CS214802B2 - Method of making the biomass of high contents of proteins - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby mikrobiální biomasy o vysokém obsahu bílkovin kultivací kmene kvasinky rodu Candida, který je schopen využívat methanolu jako jediného zdroje uhlíku a energie.

V důsledku vysoké reprodukční rychlosti mikroorganismů i jejich obsahů bílkovin představuje tvorba mikrobiálních biomas velmi rychlý způsob výroby bílkovin.

Pro výrobu biomas byly dosud používány odpadní cukry, například melasy z cukrovarů nebo odpadní sulfitové louhy z papíren.

V poslední době byly na základě značné dostupnosti a nízké ceny ropy adaptovány způsoby výroby biomasy používající jako substrát buď surové frakce ropy, nebo vysoce čištěné směsi normálních parafinů.

Použití takových substrátů založených na ropě má z technologického hlediska několik nedostatků, které jsou způsobeny jejich nerozpustností ve vodě, značným množstvím kyslíku, který potřebují mikroorganismy к asimilaci a značným množstvím tepla, které se tvoří během fermentace. Běžné náklady při výrobě biomasy jsou kromě toho zvyšovány hutností dokonalého čištění substrátu nebo/a pečlivým promýváním vznikající biomasy, aby se odstranily potenciálně nebezpečné složky ropy.

К takovým potížím nedochází, jestliže se výroba biomasy provádí za použití nižších alkoholů, například methanolu nebo ethanolu jako substrátů. V důsledku jejich dokonalé rozpustnosti ve vodě, těkavosti i skutečnosti, že jsou dostupné ve vysoké čistotě, je možné získávat biomasu, která je prostá nežádoucích zbytků. Mísitelností s vodou jsou odstraněny problémy s míšením, se kterými se setkáváme u frakcí ropy, zatímco skutečnost, že v jejich molekulách je již obsažen kyslík, snižuje potřebu kyslíku na jejich asimilaci: z této skutečnosti pramení další výhoda, totiž, že tvorba biomasy je provázena sníženým vývojem tepla, čehož důsledkem je snížení nákladů na chlazení.

Ethanol je využíván velkým množstvím mikroorganismů a měl by být ideálním substrátem pro výrobu biomas, avšak jeho cena je poměrně vysoká. Methanol naopak lze vyrábět levně a ve vysokém stupni čistoty. Tato skutečnost se stala podkladem pro úsilí, které bylo vynaloženo na nalezení mikroorganismů, které jsou schopny účinně využívat methanol. Z technické a patentové literatury je známo, že těmto požadavkům sice vyhovují četné bakterie, zatímco účinnost dosud popsaných kvasinek je spíše nízká.

Obohacením kultivačního média a izolací získaných kvasinkových buněk při kontinuální kultivaci se podle vynálezu podařilo izolovat nový výhodný kmen kvasinky (NRRL Y-11062), který je schopen využívat methanol jako jediný zdroj uhlíku a energie.

Podstata zdokonaleného způsobu výroby biomasy o vysokém obsahu bílkovin kultivací kvasinkového kmene rodu Candida, kte rý se provádí při teplotě v rozsahu 20 až 35 °G a při pH o hodnotě 2,5 až 6,5 na živné půdě, která sestává z roztoku solí a která jako jediný zdroj uhlíku a energie obsahuje methanol, a izolací získaných kvasinkových buněk, spočívá podle přítomného vynálezu v tom, že se jako kvasinkového kmene používá kmene Candida NRRL Y-11062.

Uvedený nový kmen je uložen ve veřejné sbírce kultur mikroorganismů NRRL (Northern Regional Research Laboratory v městě Peoria, Illinods, Spoj státy americké) pod depozitním registračním označením Y-11062.

Vlastnosti tohoto kmene blidou zřejmé z následující specifikace jeho znaků.

Kmen NRRLY-11062 se reprodukuje multipolární germinací a vytváří oddělené vejčité buňky nebo shluky tvořené množstvím podlouhlých buněk (pseudomycelium).

V tekutém kultivačním prostředí tvoří sediment, zatímco v pevném prostředí to jsou bud hladké a lesklé kolonie nebo neprůhledné a svraštělé kolonie. Při přípravě subkultur kmene na pevném prostředí kmen nabývá stále více hladkého a lesklého vzhledu, což odpovídá v tekutém prostředí odděleným buňkám, zatímco při kultivaci kmene za určitých podmínek v tekutém prostředí převládá pseudomyceliární forma odpovídající zvrásněným a opakním buňkám. Spory jakéhokoli druhu nebyly pozorovány. Na základě takových morfologických znaků se dospělo к závěru, že kmen náleží do rodu Candida podle klasifikace navržené J. Lodderovou v díle „The Yeasts; A Taxonomie Study“, 1970.

