DE2004299C3

DE2004299C3 - Verfahren zum aeroben Züchten von Kohlenwasserstoff abbauenden Hefen

Info

Publication number: DE2004299C3
Application number: DE2004299A
Authority: DE
Inventors: Takashi Tokio Iguchi; Tooru Tokio Nakano; Isao Iruma Saitama Takeda; Katsuaki Nobeoka Tsuzuki
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1969-01-30
Filing date: 1970-01-30
Publication date: 1975-09-25
Also published as: NL7001282A; DE2004299A1; US3674640A; GB1300087A; NL161814B; DE2004299B2; NL161814C; FR2029693A1

Description

4. Verfahren nach Anspruch ί bis 3, dadurch ge- Diese Aufgabe wird cihndungsgemäß durch die kennzeichnet, daß man das verbrauchte Nähr- Verwendung besonderer Stämme von Torulopsis medium in einer Menge von 5 bis 75 Volumen- petrophilum, Candida petrophilum oder Brettanoprozent, bezogen auf das Gesamtmedium, in den 35 myces petrophiium und durch Anwendung einer d?r Emulgiertank zurückführt. Gärungsstufe vorgeschalteten Emulgierstufe gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum aeroben Zürnten von Kohlenwasserstoff abbauenden Hefen durch kontinuierliche Gärung unter 40 üblichen Bedingungen in einem üblichen Nährmedium,

das zwischen 200 und 36O°C siedende Kohlenwasserstoffe enthält, wobei ein Teil des Nährmediums in Kreislauf geführt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Hefestämme Torulopsis petrophilum 45 ATCC Nr. 20225, Candida petrophilum ATCC Nr. 20226 oder Brettanomyces petrophilum ATCC

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum aeroben Nr. 20224 einsetzt und verbrauchtes Nährmedium Züchten von Kohlenwasserstoff abbauenden Hefen. über einen Emulgiertank durch ein Nährmedium er-Das erfindungsgemäße Verfahren wird als kontinuier- setzt, das den Kohlenwasserstoff in hoher Konzenliches Gärverfahren mit dafür geeigneten Hefe- 50 tration, verbrauchtes Nährmedium und Methanol, Stämmen, die Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoff- Äthanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Pentanol, quelle verbrauchen, durchgeführt. Hexanol, Heptanol. Capryl-, Nonyl-, Decyl-, Lauryl-,

Es ist bereits bekannt, daß einige Mikroorganismen Myristyl-, Cetylalkohol oder Octadecanol in einer die Fähigkeit besitzen, Kohlenwasserstoffe als einzige Konzentration von 0.03 bis 0,5 Volumenprozent, be-Kohlenstoffquelle abzubauen. Diese Mikroorganismen 55 zogen auf das Gesamtmedium, enthält, umfassen eine große Vielfalt von Bakterien, Hefen usw. Die Erfindung basiert auf der Feststellung, daß die

So wunie in »Die Brauerei Wissenschaftliche Beilage« genannten Hefestämme sich sehr gut vermehren, wenn 1961, S. 57 bis 60 und 71 bis 75, das aerobe Züchten ein Gärmedium, das aus Kohlenwasserstoff, anorgavon Kohlenwasserstoff abbauenden Hefen und Bak- nischem Stickstoff, anorganischen Salzen und einer terien in einem Kohlenwasserstoffe enthaltenden 60 organischen Stickstoffquelle besteht und welchem das Nährmedium beschrieben. vorher verbrauchte Nährmedium sowie eine geringe

Aus der deutschen Offenlegungsschrift 1 470 507 Menge, einer der genannten Alkohole zugesetzt wird, ist ein Verfahren zum Züchten von Hefen in einem in einen Emulgiertank eingeführt wird, in welchem vorKohlenwasserstoff enthaltenden Nährmedium be- wiegend die Bildung einer Kohlenwasserstoffemulsion kannt, bei welchem die Kohlenwasserstoffe zu 3 bis 65 stattfindet und indem die Bildung des Macels in dem Gewichtsprozent aus geradkettigen Kohlenwasser- zweiten Tank, das heißt in dem Hauptgärtank, unter stoffen bestehen sollen. Verwendung der emulgierten Gärflüssigkeit durchge-

Es war jedoch bisher schwierig, den Kohlenwasser- führt wird, die aus dem ersten Tank zugeleitet wird.

