DE2757877B2

DE2757877B2 - Herstellung von Biomassen

Info

Publication number: DE2757877B2
Application number: DE2757877A
Authority: DE
Inventors: Paolo Branduzzi; Lamberto Monterotondo Rom Formiconi; Antonio Senni; Pasquale Mentana Rom Zaffaroni
Original assignee: SnamProgetti SpA
Current assignee: Anic SpA
Priority date: 1976-12-23
Filing date: 1977-12-23
Publication date: 1979-05-23
Also published as: NO146207C; NO774441L; AU517658B2; FR2375322B1; SE7714710L; NO146207B; DE2757877C3; DK143765B; FR2375322A1; LU78772A1; HU178342B; JPS5379089A; SU759055A3; CH631054A5; AU3134677A; BE862291A; CA1106786A; DD137120A5; ZA777212B; CS214802B2

Description

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Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch angegebene Verfahren.

Für die Herstellung von Biomassen werden seit langem Abfall-Kohlenhydrate, wie Melassen aus Zukkerraffinerien oder Sulfitablaugen aus der Zellstoff-Gewinnung, verwendet In jüngerer Zeit wurden wegen der leichten Verfügbarkeit und des günstigen Preises von Erdöl auch Herstellungsverfahren für Biomassen entwickelt, bei denen als Substrate entweder Rohölfraktionen oder hochgereinigte Gemische von normalen Paraffinen eingesetzt werden. Bei der Verwendung derartiger Substrate auf Erdölbasis treten aber technologische Schwierigkeiten bzw. Nachteile auf, die auf der jo Unlöslichkeit der Erdölprodukte in Wasser, der für die Assimilation durch die Mikroorganismen benötigten großen Sauerstoffmenge und der großen Wärmeentwicklung während der Fermentation beruhen. Außerdem werden die laufenden Herstellungskosten von η Biomassen noch dadurch erhöht daß das Substrat gründlich gereinigt und/oder die produzierte Biomasse sorgfältig gewaschen werden muß, um potentiell schädliche Erdölkomponenten zu entfernen.

Diese Schwierigkeiten treten nicht auf, wenn als Substrat bei der Erzeugung von Biomassen niedere Alkohole, wie Methanol oder Äthanol, eingesetzt werden, die mit Wasser beliebig mischbar und leicht flüchtig sind und sehr rein zur Verfügung stehen. Es gibt daher keine Mischprobleme wie bei den Erdölfraktionen; außerdem wird, da diese niederen Alkohole bereits Sauerstoff in ihrem Molekül enthalten, der Sauerstoffbedarf für ihre Assimilation entsprechend reduziert: Hieraus ergibt sich als weiterer Vorteil, daß die Erzeugung der Biomasse von einer geringeren Warmeentwicklung begleitet ist, so daß die Kosten für die notwendige Kühlung entsprechend gesenkt werden können.

Äthanol wird von zahlreichen Mikroorganismen genutzt und wäre das ideale Substrat für die Herstellung v, von Biomassen, ist aber vergleichsweise teuer. Methanol hingegen kann billig und mit hohem Reinheitsgrad hergestellt werden. Diese Tatsache erklärt die Bemühungen, die darauf verwendet wurden, Mikroorganismen aufzufinden, die in der Lage sind, Methanol m> wirksam auszunutzen. In der technischen sowie Patentliteratur werden zahlreiche Mikroorganismen genannt, die diese Forderung erfüllen, aber die bisher beschriebene Wirksamkeit von Hefen ist ziemlich gering. <>< >

