DE1642587A1

DE1642587A1 - Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1642587A1
Application number: DE19671642587
Authority: DE
Inventors: Filosa Jean Antoine
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1966-05-13
Filing date: 1967-05-12
Publication date: 1971-05-06
Also published as: BE698394A; NL6706711A; GB1168835A; US3520777A

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHDNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL.-CHEM. ALEK VON KREISlER

DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH 1642587 KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 23. Mai I970 Kl/En

The British Petroleum Company Limited, Britannic House, Moor Lane, London E.C.2 / England

Verfahren zur Kultiyierung_von_Mikroorganismen

Die Erfindung bezieht 3ich auf ein Verfahren zur Erzeugung von Mikroorganismen, z.B. Hefe. Sie betrifft ferner die vollständige oder teilweise Entfernung von geradkettigen Kohlenwasserstoffen aus Gemischen mit anderen Kohlenwasserstoffen.

Bei einem Verfahren, bei dem ein Mikroorganismus in Gegenwart eines Kohlenwasserstoffs gezüchtet wird, wurde festgestellt, daß der Mikroorganismus durch sorbierte Kohlenwasserstoffe verunreinigt sein kann. Zuweilen können auch andere beim Fermentationsprozeß gebildete Stoffe anwesend sein. Beispielsweise " können Hefen mit Lipiden verunreinigt sein.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, bei dem man in einer Wachstumsstufe einen Mikroorganismus in Gegenwart eines ganz oder teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden Einsatzmaterials, in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases züchtet, anschließend in einer Reinigungsstufe den Mikroorganismus in Berührung mit einem wäßrigen Nährmedium und einem freien Sauerstoff enthaltenden Gas hält, wodurch die Menge des den Mikroorganismus verunreinigenden Kohlenwasserstoffs verringert wird,

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Neue Unterlagen (Art 7 § I Abs. 2 Nr. I Satz 3 dta Xndarunoagea. v. 4.9.1^f«i /' ORIGINAL INSPECTED

danach das den Mikroorganismus enthaltende Produkt einer Trennungsbehandlung unterwirft, anschließend eine den Mikroorganismus enthaltende Fraktion gewinnt, die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion der Lösungsmittelextraktion unterwirft und dann die den Mikroorganismus enthaltende, aus der Lösungsmittelextraktion erhaltene Fraktion trocknet.

Gegebenenfalls kann das durch Trocknen erhaltene, den Mikroorganismus enthaltende Produkt einer weiteren Lösungsmittelextraktion unterworfen werden. Die vorstehend genannte Trennbehandlung kann aus einer Dekantierung bestehen. Zusätzlich oder als Alternative kann eine Zentrifugierung vorgenommen werden.

Als Lösungsmittel eignen sich für die Zwecke der Erfindung beispielsweise Äthylalkohol, Isopropanol, leichte Kohlenwasserstoffe einschließlich Benzol und leichter Fraktionen aus Platforming-Anlagen, Äthyläther, Aceton, chlorierte Lösungsmittel und verflüssigte Erdölgase, z.B. Butan.und Propan. Das Kohlenwasserstoff-Einsatzmaterial enthält vorzugsweise Kohlenwasserstoffe einer C-Zahl von 10 oder darüber. Zweckmäßig wird eine aus Erdöl erhaltene Kohlenwasserstofffraktion verwendet.

.Gewisse Erdölfraktionen, insbesondere Gasöle, enthalten bekanntlich geradkettige Kohlenwasserstoffe, hauptsächlich Paraffine, die Wachse sind und sich nachteilig auf den Stockpunkt der Fraktion auswirken. Wenn also diese Kohlenwasserstoffe ganz oder teilweise entfernt werden, wird der Stock- . punkt der Fraktion erniedrigt. Gewöhnlich wird das Wachs durch Ausfällung mit Hilfe von Lösungsmitteln entfernt. Hierbei wird das ursprünglich in der Fraktion vorhandene Wachs als solches, d.h. ohne Umwandlung in wertvollere Produkte, gewonnen.

Die unterhalb der Gasöle siedenden Erdölfraktionen, z.B. Schwerbenzine und Leuchtpetroleum, enthalten ebenfalls gerad-

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kettige Kohlenwasserstoffe, die potentiell wertvoll für die Umwandlung in andere Produkte sind, Jedoch war bisher die Ausnutzung dieser Kohlenwasserstoffe im allgemeinen durch die Notwendigkeit erschwert, diese Kohlenwasserstoffe aus den Erdölfraktionen, in denen sie enthalten sind, abzutrennen, bevor sie in andere Produkte umgewandelt werden können.

Gemäß einem bevorzugten kennzeichen ist die Erfindung auf ein Verfahren gerichtet, bei dem man einen Mikroorganismus auf die vorstehend beschriebene Weise in Gegenwart einer teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoff bestehenden Erdölfrak- ä tion, die ein mittleres Molekulargewicht hat, das wenigstens 10 C-Atomen pro Molekül entspricht, und in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthalten-den Gases züchtet und aus dem Gemisch einerseits den Mikroorganismus und andererseits eine Erdölfraktion abtrennt, die einen verringerten Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen hat oder frei von diesen geradkettigen Kohlenwasserstoffen ist.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist von besonderem Wert für die Behandlung von Gasölfraktionen aus Erdöl, die geradkettige Kohlenwasserstoffe in Form von Wachsen enthalten, da beim •Verfahren gemäß der Erfindung ein Gasöl von verbessertem I Stockpunkt erhalten wird, während die Wachse in ein wertvolles Produkt umgewandelt werden.

