DE2408752A1

DE2408752A1 - Verfahren zur cholesteringewinnung

Info

Publication number: DE2408752A1
Application number: DE19742408752
Authority: DE
Inventors: Frank Dr Hill; Carl Krauch; Rudolf Dr Lehmann; Hans F Dipl Chem Dr Pfeiffer; Joachim Dr Schindler
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 1974-02-23
Filing date: 1974-02-23
Publication date: 1975-09-11
Also published as: JPS5830039B2; CH603688A5; GB1455231A; US3919045A; DE2408752C2; JPS50123880A; FR2262111A1; FR2262111B1

Description

Henkel &Cie GmbH

Düsseldorf, den ^l. 2. 197·! Patentabteilung

Henkelstraße 67

Patentanmeldung

D 4889-"Verfahren zur Cholesteringewinnung"

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Gewinnung bzw. Anreicherung von Cholesterin oder Cholesterinestern aus Rückständen der Fettverarbeitung.

In der fettverarbeitenden Industrie fallen bei. der- Spaltung von Fetten und der anschließenden Fettsäuredestillation jährlich große Mengen bisher meist ungenutzter Rückstände an. Diese Rückstände, insbesondere soweit sie tierischen Ursprungs sind, enthalten beträchtliche Mengen an Cholesterin und Cholesterinestern. Wegen des ständig steigenden Bedarfs an Cholesterin für pharmazeutische Zwecke erscheint eine Gewinnung dieser Sterine aus den Rückständen der Fettverarbeitung durchaus lohnend.

Es ist bekannt, daß eine Reihe von Mikroorganismen Fette und Fettsäuren abzubauen vermögen. Es hat sich aber gezeigt, daß dieser Abbau in vielen Fällen nicht mit der für den praktischen Einsatz erforderlichen Geschwindigkeit erfolgt, bzw. daß ein Teil der Mikroorganismen durch die in den Rückständen im erheblichen Umfange vorhandenen Brenz- und Teerbestandteile oder sonstigen Oxidations- und Zersetzungsprodukte in ihrem Wachstum gehemmt werden.

- 2

50 9837/0723

Blatt 2 zur Patentanmeldung D 4809 Patentabteilung

Ziel der Erfindung ist es, geeignete Mikroorganismen-Stämme aufzufinden bzw. Kulturverfahren zu entwickeln, die die Gewinnung bzw. Anreicherung von Cholesterin und Cholesterinestem aus den bei der Aufarbeitung und Fraktionierung von Fetten anfallenden Rückständen ermöglichen. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von Cholesterin und Cholesterinestem aus den Rückständen der Fettverarbeitung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rückstände in emulgierter Form in einem wäßrigen Kulturmedium mit einem Mikroorganismus der Spezies Nocardia paraffinica, Nocardia salmonicolor, Nocardia opaca, Candida lipolytica, Corynebacterium petrophilum bei einer Temperatur von 25 bis 55°C, vorzugsweise 27 bis 39 C und einem pH-Wert von 4.0 bis 8.0, vorzugsweise 5.0 bis 7.0 abbaut und anschließend die angereicherten Sterine durch Lösungsmittelextraktion aus der Kulturlösung abtrennt.

Die genannten Mikroorganismen zeichnen sich durch besondere Unempfindlichkeit gegenüber den in den Rückständen enthaltenen teerigen Bestandteilen und sonstigen Oxidationsund Zersetzungsprodukten aus und besitzen darüber hinaus eine hohe biologische Aktivität gegenüber den abzubauenden Rückständen.

Der mikrobielle Abbau erfolgt in einem wäßrigen Nährmedium, das als Kohlenstoffquelle entweder nur den abzubauenden Rückstand oder aber noch eine zusätzliche metabolisierbare Kohlenstoffverbindung sowie ferner die üblicherweise von den Mikroorganismen benötigten Nähr- und Wuchsstoffe enthält,

