DE1924333A1 - Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismenkulturen in Anwesenheit von Kohlenwasserstoffen - Google Patents

Description

DR. GERHARD RATZEL PATENTANWALT

68 MANNHEIMI, 29.4.1969 Seckenheimer Str. 36α · Telefon 46315 Postscheckkonto! Frankfurt/M. Nr. 8293*'<· B α η k ι Deutsche Bank Mannheim Nr. 72/00066 Telegr .-Codei Gerpat

INSGJITtJT PRANGAIS DU PETROLE DES CARBURANTS ET LUBRIi¹IANTS 1 & 4, Avenue de Böis-Preau
92 RUEIL-MALMAISON (Prankreich)

Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Mikroor^anismenkulturen in Anwesenheit von Kohlenwasserstoffen.

. Die Herstellung von Mikroorganismenkulturen in Anwesenheit von aus Erdöl stammenden Kohlenwasserstoffen ist an sich bekannt. Solche Verfahren sind von zahlreichen Forschern beschrieben worden, insbesondere von Just, Schnabel und Ulimann in ihrer Arbeit "Tauchkulturen von Hefe und Bakterien unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen", publiziert in "Die Brauerei- Wissenschaftliche Beilage", Nr. 8, August 1951-

Diesen drei Forschern ist es gelungen, Hefen und Bakterien auf .ι verschiedenen Kohlenwasserstoffen in Anwesenheit von wässrigem Nährmilieu und Sauerstoff zu züchten.

. Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein im industriellen Maß-

9098 85/0237

-2-

- Blatt 2 -

stab durchführbares Verfahren zur Herstellung von Hefekulturen, Schimmelpil zkultur en und Bakterienkulturen auf Kohlenwasserstoff Substraten. Dieses erfindungs-gemässe Verfahren besitzt im Vergleich zu der von den vorgenannten drei Forschern beschriebenen Technik und insbesondere gegenüber den verschiedenen bereits vorgeschlagenen "industriellen Lösungen", die zur Herstellung von Proteinen dienen sollen, zahlreiche Vorteile, insbesondere die folgenden:

- Es werden wesentlich reinere Proteine erhalten, die leicht ψ verdaulich sind und mit Vorteil zur Herstellung von Nährmittel-Kompositionen für das Vieh und gegebenenfalls auch für die menschliche Ernährung verwendbar sind,

- die Kosten des Verfahrens werden wesentlich verringert und zwar sowohl wegen der stark erhöhten Ausbeute von Proteinen als auch infolge der Tatsache, dass die einzelnen Verfahrensstufen wesentlich vereinfacht sind und die Anzahl dieser Verfahrensstufen reduziert ist. .

Diese Vorteile beruhen .darauf, dass - wie weiter unten im einzelnen geoffenbart ist - beim erfindungsgemassen Verfahren die Trennoperation«:.! der Produkte nicht durch Zentrifugieren sondern im allgemeinen durch Sedimentieren erfolgen, ferner darauf, dass die Anzahl der Waschvorgänge der Mikroorganismen reduziert wird und die Behandlungsstufen mit Lösungsmitteln entweder ganz wegfallen oder wesentlich vereinfacht sind.

Ein anderer Aspekt vorliegender Erfindung ist die Schaffung eines im industriellen Masstab durchführbaren Verfahrens, das gleichzeitig mit ausgezeichneten Ausbeuten und bei herabgesetzten Kosten sowohl eine ausgezeichnete Deparaffinierung von Erdölfraktionen ermöglicht als auch die Herstellung von Mikroorganismen, die als Proteid-Quellen und als Vitamin-Quellen für die Ernährung dienen. -

909885/0237 -3- ,

Bis jetzt hat man tatsächlich nur, je nach dem Ziel, das man * sich gesetzt hatte, die Wahl, entweder die Deparaffinierung zu begünstigen, unter gleichzeitigem Schaden für die Mikroorganismenkultur, oder die Mikroorganismenkultur zu begünstigen, unter gleichzeitigem Schaden für die Deparaffinierung.

Vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismenkulturen, das darin besteht, dass man in Anwesenheit eines molekularen Sauerstoff enthaltenden Gases einen Mikroorganismenstamm mit einer flüssigen Kohlenwasserstoff charge, die zumindest aus 70 Gew.-% linearen paraffinischen Kohlenwasserstoffen besteht und einer wässrigen Nährphase in Berührung bringt, die zumindest (a) einen Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff und einen Lieferanten für assimilierbaren Phosphor,(b) Spurenelemente, (c) Wachstumsfaktoren und (d) essentielle mineralische Elemente enthält, wobei man die vom grösseren Kohlenwasserstoff-Anteil, der nicht verbraucht wurde, befreiten Mikroorganismen, die jedoch noch einen geringeren Anteil an Kohlenwasserstoffen enthalten, isoliert, und mit einer wässrigen Phase, die keine Nährphase ist, in Berührung bringt, welche zumindest die Komponenten (a) enthält und die zumindest eine der Komponenten (b), (c) und (d) nicht enthält.

Man arbeitet vorzugsweise in den weiter unten im einzelnen beschriebenen Stufen, wobei man gegebenenfalls gewisse Stufen auslassen kann, wie dies gleichfalls im folgenden beschrieben ist:

1.) Herstellung einer flüssigen Kohlenwasserstoff charge, die zumindest zu 70 Gew.-% und vorzugsweise zumindest zu 85 Gew.-% aus einem oder mehreren normalen, d.h. linearen, also nicht verzweigten paraffinischen Kohlenwasserstoffen besteht.

2.) Wachstum der Mikroorganismen durch deren gleichzeitiges Inberührungbringen mit (a) einer gemäss Stufe 1 erhaltenen

909885/0237 _/»._

Kohlenwasserstoffcharge,("b) einem wässrigen Nährmilieu und (c) mit Sauerstoff j diese Stufe wird Fermentationsstufe genannt·,

3.) Abtrennung der Mikroorganismen vom wässrigen Nährmilieu und gegebenenfalls von den nicht verbrauchten Kohlenwasserstoffen. . ■ ■ ■ '

4-.) Inberührungbringen der gemäss der vorangegangenen Stufen erhaltenen Mikroorganismen mit Sauerstoff und einem wässrigen Milieu, das kein Nährmilieu ist und das weiter unten im einzelnen beschrieben wird; diese Stufe wird Reifungsprozess genannt.