Die geradkettigen Kohlenwasserstoffe sind in den erfindungsgemäß verwendeten Einsatzmaterialien gewöhnlich als Paraffine vorhanden. Sie können jedoch auch als Olefine vorliegen. Ferner können Gemische verwendet werden, die geradkettige Paraffine und Olefine enthalten.

Es ist ein wichtiges Merkmal der Erfindung, daß bei der Züchtung von Hefen in Gegenwart der vorstehend beschriebenen EIn-

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satzmaterialien unter Bedingungen, die das Wachstum der Hefe auf Kosten der geradkettigen Kohlenwasserstoffe begünstigen, die anderen Kohlenwasserstoffe, z.B. Isoparaffine, Naphthene und Aromaten, nicht abgebaut werden oder der abgebaute Anteil bestenfalls sehr gering ist. Ferner wird im Gegensatz zu üblichen chemischen Verfahren, die dem Massenwirkungsgesetz gehorchen, die Geschwindigkeit, mit der die geradkettigen Kohlenwasserstoffe entfernt werden, mit abnehmendem Anteil dieser Kohlenwasserstoffe im Gesamtgemisch der Kohlenwasserstoffe nicht wesentlich geringer (ausgenommen natürlich in den letzten Phasen der Entfernung). Falls gewünscht, kann somit die erreichte prozentuale Umwandlung der geradkettigen Kohlenwasserstoffe beimeinem Wert gehalten werden, der sich 100 nähert, ohne daß ein unverhältnismäßig hoher Aufwand an Kontaktzeit zur Erzielung geringer Verbesserungen notwendig ist. Ferner kann beim kontinuierlichen Verfahren diese hohe prozentuale Umwandlung erreicht werden, ohne zur Anwendung eines langen Reaktionsweges Zuflucht zu nehmen.

Durch Anwendung dieses Verfahrens unter Bedingungen, die den Abbau der geradkettigen Kohlenwasserstoffe begrenzen, ist es möglich, unter Entfernung nur eines gewünschten Anteils dieser Kohlenwasserstoffe zu arbeiten.

Zu den für das Verfahren gemäß der Erfindung geeigneten Einsatzmaterialien eignen sich Leuchtpetroleum, Gasöle und Schmieröle· Diese Einsatzmaterialien können raffiniert oder einer gewissen raffinierenden Behandlung unterworfen worden sein, jedoch müssen sie gewöhnlich einen Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen enthalten, um für die Zwecke der Erfindung geeignet zu sein. Zweckmäßig enthält die Erdölfraktion 3 bis 45 Gew.-# geradkettige Kohlenwasserstoffe.

Als Mikroorganismen, die auf die hier beschriebene Weise gezüchtet werden, kommen Hefen, Pilze oder Bakterien in Frage.

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Bei Verwendung einer Hefe gehört diese vorzugsweise zur Familie Cryptococcaceae, insbesondere zur Unterfamilie Cryptococcoideae. Gegebenenfalls können jedoch auch ascosporogene Hefen der Unterfamilie Saccharomycoideae verwendet werden. Die bevorzugten Gattungen der Unterfamilie Cryptococcoideae sind Torulopsis (auch als Torula bekannt) und Candida. Bevorzugte Hefespezies werden nachstehend genannt. Besonders bevorzugt wird die Verwendung der nachstehend zusammen mit den Hinterlegungsnummern genannten Stämme. Die mit CBS gekennzeichneten Stämme sind beim Centraal Bureau vor Schimmelculture, Baarn, Holland, und die mit INRA gekennzeichneten Stämme beim Institut National de la Recherche Agronomique, ™ Paris, Frankreich, hinterlegt.

Bevorzugter Stamm Candida lipolytica

Candida pulcherrime CBS 610

Candida utilis

Candida utilis, variati major CBS 841

Candica tropicalis CBS 23I7

Torulopsis colliculosa CBS 133

Hansenula anomala CBS 110

Oidium Iactis

Neurospora sitophila (

Mycoderma Cancoillote INRA: STV 11

Von den vorstehend genannten Stämmen wird Candida lipolytica besonders bevorzugt.