509837/0723

.Blatt 3 zur Patentanmeldung D 4 8β9 Patentabteilung

Für das Verfahren werden vorwiegend Rückstände aus der Verarbeitung von Fetten tierischen Ursprungs, insbesondere Rückstände aus der Fettsäuredestillation eingesetzt. Diese bestehen im wesentlichen aus Fettsäuren, Fettsäuremono- und -diglyzeriden, Polymer-, Oxydations- und Brenzprodukten von Fetten und Fettsäuren und teerigen Bestandteilen. Zur Stimulierung des Wachstums kann es sich empfehlen, eine zusätzliche metabolisierbare Kohlenstoffquelle anzubieten, wie z. B. Paraffine, Glycerin, niedere Carbonsäuren, Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Glukose, Fruktose, Maltose und zuckerhaltige Abfallstoffe. Geeignete Stickstoff quellen bzw. Wuchsstoffe sind Ammoniumsalze, Nitrate, Harnstoff, Peptone, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl bzw. -kuchen, Schlempe und Fischmehl. Weiterhin werden dem Nährmedium zweckmäßig anorganische Salze wie Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydrogenphosphat, Calcium-, Magnesium-, Mangan- und Eisensalze sowie Fermentationsbeschleuniger, z. B. Hefeextrakt, Fleischextrakt und Vitamine zugesetzt.

Die abzubauenden Rückstände werden dem Nährmedium in emulgierter Form in Konzentration von 1 bis 20 Gewichtsprozent, insbesondere 2 bis 10 Gewichtsprozent zugesetzt. Falls der Rückstand als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wird, wird dieser bereits zu Beginn des Kulturverfahrens angeboten und während des Wachstums gegebenenfalls kontinuierlich weiter zugeführt. Man kann auch so vorgehen, daß man die Kulturen zunächst mit herkömmlichen, z. B. zuckerartigen Stoffen oder anderen Kohlenstoffquellen zu möglichst hohen Zelldichten heranzüchtet und erst danach den abzubauenden Rückstand einsetzt, wobei die Konzentrationen höher liegen können.

509837/0723

Blatt H zur Patentanmeldung D Jj 8 89 Patentabteilung

Die Emulgierung des Fettes in der Kulturlösung erfolgt mittels bekannter Emulgatoren. Insbesondere werden nichtionogene Emulgatoren, wie z. B. Fettsäuresorbitanester und deren Äthylenoxidaddükte mit 20 bis 200 Mol, vorzugsweise 20 bis 80 Mol Äthylenoxid verwendet.

Vor Beginn des Anzüchtens wird das verwendete Kulturmedium zweckmäßig durch Erhitzen sterilisiert. Die Inkubationstemperatur beträgt 25 bis 55°C, vorzugsweise 27 bis 39 C. Der pH-Wert der Nährlösungen liegt bei pH 4,0 bis 8,0, vorzugsweise 5*0 bis 7_s0. Das Kulturverfahren wird vornehmlich unter aeroben Bedingungen durch Schütteln oder Rühren und Belüften durchgeführt und erfordert im allgemeinen einen Zeitraum von 1 bis 5 Tagen.

Nachdem der mikrobielle Abbau der Rückstände beendet ist, wird die gesamte Kulturlösung mit einem lipophilen Lösungsmittel extrahiert, ohne die Zellen vorher abzutrennen. Die Extraktion wird vorzugsweise im Kulturgefäß durchgeführt. Als Extraktionsmittel eignen sich beispielsweise Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Cyclohexan oder Benzingemische, Alkohole, wie'Butanol oder Hexanol, Ketone, wie Methylisobutylketon, Äther, wie Diäthyläther, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform oder andere übliche Lösungsmittel.

Nach dem Entfernen des Lösungsmittels verbleibt ein mit Cholesterin bzw. Cholesterinestern angereicherter Rückstand. Dieser Rückstand kann entweder als solcher weiter verarbeitet oder zur Gewinnung der reinen Sterine, beispielsweise durch Umkristallisation oder Chromatographie aufgearbeitet werden.

509837/0723

Blatt 5 zur Patentanmeldung D 4889 Patentabteilung

Beispiele
Beispiel 1

Nocardia paraffinice ATCC 21198 wird 2*1 Std. bei 3O°C unter Schütteln in einem Kulturmedium vorgezüchtet, das 1.56 % Spezialpepton, 0.28 % Hefeextrakt, Q.56 % NaCl und 0.1 % D(+)-Glukose enthält und einen pH-Wert von 6.8 aufweist. 10 ml dieser Impfkultur werden anschließend in 100 ml Hauptkultur eingeimpft und im 500 ml -Erlenmeyerkolben auf der Schüttelmaschine bei 30⁰C inkubiert. Die Zusammensetzung des Nährmediums der Hauptkultur ist wie folgt:

