DK143765B - Fremgangsmaade til fremstilling af gaercellemasse med hoejt proteinindhold - Google Patents

Description

(19) DANMARK (W)

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT an 143765 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 5604/77 (51) |nt.CI.3 C 12 N 1/32 (22) Indleveringsdag 15· dec. 1977 (24) Løbedag 15· dec. 1977 (41) Aim. tilgængelig 24. jun. 1978 (44) Fremlagt 5 · Okt. 1 g8l (86) International ansøgning nr. “ (86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag “ (62) Stamansøgning nr. “

(30) Prioritet 23· dec. 1976, 30798/76, IT

(71) Ansøger SNAMPROGETTI S.P.A., Milano, IT.

(72) Opfinder Pasquale Zaffaroni, IT: Antonio _Senni, IT: Paolo

Branduzzi, IT: Lamterto Formiconi, IT.

(74) Fuldmægtig Internationalt Patent-Bureau.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af gærcellemasse med højt protein» indhold.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af gærcellemasse med højt proteinindhold ved dyrkning af en stamme af slægten Candida på et dyrkningsmedium, der omfatter en saltopløsning indeholdende methanol som eneste carbon- og energikilde, ved en temperatur fra 20°C til 35°C og en pH-værdi mellem 2,5 og 6,5.

På grund af mikroorganismernes store reproduktionshastighed og deres proteinindhold, er produktionen af mikrobielle biomasser n ^ en meget hurtig proteinproducerende metode.

<£) Til fremstillingen af biomasser er der hidtil blevet anvendt ^ affaldskulhydrater som f.eks. melasse fra sukkerfabrikker eller -d" anvendt sulfitkogevæsker fra papirmøller.

T“

For nylig har man på grund af jordoliers lettilgængelighed *

Q

2 1Λ3765 og lave pris tilpasset biomasseproduktionsmetoder, der som substrat enten anvender de rå fraktioner af jordolie eller højt rensede blandinger af normale paraffiner.

Anvendelsen af sådan jordoliebaserede substrater udviser nogle få mangler fra et teknologisk standpunkt, hvilket skyldes deres uopløselighed i vand, den betydelige mængde af oxygen, der kræves til deres assimilering af mikroorganismer og den store varme-dannelse under forgæringen. Yderligere forøges de løbende omkostninger ved fremstillingen af biomasser, fordi det er nødvendigt at rense substratet grundigt og/eller omhyggeligt at vaske den således producerede biomasse for at fjerne potentielle skadelige jordolie-komponenter.

Sådanne vanskeligheder ses ikke, dersom produktionen af biomasserne udføres ved at anvende de lavere alkoholer som methanol eller ethanol som substrat. Det er faktisk muligt på grund af deres fuldstændige opløselighed i vand, deres flygtighed,og at de er tilgængelige i så stor renhed at opnå en biomasse, hvor der ikke findes de uønskede rester. Blandbarheden med vand løser blandingsproblemerne, der findes med jordoliefraktionerne, medens oxygenbehovet, fordi de allerede indeholder oxygen i deres molekyler, reduceres ved deres assimilering: derfor får man en yderligere fordel, som består i, at produktionen af biomassen er ledsaget af en mindre varmedannelse, hvorved resultatet bliver en reduktion af køleomkostningerne.

Ethanol anvendes af et stort antal mikroorganismer og vil være det idelle substrat til fremstillingen af biomasser, men prisen herfor er forholdsvis høj. Derimod kan methanol fremstilles billigt og med høj renhed. Dette er grunden til de anstrengelser, man har gjort sig for at finde mikroorganismer, der er i stand til effektivt at udnytte methanol. I den tekniske litteratur og i patentlitteraturen er beskrevet mange bakterier, der er i stand til at opfylde disse krav, medens virkningsgraden af de gærarter, der er beskrevet, hidtil har været temmelig lav. De foran omtalte ulemper undgås ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, som er af den kendte art, ved hvilken man dyrker en stamme af slægten Candida på et dyrkningsmedium, der omfatter en saltopløsning indeholdende methanol som eneste carbon- og energikilde, ved en temperatur fra 20°C til 35°C og en pH-værdi mellem 2,5 og 6,5. Fremgangsmåden er ejendommelig ved, at der som stamme af slægten Candida anvendes den hidtil ukendte stamme NRRL-Y 11062 (SP M 180 cc). Derved opnås en gærcellemasse med stort proteinindhold, der kan 143765 3 indgå som proteindelen i animalske foderstoffer eller hvoraf der kan udvindes ædlere produkter såsom proteiner, aminosyrer eller nucleinsyrer.