Als Mikroorganismen können in einem wäßrigen Nährmedium, das Kohlenwasserstoffe enthält, auch Pilze gezüchtet werden. Ein geeigneter Stamm ist Penicillium expansum. Auf einem festen Nährboden, der Kohlenwasserstoffe als Einsatzmaterial enthält, können Penicillium roquefort!'!, Penicillium notatum, Aspergillus fussigatus, Aspergillus nlger und Aspergillus versicolor gezüchtet werden«

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OHlGlNA*-

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Die erfindungsgemäß gezüchteten Bakterien gehören zweckmäßig zu den Ordnungen Pseudomonadales, Eubacteriales und Actinomycetales. Vorzugsweise werden Bakterien der Familie Bacillaceae und Pseudomonadaceae verwendet. Bevorzugte Spezies sind Bacillus megaterium, Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa. Weitere geeignete Spezies sind:

Bacillus amylobacter
Pseudomonas natriegens
Arthrobacter sp.
Micrococcus sp„
Corynebacterium sp.
Pseudomonas syringae
Xanthomonas begoniae
Plavobacterium devorans
Acetobacter sp.
Actinomyces sp.

PUr das Wachstum des Mikroorganismus ist außer dem Kohlenwasserstoff-Einsatzmaterial ein wäßriges Nährmedium und die Zufuhr von Sauerstoff vorzugsweise in Form von Luft erforderlich. Ein typisches Nährmedium für die Züchtung von Noeardia, eine Gattung von Actinomycetales, hat folgende Zusammensetzung:

Ammoniumsulfat 1 g

Magnesiumsulfat 0,20 g

Eisen(ll)-sulfatheptahydrat 0,005 g

Mangansulfatmonohydrat 0,002 g

Monokaliumphosphat 2 g

Dinatriumphosphat 3 g

Calciumchlorid ü_? g

Natriumcarbonat 0,1 g

Hefeextrakt 0,008 g

destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf 1000 ml)

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7	2	g
O,	1	6
ο,	5	g
2,	100	6
	ml

Ein Nährmedium, das sich für andere Bakterien eignet, hat die folgende Zusammensetzung:

Monokaliumphosphat Magnesiumsulfatheptahydrat Natriumchlorid

Ammoniumchlorid

Leitungswasser (Spurenelemente)

Hefeextrakt ' 0,025 g

destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf 1000 ml)

Ein geeignetes Nährmedium für Hefen (und Pilze) hat folgende Zusammensetzung:

Diammpniumphosphat 2 g

Kaliumchlorid 1,15 6

Magnesiumsulfatheptahydrat 0,65 g

Zinksulfat 0,17 g

Mangansulfatmonohydrat 0,045 g

Eisen(II)-sulfatheptahydrat 0,068 g

Leitungswasser 200

Hefeextrakt 0,025 g destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf lOOO ml)

..Mikroorganismen, Insbesondere Hefen wachsen zuweilen mit Schwierigkeit, wenn sie erstmals unter Verwendung von Kohlen-Wasserstofffraktionen als Einsatzmaterial gezüchtet werden. Zuweilen muß als Impfmaterial ein Mikroorganismus verwendet werden, der vorher zur Züchtung auf der Kohlenwasserstofffraktion, deren Verwendung beabsichtigt ist, angepaßt oder adaptiert worden ist. Ferner ist es möglich, daß der Mikroorganismus trotz seiner Züchtung in Gegenwart eines wäßrigen mineralischen Mediums, das die geeigneten Nährelemente enthält, nur mit Schwierigkeit wächst, weil die Kohlenwasserstoff fraktion nicht die Wuchsfaktoren enthält, die in Nährmedien auf Basis von Kohlehydraten vorhanden sind, es sei denn, diese Wuchsfaktoren werden zugesetzt.

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1Ö42S87

Das Wachstum der Mikroorganismen wird begünstigt, wenn man zum Kulturmedium eine sehr geringe Menge eines Hefeextraktes (ein durch Hydrolyse von Hefe erhaltenes, an Vitaminen der Gruppe B reiches industrielles Produkt) oder allgemein an ' Vitaminen der Gruppe B und/oder Biotin zusetzt. Diese Menge liegt vorzugsweise in der Größenordnung von 25 Teilen pro Million, bezogen auf das wäßrige Permentationsmedium. Sie kann je nach den für die Züchtung gewählten Bedingungen höher oder niedriger liegen.

Das Wachstum der Mikroorganismen erfolgt auf Kosten der Ausgangsfraktion unter Zwischenbildung von Körpern mit Säurefunktion, hauptsächlich Fettsäuren, so daß der pH-Wert des wäßrigen mineralischen Mediums progressiv sinkt. Ohne Korrektur kommt das Wachstum ziemlich schnell zum Stillstand, und die Konzentration des Mikroorganismus im Medium bzw. die Zelldichte nimmt nicht mehr zu, so daß eine sogenannte stationäre Phase erreicht wird.

Das wäßrige Nährmedium wird daher vorzugsweise durch stufenweise oder kontinuierliche Zugabe eines wäßrigen Mediums von hohem pH-Wert beim gewünschten pH-Wert gehalten. Gewöhnlich wird der pH-Wert des Nährmediums bei Verwendung von Pilzen -und Hefen, insbesondere von Candida lipolytica, im Bereich von 3 bis 6, vorzugsweise 4 bis 5 gehalten. (Bakterien erfordern einen höheren pH-Wert von gewöhnlich 6,5 bis 8).. Geeignete alkalische Materialien für den Zusatz zum Nährmedium sind Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Dinatriumhydrogenphosphat und Ammoniak in freier Form oder in wäßriger Lösung.