MU Hilfe einer so durchgeführten, kontinuierlichen Gärung können neben dem Mycel Gärungsprodukte, VHC Aminosäuren, organische Säuren und Vitamine! durch die angegebenen Stämme mit hohc-r Wirksamkeit gebildet werden.

Die in dem ersten und zweiten Tank angewendeten Gärbedüigungen können in Abhängigkeit vom gezüchteten Stamm und den gewünschten Produkten variiert werden. So beträgt beispielsweise die Züchtungstemp^ratur 25 bis 37° C. Es ist erforderlich, die Gärung unter aeroben Bedingungen durchzuführen und den pH-Wert des Gännediums einzustellen. ZüchtungsbedinguBgen, wie Temperatur und pH-Wert, können bei den in bekannten Verfahren verwendeten Werten gehalten werden und unterliegen keiner spezifischen Begrenzung.

In vorteilhafter Weise wird beim erfindungsgemäßen Verfahren als Kohlenwasserstoff eir geradkettiger Kohlenwasserstoff verwendet.

AK günstig erwies es sich auch, wenn man in dem Emulgieitank eine Konzentration des Kohlenwasserstoffs von 5 bis 40 Volumenprozent, bezogen auf das gesamte Medium, enthält.

Von Vorteil ist es auch, wenn man das verbrauchte Nährmedium in einer Menge von 5 bis 75 Volumenprozent, bezogen auf das Gesamtmedium, in den Emulgiertank zurückführt.

Die Abtrennung der gebildeten Gärfüssigkeit kann nach den in bekannten Verfahren angewendeten Methoden durchgeführt werden und umfaßt beispielsweise die Trennimg der Gärflüssigkeit in eine schwerere und eine leichtere Flüssigkeit mit Hilfe eines Westfalia-Separators, Einstellen des pH-Wertes der schwereren Massigkeit auf etwa 5, Zugabe eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels, beispielsweise Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat in einer Menge bis zu 0,005 ml pro 100 ml der Flüssigkeit, Erwärmen des Gemisches auf 50°C und anschließendes Rühren, Abtrennen der Zellen aus der Flüssigkeit mit Hilfe eines Westfalia-Separators vom Düse">typ. Waschen der Zellen mit Wasser und Trocknen mit einem Trommeltrockner. Die Abtrennung der anderen Gärungsprodukte kann beispielsweise durchgeführt werden, indem die Gärflüssigkeit, aus der die Zellen entfernt worder sind, einer Behandlung zum Konzentrieren oder einer Behandlung mit einem lonenaustauscherharz zur fraktionierten Isolierung der Produkte unterworfen wird.

In der folgenden Beschreibung wird unter Bezugnahme auf die Zeichnung das erfindurjsgemäße Verfahren erläutert. Wie aus der Zeichnung hervorgeht, wird in dem kontinuierlichen Zweitank-Gän>ystem ein Nährmedium in dem ersten Tank vorgelegt, welches aus dem Kohlenwasserstoff in hoher Konzentration, vorzugsweise 5 bis 40 Volumenprozent, sowie anorganischen Salzen, einer Stickstoffquelle und einer organischen Nährstoffquelle besteht. Diesem System wird eine geringe Menge des Alkohols zugesetzt und dann der Kohlenwasserstoff emulgiert und das Züchtungsverfahren durchgeführt. Die Emulsion aus dem ersten Tank wird entweder kontinuierlich oder intermittierend dem zweitenTank zugeleitet, in welchem die Züchtung durchgeführt wird, indem ein aus anorganischen Salzen, einer Stickstoffquelle und einer Quelle für organische Nährstoffe bestehendes wäßriges Nährmedium, welches keinen Kohlenwasserstoff enthält, zugeführt wird., Es ist erforderlich, die Züchtung sowohl im ersten als auch im zweiten Tank unter aeroben Bedingungen vorzunehmen. In dem zweiien Tank wird in wirksamer Weise die Hauptgärung, d. h. die Bildung der Zellen oder Bildung der Gärungsprodukte durchgeführt.

