter Xanthomonas begoniae
Flavobacterium sp. devorans
Arthrobacter sp. Acetobacter sp.
45 Micrococcus sp. Actinomyces sp.
Corynebacterium michiganense Agrobacterium sp.
Pseudomonas syringae Aplanobacter sp.
Für das Wachstum der Mikroorganismen ist es nötig, ausser dem Ausgangsprodukt Kohlenwasserstoff ein wässeriges Nährmedium und eine Zufuhr von Sauerstoff, vorzugsweise als Luft, zur Verfügung zu 50 stellen.
Ein geeignetes Nährmedium für Hefen und Schimmelpilze hat die folgende Zusammensetzung :
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Diammoniumphosphat
Kaliumchlorid Magnesiumsulfat. 71\0
Zinksulfat 5 Mangansulfat. 11\0 Eisensulfat. 71\0
Leitungswasser
Hefeextrakt destilliertes Wasser auffüllen auf 10 Ein typisches Nährmedium für das Wachstum beispielsweise von Nocardia (einer Gattung aus der
Reihe der Actinomycetales) hat folgende Zusammensetzung :
Ammoniumsulfat Magnesiumsulfat Eisensulfat, 7 H2O
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0Monokaliumphosphat
Dinatriumphosphat
Calciumchlorid
Natriumcarbonat 20 Hefeextrakt destilliertes Wasser auf
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20Ein anderes geeignetes Nährmedium für Bakterien hat folgende Zusammensetzung :
Monokaliumphosphat
Magnesiumsulfat, 7 HO 25 Natriumchlorid
Ammonchlorid
Leitungswasser (Spurenelemente)
Hefeextrakt mit destilliertem Wasser aufge- 30 füllt auf
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20, 1 g
2, 5 g
100 ml
0, 025 g 1000 ml Ein anderes geeignetes Nährmedium für das Wachstum von Bakterien hat die Zusammensetzung :
NH4Cl
NaCl
MgSO4 35 NaHPO
KH2PO4
Wasser zum Auffüllen auf
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gMikroorganismen und insbesondere Hefen wachsen manchmal nur schwer, wenn sie zum ersten Mal unter der Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Ausgangsprodukt kultiviert werden, und es ist manch- 40 mal notwendig, eine Impfung eines Mikroorganismus zu verwenden, der vorher an das Wachstum auf den Kohlenwasserstoff-Fraktionen, die man zu verwenden beabsichtigt, adaptiert worden war. Ausserdem kann der Mikroorganismus, auch wenn er in Gegenwart eines wässerigen mineralischen Mediums, wel- ches die geeigneten Nährstoffe enthält, gezüchtet wurde, nur schwer wachsen, weil die Kohlenwasser- stoff-Fraktion nicht die Wachstumsfaktoren enthält, die bei Kohlehydrat-Ausgangsprodukten enthalten 45 sind, wenn man nicht diese Wachstumsfaktoren zugibt.
Wenn man chargenweise arbeitet, werden die
Mikroorganismen gewöhnlich am Anfang mit geringer Zelldichtezunahme wachsen. (Diese Wachstums- periode wird als "Verzögerungsphase" bezeichnet). Sodann wird die Wachstumsgeschwindigkeit anstei- gen. Die Periode der höheren Wachstumsgeschwindigkeit wird als exponentielle Phase bezeichnet und sodann wird die Zelldichte stationär werden (die "stationäre Phase").
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Die Mikroorganismen zum Starten des nächsten Ansatzes werden vorzugsweise vor Beendigung der exponentiellen Phase entnommen.
Der Wachstumsprozess wird gewöhnlich vor der stationären Phase unterbrochen.
Zu diesem Zeitpunkt werden die Mikroorganismen gewöhnlich aus der Gesamtmasse des wässerigen
5 Nährmediums und aus der Masse der unverbrauchten Ausgangsfraktion abgetrennt.
Das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen wird begünstigt, indem man dem Zuchtmedium einen sehr kleinen Teil vom Hefeextrakt zugibt (ein an Vitaminen der B-Gruppe reiches Industrieprodukt, das durch Hefehydrolyse erhalten wird) oder Vitamine der Gruppe B und/oder Biotin zusetzt. Die Menge liegt vorzugsweise in der Grössenordnung von 25 Teilen auf 1 Million, bezogen auf das wasserigeFermen-
10 tationsmedium. Sie kann entsprechend den Bedingungen, die für das Wachstum gewählt wurden, höher oder niedriger sein.