In der GBPS I4J5 865 werden verschiedene Bakterien und Hefen, darunter Candida alcomigas als Methanol verbrauchende Mikroorganismen beschrieben. Allerdings muß bei diesen Verfahren entweder durchgehend bei einer Methanolkonzentration unter 0,02% oder mehrstufig in mehreren Tanks und in der Endstufe bei einer Endkonzentration an Methanol unter 0,02% gearbeitet werden, damit nicht Formaldehyd entsteht die die erzeugte Zellmasse für menschliche oder tierische Ernährung ungeeignet macht Für die großtechnische Erzeugung von Biomassen ist dieses Verfahren nicht wirtschaftlich genug. Erfindungsgemäß wurde nun ein neuer Hefestamm, Candida NRRL-Y 11062, aufgefunden, der in sehr wirtschaftlicher Weise die Herstellung von Biomassen, ausgehend von Methanol als einziger Quelle für Kohlenstoff und Energie ermöglicht

Aufgrund der hohen Geschwindigkeit der Reproduktion dieses Hefestammes und seines Proteingehaltes kann mit seiner Hilfe außerordentlich schnell Protein erzeugt werden.

Gegenstand der Erfindung ist das im Patentanspruch näher bezeichnete Verfahren zur Herstellung von Biomassen unter Verwendung des neuen Hefestarnmes NRRL-Y 11062.

Der Stamm Candida NRRL-Y 11062 wird durch multipolare Keimung oder Sprossing reproduziert und bildet einzelne eiförmige Zellen oder Büschel, die aus einer Anzahl von länglichen Zellen bestehen (Pseudomycelium).

In einem flüssigen Nährmedium bildet der Stamm ein Sediment, auf festem Nährboden hingegen entweder glatte und glänzende Kolonien oder opake und faltige bzw. runzelige Kolonien. Durch Nachzüchten des Stammes auf einem festen Nährboden nimmt der Stamm mehr und mehr ein glattes und glänzendes Aussehen an, das in einem flüssigen Medium den einzelnen Zellen entspricht, während beim Züchten des Stammes in einem flüssigen Nährmedium unter bestimmten Bedingungen die psuedomycelare Form überwiegt, die den runzeligen und opaken Zeilen entspricht. Keinerlei Sporen irgendeiner Art wurden bisher beobachtet. Auf der Basis dieser morphologischen Eigenschaften wird angenommen, daß der Stamm zur Gattung Candida gehört, entsprechend der Klassifizierung von J. Lodder, Herausgeber: »The Yeasts, a taxonomic Study« 1970.

Die physiologischen Merkmale des Stammes Candida NRRL-Y 11062 sind folgende:

1. Fermentative Nutzung einigerC-Quellen

D-Glucose +

D-Galactose - Saccharose -

Maltose -

Trehalosu —

Lactose -

2. Wuchs

D-Glucose +

D-Galactose -

I -Sorbose -

Saccharose —
Maltose

Cellobiose +

Trehalose -

Lactose -

Melibiose -

Raffinose -

Melecitose -

Inulin -

Stärke

D-Xylose +

1-Arabinose +

D-Arabinose - D-Ribose + (schwach)

1-Rhamnose —

Äthanol +

Glycerin -

Erythrit -

Ribhol +

Galacticol

(vgl. Merck-Index, 8. Auflage) —

D-Mannit +

D-Glucitol +

Milchsäure — Bernsteinsäure — Citronensäure —

Inosit —

Nitrat -

kein Vitamin —

bei 37° C +(schwach)

Der Vergleich der physiologischen Eigenschaften des Stammes Candida NRRL-Y 11062 mit den Eigenschaften, wie sie in der Untersuchung von L ο d d e r a.a.O. und in dem Buch »A new Key to the Yeasts« von ]. A. Barrett und R. J. Pan k hurst, 1974, angegeben sind, zeigt, daß der Stamm Candida NRRL-Y 11062 sich von allen in diesen Druckschriften beschriebenen Hefearien unterscheidet

In der technischen sowie in der Patentliteratur sind bisher zahlreiche Hefen beschrieben worden, die in der Lage sind. Methanol nutzbar zu /lachen (vgl. C. L C ο ο η e y und D. W. L e ν i π e in »Single-Cell Protein II« — MIT Press, 1975), aber die I genschaften des Stammes Candida NRRL-Y 11062 unterscheiden sich von den Eigenschaften aller anderen bisher bekannt gewordenen Stämme.