Die Art der anorganischen Salze, der Stickstoff quelle und der Quelle für organische Nährstoffe, die in dem ersten und zweiten Tank verwendet werden, unterliegt keiner speziellen Einschränkung. Diese Salze können daher aus den nach dem Stand der Technik verwendeten Salzen ausgewählt we: den. So sind beispielsweise als anorganische Salze Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Ferrosulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Calciumchlorid und ähnliche Verbindungen zu erwähnen. Als Quelle für organische Nährstoffe können Pepion, N-Z-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl und dessen Hydrolysat und ähnliche Substanzen verwendet werden.

Stickstoff enthaltende Materialien wie Ammoniak.

»ο anorganische und organische Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat sowie Harnstoff können als Stickstoffquelie Verwendung finden

Des weiteren erfolgt ein Zusatz des bereits verbrauchten Nährmediums und ferner einer geringen Menge eines Alkohols, wie Äthanol und Methanol, zu dem ersten Tank. Der Zusatz des verbrauchten Nährmediums erfolgt vorzugsweise in einem Verhältnis von 5 bis T^ Volumprozent, bezogen auf das gesamte Medium Als verbrauchtes Nährmedium kann, wie in der Zeichnung gezeigt wird, die durch /entrifugalabscheidung erhaltene leichtere Flüssigkeit verwendet werden Manchmal findet das verbrauchte Nährmedium vor der Zentnfugala^scheidung oder dessen Hydrolysat Verwendung.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden dann noch die Hefestämme Torulopsis petrophilum ATCC Nr 20225, Candida petrophilum ATCC Nr. 20226 oder Brettanomyces petrophilum ATCC Nr. 20224 eingesetzt, die sich auf Grund ihrer ausgezeichneten Eigenschaften auch zur Verwendung als Nahrungsoder Futtermittel eignen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden sehr viel bessere Ergebnisse als nach den bisher bekannten Methoden erzielt, wie aus der nachfolgenden Beschreibung noch hervorgeht. Zunächst gestattet die kontinuierliche Gärung unter Verwendung eines Zwcitank-Gärsystems die Zuführung eines Ausgangsso materials, welches die Kohlenwasserstoffe in hoher Konzentration enthält. Auf diese Weise wird nur ein kleinerer Fermentationstank benötigt, in welchem die Bildung der Emulsion aus dem Kohlenwasserstoff eine geringere Zeit erfordert als bei der Zuführung des Kohlenwasserstoffs in niedriger Konzentration. Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von den bisher bekannten Verfahren dadurch, daß /usa'/lich zu dem Hauptfermentationstank ein hmulgiertank vorgesehen ist. Zweitens ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Wirkungsgrad des Kohlenwasserstoffabbaus sehr hoch. Nach dem Stand der Technik war es allgemein bekannt, daß aus Kohlenwasserstoffen, insbesondere aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen, das Hefemycel in einem Verhältnis von 1 : 1 gebildet wird. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird jedoch das Mycel in einem Verhältnis von mehr als 1 · 1 aus dem Kohlenwasserstoff erhalten, und die anderen Gärungsprodukte werden ebenfalls in

höherer Ausbeute als bei bisher bekannten Verfahren gebildet. Es ist speziell hervorzuheben, daß bisher kein Verfahren existierte, bei dem die Ausbeute der Bildung von Hefemycel, bezogen auf zugesetzten Kohlenwasserstoff, 100% überschreitet. Eine Ausbeute von mehr als 100% kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zum ersten Mal erzielt werden. Andere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind aus der Beschreibung und den Beispielen ersichtlich. Die Wirkung des Zusatzes des verbrauchten Nährmediums und geringer Mengen des Alkohols gehen aus den nachstehend beschriebenen Versuchen hervor.

Ein erster Versuch wurde unter Verwendung von Candida petrophilum ATCC Nr. 20226 durchgeführt.