Das Wachstum der Mikroorganismen findet auf Kosten der Erdölfraktion statt, wobei sich als Zwi- schenprodukte Körper bilden, die sauer reagieren, hauptsächlich Fettsäuren, so dass der pH-Wert des wässerigen, mineralsalzhaltigen Mediums stetig abnimmt. Wenn man diesen nicht korrigiert, wird das
15 Wachstum ziemlich rasch unterbrochen und die Konzentration der Mikroorganismen in dem Medium oder die Zelldichte wächst nicht mehr weiter an, so dass ein sogenannter stationärer Zustand erreicht wird.
Vorzugsweise wird deshalb das Nährmedium beim gewünschten pH-Wert durch portionsweise oder ständige Zugabe eines wässerigen Mediums hohen pH-Wertes gehalten. Gewöhnlich wird bei der Ver- 20 wendung von Schimmelpilzen oder Hefen und im besonderen bei der Verwendung von Candida lipolytica der pH-Wert des Nährmediums im Bereich zwischen 3 und 6, vorzugsweise zwischen 4 und 5 gehalten.
Bakterien benötigen einen höheren pH-Wert, gewöhnlich 6, 5 bis 8. Als Zusatz zur flüssigen Kultur ge- eignetealkalischwirkendeSubstanzensind Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Dinatriumhydrogenphos- phat und Ammoniak, entweder frei oder in wässeriger Lösung.
25 Das Temperaturoptimum der Flüssigkeiten wird dem Typ der Mikroorganismen entsprechend variie- ren und liegt gewöhnlich im Bereich zwischen 25 und 35 OC. Verwendet man Candida lipolytica, ist der bevorzugte Temperaturbereich 28 bis 320C.
Die Sauerstoffaufnahme ist für das Wachstum der Mikroorganismen wesentlich. Gewöhnlich wird der Sauerstoff in Form von Luft zur Verfügung gestellt. Um ein rasches Wachstum aufrechtzuerhalten, 30 sollte die Luft, die den Sauerstoff liefert, in Form kleiner Bläschen anwesend sein. Die Luft kann durch eine gesinterte Oberfläche eingeführt werden. Vorzugsweise kann jedoch das System der innigen Be- lüftung, das aïs"Wirbelbeluftung"bekannt ist, angewendet werden.
Es wurde gefunden, dass bei der Verwendung von Hefe des Stammes Candida lipolytica in einem erfindungsgemässen Prozess bei dem die Belüftung durch"Wirbelbeluftung"bewirkt wird, eine hohe 35 Wachstumsgeschwindigkeit erreicht wird, wobei die Generationsdauer in der Grössenordnung von 2 bis 5 h liegt und die Zellkonzentration innerhalb von 2 Tagen um einen Faktor bis zur 12 - fachen Menge an- steigt.
Der Mikroorganismus wird vorzugsweise aus der Masse der flüssigen Phasen, wenn es möglich ist, durch Zentrifugieren entfernt und wird als eine Creme oder Paste erhalten. Jedoch in manchen Fällen 40 wird die Abtrennung durch Filtration oder bis zu einem gewissen Ausmass durch Dekantieren erreicht.
Diese Creme oder Paste, die wässeriges Material enthält, wird durch kontinuierliche Lösungsmittel- extraktion oder durch aufeinanderfolgende Waschungen mit einem Lösungsmittel, welchen eine Phasen- trennungfolgt, behandelt. Geeigneterweisewird die Extraktion in einem feststehenden Gefäss ausgeführt, welches mit Armrührern ausgestattet ist, welche vorzugsweise mit weniger als 10 Umdr/min rotieren 45 oder in einem Gefäss, das um eine horizontale Achse rotiert. Wenn nach der kontinuierlichen Lösung- mittelextraktiongearbeitetwird, wird der Extrakt kontinuierlich abgezogen und kontinuierlich oder por- tionsweise bei Atmosphären- oder vermindertem Druck destilliert und das Lösungsmittel kontinuierlich in den Extraktor zurückgeführt. Unter diesen Bedingungen kann die Hefe kontinuierlich oder portionswei- se eingeführt und abgezogen werden.
50 Vorzugsweise erfolgt die Lösungsmittelextraktion, während das Lösungsmittel dem Extraktor mit einer periodisch schwankenden Geschwindigkeit zugeführt wird, um pulsierendes Fliessen des genannten
Flüssigkeitsstromes hervorzurufen.