Ein Merkmal sui generis des Stammes Candida NRRL-Y 11062 ist seine Fähigkeit, Methanol wirksamer zu assimilieren als Äthanol. Der Stamm kann sowohl in diskontinuierlichen wie in kontinuierlichen Kulturen gezüchtet werden, seine Eigenschaften werden aber in kontinuierlichen Kulturen besser ausgenützt.

Weiterhin kann aufgrund der Fähigkeit, ein Pseudomycelium zu bilden, eine Kultur erhalten werden, die sich sehr leicht absetzt; dieses Merkmal oder diese Eigenschaft kann bei der Ausführung der kontinuierlichen Kultur mit partieller Rückspeisung der Biomasse genutzt werden, eine Tatsache, die einen höheren stündlichen Ausstoß ermöglicht. Das leichte Absetzen erleichtert darüberhiriaus das Sammeln oder Isolieren der Biomasse.

In der Praxis besteht das Verfahren darin, daß man mit dem Stamm Candida NRRL-Y 11062 ein Kulturmedium bzw. einen Nährboden beimpft, der die wesentlichen Elemente (N, P, K, Mg, Fe, Ca), die Wuchsfaktoren (Hefeextrakte und Biotin), mineralische Spurenelemente sowie Methanol als Quelle für Kohlenstoff und Energie enthält. Der Nährboden wird unter Rühren bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 35°C, am besten 30 bis 33°C, und bei einem pH von 23 bis 6,5, am günstigsten 4 bis 4,5, inkubiert, wobei kontinuierlich mit einem sauerstoffhalligen Gasgemisch, beispielsweise Luft, belüftet wird.

Die Hefezellen, die sich zu Lasten der zur Verfügung gestellten Nährstoffe vermehren, werden mittels Sedimentation und Filtration gesammelt, mit Wasser

gewaschen und unter Erwärmen getrocknet. Die erhaltene Biomasse kann unmittelbar als solche als Protein-Integrator für Nahrungsmittel und Tierfutter verwendet werden, oder es können wertvolle Stoffe daraus extrahiert werden, beispielsweise Proteine, Aminosäuren und Nucleinsäuren.

Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung:

Beispiel I

Es wurden 500 ml Erlenmeyer-Kolben bereitgestellt, die jeweils 50 ml des folgenden Nährbodens enthielten:

KH₂PO₄	2.0 g/l
NaH₂PO₄ · H₂O	2,0 g/l
(NH₄J₂SO₄	5,0 g/l
FeSO₄ · 7 H₂O	2,0 mg/1
CaCI₂	2,0 mg/1
ZnSO₄ · 7 H₂O	2,0 mg/I
Hefe-Extrakt	200,0 mg/1
Biotin	25,0 μg/I
Spurenelemente (Lösung)	ί ml/1

Die Lösung der Spurenelemente, hergestellt in verdünnter HCI (1 m! konz. HCl in 1 I Wasser) hatte folgende Zusammensetzung:

CuSO₄	-5H₂O	200 mg/1
HjBO₃		500 mg/1
MnSO₄	■ H₂O	500 mg/I
KI		10 mg/1
CoCI₂ ·	6H₂O	10 mg/1
MoO₃		10 mg/1

Der pH-Wert des Nährbodens wurde auf 5,0 gebracht, die Kolben wurden dann 20 Minuten bei 116°C sterilisiert. Zu 2 Kolben wurden jeweils 0,75 ml (1,9 VoIumen-%, bezogen auf das Volumen) Methanol gegeben und die Kolben dann mit dem Stamm Candida NRRL-Y 11062 in Schrägkultur beimpft. Die Kolben wurden 72 Stunden auf einer rotierenden Rührvorrichtung inkubiert (220 UpM, Durchmesser der Verschiebung 33 cm), wobei die Temperatur von 32,5°C thermostatisch gesteuert bzw. überwacht wurde.