Den omhandlede stamme er den 6. januar 1977 blevet deponeret i Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, USA, under betegnelsen NRRL-Y 11062.

Den hidtil ukendte stammes karakteristika beskrives i det følgende.

Stammen SP M 180 cc reproduceres ved multipolar udspiring og danner adskilte ægformede celler eller klatter, der består af et antal aflange celler (pseudomycelium).

I flydende dyrkningsmedier danner den bundfald, medens den i fast medium danner enten glatte og skinnende kolonier, eller uigennemsigtige og rynkede kolonier. Når man dyrker stammen på et fast medium, bliver stammen mere og mere glat og skinnende, hvilket i et flydende medium svarer til de adskilte celler, medens når man dyrker stammen i et flydende medium under visse betingelser, dominerer den pseudomyceliære form, hvilket svarer til de rynkede og uigennemsigtige celler. Man har aldrig set sporer af nogen art.

Ud fra sådanne morphologiske karakteristika, antager man, at stammen hører til arten Candida ifølge den klassifikation, der er foreslået af J. Lodder, The Yeasts : a taxonomic Study, 1970.

De fysiologisk karakteristika af stammen SP M 18 cc er følgende: 1. Forgæringsudnyttelse af nogle få carbonkilder: D-glucose + D-galactose

Saccharose

Maltose

Trealose

Lactose 2. Vækst: D-glucose + D-galactose 1-sorbose

Saccharose

Maltose

Cellobiose +

Trealose

Lactose , 143765 4

Melibiose

Raffinose

Melezitose

Inulin -

Stivelse D-xylose + 1-Arabinose + D-Arabinose - D-Ribose + (svag) 1-Rhamnose -

Ethanol +

Glycerol

Erythritol

Ribitol +

Galacticol D-Mannitol + D-Glucitol + Mælkesyre Ravsyre Citronsyre Inositol Nitrat

Ingen vitamin ved 37°C + (svag)

En sammenligning af de fysiologiske karakteristika for SP M 180 cc stammen med de karakteristika, der er beskrevet i arbejdet af Lodder citeret ovenfor såvel som sammenlignet med de oplysninger, der er omtalt i bogen "A new Key to the Yeasts", af J. A. Barrett og R. J. Pankhurst, 1974 har vist, at stammen SP M 180 cc er forskellig fra alle de gærarter, der er beskrevet i disse bøger.

Den tekniske litteratur og patentlitteraturen har hidtil beskrevet mange gærarter, der er i stand til at anvende methanol (jfr. C. L. Cooney og D. W. Levine i "Single-Cell Protein II - MIT Press, 1975), men karakteristika for stammen SP M 180 cc er forskellig fra alle de hidtil kendte stammer.

En "sui generis" egenskab ved denne stamme er dens evne til at assimilere methanol mere effektivt end ethanol. Stammen kan dyrkes både i diskontinuerte og kontinuerte kulturer, men dens egen- 143765 5 skaber er bedre udnyttet i kontinuerte kulturer.

Yderligere kan der opnås en kultur, der meget let falder til bunds, på grund af dens evne til at danne pseudomycelium. En sådan egenskab kan udnyttes til at udføre kontinuert kultur med en partiel biomasse feed back eller recirkulering, en evne der muliggør, at man kan opnå et højere udbytte pr. time. Yderligere muliggør den lette bundfældning,at opsamlingen af biomassen er mere bekvem.