Die Stösse der Flüssigkeit auf das feste Material rufen Oszillationen und begrenzte Lageveranderun- gen jedes Korns des festen Materials im Verhältnis zu seinem Nachbarn hervor. Dies entspricht einer 55 mechanischen Durchrührung der gesamten Masse. Deshalb werden die gesamten Produkte viel rascher und vollständiger extrahiert.
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In der Zuführvorrichtung des Flüssigkeitsstromes befindet sich eine Einrichtung, welche die Flüssig- keitsstössehervorruft, deren Grösse und Frequenz experimentell auf den für den jeweiligen Fall günstigen
Wert reguliert werden kann. Diese Stösse werden durch irgendein geeignetes bekanntes Verfahren her- vorgerufen, vorzugsweise wird eine alternierende Pumpe verwendet, deren Ventile entfernt worden wa- 5 ren.
Vorzugsweise liegt die Zahl der Stösse zwischen 1 und 60/min.
Geeignete Lösungsmittel zur Verwendung in diesem Verfahren wurden bereits beschrieben. Wenn man wünscht, kann der erste Schritt der Extraktion unter Verwendung eines polaren Lösungsmittels, wie z. B. eines alkoholischen Lösungsmittels, z. B. Äthanol oder Isopropanol ausgeführt werden und dann
10 kann der teilweise gereinigte Mikroorganismus in einer zweiten Extraktionsstufe unter Verwendung eines
Kohlenwasserstofflösungsmittels, z. B. n-Hexan oder einer leichten Platformingfraktion oder Benzol be- handelt werden.
Vorzugsweise wird in der zweiten Stufe als Lösungsmittel ein Gemisch eines grösseren Anteiles eines
Kohlenwasserstoffes mit einem kleineren Anteil eines polaren Lösungsmittels verwendet. Vorzugsweise
15 wird die azeotrope Mischung von Hexan mit Isopropanol oder Äthanol verwendet. Gegebenenfalls kön- nen beide Extraktionsstufen kontinuierlich ausgeführt werden.
Wenn man ein Lösungsmittel, das aus einer Mischung von Kohlenwasserstoff und polarem Lösung- mittel besteht, verwendet, wird angenommen, dass die Funktion oder eine der Funktionen des polaren
Lösungsmittels darin besteht, die Verklebung des zu extrahierenden Materials zu schwächen. (Sogar die
20 Verklebung von Kohlenwasserstoffen, welche selbst in dem polaren Lösungsmittel nicht löslich sind).
Durch die Verwendung irgendeines Alkohols im ersten Schritt einer zweistufigen Extraktion, wie sie vorher beschrieben wurde, wird der Wassergehalt der Mikroorganismen-Creme oder-Paste wesentlich verringert. Dadurch hat das die Mikroorganismen enthaltende Material, welches in die zweite Stufe ein- geführt wird, einen wesentlich geringeren Wassergehalt, der bewirkt, dass die nicht-wässerigen Bestand-
25 teile, die noch anwesend sind, mit dem Lösungsmittel, das in der zweiten Extraktionsstufe verwendet wird, mischbar sind. Jede Extraktionsstufe kann aus einem oder mehreren Teilschritte bestehen, die darin bestehen, dass man mit dem Lösungsmittel wäscht, das in der Verfahrensstufe verwendet wird, nach welcher die Abtrennung erfolgt.
Wenn einfaches Waschen im ersten Schritt angewendet wird, soll die Menge an Äthanol oder Iso-
30 propanol, die verwendet wird, das 1, 5- bis 3-fache des Volumens des Wassers, das in der Creme oder
Paste der Mikroorganismen anwesend ist, betragen. Jedoch können, wenn dies gewünscht wird, zwei
Waschungen mit Äthanol oder Isopropanol vorgenommen werden, wobei bei der ersten Waschung ein
Volumen an Lösungsmittel, das dem Volumen an Wasser in der Creme oder Paste gleich ist, verwendet wird und bei der zweiten Waschung eine geringere Menge an Äthanol oder Isopropanol, z. B. die Hälfte 35 der Menge, die bei der ersten Waschung verwendet worden war.
Zwischen den Waschungen jeder Stufe oder jedes Teilschrittes lässt man die Creme oder Paste ab- tropfen, z. B. indem man filtriert und ein Teil des zurückbleibenden Lösungsmittels wird dann vorzugs- weise durch Vakuumfiltration entfernt.
In der zweiten Stufe wird die Menge des Lösungsmittels, das bei dem oder bei jedem Waschen ver- 40 wendet wird, gewöhnlich das 2-bis 20-fâche des Volumens der sich ergebenden trockenen Mikroorga- nismen betragen.