Fyziologické vlastnosti uvedeného nového kmene jsou následující:

1. Fermentační využívání některých zdrojů uhlíku:

D-glukóza4D-galaktóza— sacharóza— maltóza— trealóza— laktóza—

2.Růst:

D-glukóza+

D-galaktéza—

L-sorbóza— sacharóza— maltóza— cellobióza+ trehalóza— laktóza— malibióza— rafinóza— melezitóza— inulin— škrob—

D-xyloza+

L-arabinóza—

1. Fermentační využívání iů uhlíku:	některých zdro
D-arabinóza	__
D-ribóza	+ (slabě)
L-rhamnóza	—
ethanol	+
glycerol	—
erythrit	—
D-glucit	+
kyselina mléčná	—
kyselina jantarová	—
kyselina citrónová	—
inosít .	—
dusičnan	—
bez vitamínů	—
při teplotě 37 °C	+ (slabě)

Srovnání fyziologických vlastností uvedeného nového kmene s vlastnostmi uvedenými vpředu ve studii Lodderové, jakož i s vlastnostmi uvedenými v knize J. A. Barreta a R. J. Pankhursta „A New Key to · the Yeasts“ ukázalo, že tento kmen se liší od všech druhů kvasinek popsaných v těchto knihách.

V technické a patentové literatuře bylo popsáno mnoho kvasinek schopných využívat methanol (viz C. L. Cooney a D. W. Levine: „Singlo-cell protein“ II-ΜΙΤ Press, 1975), avšak vlastnosti kmene SP M 180 se liší od všech kmenů, které jsou vynálezcům známé.

Pro tento kmen je svého .druhu · příznačnou jeho schopnost asimilovat . účinněji methanol než ethanol. Kmen lze kultivovat v diskontinuálních i kontinuálních kulturách, avšak jeho vlastnosti se lépe využívají v kontinuálních kulturách.

Kromě toho, v důsledku jeho schopnosti vytvářet pseudomycelium, lze získat kulturu, která velice snadno sedlmentuje: této vlastnosti lze ' využít pro kontinuální kultivaci s částečným odebíráním nebo recyklováním biomasy, což je skutečnost, která . umožňuje vyšší hodinovou produkci. Snadná sedimentace činí mimo to izolaci biomasy pohodlnější.

Při praktickém provádění sestává způsob z naočkování půdy kmenem NRRL Y-11062, kterážto půda obsahuje . esenciální prvky (dusík, fosfor, draslík, hořčík, železo, vápník), růstové faktory (kvasničné extrakty a biotin), minerální stopové prvky a methanol jako zdroj uhlíku a energie. Živná půda se inkubuje za míchání při teplotě v rozsahu 20 °C až 30 °C, s výhodou mezi 30 ^cC a 33 °C, přičemž hodnota pH se udržuje mezi 2,5 a 6,5, s výhodou mezi 4 a 4,5, přičemž se kontinuálně dodává plynná směs s obsahem kyslíku, například vzduch.

Buňky kvasinek, které se množí na ' útraty dodávaných živin, se izolují pomocí sedimentace a filtrace, promývají se vodou a suší zahříváním.

Takto získanou biomasu lze užívat jako takovou jako bílkovinný souhrn pro potraviny a krmivá, nebo z ní mohou být izolovány z ušlechtěných produktů, například bílkoviny, aminokyseliny a nukleové kyseliny.

Následující příklady vynález ilustrují, avšak neomezují jeho rozsah.

Přikladl

500 ml Erlenmeyerovy baňky obsahovaly každá 500 ml živného prostředí o následujícím složení:

dihydrogenfo-storečnan draselný KH2PO4 dihydrogenfosforečnan sodný NaH₂PO/ síran amonný (NH4J.2SO4 síran horečnatý MgSO₄.7 H2O síran železnatý FeSO₄.7 H2O chlorid vápenatý CaCl₂ síran zinečnatý ZnSO/.7 H₂O

Kvasničný extrakt

Biotin

Stopové prvky (roztoky)