5·) Abtrennung der Mikroorganismen aus dem wässrigen Nichtnährmedium.

6.) Einmaliges oder mehrmaliges Vaschen der Mikroorganismen . 7«) Trocknung der Mikroorganismen.

Die erste Stufe besteht in einer Deparaffinierung einer Kohlenwasserstoff-Ausgangsfraktion, die darin besteht, dass man ein Produkt erhält,.das zumindest 70 Gew.-% und vorzugsweise zumindest 85 Gew.-% an normalen Paraffinen, d.h. an linear gebauten Paraffinen enthält.

Dieses Produkt enthält beispielsweise grössehordnungsmässig 75 bis 95 Gew.-% an normalen Paraffinen. Im allgemeinen ist der Gehalt nicht über 99 %. Tatsächlich lassen sich die Stufen 2 bis 7 des erfindungsgemässen Verfahrens durchaus auch dann durchführen, wenn der Gehalt an n-Paraffinen oberhalb 95 % und insbesondere oberhalb 99 % liegt, jedoch fallen dann die Kosten der ersten Stufe derart stark ins Gewicht, dass die Gefahr der Auswirkung auf die Gesamtkosten des Verfahrens entstehen kann.

Diese Ausgangs-Kohlenwasserstoff-Charge ist im allgemeinen eine Fraktion vom Kerosin-Typ, eine ölfraktion oder vorzugsweise

90 9 885/0237 -5-

- Blatt 5 -

eine Fraktion vom Gasöl-Typ. Die De-n-Paraffinierung dieser Ausgangscharge wird vorzugsweise nach dem in der französischen Patentschrift 1 463 784 "beschriebenen Verfahren durchgeführt. Dieses Verfahren besteht darin, dass man eine Kohlenwasserstoffcharge mit Harnstoff in Suspension oder in einem Gemisch aus Monocarbonsäuren!tril und Wasser aufgelöst, in Berührung bringt. Hierbei bildet sich ein fester Komplex zwischen dem Harnstoff und den normalen Paraffinen, der sodann von dem verbliebenen Kohlenwasserstoff und dem grösseren Anteil des Gemisches Wasser-Nitril in einem oder mehreren Separatoren, ,im allgemeinen Zentrifugen, vorzugsweise solchen vom Gyclontyp, abgetrennt und anschliessend cfcjrch Einwirkung von Hitze zerstört wird, wobei man die gewünschten normalen Paraffine erhält.

Es ist wesentlich, dass man am Ende der ersten Stufe die oben angegebenen Konzentrationen der η-Paraffine erreicht. Tatsächlich kann eine Charge, die weniger als 70 % an n-Paraffinen enthält, nicht gemäss vorliegender Erfindung verarbeitet werden; Insbesondere führt dann die 4. Stufe (Reifungsprozess) nicht mehr zu den gewünschten Ergebnissen, wie weiter unten im einzelnen beschrieben wird.

Je nach der Menge des mit der Ausgangs-Kohlenwasserstoff-Gharge. in Kontakt gebrachten Harnstoffs erzielt man eine mehr oder weniger fortgeführte Deparaffinierung.

Entsprechend ist auoh die Ausbeute an Proteinen im Gegensatz zu derjenigen der Verfahren des Standes der Technik maximal.

-6-909885/0237

- Blatt 6 -

Wenn man von Anfang an über eine Kohlenwasserstoffcharge ver- * fügt, deren Gehalt an η-Paraffinen oberhalb von 70 Gew.-% liegt, so kann die erste Stufe entfallen.

Die zweite Stufe, die auch Wachstumsstufe oder Fermentationsstufe genannt wird, besteht darin, dass man die Mikroorganismen, deren Wachstum oder deren Vervielfältigung gewünscht ist, mit der paraffinischen Kohlenwasserstoff charge, mit Sauerstoff und einem wässrigen Nährmilieu in Berührung bringt.

Dabei verwirklicht man einen Kontakt zwischen den drei Phasen, d.h. den Mikroorganismen, der Kohlenwasserstoffphase und der wässrigen Phase, der so eng wie möglich ist. Im allgemeinen erreicht man eine gute Durchmischung bzw. Dispersion dieser drei Elemente dadurch, dass man das den molekularen Sauerstoff enthaltende Gas in fein zerteilter Form einpresst.

Zur Durchführung dieser Stufe kann man jede Vorrichtung verwenden, die den Kontakt der genannten Phasen erleichtert, beispielsweise einen Apparat, wie er in der französischen Patentschrift 1 529 536 oder vorzugsweise in der französischen Patentanmeldung Nr. 1 77 774·* angemeldet von der Anmelderin dieser Offenbarung am 11. Dezember 1968 (französisches

Patent Nr ) beschrieben ist. Diese letztgenannte

Patentanmeldung beschreibt einen im industriellen Masstab anwendbaren Apparat, der es insbesondere gestattet, einen engen Kontakt zwischen mehreren flüssigen miteinander nicht mischbaren Phasen, ferner einer gasförmigen Phase und einer festen Phase, die beispielsweise aus Hefeteilchen besteht, zu bewirken. ^;

In dieser zweiten Stufe sind die Betriebsbedingungen vorzugsweise folgendermassen:

- Es herrscht eine !Temperatur zwischen 20 und 40⁰C und insbesondere eine solche zwischen 27 und ⁰

90 98 85/0237

- .Der pH-Wert liegt unterhalb 7 und wird vorzugsweise zwischen* 3 und 5 gehalten. Angesichts der* Tatsache, dass das Milieu im allgemeinen die Tendenz aufweist, im Verlauf des Wachstums der Mikroorganismen saurer zu werden, ist es besonders angezeigt, dass der pH-Wert stet^ auf seinem optimalen Wert gehalten wird, was beispielsweise durch periodische Einspeisungen von alkalischen Losungen, beispielsweise von Ammoniak, geschehen kann. Der progressive Abfall des pH-Werts im Verlauf der Fermentationsstufe erfolgt, wenn das wässrige Milieu verbrauchbare Ammoniumionen enthält, wie das weiter unten beschrieben wird.