Vorzugsweise ist der Endschritt der zur Entfernung eines Lösungsmittels angewendet wird, eine Ver- dampfung, geeigneterweise unter vermindertem Druck und geeigneterweise in einem Strom Inertgas, z. B. Stickstoff oder überhitztem Dampf.
45 Dadurch, dass man im zweiten Extraktionsschritt ein Lösungsmittel verwendet, welches eine
Mischung aus Kohlenwasserstoff und einem polaren Lösungsmittel ist, wird die Zusammensetzung des
Lösungsmittels der zweiten Stufe, welches auf jeden Fall ein polares Lösungsmittel von der ersten Stufe der Extraktion dazu bekommen wird, stabilisiert werden können. Anreicherung des polaren Lösungsmit- tels kann im Verlauf eines Destillationsschrittes vermieden werden, bei dem das Lösungsmittel der zwei- 50 ten Stufe wiedergewonnen werden kann, indem getrennt Ströme abgeleitet werden, die aus a) polarem
Lösungsmittel znr Rückführung in den ersten Reaktionsschritt und b) einer Mischung von Kohlenwasser- stoffen und polarem Lösungsmittel zur Rückführung in den zweiten Reaktionsschritt bestehen.
Geeigneter- weise wird in einem Destillationsschritt der Extrakt, der vom Extraktionsschritt herrührt, destilliert, um zu gewinnen : 55 a) über Kopf eine Mischung aus Kohlenwasserstoff, polarem Lösungsmittel und Wasser zur Rückfüh- rung in den zweiten Reaktionsschritt und
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b) am Boden eine Fraktion, die das polare Lösungsmittel, Wasser und die extrahierten Materialien enthält.
Diese Fraktion wird vorzugsweise mit dem ersten Extraktionsschritt gemischt, bevor sie der Destil- lation unterworfen wird, wodurch alle Verunreinigungen, die durch Lösungsmittelextraktion erhalten
5 wurden, alsBodenfraktion dieses Destillationsschrittes entfernt werden können. Geeigneterweise wird das polare Lösungsmittel Äthanol oder Isopropanol sein. Geeigneterweise ist das Lösungsmittel des zweiten
Reaktionsschrittes eine azeotrope Mischung.
NacheinerbevorzugtenAusführungsformwirddie den Mikroorganismus enthaltende Fraktion in einer ersten Stufe, die aus mehreren Teilstufen bestehen kann, behandelt, wobei in jeder Teilstufe die Frak- 10 tion mit einem polaren Lösungsmittel gewaschen und der Extrakt abgetrennt wird. Eine oder mehrere
Extraktionsfraktionen werden mit einer nochmals verwendeten Fraktion der zweiten Stufe gemischt und die Mischung wird zwecks Erhalt des Lösungsmittels der ersten Stufe, welches zurückgeführt wird und einer Rückstandsfraktion destilliert. Anschliessend wird das Produkt der ersten Stufe der zweiten Stufe, die eine oder mehrere Teilstufen enthalten kann, zugeführt, wobei in jeder Teilstufe die Fraktion mit 15 einer Mischung aus einem Kohlenwasserstoff und einem polaren Lösungsmittel gewaschen und der Ex- trakt abgetrennt wird.
Eine oder mehrere Fraktionen der zweiten Stufe werden destilliert um : a) ein Lösungsmittel der ersten Stufe, welches zur ersten Stufe zurückgeführt wird, b) eine Fraktion, die den Kohlenwasserstoff und das polare Lösungsmittel enthält, welche in die zweite Lösungsmittelextraktionsstufe zurückgeführt wird und 20 c) eine Rückstandsfraktion zu erhalten, die die extrahierten Materialien und die Fraktion, die in die zweite Stufe zurückgeführt wird, enthalt.
Die optimale Kontaktzeit wird sich gewöhnlich verkehrt proportional zur Extraktionstemperatur verhalten. Gewöhnlich ist es nicht wünschenswert, eine Temperatur über 700C zu verwenden, da höhe- re Temperaturen zu einem gewissen Abbau des Produkts führen.