Andere Kolben, die den gleichen Nährboden mit Zusatz von I Vol.-% Methanol, 2 Vol.-% Äthanol und 2% GewVVol. Glucose enthielten, wurden mit jeweils 5 ml der obigen Vorkultur beimpft. Nach 24stündiger Inkubation wurden zu jedem Kolben weitere I Vol.-% Methanol gegeben. Nach insgesamt 28stündiger Inkubation wurde der Inhalt an Biomasse der einzelnen Kolben gemessen und folgende Ergebnisse erhalten:

Substrat Optische Dichte Trockene Biomasse

(I : 10) bei 660 nm Proteine

g/l %

Glucose

Methanol

Äthanol

0,340
0,270
0,095

3,99	54,5
3,68	51,0
1,18	54,1

Der Proteingehalt war mit Hilfe der ßiurct-Methode bcslimmt worden,

Beispiel 2

Ein Fermenter mit Nutzvolumen etwa 8 I, der den Nährboden gemäß Beispiel I enthielt, wurde mit einer Suspension des Stammes Candida NRRL-Y 11062 beimpft. Die Temperatur des Fermenters wurde

thermostatisch bei 32,5°C gehalten; außerdem wurde Methanol zugegeben, um sicherzustellen, daß die Restkonzentration in der Bouillon zu keinem Zeitpunkt ! Vol.-% überstieg. Nachdem die Kultur zufriedenstellend gewachsen war, wurde mit der kontinuierlichen Zuspeisung des sterilen Nährbodens in den Fermenter begonnen; der sterile Nährboden enthielt 29,6 g/l Methanol; gleichzeitig wurde eine Menge Nährboden-Kultur abgezogen, die gleich war der zugesetzten Menge Nährboden. Die Einspeisuhgsmenge und Abzugsmenge wurden zunehmend erhöht, bis eine Verdünnungsgeschwindigkeit (D = Strömungsgeschwindigkeit bei der Einspeisung zu Volumen der Kultur) von 0,166 h-' erreicht worden war. Unter diesen

Bedingungen enthielt der abgezogene Strom 10,28 g/l trockene Biomasse sowie 146 ppm Rest-Methanol, mit einer Ausbeute von 35% und einer stündlichen Erzeugung von 1,72 g/l Biomasse. Die so erhaltene Biomasse enthielt 55,6% Proteine (Biuret-Test).

Beispiel 3

Ein Fermenter, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde mit einem Absetztank für den abgezogenen Strom verbunden, ein Teil des Nährboden-Kultur-Gemisches, angereichert mit Biomasse, wurde regelmäßig in den Fermenter zurückgespeist. Durch Zugabe von frischem Nährboden zu dem Fermenter, der 24 g Methanol/l enthielt, mit einer solchen Strömungsgeschwindigkeit, daß eine Vcrdünnungsgcschwindigkeit von 0,267 h~' erreicht wurde, erzielte man in dem nicht zurückgeführten Teil, der aus dem Absetztank abgezogen wurde, eine Nährboden-Kultur, die 7,80 g/l Biomasse und 120 ppm

Restmethanol enthielt, mit eine:· Ausbeute von 323% und einem stündlichen Ausstoß von 2,08 g/l. Die auf diese Weise erhaltene Biomasse enthielt 53,0% Proteine (Biuret-Test).

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Biomassen mit hohem Proteingehalt durch Züchten eines Stammes der Gattung Candida bei einer Temperatur im Bereich von 20—35°C und einem pH-Wert von 2,5—6,5 auf einem Nährboden, der aus einer Salzlösung besteht, welche als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle Methanol enthält, und Isolieren der erhaltenen Hefezellen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefestamm Candida NRRL-Y'.1062 einsetzt

ίο