Die optimale Temperatur des Nährmediums ist verschieden je nach der Art des verwendeten Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im Bereich von 25 bis J55°C. Bei Verwendung von Candida lipolytica wird ein Temperaturbereich von 28 bis 32°C bevorzugt«

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Die Aufnahme von Sauerstoff ist für das Wachstum der Mikroorganismen wesentlich» Der Sauerstoff wird gewöhnlich als Luft zugeführt. Damit die Wachstumsgeschwindigkeit hoch bleibt, muß die für die Einführung von Sauerstoff verwendete Luft durch Rühren in feine Bläschen zerteilt werden. Die Luft kann durch eine Pritte eingeführt werden, jedoch kann auch das als "Wirbelbelüftung" bekannte System der intensiven Belüftung zur Anwendung kommen.

Es wurde gefunden, daß bei Verwendung von Hefe des Stammes Candida lipolytica beim Verfahren gemäß der Erfindung, wobei die Belüftung durch "Wirbelbelüftung" erfolgt, eine hohe f

Wachstumsgeschwindigkeit erreicht wird, wobei die Generationszeit im Bereich von 2 bis 5 Stunden liegt und die Zellkonzentration in 2 Tagen um einen Paktor bis zu 1000 gesteigert wird.

Bei Chargenbetrieb wachsen die Mikroorganismen gewöhnlich zunächst mit langsamer Zunahme der Zelldichte. (Diese Wachstumsperiode wird nachstehend als "Trägheitsphase" bezeichnet.) Danach steigt die Wachstumsgeschwindigkeit auf einen höheren Wert. Die Periode mit höherer Wachstumsgeschwindigkeit wird als "Exponentialphase" bezeichnet. Anschließend wird die ZeIl-"dichte wieder konstant (Stationäre Phase"). ä

Eine gewisse Menge des Mikroorganismus für den Beginn der nächsten Charge wird vorzugsweise vor Beendigung der Exponentialphase abgenommen. Die Züchtung oder Bebrütung wird gewöhnlich vor der stationären Phase abgebrochen. In dieser Stufe wird der Mikroorganismus gewöhnlich von der Hauptmenge der nicht gebrauchten Einsatzfraktion abgetrennt.

Nach einer der möglichen Methoden zur Aufarbeitung des Produkts wird zuerst der größere Teil der geschlossenen wäßrigen Phase abgetrennt. Dies geschieht vorzugsweise durch Zentrifugieren oder Dekantieren. Die abgetrennte wäßrige Phase enthält

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gewöhnlich in höherer Konzentration Ionen von Stoffen, die keine Nährstoffe sind und im Kreislaufstrom toleriert werden können. Wenn dites der Fall ist, kann nur ein Teil der gewonnenen wäßrigen Phase im Kreislauf geführt werden. So ist es gewöhnlich möglich, etwa 96 Gew.-^ der im Produkt vorhandenen wäßrigen Phase abzutrennen, wovon auf der gleichen prozentualen Basis etwa 20 Gew.-% verworfen werden. Dem Kreislaufstrom werden ergänzende Mengen der notwendigen Nährstoffe zugesetzt, worauf er in den Permenter zurückgeführt wird. Die ergänzenden Stoffe können dem Fermenter gegebenenfalls als getrennter Strom zugeführt werden.

Durch Zentrifugieren des aus dem Fermenter kommenden Produkts (vorzugsweise nach Dekantierung in der beschriebenen Weise) werden drei Fraktionen gewonnen, nämlich (in der Reihenfolge steigender Dichte):

I. Eine ölphase, die Zellen des Mikroorganismus enthält.

II. Eine wäßrige Phase, die Spuren von öl und Mikroorganismus enthält.

III. Eine aus dem Mikroorganismus zusammen mit wäßriger Phase bestehende Mikroorganismus-"creme", an deren Zellen öl haftet.

Die Fraktion III wird dann mit einem wäßrigen Nährmedium gemischt, das die gleiche oder eine andere Zusammensetzung wie das in der Wachstumsphase verwendete wäßrige Nährmedium haben kann, und wird in Mischung mit einem Gas gehalten, das freien Sauerstoff enthält, wodurch die Menge des Kohlenwasserstoffs, der den Mikroorganismus verunreinigt, verringert oder dieser Kohlenwasserstoff entfernt wird. Auch hier wird vorzugsweise der größere Teil der geschlossenen wäßrigen Phase unter Kreislaufführung eines Teils der zurückgewonnenen wäßrigen Phase abgetrennt, wie vorstehend beschrieben. Die Rückführung kann nach Wunsch entweder zur Wachstumsstufe oder zur Reinigungsstufe erfolgen.

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- Ii -

Durch Zentrifugieren des aus dem Fermenter entnommenen Produkts, vorzugsweise nach Abtrennung des größeren Teils der wäßrigen Phase durch Dekantieren, werden ^a

1. eine wäßrige Phase, die Spuren des Mikroorganismus enthält, und

2. eine Mikroorganismus-creme

erhalten. Diese Creme, die wäßriges Material enthält, kann einer kontinuierlichen Lösungsmittelextraktion oder aufeinanderfolgenden Waschen mit Lösungsmitteln und anschließender Phasentrennung unterworfen werden. Vorzugsweise enthält diese Creme Wasser und Mikroorganismus (Trockengewicht) im Gew._T Verhältnis von 1:3 bis 3:1. Gegebenenfalls kann eine Paste durch Zentrifugieren gewonnen und mit Wasser zur Creme verdünnt werden.