25 Wenn die Creme oder Paste der Mikroorganismen vor der Lösungsmittelextraktion einer teilweisen
Trocknung unterworfen wird, wird es gewöhnlich möglich sein, den ersten Extraktionsschritt mit einer einzigen Waschung mit einem alkoholischen Lösungsmittel und unter Verwendung einer kleineren Menge an Lösungsmittel durchzuführen, als sie nötig wäre, wenn keine Trocknung stattgefunden hätte. Wenn
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beträchtlichmannach demeinstufigen Extraktionsverfahren arbeiten, indem man ein Lösungsmittel verwendet, wel- ches vollkommen aus Kohlenwasserstoff besteht oder welches eine Mischung aus Kohlenwasserstoff und polarem Lösungsmittel, z. B. einem Alkohol oder Keton oder chloriertem Kohlenwasserstoff darstellt.
Gewöhnlich ist es wünschenswert, eine Trocknung unter drastischen Bedingungen zu vermeiden, da 35 diese zu einem teilweisen Zersetzen der Mikroorganismen, z. B. durch Zerstörung der Vitamine und
Oxydation der ungesättigten Verbindungen führen wird. Ausserdem werden die Zersetzungsprodukte im
Lösungsmittel löslich sein, das bei der extraktiven Destillation verwendet wird, und so aus dem Produkt verloren wird oder es werden zu ihrer Wiedergewinnung weitere Schritte nötig sein.
Eine Hefe, die von ihren Lipoiden und den verunreinigenden Kohlenwasserstoffen teilweise oder 40 ganz nach einer der oben beschriebenen Methoden befreit worden ist, und deren Geschmack verbessert worden ist, stellt ein neues Industrieprodukt dar, das für die menschliche Ernährungwertvoll ist.
Der Lipoid-Extrakt, der durch die Verdampfung des Lösungsmittels gewonnen wurde, stellt eben- falls ein Industrieprodukt dar, welches entweder als solches oder als Rohmaterial zur Abtrennung seiner
Sterine, Fettsäuren (entweder vor oder nach der Verseifung) oder seinen andern Bestandteilen dient.
45 Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele 1 bis 6 beschrieben, aber nicht eingeschränkt.
Beispiel 1 : 101 des folgenden wässerigen mineralischen Mediums wurden in einen 15 1 fassen- den gerührten Fermenter eingebracht ; die Teile sind Gew.-Telle :
Trinatriumphosphat 3, 4
Kaliumchlorid 0,6 50 Magnesiumsulfat 0, 3
Ammoniumsulfat 2,5
Mit weichem Wasser, welches Spurenelemente enthielt, wurde auf 1000 Teile aufgefüllt. Ein ge- eignetes anderes Medium hat folgende Zusammensetzung :
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Diammoniumphosphat 2 g
Kaliumchlorid 1, 15 g
Magnesiumsulfat, 7 Hop 0, 65 g
Zinksulfat 0, 17 g
5 Mangansulfat, 1 HO 0, 045 g
Eisen- (II)-sulfat,7H2O0,068g
Leitungswasser 200 g
Hefeextrakt 0, 025 g destilliertes Wasser (Auffüllung auf 1000 ml).
10 Dem Fermenter wurden einige ppm eines Hefeextrakts und dann 50 g Candida lipolytica In Form einer wässerigen Creme, welche 20 Gew. 40 von trockenem Material enthielt, und hierauf 150 g eines schweren Gasöls, welches aus Erdöl stammte und 20 Gew. -0/0 Normalparaffine enthielt, zugegeben.
Als die Kultur die gewünschte Konzentration an Hefezellen für eine kontinuierliche Verfahrenswei- se erreicht hatte, wurde mit der kontinuierlichen Zugabe der wässerigen Mineralsalzlösung und des Öls
15 zum Fermenter begonnen. Die Temperatur wurde auf 300C gehalten und der pH-Wert des Mediums wur- de durch dauernde geregelte Zugabe wässerigen Ammoniaks auf einen Wert von 4 gehalten.
Diese Emulsion wurde in eine Zentrifugentrennanlage gegeben, aus der drei Phasen gewonnen wur- den. Diese waren, nach ansteigender Dichte geordnet : a) eine Ölphase, welche Hefezellen enthielt,
20 b) eine Phase wässerigen mineralischen Mediums (gegebenenfalls mit einem Gehalt an Öl-und He- fespuren) und c) eine Hefecreme, welche etwa 1 Teil Hefe, 4 Teile wässeriges Medium und eine bestimmte Men- ge Öl, welches an den Hefezellen haftete, enthielt.
Die Hefecreme wurde gemeinsam mit der wässerigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels, z. B.