Das Nährmedium in dem ersten Tank hat folgende Zusammensetzung:

Geradkeltige Paraffine mit 14 bis

Volumenprozent

17 Kohlenstoffatomen (Reinheit 98%

oder mehr) 15

Gewichtsteile pro 100 Volumenteile

^angansulfat 0,004

Magnesiumsulfat 0,05

Calciumchlorid 0,01

Harnstoff 0,3

Tabelle 1

Wirkung des verbrauchten Nährmediums auf die Emulgierung und die Mycelbildung.

IO Konzentration des verbrauchten Nährmediums

(Volumenprozent)

	Trockenes Mycel
Emulgicrdaucr	(g)
(l.Tank)	pro zugesetzten
Sdt.	Kohlenwasserstoff
	(g) 7o
5	92"
5	95
4	99
3,5	103
3	103
7	91

10
25
50
75

Gärbedingungen in dem ersten Tank: 30" C, «ο 500 Upm, Belüftung60%, Flüssigkeitsvolumen 4 Liter, Einstellung des pH-Werts auf 4,5 bis 5,0 mit Hilfe von wäßrigem Ammoniak.

Gärbedingungen in dem zweiten Tank: 30⁰C, 400 Upm, Belüftung 100%, Verweilzeit 4 Stunden. =5 In einem zweiten Versuch wurde derselbe Stamm und das gleiche Medium wie im Versuch 1 verwendet, mit der Ausnahme, daß das verbrauchte Nährmedium dem ersten Tank in einer Konzentration von 25 Volumenprozent, bezogen auf das Gesamtmedium, zugesetzt wurde und die Wirkung der Zugabe des Alkohols zu dem ersten Tank geprüft wurde. Tabelle 2 zeigt die erhaltenen Ergebnisse.

Ammoniumsulfat 0,2

Ferrosulfat 0,005

Maisqucllwasscr 0,1

4 Liter des wie oben zusammengesetzten Nährmediums mit einem pH-Wert von 4,5 werden in den ersten Tank (mit einem Fassungsvermögen von 8 Liter) £egeben und die Konzentrationen der Nährstoffquellen konstant gehalten. Bei der praktischen Durchführung werden die verbrauchten Anteile der anorganischen Salze, der Stickstoffquelle und der Quelle für organische Nährstoffe gemäß der Bestimmung der Ausbeute des geb ldeten Produkts ständig ergänzt. Bei der Verwendung Von verbrauchtem Nährmedium zur Bildung der Emulsion werden die auf die oben angegebene Zusammensetzung fehlenden Bestandteile diesem vor dem Wiedereinsatz zugesetzt. Die aerobe Kultur wird in dem zweiten Tank durchge'ü 11t. Zu diesem Zweck •werden 20 Liter des Nährmediurns in den Tank mit 40 Liter Fassungsvermögen gegeben. Diesem Tank wird eine wäßrige Lösung derselben Zusammensetzung wie oben, mit Ausnahme des Kohlenwasserstoffs, kontinuierlich zugeführt. Es wird jedoch kein Kohlenwasserstoff zugesetzt. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse einer Bestimmung der für die Fmulsionsbildung erforderlichen Zeit (Verweilzeit) in «lern ersten Tank und der Wirkungsgrad der Zcllbildung im zweiten Tank für den Fall angegeben, in welchem das verbrauchte Nährmedium in einem Verhältnis von 5 bis 75 Volumenprozent, bezogen auf das (icsamtmedium. zugesetzt wird. Durch den Zusatz des verbrauchten Nährmediums zu dem crsicn Tank im eine Verringerung der zum I mtilgicren des Kohlenwasserstoffs crforlichcn /i-it und cihc* I rhohiinc ik-r Ausheule /11 bcoh.iditen. Tabelle 2
Wirkung des Alkoholzusatzes

Konzentration des Alkohols

Alkohol

Methanol

Äthanol

Propanol

Isopropanol ....

Butanol

Pentanol

Hexanol

Heptanol

Capryla'kohol ...
Nonylalkohol ...
Dccyio'.kohol ...
Laurylalkohol ...
Myristylalkohol .
Cetylalkohol ....
Octadecanol ....
Verglcichsversuch

Volumenprozent	0,1
0,05	101
106	118
108	118
111	119
112	117
110	116
109	106
106	108
110	113
111	111
113	110
117	111
108	112
105	112
110	117
108

99

Die /ahlenwerte in der Tabelle bedeuten Gewicht der getrockneten Zellen in Gramm pro 100 Gewichtsteile des zugesetzten Kohlenwasserstoffs in Gramm.