Die Extraktion wird zweckmäßig in einem feststehenden Behälter, der mit Paddelrührern versehen ist, die vorzugsweise mit weniger als 10 UpM rotieren, oder in einem Gefäß durchgeführt, das um eine horizontale Achse rotiert. Wenn eine kontinuierliche Lösungsmittelextraktion vorgenommen wird, wird der Extrakt kontinuierlich abgezogen und kontinuierlich oder chargenweise bei Normaldruck oder vermindertem Druck destilliert, während das Lösungsmittel kontinuierlich in den Extraktor zu- '* rückgeführt wird. Unter diesen Bedingungen kann die Hefe kontinuierlich oder chargenweise eingeführt und abgezogen werden.

Die Lösungsmittelextraktion wird vorzugsweise vorgenommen, während das Lösungsmittel dem Extraktor in periodisch schwankender Geschwindigkeit zugeführt wird, wodurch der Flüssigkeitsstrom stoßweise pulsiert« Die pulsierenden Stöße der durch den Feststoff strömenden Flüssigkeit bringen Schwingungen und begrenzte Verschiebungen jedes Feststoffkorns relativ zu seinen Nachbarn hervor, und dies ist einer mechanischen Bewegung der Gesamtmasse gleichwertig. Aus diesem Grunde wer-

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den alle zu extrahierenden Produkte schneller und vollständiger extrahiert.

Zweckmäßig wird in der Zuführungsleitung des Flüssigkeitsstroms eine Vorrichtung angeordnet, die eine pulsierende Strömung erzeugt, wobei die Amplitude und die Frequenz experimentell in jedem besonderen Fall auf den günstigsten Wert eingestellt werden« Diese Stöße werden nach beliebigen bekannten Verfahren erzeugt. Vorzugsweise wird eine Kolbenpumpe verwendet, deren Ventile entfernt worden sind. Die Zahl der Stöße beträgt vorzugsweise 1 bis 6o/Min. Die Durchführung des Verfahrens unter der Einwirkung der Strömungsstöße ist ausführlicher in der britischen Patentanmeldung 22j54/6j5 beschrieben.

Geeignete Lösungsmittel für das Verfahren gemäß der Erfindung wurden bereits genannt. Gegebenenfalls kann eine erste Extraktiohsstufe unter Verwendung eines polaren Lösungsmittels, z.B. eines alkoholischen Lösungsmittels, wie Äthanol oder Isopropanol, vorgenommen werden, und der teilweise gereinigte Mikroorganismus kann dann in einer zweiten Extraktionsstufe unter Verwendung eines Kohlenwasserstoffs als Lösungsmittel, z.B. η-Hexan oder einer leichten Platforming-Fraktion oder Benzol, weiter behandelt werden. In der zweiten Stufe wird vorzugsweise als Lösungsmittel ein Gemisch eines Kohlenwasserstoffs in größerer Menge mit einem polaren Lösungsmittel in geringerer Menge verwendet. Vorzugsweise wird das azeotrope Gemisch aus Hexan mit Isopropanol oder Äthanol gebraucht. Gegebenenfalls kann in beiden Extraktionsstufen kontinuierlich gearbeitet werden.

Es wird angenommen, daß bei Verwendung eines Gemisches aus Kohlenwasserstoff und polarem Lösungsmittel die Aufgabe oder eine der Aufgaben des polaren Lösungsmittels darin besteht, die Bindung des zu extrahierenden Materials (auch die Bindung von Kohlenwasserstoffen, die als solche in polaren Lösungsmitteln nicht löslich sind) zu schwächen.

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Wenn eine einzige Wäsche in der ersten Stufe zur Anwendung kommt, sollte die verwendete Äthanol- oder Isopropanolmenge das 1,5- bis j5-fache des Wasseryolumens betragen, das in der Creme oder Paste des Mikroorganismus vorhanden ist. Gegebenenfalls können jedoch auch zwei Wäschen mit Äthanol oder Isopropanol vorgenommen werden, wobei in der ersten Wäsche das Lösungsmittel das gleiche Volumen hat wie das Wasservolumen in der Creme oder Passe und in der zweiten Wäsche eine kleinere Äthanol- oder Isopropanolmenge, z.B. die Hälfte der in der ersten Wäsche verwendeten Menge gebraucht wird.

Zwischen den Wäschen Jeder Stufe oder Unterstufe wird die Creme oder Paste entwässert, z.B. durch Filtration, und ein Teil des restlichen Lösungsmittels wird dann vorzugsweise durch Vakuumfiltration entfernt. In der zweiten Stufe entspricht die Lösungsmittelmenge, die in der (oder jeder) Wäsche verwendet wird, gewöhnlich dem 2- bis 20-fachen Volumen des erhaltenen trockenen Mikroorganismus.