25 ein nichtionisiertes Detergent mit einer kondensierten Äthylenoxydkette im Molekül, kontinuierlich in einen Mixer eingebracht, worauf die so erhaltene Mischung zentrifugiert wurde. Die drei erhaltenen
Fraktionen nach ansteigender Dichte geordnet waren : a) eine Ölphase, b) eine wässerige Phase, welche das oberflächenaktive Produkt enthielt, das wieder zum Mixer 30 rück geführt wurde und c) eine zweite Hefecreme, die einen Gew.-Teil Hefe enthielt (welche noch immer leicht durch Öl verunreinigt war), sowie 4 Gew.-Teile einer wässerigen Fltissigkeit, welche das oberflÅachenaktive
Material enthielt.
Diese zweite Hefecreme wurde mit Wasser einem Mixer zugeführt, und diese erhaltene Mischung 35 wurde zentrifugiert. Man erhielt : a) eine Ölphase, b) eine wässerige Phase und c) eine dicke Hefecreme, welche 20 Gel.-% Hefe, (bezogen auf Trockenhefe) und 80 Gew. 40
Wasser sowie nur eine sehr geringe Ölmenge enthielt.
40 Diese dicke Hefecreme enthielt 44 Gew. 40 an Proteinen und 18, 5 Gew.-% Fette oder fettähnlich
Substanzen (lipids). Sie besass einen scharfen und ranzigen Geschmack.
Die Lipoide mit dem restlichen Öl wurden durch Lösungsmittelextraktion unter Verwendung einer
Mischung aus 800/0 Hexan und 200/0 Äthylalkohol aus der Hefe extrahiert.
Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels, wurde eine Hefe mit einem Gehalt an 521o Proteinen 45 und 3% Lipoiden erhalten.
(Aus 100 g Hefe wurden durch Lösungsmittelextraktion 16 g Extrakt erhalten, der im wesentlichen aus Fettsäuren, Estern und Sterinen bestand).
Die Hefe, welche vom grösseren Teil ihrer Lipoide befreit worden war, besass einen neutralen Ge- schmack.
50 Beispiel 2: Eine dicke Creme, wie in Beispiel 1 beschrieben, wird hergestellt und in einer Lö- sungsmittelextraktionsanlage behandelt, die aus einer um ihre horizontale Achse rotierenden Filtrier- trommel besteht.
Hefecreme, die 2 Gew. -Teile trockener Hefe und 8 Gew. -Teile Wasser enthielt, wurde dem Ex- traktor mit 16 Teilen Äthanol zugeführt. Die Mischung wurde 30 min lang in der rotierenden Trommel 55 auf 60 C gehalten.
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Das Losungsmittel wurde abgezogen, am Schluss unter Anwendung von. Vakuum. Man erhielt so eine
Mischung aus zwei Teilen Hefe und zwei Teilen Lösungsmittel, welches zu 1/3 aus Wasser und zu 2/3 aus Äthanol zusammen mit einigen zurückbleibenden Verunreinigungen bestand.
Diese Mischung wurde mit 10 Gew.-Teilen einer Lösungsmittelmischung, die aus 80 Gew.-'% n-
5 Hexan und 20 Gew.- Äthanol bestand, behandelt.
Die Mischung wurde 15 min lang bei 600C gehalten, worauf das Lösungsmittel zum Schluss unter Vakuumabgezogenwurde. Das Waschen mit dieser Lösungsmittelmischung wurde mehrere Male wieder- holt. (Wenn ein Hefeprodukt hoher Reinheit benötigt wird, kann der Waschvorgang bis zu z. B. zehnmal wiederholt werden). Abschliessend wird das Hefeprodukt in einem überhitzten Dampf getrocknet.
10 Die Analyse der Hefecreme vor der Lösungsmittelextraktion und des Hefeproduktes, das erhalten wird, wird in der folgenden Tabelle gezeigt :
Tabelle 1 :
Beispiel 3 : Die Hefecreme, die in Beispiel 2 beschrieben wurde. wurde in einer Trommel mit vertikaler Achse undPadde1rührer. welcher sich mit 10 Umdr/min drehte, kontinuierlich extrahiert. Bei 15 den einzelnen Versuchen war das Lösungsmittel der Reihe nach Äthanol, Äthanol gefolgt von n-Hexan und Isopropanol.
Der Extrakt wurde zur Gewinnung der Lipoide und Kohlenwasserstoffe kontinuierlich destilliert und das Lösungsmittel in den Extraktor zurückgeführt.