Wie aus Tabelle 2 klar hervorgeht, hat die gleichzeitige Zugabe des verbrauchten Nährmediurns und des Alkohols eine unerwartete Wirkung.

Die Wirkung des Alkohoizusatzcs kann einer verbesserten Assimilation des Kohlenwasserstoffs durch die /dien zugeschrieben werden, ist jedoch nicht ajf cmc Assimilation des Alkohols als Kohlcnstoffquclle durch die /eilen zurückzuführen. Dies ist aus der

Tatsache verständlich, daß höhere Ausbeuten an Zellen erzielt werden, als bei der höchstmöglichen Assimilation des Alkohols durch die Zellen. Der Zusatz von Alkoholen erfolgt vorzugsweise in einer Menge von 0,03 bis 0,5 Volumprozent, bezogen auf das gesamte Medium.

Beispiel 1

Die kontinuierliche Gärung von Candida petrophilum ATCC Nr. 20226 wurde in zwei Gärtanks durchgeführt, welche ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung enthielten.

Nährmedium in dem ersten Tank:

Geradkettige Paraffine mit 14 bis 17 Kohlenstoffatomen (Reinheit 98 %

oder mehr) 20 ml

Ammoniumsulfat 0,3 g

Harnstoff 0,3 g

monobasisches Kaliumphosphat 0,1 g

dibasisches Kaiiumphosphat 0,1 g

Äthanol 0,05 g

Magnesiumsulfat 0,01 g

Ferrosulfat 0,005 g

Maisquellwasser 0,2 g

Leitungswassei 100 ml

pH-Wert 5,5

Nährmedium in dem zweiten Tank:

Ammoniumsulfat 0,3 g

monobasisches Kaliumphosphat 0,1 g

dibasisches Kaliumphosphat 0,1 g

Natriumchlorid 0,1 g

Magnesiumsulfat 0,01 g

Ferrosulfat 0,005 g

Vitamin B₁ 100 γ

Leitungswasser 100 ml

pH-Wert 4,5

Flüssigkeit wurde ein Sorbitanester einer aliphatischen Säure in einem Verhältnis von 0,005 g pro 100 ml der Gärflüssigkeit zugesetzt und das Gemisch auf 50⁰C erwärmt und anschließend separiert. Die so abgetrennten Zellen wurden mit Wasser gewaschen und in einem Trommeltrockner getrocknet. Die Ausbeute an Hefezellen (auf Trockenbasis) betrug 109 g pro 100 g des zugesetzten Kohlenwasserstoffs. Die Ausbeute bei der Isolierung der Zellen betrug 92%, so daß die Zellen als solche als Proteinquelle für Futtermittel Verwendung finden können.

Beispiel 2

Nach einem Verfahren, das mit dem in Beispiel 1 verwendeten Verfahren völlig identisch war, wurde Torulopsis petrophilum ATCC Nr. 20225 eingesetzt. Als Alkohol wurde Propanol verwendet. Propanol wurde in einer Konzentration von etwa 0,05 Volumenprozent kontinuierlich dem ersten Tank zugeführt. Die kontinuierliche Gärung wurde unter Verwendung eines Waldhof-Tanks der gleichen Kapazität wie im Beispiel 1 als zweiter Tank vorgenommen. Unter Gärbedingungen und nach einer Behandlung nach der Abtrennung der Zellen gemäß Beispiel 1 wurde das getrocknete Mycel in einer Ausbeute von 104 g pro 100 g des zugesetzten Kohlenwasserstoffs erhalten. Der Wirkungsgrad der Abtrennung der Zellen unter Verwendung eines Westfalia-Separators betrug 92%. Die so erhaltenen Zellen können als solche als Proteinquelle für Tierfuttermittel verwendet werden.