Durch Verwendung eines Gemisches aus Kohlenwasserstoff und polarem Lösungsmittel als Lösungsmittel in der zweiten Extraktionsstufe kann die Zusammensetzung des Lösungsmittels der zweiten Stufe, das in jedem Fall polares Lösungsmittel aus 'der ersten Extraktionsstufe aufnimmt, stabilisiert werden. ™ Eine Anreicherung an polarem Lösungsmittel kann im Laufe einer Destillationsstufe vermieden werden, in der das Lösungsmittel der zweiten Stufe durch Abnahme von getrennten Strömen zurückgewonnen wird, die aus a) polarem Lösungsmittel zur Rückführung zur ersten Extraktionsstufe und to) einem Gemisch von Kohlenwasserstoff und polarem Lösungsmittel zur Rückführung zur zv/eiten Stufe bestehen. Zweckmäßig wird der durch die zweite Extraktionsstufe erhaltene Extrakt in einer Destillationsstufe in a) ein Kopfprodukt, das aus einem Gemisch von Kohlenwasserstoff, polarem Lösungsmittel und Wasser besteht und in die zweite Extraktionsstufe zurückgeführt wird, und b)

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eine Bodenfraktion getrennt, die polares Lösungsmittel, Wasser und die extrahierten Materialien enthält. Diese Fraktion wird vorzugsweise mit dem in der ersten Extraktionsstufe erhaltenen Extrakt gemischt, bevor dieser in die Destillation eingeführt wird, wodurch alle durch Lösungsmittelextraktion zurückgewonnenen Verunreinigungen als Bodenprodukt in dieser Destillationsstufe anfallen. Zweckmäßig wird Äthanol oder Isopropanol als polares Lösungsmittel verwendet. Das Lösungsmittel der zweiten Stufe ist zweckmäßig ein azeotropes Gemisch·

Die Mikroorganismus-Fraktion, aus der möglichst viel Lösungsmittel durch Dekantieren und/oder Zentrifugieren und/oder Filtration entfernt worden ist, wird von den restlichen Spuren von Lösungsmittel und/oder Wasser durch Eindampfen, vorzugsweise unter vermindertem Druck, befreit«, Falls gewünscht, kann die trockene Mikroorganismus-Fraktion einer weiteren Extraktion mit einem Lösungsmittel unterwerfen werden, das einen Kohlenwasserstoff enthält.

Eine Hefe, die ganz oder teilweise von ihren Lipiden und den verunreinigenden Kohlenwasserstoffen nach einer der vorstehend beschriebenen Methoden befreit worden ist, und deren Geschmack verbessert worden ist, stellt ein wertvolles industrielles Produkt für die menschliche Ernährung ab. Der Lipidextrakt, der durch Abdampfen des Lösungsmittels gewonnen worden ist, ist ebenfalls ein neues industrielles Produkt, das entweder als solches oder als Ausgangsmaterial für die Abtrennung seiner Sterole, Fettsäuren (entweder vor oder nach Verseifung) oder seiner anderen Bestandteile verwendet werden kann_e

Beliebige Stufen des Verfahren können kontinuierlich oder chargenweise durchgeführt werden, y&wi kontinuierlich gearbeitet wird, ist es gewöhnlich notwendig, getrennte «erneuter oder getrennte Zonen im gleichen Fermenter für dis* Durchführung der Züchtungs- und Reinigungsstufen vorsTv'-isVian,

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Weitere Maßnahmen, die zur Erzielung eines gereinigten Mikroorganismus oder eines davon stammenden Produkts oder zur Verbesserung des Verfahrens hinsichtlich der Bildung der nicht aufgespaltenen Kohlenwasserstofffraktion ergriffen werden können, sind in den folgenden Patentschriften und Patentanmeldungen beschrieben. Die Anwendung aller dieser Maßnahmen ist im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung möglich.

Bevorzugte Verfahren zur Züchtung der Mikroorganismen und zur Produktabscheidung sind in den britischen Patentschriften 914.567, 914*568 und 1,017.584 sowie in den folgenden deut- | sdien Patentanmeldungen beschrieben:

B 78.776 IVa/6a B 85.074 IVa/6a

B 79.52I IVa/6b B 85.075 IVa/6a

B 85.070 IVa/6a B 87.7I3 IVa/6a

B 85.O7I IVa/6a B 89.462 IVd/23b

B 85.072 IVd/23b B 91.002 IVd/23b

B 85.073 IVd/23b B 9I.OO3 IVd/23b B 74.85I IVa/6a

Beispiel 1

In einen Fermenter aus nichtrostendem Stahl (erste Stufe) mit einem Fassungsvermögen von 60 1 wurden 40 1 eines wäßrigen mineralischen Nährmediums gegeben. Um die Temperatur im Fermenter konstant bei 30⁰C zu halten, wurde Wasser in einem Ringraum zwischen zwei konzentrischen Zylindern, von denen der eine den Fermenter selbst darstellte, umgewälzt. Das wäßrige Nährmedium hatte folgende Zusammensetzungi