- Dem wässrigen Nährmedium (Nährmilieu)'wird bzw. werden kontinuierlich der oder die Kohlenwasserstoffe, die Normal-Paraffine enthalten, sowie das Gas, das molekularen Sauerstoff enthält, eingespeist. ■

Vorzugsweise hält man den Grad des Wachstums der Mikroorganis-. men dadurch unter Kontrolle, dass man den Kohlenwasserstoff in einer Menge eingibt, die ein wenig unter derjenigen liegt, die dem optimalen Wachstum der Mikroorganismen entspricht.

Das wässrige Nährmilieu 'enthält als essentielle Bestandteile:

(1) Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff und assimilierbaren Phosphor, z.B. in Form der Ionen NH^⁺ oder PO^ , in Form von Nitraten oder Harnstoff;

(2) Spurenelemente,z.B. Verbindungen des Eisens und des Kupfers; C3) Wachstumsfaktoren vom Typ der B-Vitamine, die man beispielsweise in Gestalt von Hefeextrakten erhalten hat und

(4) mineralische Elemente, die für das Wachstum und die Vervielfältigung notwendig sind und beispielsweise in Ionenform vorliegen, wobei deren Natur vom jeweiligen zu kultivierenden Stamm der Mikroorganismen abhängt.

Im Falle des Hefestammes der Art Candida muss das Nährmilieu beispielsweise zumindest Kalium, Schwefel, beispielsweise in Form von SuIf at ionen, und Magnesium enthalten.

903885/0237 -8-

- Blatt 8 -

Im allgemeinen liegt der Gehalt an Stickstoffverbindung, bei-' spielsweise derjenige von Ammoniumsulfat, beim wässrigen Milieu zwischen 0,1 und 60 Gramm und vorzugsweise zwischen 1 und 20 g Stickstoffverbindung pro Liter, ohne dass diese Werte irgendeine Begrenzung darstellen. .

Die Gehalte an Phosphorverbindungen, beispielsweise von Kaliumphosphat liegen im allgemeinen zwischen 0,5 "und 20 g pro Liter, ohne dass diese Werte irgendeine Begrenzung bedeuten.

Vorzugsweise gibt man den Phosphor in das wässrige Nahrmilieu in Form von Ammoniumphosphat ein. Man kann jedoch ebenso auch Kaliumphosphat oder Natriumphosphat verwenden, ohne dass diese Angaben irgendeine Begrenzung bedeuten sollen.

Es ist hier festzustellen, dass zu den erfindungsgemäss verwendbaren bzw. erfindungsgemäss zu behandelnden Mikroorganismen sowohl die Hefen als auch Bakterien und auch Schimmelpilze oder deren Gemische gehören. Als nicht begrenzende Beispiele dieser drei Kategorien von Mikroorganismen seien die folgenden genannt:

a) Hefen;

Die Familie der Endomycetaceae und insbesondere die Unterfamilie der Saecharomycetoideae,zu denen die Gattungen Piehia,Hansenula Debaryomyces gehören,ferner die ühterfamilie der Lipomycetoideae und insbesondere die Gattung Liporayces.

Die Familie der Cry pt ococcaceae, insbesondere, die Ühterfamilie der Cryptococcoideae mit den Gattungen Torulopsis und Candida, die Unterfamilie Rhodotoruloideae mit der Gattung Rhodotorula.

b) Bakterien:

Die Ordnung der Pseudomonadales, insbesondere die Familie der Pseudomonadaceae mit der Gattung Pseudomonas und von dieser

90-9.885/0237 -9- .

die Arten

Pseudomonas fluorescens

Pseudomonas ovalis Pseudomonas cruciviae.

Die Ordnung der Eubacteriales mit der Familie der Achromobacteraceae "und insbesondere die Gattung Achromobacter, die Gattung Flavobacterium mit den Arten:

Plavobacterium aquatile Flavobacterium lutescens Flavobacterium marinum,

die Familie der Micrococcaceae, insbesondere die Arten Micrococcus luteus und Micrococcus flavus, die Familie der Brevibacteriaceae miirder Gattung Brevibacterium.

Die Ordnung der Actinomycetales mit den Familien Mycobacteriaceae und Actinomycetaceae.

c) Schimmelpilze;

Die Familie der Mucoraceen mit der Gattung Ehizopus.

Die Familie der Aspergillales mit den Gattungen Aspergillus und Penicillium.

Die dritte Stufe des erfindungsgemässen Verfahrens besteht in der Trennung der Mikroorganismen von dem wässrigen Nährmilieu und gegebenenfalls von der im Verlauf der zweiten Stufe nicht verbrauchten Kohlenwasserstoffphase j das Ziel dieser Operation ist die Gewinnung von Mikroorganismen, die so wenig wie möglich mit wässriger Phase und insbesondere mit Kohlenwasserstoffen vergesellschaftet sind.

Diese Trennoperation' kann auf jede an sich bekannte Art und

90988 5/0237 ~¹⁰-

- Blatt 10 -

Weise durchgeführt werden.. Ein Vorteil dieser Stufe bestellt darin, dass diese Trennung durch einfaches Abdekantieren des Kulturmilieus durchführbar ist, was bei den Verfahren des Standes der Technik nicht möglich ist.

Bei den Verfahren des Standes der Technik war man gezwungen, diese Trennoperation durch Zentrifugieren auszuführen, was eine teure Apparatur erfordert.

beim
Im Gegensatz dazu erhält man /erfindungsgemässen Verfahren zumindest zwei und gegebenenfalls drei Phasen, die im folgenden in der Reihenfolge steigender Dichten angegeben sind:

a) Eine Phase, die im wesentlichen aus Kohlenwasserstoffen besteht; diese Phase kann gegebenenfalls nicht vorhanden sein, wenn alle Kohlenwasserstoffe verbraucht wurden,

b) Eine im wesentlichen aus Wasser bestehende Phase, das die nicht verbrauchten Nährsalze enthält,

c) eine Mikroorganismen-Creme im unteren Teil des Dekantiergefässes.

Es ist auch möglich, dass man nur zwei Phasen enthält, nämlich die schwere Mikroorganismen-Creme (Hefe-Creme) c) und eine Mischphase b¹)» die aus einer Emulsion von Wasser und dem bzw. den Kohlenwasserstoffen besteht. Wenn sich zwei oder drei Phasen bilden, führt die natürliche Sedimentation zu einer deutlichen Abtrennung der Hefe-Creme vom Best des Wachstumsmilieus.

Es genügt daher, diese Mikroorganismen-Creme abzuziehen und der folgenden Verfahrensstufe zuzuführen.

Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die Sedimentation nur möglich ist, wenn die mit den Mikroorganismen im Verlauf

909885/0237 ₄ _11_

.der zweiten Stufe in Berührung gebrachte Kohlenwasserstoff charge zumindest 70 % an normalen Paraffinen enthält. Unterhalb dieses Wertes findet zwar auch ein Mikroorganismen-Wachstum statt, jedoch erhält man eine Emulsion, die Kohlenwasserstoffe enthält, die nicht dem Stoffwechsel unterliegen, die ferner Mikroorganismen und eine wässrige Phase enthält, wobei es nicht mehr möglich ist, aus der Emulsion durch einfaches Dekantieren die Inhaltsstoffe abzutrennen. Man ist daher gezwungen, zu zentrifugieren, wobei man zum Zwecke der Erleichterung der Trennung meist zusätzlich noch oberflächenaktive Agentien benutzt.

Selbstverständlich kann man, wenn dies gewünscht sein sollte, bei der Durchführung der dritten Stufe des Verfahrens eine Zentrifugierung oder eine Filtration oder auch eine Kombination dieser beiden Trennverfahren anwenden. ■

n.

Am Ende dieser dritten Stufe des erfindungsgemässen Verfahrens gewinnt man Mikroorganismen, die in ihren Wänden noch Kohlenwasserstoffe adsorbiert aufweisen. Biese adsorbierten Kohlenwasserstoffe bestehen im wesentlich^*¹ on.q dem Stoffwechsel unterliegenden Verb indungen, d.h. aus n-Paraf f inen, je nach der Eigenart der im Verlauf 'der Fermentationsstufe verwendeten Charge. .

Diese Mikroorganismen-Cieme wird im Verlauf der vierten Verfahrensstufe, der sogenannten Reifungsstufe, mit Sauerstoff und einer wässrigen Nichtnährphase, die zumindest einen Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff und zumindest einen Lieferanten für von den Mikroorganismen assimilierbaren Phosphor enthalt, in Berührung gebracht. ^f

Diese wässrige Nichtnährphase kann ferner noch weitere Elemente von der Axt enthalten, wie sie unter den Ziffern 2 bis 4- bei der Beschreibung des Nährmilieus der zweiten Stufe aufgeführt 'Bind·, ■-. ■ . '■■ ·■■■--,-,·. - .'"■■■ :. ·;;.";

$09885/0237 -12-

In jedem Fall soll die Nichtnährphase der Reifungsstufe zu- ' mindest eine Verbindungstype der Gruppe Wachstumsfaktoren, Spurenelemente und essentielle mineralische Elemente, wie beispielsweise K⁺, Mg⁺⁺, nicht enthalten. .

Es ist jeder bekannte Stickstoff-Lieferant, der löslich und von den Mikroorganismen assimilierbar ist, verwendbar. Dieser Stickstoff-Lieferant (Stickstoff-Quelle) besteht vorzugsweise aus löslichen Ammoniumsalzen, z.B. aus Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumeitrat oder Ammonium-. phosphat. Man kann auch jeden anderen Stickstoff-Lieferanten " von der Art des Harnstoffes oder von der Art der Nitrate verschiedener Metalle verwenden.

Der Gehalt der wässrigen Lösung an Stickstoff-Verbindung, z.B. an Ammoniumsulfat, entspricht im allgemeinen einem Wert zwischen 0,1 und 60 g und vorzugsweise zwischen 1 und 20 g, beispielsweise 5 K pro Liter, wobei diese Werte nicht begrenzend sind.

Es kann jeder an sich bekannte Phosphor-Lieferant verwendet werden, der löslich und von den Mikroorganismen assimilierbar ist, z.B. eine in Wasser lösliche Phosphorsäure, Vorzugsweise ) verwendet man Ammoniumphosphate und insbesondere saure Ammoniumphosphate. Man kann auch die Phosphate des Natriums, Kaliums oder Magnesiums verwenden.

Der Gehalt an Phosphor, ausgedrückt in PO^ , beträgt im allgemeinen 0,5 bis 20 g pro Liter wässriger Lösung.

Eine bevorzugte Ausführungsform dieser vierten Verfahrensstufe besteht darin, dass man einen Phosphor-Lieferanten in Form eines Gemisches von Monophosphaten und Diphosphaten verwendet.

Es ist von essentieller Bedeutung, den Unterschied der Natur des im Verlauf der zweiten und vierten Verfahrensstufe verwen-

909885/0237 -13-

deten wässrigen Milieus zu beachten.

₍ Im ersten Fall, d.h. bei der zweiten Stufe, die die Wachstums- ! und Vermehrungsphase der Mikroorganismen darstellt, handelt es sich bei dem wässrigen Milieu um ein Nährmilieu, das nicht nur einen Stickstoff-Lief eranten und einen Phosphor-Lieferanten enthält, sondern gleichfalls andere essentielle Elemente, die weiter oben im einzelnen angeführt sind.

Demgegenüber ist das Nichtnährmilieu der vierten Stufe von zumindest einem dieser anderen essentiellen Elemente der Kategorien 2 bis 4, d.h. den Spurenelementen, den Wachstumsfaktoren und den essentiellen mineralischen Elementen, entblösst.

Vorzugsweise ist das für die Reifungsstufe verwendete Nichtnährmilieu von zumindest einer der Verbindungen der vierten Kategorie entblösst, beispielsweise vom Magnesium.

Im Verlauf dieser vierten Stufe, die Reifung genannt wird, vermehren sich die Mikroorganismen nicht mehr. Sie oxydieren und transformieren zunächst die noch in den Wänden ihrer Zellen adsorbierten Kohlenwasserstoffe und transformieren sodann die Fette und andere fettähnliche Verbindungen, die entweder an den Zellen adsorbiert sind oder sich im Innern der Zellen befinden.