2,0 g v litru

2,0 g v litru

5,0 g v litru

0,2 g v litru

2,0 mg

2,0 g v litru

2,0 g . . v. litru 200,0 v litru 25,0 μξ v litru ml v litru

Roztok stopových prvků,. připravený ve zředěné kyselině chlorovodíkové (1 ml kon centrované kyseliny chlorovodíkové v 1 litru vody), měl následující složeni:

síran mědnatý GuSO/. 5 H2O kyselina boirltá H3BO3 síran, manganatý MnSO/ . H2O jodid draselný KJ chlorid kobaltinatý CoCl2.6 H2O kysličník molybdenový MoO3

200 mg v litru

500 mg v litru

500 mg v litru mg v litru mg v litru mg v litru

Hodnota pH prostředí byla upravena na hodnotu 5,0 a baňka byla potom sterilizována po dobu 20 minut při teplotě 116 °C. Do dvou baněk bylo potom přidáno 0,75 ml (1,9 % objem/objem) methanolu a baňka byla potom zaočkována kmenem NRRL Y-11062 na šikmém agaru. Baňky byly inkubcvány po dobu 72 hodin na rotačním míchacím zařízení (220 ot./min., průměr 3,5 centimetru), přičemž teplota 32,5 °C se udržuje termostaticky.

Ostatní baňky, obsahující totéž prostředí a do kterých bylo přidáno 1 % (objem/ /objem) methanolu, 2 °/o (objem/objem) ethanolu a 2 % (hmotnost/objem) glukózy byly zaočkovány jednotlivě 5 ml výše specifikované subkulťury. Po 24 hodinách inkubace bylo do každé baňky přidáno další 1 °/o‘ objem/objem methanolu. Po celkem· 43 hodinách inkubace byl měřen obsah biomasy v baňce, přičemž byly získány následující výsledky:

Substrát Optická hustota (1 : 10) při Suchá biomasa

660 nm gramy v litru bílkoviny

glukóza	0,340	3,99	54,5
methano!	0,270	3,63	51,0
ethanol	0,095	1,18	54,1

Obsah bílkovin byl stanoven biuretovou metodou.

Příklad 2

Do fermentoru s účinným objemem asi 8 litrů a obsahujícím kultivační médium z příkladu 1 byla naočkována suspenze kmene NRRL Y-11062. Do fermentoru, jehož teplota byla řízena termostatem na 32,5 “C byl přidáván měthanol tak, aby se zajistilo, že zbytková koncentrace živného prostředí nepřekročí 1 % objemu, vyjádřeno objemově.

Když kultura dodatečně narostla, započalo se s kontinuálním přidáváním sterilního živného prostředí do fermentoru, přičemž sterilní živné prostředí obsahovalo

29,6 g methanolu v litru, zatímco· se současně odebíralo množství živné kultury rovnající se množství přidanému ke kultivačnímu prostředí. Množství přidaného prostředí a odběr živné kultury byly zvyšovány, až dosáhly rychlosti ředění (D — poměr vstupního přítoku ku objemu kultury) 0,166 h^_1. Vycházející proud obsahoval za těchto pod mínek 10,28 g suché biomasy v litru a 146 ppm zbytkového methanolu, s výtěžkem 35 proč, a hodinovou produkcí 1,72 g biomasy na litr. Takto získaná biomasa obsahovala 55,6 % bílkovin (podle biuretové metody).

P ř í к 1 a d 3

К fermentoru druhu popsaného v příkladu 2 byl připojen usazovací tank pro vycházející proud, a část živného prostředí obohacená biomasou byla pravidelně vracena do fermentoru. Přidáváním čerstvého živného prostředí do fermentoru, přičemž živné prostředí obsahovalo 24 g methanolu v litru, za takového přítoku, aby se dosáhlo rychlosti ředění P, 267 h¹, byla získána v nerecyklovaném. podílu vycházejícím ze sedimentačního tanku vyfermentovaná kultura obsahující 7,80 g biomasy v litru, a 120 ppm zbytkového methanolu, s výtěžkem 32,5 °/o a hodinovou produkcí 2,08 g v litru. Takto získaná biomasa obsahovala 53,0 % bílkovin (podle biuretové metody).

Claims (1)

1. P R E DMÉ T - V Y N A L E Z U

   Způsob výroby biomasy o vysokém obsahu bílkovin kultivací kvasinkového kmene rodu Candida při teplotě v rozsahu 20 až 35 °C a při pH o hodnotě 2,5 až 6,5 na živné půdě, která sestává z roztoku solí, a která jako jediný zdroj uhlíku a energie obsahuje měthanol, s izolací získaných kvasinkových buněk, vyznačující se tím, že se jako kvasinkového kmene používá kmene Candida NRRL Y-11062.