Diammoniumhydrogenphosphat	2,0	g
Kaliumchlorid	1*15	g
Magne siumsulfatheptahydrat	0,65	g
Zinksulfat	0,17	g
Mangansulfatmonohydrat	0,045	g

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Eisen(II)-sulfatheptahydrat 0,068 g Hefeextrakt 0,025 g

Leitungswasser 200 g

destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 1000 ml

Als Impfmaterial wurden dann 20 1 einer 24 Stunden-Kultur von Candida tropicalis auf einem Gemisch von C^Q-CpQ-Normalkchlenwasserstoffen zugesetzt, so daß die Zelldichte etwa 1 g Trokkensubstanz/Liter betrug. Dann wurden 1,OJ 1 schweres Gasöl, d.he 15 g/l* zugesetzt. Diese Menge genügte, um die Zelldichte auf 2 g/l zu bringen.

Die Temperatur der Kultur wurde bei J>0 ί 1°C, der pH-Wert bei 4 gehalten. Durch Belüftung und Bewegung wurden 3 mMol 0_p/l Medium/min, zugeführt. Die Ammoniaklösung wurde durch einen automatischen pH-Regler zudosiert. Nachdem 20 ml Ammoniak zugeführt waren, wurde mit der Zugabe von Gasöl begonnen, wobei eine auf Gasöl bezogene und aus

( gebildete Trockenhefe \ eingesetztes Gasöl

berechnete Ausbeute von 10 Gew.-% und eine Zellteilungszeit von 3 Stde zugrunde gelegt wurde. Diese Zugabe erfolgte jede .Stunde, bis 200 g/l, d«,h· 13,8 1 zugesetzt worden waren.

Ausgehend von einer Zelldichte von 2 g/l betrug die Zelldichte nach 25 Stunden (bei Beendigung der Exponential-Wachstumsphase) 15 g/l. Der Permenter wurde dann kontinuierlich bei einer Verdünnungsrate von 0,2 V/V/Std. betrieben, wobei die Zelldichte während des gesamten Versuchs konstant bei 15 g/l blieb. Die am Austritt des Permenters abgezogene Brühe wurde dekantiert. Hierbei wurde eine wäßrige Phase, die 65 Gew.-^ der Brühe ausmachte, als ,ausgebrauchtes Medium abgezogen und der Rest der Brühe, nunmehr in Form einer Hefecreme, gewonnen. Diese Hefecreme hatte die folgende Zusammensetzung:

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Hefe (Trockengewicht) 4,5 Gew.-%

restliches Gasöl 51,5 Gew.-#

wäßriges Medium 64,0 Gew.-^

Abgesehen von dem von der Hefe absorbierten Gasöl wurde das restliche Gasöl mit Hilfe einer Sharples-Superzentrifuge entfernt. Die Hefe hatte nach dem Zentrifugieren folgende Zusammensetzung:

Feuchtigkeit . 68 Gew.-^ Lipide (auf Trockenbasis) 18 Gew.-#

nicht verseifbare Bestandteile 4o Gew.-^ ™

(auf Trockenbasis)

(mit restlich absorbiertem öl)

Diese gewonnene Hefe wurde mit Nährmedium in einer solchen Menge gemischt, das eine Creme erhalten wurde, deren ^eIldichte 15 g/l betrug. Diese Hefecreme wurde kontinuierlich einem zweiten Fermenter zugeführt, der mit dem Fermenter der ersten Stufe identisch war und unter den gleichen Bedingungen wie in der ersten Stufe betrieben wurde, außer daß kein zusätzliches Substrat bzw. wäßriges Medium zugeführt wurde. Die Belüftung wurde auf 5 mMol Og/1 Medium/Min, eingestellt.

•Die Brühe wurde kontinuierlich abgezogen und in eine Sharpies- " Superzentrifuge gegeben, aus der eine Hefepaste gewonnen wurde. In dieser Phase hatte die Hefe folgende Zusammensetzung:

Feuchtigkeit 65 Gew.-% (Trockenbasis)

Lipide 5 Gew.-^

nicht verseifbare Bestandteile 10 Gew.-^

Stickstoff 10 Gew.-^

Der Wassergehalt der Hefepaste wurde auf 1,5 Gew«- Teile V/asser/Teil Trockenhefe eingestellt, wobei eine HefeGreme erhalten wurde. Diese Creme wurde in einen Extrak';or gepumpt, in dem ihr ein azeotropes Gemisch aus Isopropanol und η-Hexan in

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einer Menge von 8 Teilen Lösungsmittel pro Teil Hefe (Trockengewicht) zugesetzt wurde. Diese Extraktion wurde wMerholt. Auf diese beiden Extraktionen folgte eine zweite Extraktionsstufe, die aus einer Wäsche mit Isopropanol in einer Menge von 8 Teilen Lösungsmittel pro Teil Hefe (Trockengewicht) bestand. Die Lösungsmittel wurden dann abgezogen, wobei zum Schluß unter Vakuum gearbeitet wurde. Zurückbleibende Lösungsmittelspuren wurden entfernt und die Hefe in überhitztem Dampf getrocknet. Das Hefeprodukt hatte folgende endgültige Zusammensetzung (auf Trockenbasis):

Feuchtigkeit 5 Gew.-^

Lipide 0,2 Gew.-#

nicht verseifbare Bestandteile 0,1 Gew.-#

Stickstoff 11'. Gew.-#

Nach diesen verschiedenen Extraktionen wurden die Lösungsmittel getrennt oder in Mischung zurückgewonnen und destilliert. Hierbei wurden erhalten:

a) ein azeotropes Gemisch von Isopropanol und n-Hexan

b) ein azeotropes Gemisch von Isopropanol und Wasser

c) eine Rückstandsfraktion.