Die erfindungsgemässe Reifungsstufe ist also durch eine Verringerung des Fettgehaltes und allgemeiner gesagt durch eine Verringerung des extra- und intrazellulären Gehalts an fettartigen Stoffen gekennzeichnet, und zwar im allgemeinen durch ein fast vollständiges Verschwinden der Fette und gleichzeitig durch ein Anwachsen des Frozentgehaltes dieser Mikroorganismen an Eiweiss-Stoffen, wobei dieser Eiweisszuwachs nicht nur auf ". die Verringerung oder das Verschwinden der Fettkörper zurück-• zuführen ist, sondern auch zumindest teilweise auf deren Trans-

909885/0237 -14-

-Blatt 14- T924333

formation in Eiweisskörper.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass die erfindungsgemässe Reifung nur möglich ist, wenn die Mikroorganismen sowohl vom Kohlenwasserstoff-Substrat (mit Ausnahme der ursprünglich von den Zellwänden adsorbierten geringen Mengen) als auch von zumindest einer der essentiellen Komponenten der oben definierten Kategorien 2 bis 4- befreit sind.

Wenn man also zu Vergleichszwecken die Mikroorganismen in Anwesenheit von Sauerstoff mit einem vollständigen wässrigen Nährmilieu behandelt, beispielsweise mit einem solchen, das während der zweiten Verfahrensstufe angewendet wird, stellt man selbst bei Abwesenheit"eines Kohlenwasserstoff-Lieferanten eine gewisse Abnahme der adsorbierten Kohlenwasserstoffe fest, wobei man in allen Fällen keine Verringerung der internen Fette beobachtet.

Andererseits ist die Reifungsstufe gemäss vorliegender Erfindung nicht möglich, wenn die Kohlenwasserstoff-Charge, die bei der zweiten Stufe als Substrat verwendet wird, nicht den Prozentsatz an η-Paraffinen enthält, der weiter oben definiert wurde.

Wenn man also beispielsweise als Charge für die zweite Stufe eine Kohlenwasserstoff-Fraktion verwendet, die beispielsweise 15 Gew.-% an η-Paraffinen enthält, stellt man im Experiment fest, dass die erfindungsgemässe Reifungsstufe nicht mehr möglich ist, und zwar auch nicht in Anwesenheit eines wässrigen Nichtnährmediums, das zum Beispiel nur .(NH^) JPO^ enthält, wobei natürlich keine weiteren Kohlenwasserstoffe hinzugekommen sind.

In diesem Fall beobachtet man leicht eine mehr oder weniger starke Verringerung der an den Zellwänden adsorbierten Kohlenwasserstoffe; man beobachtet jedoch weder ein wirkliches An-

909885/0237

-15-

steigen des Eiweissgehaltes der Mikroorganismen noch eine merkliche Verringerung des Gehaltes der Mikroorganismen an internen Fetten. Im Gegenteil beobachtet man meist eine Zunahme des Fettgehaltes, der wahrscheinlich auf die Oxydation von an den Zellwänden adsorbierten Isoparaffinen zurückzuführen ist.

-*■

Darüberhinaus muss das wässrige Milieu im Verlauf der Reifung notwendigerweise einen Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff und einen Lieferanten für assimilierbaren Phosphor enthalten. ■ -,

Venn dies, nicht der Fall ist und wenn beispielsweise das wässrige Milieu aus reinem Wasser oder aus Wasser besteht, das nur Kaliumphosphat, also keinen Stickstoff-Lieferanten, enthält, wird nicht nur das Wachstum der Mikroorganismen, d.h. ihre Vermehrung abgestoppt, sondern es werden auch die Mechanismen der intrazellulären Umwandlung gleichfalls blockiert, wobei dann die Gehalte an Feststoffen und Eiweisstoffen der Zellen sich nicht mehr verändern.

Die Bauer des Kontakts im Reifungsgefäss zwischen den Mikroorganismenzellen, dem wässrigen Nichtnährmedium und der Luft hängt von verschiedenen Faktoren ab, insbesondere von der Temperatur, dem jeweiligen Mikroorganismenstamm usw. Nach einer allgemeinen Regel soll diese Zeitspanne zumindest 30 Minuten betragen und beispielsweise 1 bis 20 Stunden und vorzugsweise 2 bis 10 Stunden dauern.

Man sieht also die Wichtigkeit dieser Bedingungen, unter denen sich die Reifung abspielt und die zu beachten sind, wenn man die Vorteile der Erfindung wahrnehmen will. Die Beschreibung der Endstufen des Verfahrens zeigen gleichfalls die Zwischenwirkung der verschiedenen Stufen und insbesondere den Einfluss der Reifung auf diese Endstufen,

909885/0237 -16-

- Blatt 16 -

Die fünfte Stufe des Verfahrens besteht in einer !Trennung der' Mikroorganismen vom wässrigen Nichtnährmedium. Diese Trennung kann auf an sich bekannte Art und Weise durchgeführt werden, beispielsweise durch Dekantieren, Filtrieren und/oder Zentri~ *. fugieren.

Man führt sodann im Verlauf der sechsten Stufe eine oder mehrere Waschungen der Mikroorganismen mit wässrigen Salzlösungen und/ oder mit praktisch reinem Wasser durch. Man kann gegebenenfalls im Verlauf der Waschung bzw. Waschungen ein oberflächenaktives Mittel verwenden, Jedoch ist dies im allgemeinen nicht notwendig.

Eine andere Ausführungsform besteht darin, dass man die Waschung mit Wasser durch eine oder mehrere Waschungen mit einem Lösungsmittel ergänzt oder durch eine solche Waschung ersetzt. Diese letztgenannte Operation verfolgt den Zweck, die letzten Spuren an Kohlenwasserstoff und/oder Fettstoffen, die den Mikroorganismen anhingen, zu entfernen.

Wenn diese beiden Verbindungstypen im Verlauf der Reifung im wesentlichen verschwunden sind, ist im Unterschied zu den Verfahren des Standes der Technik eine solche Lösungsmittelbehandlung im allgemeinen nicht notwendig.

Wenn man dagegen wünscht, Mikroorganismen mit einem noch erhöhten Reinheitsgrad bezüglich Proteinen zu erhalten, kann man mit Vorteil diese ergänzende Behandlung mit Lösungsmittel durchführen, wobei man Jedoch nur Lösungsmittelmengen und auch einen Zeitaufwand für den Kontakt dieser Lösungsmittel mit den Mikroorganismen benötigt, der im Verhältnis zu den

i-'j

Verfahren des Standes der Technik wesentlich kürzer ist.