O₁₁.2 H₂O 0.05 %> K₂HPO₂₁ 0.18 %, NH₄NO₇ O.O6 %, .7 H₂O 0.06 JS, MnCl₂.1 H₃O 0.02 %, PeSO₄.7 H₃O 0.01 %, CaCl₂.2 H₂O 0.01 JS, Maisquellwasser 0.50 JS, Sojamehl 0.50 JS, Tween 80 0.05 %» Pettsäuredestillationsrückstände 2 %. Der pH-Wert der Nährlösung beträgt 6.5· Die Kulturen werden nach 72 Stunden Bebrütung geerntet. Die gesamte Kultur wird mit Chloroform extrahiert. Nach Abdestillation des ' Lösungsmittels verbleibt ein schwach gelblicher Rückstand, der zu 80 - 95 % aus Cholesterinester besteht.

Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn man den Abbau mit den Spezies Nocardia salmonicolor ATCC 19149 oder Nocardia opaca OSM. 363 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Inst. f. Mikrobiologie, Göttingen) oder Candida lipolytica DSM durchführt.

509837/0723

Blatt 6 HurPatentanmelAingD 1j839 Patentabteilung

Beispiel 2

Corynebacterium petrophilum ATCC 19080 wird in der gleichen Weise wie unter Beispiel 1 als Impfkultur·herangezüchtet und anschließend die angeimpfte Hauptkultur bei 37°C auf der Schüttelmaschine inkubiert. Die Zusammensetzung des Hauptmediums ist wie folgt:

NaH₂PO₄.2 H₂O 0.05 %, K₂HPO₄ 0.18 %, NH₄NO₃ 0.06 %, MgSO₄. 7 H₂O 0.06 %_s MnCl₂.4 H₃O 0.02 %, FeSO₄.? H₃O 0.01 %, CaCl₂.2 H₂O o.01 %, Maisquellwasser 0.80 %, Sojamehl 0.50 %_s Stärke (mit Amylase abgebaut) 1.00 %_s Fettsäuredestillationsrückstände 0.50 %, Tween 80 0.07 %. Der pH-Wert der Nährlösung beträgt 6.5. Nach 36 Stunden Bebrütung werden 10 % Fettsäuredestillationsrückstände zugegeben und die Kultur nach weiteren HS Std. Bebrütung geerntet.

Die Gesamtkultur wird mit Methylisobutylketon extrahiert. Nach Trocknen und Abdestillation des Lösungsmittels verbleibt ein nur schwach gefärbter Rückstand, der zu 50 - 70 % aus Cholesterin besteht.

SQ9837/0723

Claims

Blatt 7 zur Patentanmeldung Γ i|Ö89 Patentabteilung Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von Cholesterin und Cholesterinestern aus den Rückständen der Fettverarbeitimg, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rückstände in emulgierter Form in einem wäßrigen Kulturmedium mit einem Mikroorganismus der Spezies Nocardia paraffinica, Noeardia salmonicolor, Nocardia opaca, Candida lipolytica, Corynebacterium petrophilum bei einer Temperatur von 25 bis 55 C, vorzugsweise 27 bis 39⁰C und einem pH-Wert von 4.0 bis 8.0, vorzugsweise 5.0 bis 7.0 abbaut und anschließend die angereicherten Sterine durch Lösungsmittelextraktion aus der Kulturlösung abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rückstände als einzige Kohlenstoffquelle in dem Kulturmedium verwendet.

3. Verfahren.nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als zusätzliche Kohlenstoffquelle Paraffin, Glycerin, niedere Carbonsäuren, Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Glucose, Fructose, Maltose oder zuckerhaltige Abfallstoffe verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3_} dadurch gekennzeichnet, daß man das Kulturverfahren unter aeroben Bedingungen durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Emulgatoren zur Emulgierung der Fettrückstände Fettsäuresorbitanester oder deren Äthylenoxidaddukte

5Θ9837/.0 723

Henkel &Cie GmbH

Blatt 8 zur Patentanmeldung D 4 8 8 9 Patentabteilung

mit 20 bis 200, vorzugsweise 20 bis 80 Mol Äthylenoxid verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man das Kulturmedium nach Beendigung des mikrobiellen Abbaues mit einem organischen Lösungsmittel aus der Gruppe Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Ketone, Äther und chlorierte Kohlenwasserstoffe extrahiert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion mit Benzin, Chloroform oder Methylisobutylketon durchführt.

509837/0723