I praksis består fremgangsmåden i,at man poder et dyrkningsmedium med stammen SP M 180 cc, idet dyrkningsmediet indeholder de nødvendige grundstoffer (N, P, K, Mg, Fe, Ca), vækstfaktorer (gærekstrakter og biotin), mineralsporstoffer, og methanol som carbon- og energikilde. Builionen dyrkes under omrøring ved en temperatur fra 20°C til 35°C, fortrinsvis mellm 30°C og 33°C, idet pH-værdien holdes mellem 2,5 og 6,5, fortrinsvis mellem 4 og 4,5, idet man tilfører en kontinuert mængde af en gasblanding, der indeholder oxygen, som f.eks. luft.

Gærcellerne, der formerer sig på bekostning af næringsmidlerne, der tilføres, opsamles ved bundfalching og filtrering, vaskes med vand og tørres ved opvarmning.

Den således opnåede biomasse kan anvendes som proteindelen af animalske foderstoffer, eller man kan ekstrahere ædlere produkter fra det såsom proteiner, aminosyrer og nucleinsyrer.

Nærværende patent omfatter ikke fremgangsmådens anvendelse ved tilvirkning af næringsmidler.

Opfindelsen belyses nærmere nedenfor ved følgende eksempler.

Eksempel 1

Der anvendtes 500 ml Erlenmeyer-kolber, der hver indeholdt 50 ml af et dyrkningsmedium med følgende sammensætning: KH2P04 2,0 g pr. liter

NaH2P04.H20 2,0 " (NH4)2S04 5,0 "

MgS04.7H20 0,2 "

FeS04.7H20 2,0 mg pr. liter

CaCl3 2,0 "

ZnS04.7H20 2,0 " Gærekstrakt 200,0 "

Biotin 25,0 mikrogram pr. liter

Sporstoffer (opløsning) 1 ml pr. liter c 143765 6

Opløsningen af sporstofferne er fremstillet i fortyndet HC1 (1 ml koncentreret HC1 i 1 liter vand) og havde følgende sammensætning:

CuS04.5H20 200 mg pr. liter H3B03 500 "

MnS04.H20 500 "

Kl 10 "

CoC12,6H20 10 "

Mo03 10 "

Substratets pH indstilledes på 5,0, og kolben steriliseredes ved 116°C i 20 minutter. Til to kolber sattes der 0,75 ml (1,9% vol/vol) methanol, og kolberne tilsåedes med en skråpodning af stammen SP M 180 cc. Kolberne dyrkedes i 72 timer på en roterende anordning (220 omdr. pr. minut, idet bevægelsens diameter var 3,5 cm), og en temperatur på 32,5°C, der kontrolleredes termostatisk.

Andre kolber, der indeholdt det samme medium,og til hvilke der var sat 1% (vol/vol) methanol, 2% (vol/vol) ethanol og 2% vægt/vol) glucose tilsåedes med 5 ml af den ovenfor beskrevne forkultur. Efter 24 timers dyrkning tilsattes yderligere 1% vol/vol methanol til hver kolbe. Efter ialt 48 timers dyrkning måltes indholdet af biomasse i kolberne, idet resultaterne var følgende:

Substrat Optisk tæthed Tør biomasse _ (1:10) ved 660 nm g/liter Proteiner

Glucose 0,340 3,99 54,5

Methanol 0,270 3,68 51,0

Ethanol 0,095 1,18 54,1

Proteinindholdet bestemtes ved biuret-prøven.

Eksempel 2

En forgæringsbeholder, der havde et effektivt rumfang på ca. 8 liter, og som indeholdt dyrkningsmediet fra eksempel 1 podedes med en suspension af stammen SP M 180 cc. Til forgæringsbeholderen, der var kontrolleret termostatisk på 32,5°C, sattes methanol, idet man sikrede sig at restkoncentrationen i builionen aldrig oversteg 1% vol/vol. Når kulturen var groet tilfredsstillende, påbegyndtes den kontinuerte tilsætning af steril builion til forgæringsbeholderen , idet den sterile builion indeholdt 29,6 g methanol pr. liter, medens en del af buillonkulturen samtidig fjernedes, svarende til den mængde, der blev sat til dyrkningssubstratet. Mængden af tilsat