Man verwendet hierbei Lösungsmittel, die von der Extraktion dieses Typs von Verbindungen an sich bekannt sind, beispielsweise polare Verbindungen, wie beispielsweise Alkohole mit

909885/0237 -17- '

niederem Molekulargewicht, also Äthanol, Propanol, Isopropanoi· oder auch gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffe, wie . Hexan, Octan, Benzol, wobei man diese beiden Lösungsmitteltypen hintereinander oder auch in Form eines Gemisches in Kombination anwendet.

Man trocknet die Mikroorganismen im Verlauf der siebten und letzten Stufe. Man kann diese Stufe nach jeder an sich bekannten Art und Weise, beispielsweise durch Zerkleinern bzw. Zerstäuben (Atomisieren) durchführen. In diesem Fall wird ein Teil und zumindest die Au£,senhaut der Mikroorganismen zertrümmert.

Wenn man als Mikroorganismen Hefe eingesetzt hat, so kann diese als Produkt der siebten Verfahrensstufe vorteilhafterweise als Protein-Quelle insbesondere für tierische Nahrung dienen.

In diesem Fall vermischt man diese Proteine vorteilhafterweise mit anderen Nahrungskomponenten, zum Beispiel mit Getreide und Fettstoffen, wodurch man ein fertiges bzw. vollständiges Nahrungsmittel erhält.

Als Variante des oben beschriebenen siebenstufigen Verfahrens kann man, wenn man Mikroorganismen und insbesondere Hefe von sehr hoher Reinheit zu erhalten wünscht, die gegebenenfalls auch zur menschlichen Ernährung herangezogen werden kann, eine Ergänzungsstufe einschieben.

Diese Ergänzungsstufe, die man vorzugsweise nach der* Waschung der Mikroorganismen, d.h. nach der sechsten oben beschriebenen Stufe und im allgemeinen vor der gegebenenfalls erfolgenden Behandlung mit dem Lösungsmittel, einschieben kann, besteht 'darin, dass inän die Mikroorganismen unter solchen Bedingungen behandelt, dass ihre Zellen bzw· Zellwände zerbrechen bzw. zerplatzen. Dieses Zerbrechen bzw. Zerplatzen kann beispielsweise durch Autolyse, Hydrolyse oder Plasmolyse der Zellen bewirkt werden.

909885/02 37 -¹⁸~

. - Blatt 18 -

Die Autolyse besteht in einem Abbau der Mikroorganismen durch ·. Enzyme, die diese selbst enthalten oder die man den Mikroorganismen zusetzt. Die Autolyse findet im allgemeinen bei einer Temperatur in der Grossenordnung von 30 - 60⁰O statt.

Im Fall der Hydrolyse wird die Zersetzung bzw. der Abbau der Zellen durch die Einwirkung von Säuren oder alkalischen Basen bewirkt; die Plasmolyse besteht darin, dass man die Proteine des Oytoplasmas unter der Einwirkung eines Wechsels des osmotischen Drucks durch die Zellwände diffrsndieren lässt.

Die Autolyse, die Hydrolyse oder die Plasmolyse gestatten daher eine wesentlich stärkere und vollständigere nachgeschaltete Einwirkung der Lösungsmittel, die in der angegebenen Variante der sechsten Stufe besteht.

Der weitere Verlauf des Verfahrens, d.h. die Trocknung, ist gegenüber dem oben Gesagten nicht wesentlich verändert.

Eine andere Variante des Verfahrens besteht darin, dass man die Mikroorganismen, die am Ende der fünften Stufe anfallen, der Art einer thermischen Behandlung (Trocknung) unterwirft, dass die Zellwände zerplatzen.

Anschliessend erfolgt dann eine Lösungsmittelbehandlung, vorzugsweise mit einem oder mehreren chlorierten Lösungsmitteln, wie beispielsweise mit Chloroform, Dichloräthan, Dichlorpropan, einem Gemisch Chloroform-Methanol und eine anschliessende endgültige Trocknung.

Es ist zu betonen, dass in diesem Fall die Stufen sechs und sieben des allgemeinen Verfahrensschemas weggelassen wurden.

Die folgenden Beispiele 1 bis 3, die in keiner Weise begrenzend wirken sollen, dienen zur Erläuterung des Gegenstandes vorliegender Erfindung. Die Beispiele IA und IB sind Vergleichsbei·«-

909385/0237. "

spiele und fallen nicht in den Umfang vorliegender Erfindung. *

Beispiel 1;

Man "bringt bei einer Temperatur von 20⁰O ein Gasöl, das 11 Gew.-% an linearen päraffinischen Kohlenwasserstoffen enthält, mit einem Gemisch aus Harnstoff, Acetonitril und Wasser nach der Verfahrensvorschrift der französischen Patentschrift 1 463 784 in Berührung.

Es "bildet sich hierbei ein Komplex, und zwar vorzugsweise zwischen den linearen Paraffinen und dem Harnstoff; dieser Komplex wird von den verschiedenen Kohlenwasserstoffen in einer Reihe von Hydrocyclonen getrennt.

Der Komplex wird sodann durch Hitzeeinwirkung bei 7O°C zersetzt. Man erhält auf diese Weise eine Kohlenwassers to ff phase, die 89 Gew.-% an linearen Paraffinen enthält (die Ergänzung zu 100 % besteht im wesentlichen aus Iso-Paraffinen) und die ferner Harnstoff beinhaltet.

Diese Kohlenwasserstoff phase wird sodann in einem Fermentationsgefäss bei 30⁰C mit Candida Lipolytica, welches vorher auf Kohlenwasserstoffen kultiviert worden war, in Anwesenheit eines wässrigen Nährmediums, dessen Zusammensetzung weiter unten angegeben ist, sowie in Anwesenheit von in fein zerteilter Form eingegebener Luft, geimpft.

Die Zusammensetzung des wässrigen Nährmilieus ist im folgenden angegeben:

saures Ammoniumphosphat 2,9 g

Magnesiumsulfat 0,9 g

Kaliumchlorid 1»32 g

Hefeextrakt (Wachstumsfaktor) 0,03 g Leitungswasser (enthält Spurenelemente) 300 g destilliertes Wasser 700g .

909885/0237 ; »20-

— Blatt 20 — ι η ο / ο ο '^ '

i αz4333

Der pH-Wert des Milieus wird durch Eingabe von Ammoniak auf 4 gehalten.

Der Durchsatz an Luft wird derart eingestellt, dass sich eine Emulsion der drei Phasen (flüssige Kohlenwasserstoffphase, wässrige Phase und Gasphase) bildet, wobei ein guter Eontakt zwischen den Hefeteilchen und diesen drei Phasen festgestellt wird.