Die Bedingungen und die Resultate, die man erhielt, werden in der folgenden Tabelle gezeigt :
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Tabelle 2 :
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<tb>
<tb> Versuch
<tb> Lösungsmittel <SEP> und <SEP> Periode <SEP> Äthanol <SEP> Äthanol <SEP> (20 <SEP> h) <SEP> Isopropanol <SEP> (40 <SEP> h)
<tb> der <SEP> Behandlung <SEP> (11 <SEP> h) <SEP> Hexan <SEP> (9 <SEP> h)
<tb> Geschwindigkeit <SEP> der <SEP> Lö- <SEP> 600 <SEP> ml/h <SEP> 600 <SEP> ml/h <SEP> 600 <SEP> ml/h
<tb> sungsmittelzugabe
<tb> Temperatur <SEP> 60 C <SEP> c <SEP> 60 <SEP> 60 <SEP> c <SEP>
<tb> Gewicht <SEP> der <SEP> Hefe- <SEP> 1000 <SEP> 1000 <SEP> 1000
<tb> paste <SEP> (g)
<tb> Analyse <SEP> vor <SEP> der <SEP> Be- <SEP> nach <SEP> der <SEP> Be- <SEP> vor <SEP> der <SEP> Be- <SEP> nach <SEP> der <SEP> Be- <SEP> vor <SEP> der <SEP> Be- <SEP> nach <SEP> der <SEP> Behandlung <SEP> handlung <SEP> handlung <SEP> handlung <SEP> handlung <SEP> handlung
<tb> Trockene <SEP> Hefe
<tb> Gewicht <SEP> in <SEP> g <SEP> 210 <SEP> 140 <SEP> 210 <SEP> 160 <SEP> 210 <SEP> 140
<tb> % <SEP> Stickstoff <SEP> 6, <SEP> 05 <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 65 <SEP> 7, <SEP> 45 <SEP> 5, <SEP> 65 <SEP> 8, <SEP> 50 <SEP>
<tb> Gesamt-Gew.-% <SEP> der <SEP> 41, <SEP> 2 <SEP> 5,0 <SEP> 42, <SEP> 9 <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 42, <SEP> 9 <SEP> 6, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Lipoide <SEP> in <SEP> der <SEP> Hefe
<tb> Extrakt
<tb> Gewicht <SEP> (g) <SEP> 72 <SEP> 50 <SEP> 70
<tb>
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B eis pie I 4 :
Eine Hefe des Stammes Hansenula suaveolens wurde in einer kontinuierlichen Kul- tur mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0, 2 Vol/Vol/h auf einem paraffinischen Gasöl, welches eine Konzentration von 120 g/1 aufwies. bei einer Temperatur von 300C und einem wässerigen Nähr - medium (enthaltend Natriumphosphat, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat und Ammoniumsulfat), wie in
5 Beispiel 1 beschrieben, wachsen gelassen.
Der pH-Wert wird durch kontinuierliche Zugabe von kontrollierten Mengen an wässerigem Am- moniak auf 4 gehalten.
Die Wachstums geschwindigkeit liegt in der Grösse von 10 gll. Die so erhaltene Brühe, die eine mit nicht-assimiliertem Ausgangsmaterial und wässerigem Nährmedium verunreinigte Hefe enthält, wird 10 zentrifugiert, um eine Hefecreme zu erhalten. Diese Hefecreme wird dann mit einem wässerigen Me- dium, welches 0, 5 g/1 eines nichtionisierten oberflächenaktiven Mittels, das aus dem Kondensations- produkt aus 1 Mol Laurylalkohol mit 8, 75 Mol Äthylenoxyd besteht, enthält, behandelt. Die Mischung wurde in eine Zentrifuge (röhrenförmige Type) eingespeist.
Die aus der Zentrifuge erhaltene Fraktion, welche den Mikroorganismus enthält, wird nachher nur
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trommel zusammen mit 8 Gew.-Teilen Isopropanol eingebracht. Die Mischung wurde während 30 min auf 600C gehalten, wobei die Trommel rotierte.
Das Lösungsmittel wurde am Schluss unter Vakuum abgezogen. Man erhielt so eine Mischung aus 20 1 Teil Trockensubstanz und l'Teil Lösungsmittel, welches aus 1/3 Wasser und 2/3 Isopropanol zusam- men mit einigen zurückbleibenden Verunreinigungen bestand.
Diese Mischung wurde mit 10 Gew.-Teilen einer Lösungsmittelmischung, die aus 80 Gew.-% n-
Hexan und 20 Gel.-% Isopropanol bestand, behandelt. Die Mischung wurde 15 min lang auf 600C ge- halten, worauf das Lösungsmittel am Schluss unter Vakuum abgezogen wurde.