Beispiel 3

Die kontinuierliche Gärung wurde in zwei Gärtanks durchgeführt, die ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung enthielten. Als Hefe wurde Candida petrophilum ATCC Nr. 20226 verwendet.

Nährmedium in dem ersten Tank:

Das Nährmedium in dem ersten Tank enthält den Kohlenwasserstoff in einer Menge von 20 Volumenprozent, während das Nährmedium in dem zweiten Tank keinen Kohlenwasserstoff enthält. Das Nährmedium aus dem ersten Tank wurde in den zweiten Tank überführt, um die kontinuierliche Züchtung mit den angegebenen Verweilzeiten unter den nachstehend genannten Bedingungen durchzuführen. In den ersten und zweiten Tank, der ein Fassungsvermögen von t bzw. 40 Liter hatte, wurden 4 bzw. 20 Liter des ent- «prechenden Nährmediums eingeführt. Die Zellen in dem zweiten Tank wurden nach beendigter Gärung durch Zentrifugalabscheidung entfernt und die leichtere Flüssigkeit in den ersten Tank zurückgeführt, um ein Gemisch aus der leichteren Flüssigkeit und dem frischen Nähnnedium in einem Verhältnis von 4: 6 Volumenteilen für die in diesem Tank durchgeführte Gärung zu bereiten. Die Verweilzeit im ersten Tank betrug 3 Stunden und die Gärung in dem zweiten Tank wurde während einer Dauer von 4 Stunden durchgeführt. Die Gärbedingungen umfaßten in dem ersten Tank eine Temperatur von 30°C, einen pH-Wert von 5,0 bis 6,0, der mit wäßrigem Ammoniak eingestellt wurde, 400 Upm und 60% Belüftung. Der zweite Tank wurde unter folgenden Bedingungen gehalten: 33°C, pH-Wert 4,5 bis 5,0, 400 Upm, und 100% Be- δ₅ lüftung. Die so gebildete Gärflüssigkeit wurde in einem. Westfalia-Separator separiert und in eine leichtere und eine schwerere Flüssigkeit getrennt. Der schwereren

Hexadecan

Ammoniumsulfat

Harnstoff

monnbasisches Kaliumphosphat

dibasisches Kaliumphosphat

Propanol

Magnesiumphosphat

Ferrophosphat

Maisquellwasser

Leitungswasser

pH-Wert 5,5

Nährmedium in dem zweiten Tank:

Ammoniumsulfat

monobasisches Kaliumsulfat

dibasisches Kaliumphosphat

Magnesiumsulfat

Ferrosulfat

MeSasseabfall

Trimethyloctadecylammoniumchlorid

Leitungswasser

pH-Wert 5,5

20 ml
0,3 g
0,3 g
0,1g
0,1g
0,05 ml
0,01g
0,005 g
0,2 g
100 ml

0,3 g 0,1g 0,1g 0,01g 0,005 g 0,3 g 0,05 g 100 mi

Ein ähnliches Nähnnedium, wie das im Beispiel 1 verwendete, wurde mit der Hefe beimpft und in das gleiche Gefäß gegeben. Nach beendigter Gärung ha zweiten Tank wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und die leichtere Flüssigkeit in den ersten Tank geleitet, in welchem die Gärung in einem Gemisch a"s der leichteren Flüssigkeit and frischem

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Nährmedium in einem Verhältnis von 4: 6 durchgeführt wurde. Die Verweilzeit in dem ersten Tank betrug 3 Stunden, und die Gärung im zweiten Tank wurde innerhalb von S Stunden abgeschlossen. Die kontinuierliche Gärung wurde unter folgenden Bedingungen im ersten Tank: 30⁰C, pH-Wert 5,0 bis 6,0, 500 Upm und 100% Belüftung und im zweiten Tank bei 30⁰C, pH-Wert von 5,0 bis 6,0, 400 Upm und 100 % Belüftung vorgenommen. Aus der so erhaltenen Gärflüssigkeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und die Gärflüssigkeit mit Schwefelsäure angesäuert. Dann wurde der angesäuerten Gärflüssigkeit Äther in einem Verhältnis von 300 ml Äther pro 1 Liter der Flüssigkeit zugesetzt. Die Extraktion wurde zweimal wiederholt und der Äther aus dem Extrakt unter