Das Fermentationsgefäss wird kontinuierlich mit einem Kohlenwasserstoff substrat, das 89 % an linearen Paraffinen enthält, mit wässrigem Nährmilieu und Luft versorgt, wobei man ebenfalls kontinuierlich einen Teil des Kulturmilieus abzieht.

Das abgezogene Produkt wird in ein Dekantiergefäss gegeben, in welches sich sehr schnell zwei Phasen bilden, nämlich

1) eine Mischphase, die Wasser und Kohlenwasserstoffe enthält,

2) eine Hefe-Creme, die sich am unteren Teil des Dekantiergefässes befindet.

Die Hefe-Creme wird in ein Reifungsgefäss gegeben (das Reifungsgefäss und das Fermentationsgefäss sind von gleicher Gestalt), in welchem es in Anwesenheit von Luft mit einem wässrigen Nichtnährmilieu in Berührung gebracht wird, dessen Zusammensetzung im folgenden angegeben ist:

saures Ammoniumphosphat 2,9 g

Kaliumchlorid 1,32g

Leitungswasser (enthält Spurenelemente) 300 g

destilliertes Wasser 700 g .

Die Temperaturbedingungen und der pH-Wert sind hierbei die gleichen wie im Fermentationsgefäss. Die eingesetzten anteiligen Mengen betragen 100 Volumteile Hefe-Creme pro 16 Volumteile wässriges Milieu,

-21-

90 338 5 /0 237

Durch mikroskopische Beobachtung der Hefezellen stellt man fest, dass zunächst ein Verbrauch der Kohlenwasserstoffe- stattfindet, die im Laufe der Fermentations stufe durch die Zellwände adsorbiert waren und sodann ein Wechsel des Aussehens des Oytoplasmas der Zellen.

Die verschiedenen Phasen wurden der chemischen Analyse unterworfen, deren Resultate in der folgenden Tabelle I angegeben sind.

Bei diesem Beispiel uxid auch bei den folgenden Beispielen wurden hierbei folgende Bestimmungsmethoden angewendet;

- Bestimmung des Stickstoffs nach der Kjeldahl-Methode

- Bestimmung der externen Fettstoffe (im wesentlichen Ester, Ketone, Fettsäuren) und der Kohlenwasserstoffe: Man wäscht

die Hefe dreimal mit η-Hexan bei 25⁰C, das sodann abgedampft wird; anschliessend wird der Verdampfungsrückstand gewogen.

- Bestimmung der Gesamtfettstoffe: Man zerstört die Zellen durch Ultraschall und führt hierauf drei hintereinanderge-

schaltete Extraktionen mit siedendem Aceton durch. Hierauf wird das Aceton abgedampft und der Verdampfungsrückstand gewogen.

Die internen Fettstoffe (im wesentlichen Lipide) errechnen sich aus der.Differenz des Gesamtfettgehaltes und des Gehalts an externen Fettstoffen.

Die folgende Tabelle I gibt die gewichtsmässige Zusammensetzung der Zellen, ausgedrückt in Prozent, in Abhängigkeit von der Zeit an. Die Ergänzung der aufgeführten Zahlen auf 100 ergibt sich durch die Pröteide, deren Stickstoff beteiligt ist, die Glucide und die mineralischen Salze.

909385/0237 -²²~

- Blatt 22 -

TABEIJjE I

Zeit in Stunden	0	1	2	A.	12
Stickstoff	6,		6	A	8,5
Externe Fettstoffe + adsorbier		5
te Kohlenwasserstoffe	0,	5	0	0
Interne Lipide	10,		10	1
Gesamtfette	11	10	1

Man sieht also anhand dieser Tabelle, dass die Zellen, die man am Ende der zweiten Reifungsstunde erhält, frei sind von externen Fettstoffen und adsorbiertem Kohlenwasserstoff; jedoch enthalten diese Zellen noch einen wesentlichen Anteil an internen Lipiden und es ist festzustellen, dass diese selbst nach dreimaligem Waschen mit Wasser und anschliessender Trocknung leicht beim Aufbewahren ranzig werden.

Im Gegensatz dazu sind die Zellen, die man am Ende von 12 Stunden erhält, praktisch frei von internen und externen Fettstoffen. Ferner ist ihr Prozentgehalt an Stickstoff infolge der Proteide angewachsen.

Nach 12-stündiger Reifung gewinnt man die Hefeteilchen durch Zentrifugieren.

Diese werden sodann dreimal mit gewöhnlichem Wasser gewaschen und sodann getrocknet; diese Hefe wird unter den üblichen Aufbewahrungsbedingungen an der Luft nicht ranzig.

Beispiel IA:

Es wird das Beispiel 1 wiederholt, wobei alle Verfahrensstufe4 und Verfahrensbedingungen gleich bleiben, mit der Abänderung,

909885/0237

-23-

- Blatt 23 -

dass diesmal bei der Reifungsstufe ein wässriges Milieu angewendet wird, das gleich ist mit dem Nährmilieu, das während der Fermentations stufe, die auch Wachstumsstufe genannt wird, zur Anwendung gelangt.

Die Analysenergebnisse der Zellen, die bei dieser Reifung erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle II zusammengefasst:

TABELLE II

Zeit in Stunden	0	2	12
Stickstoff	6,1	6,1	6,1
Externe Fettstoffe + adsorbier
te Kohlenwasserstoffe	0,5	0,2	0,1
Interne Lipide	10,5	10,5	10,5
Gesamtfette	11	10,7	10,6

Man sieht hieraus, dass eine Reifung, die in Anwesenheit des oben angegebenen Nährmediums durchgeführt wurde, es nicht gestattet, die Gesamtheit der externen Fette zu eliminieren; ferner ist diese Reifung unwirksam bezüglich des Verschwindens der internen Lipide. Es ist ferner festzustellen, dass bei dieser Reifung, die nicht vorliegender Erfindung entspricht, der Stickstoffgehalt der Hefeteilchen unverändert bleibt.

Beispiel IB;

Es wird das Beispiel 1 wiederholt, wobei man die Hefeteilchen direkt auf einem Gasöl mit einem Gehalt an linearen Paraffinen, von 11 % wachsen lässt, wobei keine vorherige Konzentration dieser Paraffine erfolgt ist.