25 Das Waschen mit dieser Lösungsmittelmischung wurde mehrere Male wiederholt. Abschliessend wird das Hefeprodukt in einem überhitzten Dampf getrocknet.
Beispiel 5 : Das Verfahren nach Beispiel 4 wurde wiederholt unter Verwendung eines Stammes von Candida utilis ; auch dabei wurde ein zufriedenstellendes Hefeprodukt erhalten.
Beispiel 6 : Ein Bakterium des Stammes Pseudomonas aeruginosa wurde in kontinuierlicher Ver- 30 fahrensweise bei einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0, 2 Vol/Vol/h auf paraffinischem Gasöl als
Ausgangsmaterial gezüchtet, wobei man eine Konzentration des genannten Gasöls von 120 g/l, einen pH-Wert von 7, 1, eine Temperatur von 320C und ein Nährmedium wie folgt verwendete : KH, pq
NaCl 35 MgS04. HZO
NH4Cl
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Hefeextrakt 40 weiches Wasser zum Auf- füllen 1. 6 g
0, 02 g
0, 48 g
4, 6 g
100 ml
25 ml 1000 ml
Die Zuwachsmenge lag in der Grössenordnung von 5 g/l.
Die so erhaltene Brühe, welche mit nicht assimiliertem Ausgangsmaterial verunreinigte Bakterien enthielt, wurde einer Zentrifugierung unterworfen. Die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion wurde einer Behandlung mit einem wässerigen
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tig mit dem wässerigen oberflächenaktiven Mittel 0,5 g/1 Laurylalkohol vermischt mit 8, 75 g/1 Âthylen- oxyd vermischt und in einer Zentrifuge (Röhrenform) zentrifugiert, wonach der Mikroorganismus nur mit
Leitungswasser gewaschen wurde. Die Creme, welche 1 Gew.-Teil Bakterien (bezogen auf Trockenge- wicht) und 3 bis 4 Teile Wasser enthielt, wurde in einen Trommeltrockner gebracht. Das so erhaltene 50 Trockenprodukt enthielt 60 Gew.. 11/o an Protein, und 15 Gew.-% Fette oder fettähnliche Substanzen (lipids).
Es besass einen scharfen und ranzigen Geschmack, charakteristisch für Bakterien, welche aus
Erdölfraktionen gewonnen wurden. Das genannte Bakterium wurde in einem Soxhlet-Extraktor mit einer
Mischung aus 80% Hexan und 20% äthanol extrahiert. (Gegebenenfalls kann statt Äthanol auch Isopro- panol verwendet werden).
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Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhielt man eine Bakteriencreme, welche 671o Proteine und 5'10 an Fetten und fettähnlichen Substanzen (lipids) enthielt.
Aus 100 g des Bakteriums erhielt man durch die Lösungsmittelextraktion 9 g eines Extrakts, der hauptsächlich aus Fettsäuren und Estern und restlichen Kohlenwasserstoffen bestand.
5 Das Bakterium, welches vom Hauptteil seiner "Lipids" befreit worden war, besass einen völlig neu- tralen Geschmack.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten, geschmacksverbesserten Mikroorganismenmaterials durchSubmerskultur dieses geradkettige Kohlenwasserstoffe assimilierenden Mikroorganismus, in Gegen- wart von Sauerstoff, in einem Gemisch eines wässerigen Mediums mit zumindest zum Teil geradketti-
10 gen Kohlenwasserstoffen, wobei der Gehalt des Kohlenwasserstoffsubstrats an geradkettigen Kohlenwas- serstoffen vermindert wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Gärungsendprodukt durch eine bekannte Methode in eine Kohlenwasserstoff-Fraktion mit vermindertem Gehalt an-bzw.
frei von - ge- radkettigen Kohlenwasserstoffen und eine Fraktion, welche den Mikroorganismus gemeinsam mit einer wässerigen Phase und einem Anteil an restlichen Kohlenwasserstoffen enthält, getrennt wird, dass diese
15 letztere Fraktion mit einem oberflächenaktiven Mittel vermischt und neuerdings in Fraktionen getrennt wird, so lange, bis eine nur noch schwach verunreinigte Mikroorganismenfraktion erhalten wird, und diese mikroorganismenhaltige Fraktion einer oder mehreren aufeinanderfolgenden Lösungsmittelextrak- tionen unterworfen wird, wodurch zumindest teilweise die Fette und fettähnlichen Substanzen (lipids) gemeinsam mit den noch am Mikroorganismus haftenden Kohlenwasserstoffen entfernt werden.