ίο

vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde an einem kühlen Ort stehengelassen, wobei 14 g kristalline Zitronensäure aus 1 Liter Fermentationsflüssigkeit erhalten wurden.
5

Beispiel 4

Eine Kultur von Brettanomyces petrophilum ATCC Nr. 20224 wurde unter Bedingungen gezüchtet, die

ίο den Bedingungen des Beispiels 1 mit der Ausnahme glichen, daß geradkettige Paraffine mit 11 bis 15 Kohlenstoffatomen (in einer Reinheit von 98 % oder mehr) verwendet wurden. Die Hefezellen wurden in einer ausbeute von 102 g auf Trockenbasis pro 100 g des zugesetzten Kohlenwasserstoffes erhalten.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

stoff in zufriedeosteliender Ausbeute abzubauen. So wurde festgestellt, daß nur ein sehr eng begrenzter Bereich von Hefestämmen den Kohlenwasserstoff mit hoher Wirksamkeit abbaut Es war also äußerst

1. Verfahren zum aeroben Züchten von Kohlen- S schwierig, Hefezellen in zufriedenstellender Weise zu wasserstoff abbauenden Hefen durch kontinuier- erhalten und auf diese Weise wertvolle Naturprodukte, liehe Gärung unter üblichen Bedingungen in einem wie Proteine, Nucleinsäuren und Lipide, im industriellen üblichen Nährmedium, das zwischen 200 und 360⁰C Maßstab aus Erdöl herzustellen.

siedende Kohlenwasserstoffe enthält, wobei ein Um eine Verbesserung der Ausbeute im Hinblick

Teil des Nährmediums in Kreislauf geführt wird, io auf das als Nährstoff eingesetzte Phosphat zu erzielen, dadurch gekennzeichnet, daß man die ist aus der DDR-Patentschrift 64 674 ein zweistufiges Hefestämme Torulopsis petrophüum ATCC Gärungsverfahren bekannt, bei dem ein Mikroorga-Nr. 20225, Candida petraphflum ATCC Nr. 20226 nismus in einer ersten Stufe in einem aus wäßrigem oder Bretianomyces petrophilum ATCC Nr. 20224 Nähnnedium und Erdölfraktion bestehenden Gäreinsetzt und verbrauchtes Nährmedium über einen 15 medium gezüchtet wird und eine zweite Züehtungs-Eraulgiertank durch ein Nährmedium ersetzt, das stufe in einem wäßrigen Nähnnedium durchgeführt den Kohlenwasserstoff in hoher Konzentration, wird, das ganz oder teilweise aus dem wäßrigen Nährverbrauchtes Nähnnedium und Methanol, Äthanol, medium besteht, welches der ersten Stufe entnommen Propanol, Isopropanol, ButanoJ, Pentanol Hexanol, wurde.

Heptanol, Capryl-, Nonyl-, Decyl-, Lauryl-, ao Bei diesem bekannten Verfahren wird demnach die Myristyl-, Cetylalkohol oder Octadecanol in einer Gärung in zwei Phasen durchgeführt, in einer Wachs-Konzentration von 0,03 bis 0,5 Volumenprozent, tumsphase und in einer Reifungsphase, bezogen auf das Gesamtmedium, enthält Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zu-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- gründe, ein Verfahren zum aeroben Züchten von zeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff einen as Kohlenwasserstoff abbauenden Hefen zugänglich zu feradkettigen Kohlenwasserstoff verwendet machen, das ermöglicht, Hefezellen in hoher Ausbeute,

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch bezogen auf das Kohlenwasserstoff-Ausgangsmaterial, gekennzeichnet, daß man in dem Emulgiertank zu erhalten und bei dem die Hefen in einer kürzeren eine Konzentration des Kohlenwasserstoffs von Kulturdauer gezüchtet werden können, als es bisher 5 bis 40 Volumenprozent, bezogen auf das gesamte 30 möglich war. Dieses Verfahren soll kontinuier'ich im Medium, einhält. industriellen Maßstab durchgeführt werden können.