90 9 885/023 7

-24-

Es wird festgestellt, dass das aus dem Fermentationsgefäss, , d.h. aus der Wachstumszone, entnommene Produkt aus einer Bmul~ sion besteht, aus der es nicht möglich ist, die Hefeteilchea durch einfaches Dekantieren abzutrennen» Man ist gezwungen, hierzu in Anwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels zu zentrifugieren.

Die solchermassen zentrifugierte Hefe wird in das Heifungsgefäss gegeben, wo sie mit dem wässrigen Michtnährmilieu in Berührung gebracht wird, das demjenigen des Beispiels 1 entspricht, wobei die gleichen Bedingungen eingehalten werden«

Selbst am Ende von 12 Stunden enthalten die Zellen 13,1 % an Gesamtfett» wobei 1 % in Form von externen Fettstoffen und adsorbierten Kohlenwasserstoffen vorliegt. Man musste die Hefeteilchen noch fünfmal hintereinander mit Wasser und sodäön zweimal mit einem Gemisch aus Hexan-Äthanol vor der Trocknung waschen, um ein Produkt zu erhalten, das man aufbewahren konnte, ohne ein merkliches Risiko des Ranzigwerdens einzugehen.

Beispiel 2;

Es wurde das Beispiel i wiederholt, wobei diesmal ein sogenannter "Gatsch" eingesetzt wurde, nämlich eine Hohcharge von Paraffinen, die man durch Deparaffinierung einer Schmierölfraktion erhalten hatj dieser Gatsch enthält 7.8 % an linearen Paraffinen.

Der Gatsch wird in dem Fermentationsgefäss mit dem gleichen wässrigen Nährmedium wie in Beispiel 1 beschrieben und unter den gleichen Verfahrensbedingungen in Berührung gebracht. Das aus dem Fermentätionsgefäss abgezogene Produkt trennt sich durch Sedimentation in zwei Phasen, von denen eine aus Hefe-Creme besteht, die abgezogen wird. Diese Hefe-Creme wird sodann in das Reifungsgefäss eingegeben, in dem unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet wird, doh. hier befinden sich die Hefeteilchen in Gesellschaft mit einem

9038 8 5/0 237 _₂₅_

wässrigen Nichtnährmilieu.

.Am Ende dieser Verfahrensstufe sind die Hefeteilchen praktisch frei von externen und internen Fettstoffen. Nach der Waschung in Wasser und dem Trocknen erhält man Hefe, die beim Aufbewahren nicht ranzig wird·

Beispiel 5*

Es wird das Beispiel 1 wiederholt, wobei man diesmal im Verlauf der Reifungsstufe ein wässriges Nichtnährmilieu verwendet, das folgende Zusammensetzung hat:

saures Ammoniumphosphat 2,9 g

Magnesiumsulfat 0,9 g

Hefeextrakt . 0,0$ g

Leitungswasser mit Spurenelementen 300 g

destilliertes Wasser 700 g

Alle übrigen Verfahrensbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1 beschrieben! man erhält praktisch die gleichen Resultate wie bei Beispiel 1·

-26-/Pat ent ansprüche s

909885/0237

Claims (5)

- Blatt 26 - Patentansprüche

1.) Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen-Kulturen, die für die Ernährung geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, daß man in Anwesenheit eines molekularen Sauerstoff enthaltenden Gases einen Mikroorganismenstamm mit einer flüssigen Kohlenwasserstoffcharge, die zumindest zu 70 Gew.-$ aus linearen paiaffinisehen Kohlenwasserstoffen besteht und mit einer wässrigen Nährphase in Berührung bringt, die zumindest (a) einen Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff und einen Lieferanten für assimilierbaren Phosphor, (b) Spurenelemente, (c) Wachstumsfaktoren und(d) essentielle mineralische Elemente enthält, dass man die. Mikroorganismen isoliert, die von dem grösseren Anteil an nichtverbrauchten Kohlenwasserstoffen befreit sind, die jedoch noch einen geringeren Anteil an Kohlenwasserstoffen aufweisen und dass man diese Mikroorganismen mit einer wässrigen Nichtnährphase in Berührung bringt, die zumindest die vorgenannten Komponenten (a) enthält, jedoch zumindest eine der Komponenten (b), (c) und (d) nicht enthält.

2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mit der wässrigen Nährphase in Kontakt gebrachte Kohlenwasserstoffcharge zumindest 85 Gew.-% an linearen paraffinischen Kohlenwasserstoffen enthält.

3.) Verfahren nach Ansprüchen l'oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Nichtnährphase zumindest eine, Komponente der Kategorie (d) nicht enthält.

4.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3i dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen der Gruppe der Hefen, der Schimmelpilze und der Bakterien angehören.

-27-

909 8 85/0237.

Blatt 27

)- Verfahren nach, einem der Ansprüche 1 bis 4-, dadurch ge— kennzeiclinet, dass man di© Mikroorganismen nach ihrem Kontakt mit der !Wässrigen Mchtnährphase abtrennt und zumindest eimaal mit einer Maschflüssigkeit wäscht.

) Verfahren nach Jkaspracb. 5₅ dadurch gekennzeichnet, dass die Waschflüssigkeit aus reinem Wasser, salzhaltigem Wasser, polaren Lösungsmitteln, Kohlenwasserstoff lösungs mitteln oder aus Gemischen dieser Flüssigkeiten besteht.

) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet-, dass die polaren Lösungsmittel aus Alkoholen mit niederem Molekulargewicht und die Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel aus gesättigten Kohlenwasserstoffen bestehen.

) Verfahr^en nach einem der Aasprüeh© 5 bis- 79 dadurch gekennzeichnet s dass man die. Mikroorganismen mit verschiedenen Waschflüssigkeit©!! wäscht °

5 bis 8, dadurch geeinmal gewaschenen unterwirft, bei denen

9·) Verfahren nach einem der

kennzeichnet, dass man die
Mikroorganismen solchen
die Zellwände aufplatzen

10ο) Verfahren nach Anspruch 9? dadurch gekennzeichnet, dass man. die Zerstörung bzw. das Zerreissen der Zellwände durch Hydrolyse, Autolyse oder Plasmolyse bewirkt.

ο) Verfahren nach einem der Ansprüche 5 "bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen anschliessend getrocknet werden. =

909885/0237