Die zurückgewonnenen Lösungsmittel wurden in die Extraktionsstufen zurückgeführt.

Es ist ersichtlich, daß der Fermenter der zweiten Stufe eine Reinigungsstufe darstellt. In diesem Fall wurde zur Entfernung des absorbierten Öls keine Wäsche mit einem Waschmittel vorgenommene

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Beispiel 2

Der im Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Lösungsmittelextraktion der Hefecreme wie folgt durchgeführt wurde:

Die Hefecreme wurde in einen Extraktor gepumpt, der mit 10 UpM um eine horizontale Achse rotierte. In. diesen Extraktor wurde ein azeptropes Gemisch aus gleichen Raumteilen Isopropancl und η-Hexan in einer Menge von 8 Teilen Gemisch pro Gew.-Teil Trockenhefe 30 Minuten bei 60°C gegeben. Das feste Material aus dieser ersten Extraktionsstufe wurde mit einem azeotro- λ pen Gemisch von Isopropanol und η-Hexan extrahiert. Diese Maßnahme wurde sechsmal wiederholt« Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen, wobei zum Schluß unter Vakuum gearbeitet wurde.

Die Spurenmenge an restlichem Lösungsmittel wurde durch abschließendes Abstreifen entfernt. Das Hefeprodukt wurde in überhitztem Dampf getrocknet« Das Hefeprodukt hatte die folgende endgültige Zusammensetzung:

Wasser 5 Gew»-#

Lipide 0,2 Gew.-#

nicht verseifbare Bestandteile 0,1 Gew.-%

•Stickstoff 11,5 Gew.-% g

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Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung eines gereinigte^ Mikroorganismen enthaltenden Produkts, dadurch gekennzeichnet, daß in einer Wachstumsstufe ein Mikroorganismus in Gegenwart eines mindestens teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden Kohlenwasserstoffausgangsmaterials, eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases kultiviert und dann zur Verringerung der Menge des den Mikroorganismus verunreinigenden Kohlenwasserstoffs in einer Reinigungsstufe in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases in Abwesenheit einer äußeren Kohlenstoffquelle in einem wäßrigen Nährmedium gehalten wird, daß danach das den Mikroorganismus enthaltende Produkt einer Trennungsbehandlung unterworfen wird und anschließend eine den Mikroorganismus enthaltende Fraktion gewonnen wird, diese Fraktion einer Lösungsmittelextraktion unterworfen wird und die dabei erhaltene, den Mikroorganismus enthaltende Fraktion dann getrocknet wird.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein paraffinische Kohlenwasserstoffe verbrauchender Mikroorganismus eingesetzt wird.

3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus eine Hefe verwendet wird»

4) Verfahren nach Anspruch j5, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Candida lipolytica verwendet wird.

5) Verfahren nach Anspruch J5» dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Candida tropicalis verwendet wird.

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Unterlagen (Art 7 § I Abs. 2 Nr. 1 Satz 3 dte Xndwuneages. v. 4.9.' · ί■ ·'

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6) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein Bakterium verwendet wird.

7) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung ganz oder teilweise in einer Dekantierung besteht.

8) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennungsstufe ganz oder teilweise in einer Zen-r trifugierung besteht.

9) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine bei der Zentrifugierung erhaltene Mikroorganismenpaste zur Bildung einer Creme mit Wasser vermischt und diese Creme dann der Lösungsmittelextraktion unterworfen wird.

10) Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die Paste mit so viel Wasser vermischt wird, daß sich in der Creme ein Gewichtsverhältnis von Wasser zu trockenem Mikroorganismus im Bereich von 1:1 bis 3*1 ergibt.

11) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet,

daß die Lösungsmittelextraktion mit Hilfe eines ein pola- ä res Lösungsmittel enthaltenden Mittels durchgeführt wird.

12) Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel ein Gemisch aus einem Kohlenwasserstoff und einem polaren Lösungsmittel verwendet wird.

13) Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als polares Lösungsmittel ein Alkohol verwendet wird.

Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als polares Lösungsmittel Äthanol verwendet wird.

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15) Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als polares Lösungsmittel Isopropanol verwendet wird.

16) Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenwasserstoff. η-Hexan verwendet wird.

17) Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenwasserstoff Benzol verwendet wird.

18) Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein azeotropes Geraisch verwendet wird.

19) Mikroorganismenhaltiges Produkt, erhältlich nach den Ansprüchen 1 bis 18.

20) Kohlenwasserstoffprodukt, erhältlich nach den Ansprüchen 1 bis 19»

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