DE2757877A1 - Hefestamm der gattung candida nr. nrrl-y 11062 - Google Patents

Description

DH. ING. F. A\^rUKSTnOKF DH.K. v. IMiClIMANN DK. IN<;. 1). ItKlIHKNS

Din- IN«. H. <;<)KTZ

PATENTANWALT»

SOCO MÜNCTTKN OO .s;ii\\*rniKHSTitAssi: a t;i,kk(N (080) 00 3001 TKLKX 3 2-4 070

TK I. KtIIlAMMlC I IMIOTKOTPATKKT

1A-50 246

Patentanmeldung

Anmelder: SNAMPROGETTI S.p.A. Corso Venezia 16 Mailand (Italien)

Titel:

Hefestamm der Gattung Candida Nr. NRRL-Y 11062

I)H. IX«;. F. WΓKSTIHJFK III«. JC. ν. 1·Κ«Ί1 M A K X du. ix«;. ι>. KKHKKxs 1)11*1.» IX«;. ti. <;«»KTZ ΙΆΤ KNTAXW A Ι.ΤΕ

MM)O V ItKCH KX «Ο

1Α-50 246

Anm.: Snamprogetti Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung einer durch Mikroorganismen erzeugten Biomasse durch Züchten eines neuen Hefestatames, der in der Lage ist, Methanol als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle auszunützen.

Aufgrund der hohen Geschwindigkeit der Reproduktion dieser Mikroorganismen und ihres Proteingehaltes ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Biomassen ein Verfahren, mit dem außerordentlich schnell Protein erzeugt

vi rd.

Für die Herstellung von Biomassen wurden bisher Abfall-Kohlenhydrate, wie Heiassen aus Zuckerraffinerien oder Sulfitablaugen aus der Zellstoff-Gewinnung, verwendet. Die jüngerer Zeit wurden wegen der leichten Verfügbarkeit und des günstigen Preises von Erdöl Herstellungsverfahren für Biomassen entwickelt, bei denen als Substrate entweder Fraktionen des Rohöls oder hochgereinigte Gemische von normalen Paraffinen eingesetzt werden.

Die Verwendung derartiger Substrate auf Erdölbasis bringt aus technologischer Sicht einige Nachteile mit sich, die auf der Unlöslichkeit der Erdölprodukte in Wasser, der für die Assimilation durch die Mikroorganismen benötigten großen Sauerstoff menge und der großen Wärmeentwicklung während der Fermentation beruhen. Außerdem werden die laufenden Herstellungskosten von Biomassen noch dadurch erhöht, daß das Substrat gründlich gereinigt und/oder die produzierte Biomasse sorgfältig gewaschen werden muß,um potentiell

schädliche Erdöl-

1A-50

komponenten zu entfernen.

Diese Schwierigkeiten treten nicht auf, wenn für die Erzeugung von Biomassen als Substrate die niederen Alkohole, wie Methanol oder Äthanol, eingesetzt werden. In der Tat ermöglicht ihre vollständige Löslichkeit in Wasser, ihre Flüchtigkeit und die Tatsache, daß sie sehr rein zur Verfügung stehen, die Herstellung einer Biomasse, die frei ist von unerwünschten Rückständen. Infolge der Mischbarkeit mit Wasser gibt es keine Mischprobleme wie bei den Erd ölfraktionen; außerdem wird, da diese niederen Alkohole bereits Sauerstoff in ihrem Molekül enthalten, der Sauerstoffbedarf für ihre Assimilation entsprechend reduziert: Hieraus ergibt sich ein weiterer Vorteil, daß nämlich die Erzeugung der Biomasse begleitet ist von einer geringeren

sodaß
Wärmeentwicklung, die Kosten für die notwendige Kühlung entsprechend gesenkt werden können.

Äthanol wird von zahlreichen Mikroorganismen genutzt und wäre das ideale Substrat für die Herstellung von Biomassen, ist aber vergleichsweise teuer. Andererseits kann Methanol billig und mit hohem Reinheitsgrad hergestellt werden. Diese Tatsache erklärt die Bemühungen, die darauf verwendet wurden, Mikroorganismen aufzufinden, die in der Lage sind, Methanol wirksam auszunutzen. In der technischen sowie Patentliteratur werden zahlreiche Bakterien bzw. Mikroorganismen genannt, die diese Forderung erfüllen, aber die bisher beschriebene Wirksamkeit von Hefen ist ziemlich gering. Durch Anreichern des Nährbodens und Isolieren in kontinuierlicher Kultur oder Züchtung wurde erfindungsgemäß nun ein neuer Hefestamm (SP M 180 cc) isoliert, der der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist und in der Lage, Methanol als einzige Quelle für Kohlenstoff und Energie auszunutzen.

8 1 η 1 £

1A-50 246

Die Neuheit des Stammes ergibt sich aus der narhiDlgen-' den Beschreibung seiner Merkmale.

Der Stamm SP M 180 cc wird durch multipolare Keimung oder Sprossung reproduziert und bildet einzelne eiförmige Zellen oder Büschel, die aus einer Anzahl von länglichen Zellen bestehen (Pseudomycelium).

In einem flüssigen Nährmedium bildet der neue Stamm ein Sediment, auf festem Nährboden hingegen entweder glatte und glänzende Kolonien oder opake und faltige bzw. runzelige Kolonien. Durch Nachzuchten (Bildung von Tochterkulturen) des Stammes auf einem festen Nährboden nimmt der Stamm mehr und mehr ein glattes und glänzendes Aussehen an, das in einem flüssigen Medium den einzelnen Zellen entspricht, während beim Züchten des Stammes in einem flüssigen Nährmedium unter bestimmten Bedingungen die pseudomycelare Form überwiegt, die den runzeligen und opaken Zellen entspricht. Keinerlei Sporen irgendeiner Art wurden bisher beobachtet. Auf der Basis dieser morphologischen Eigenschaften wird angenommen, daß der Stamm zur Gattung Candida gehört, entsprechend der Klassifizierung von J. Lodder, Herausgeber:"The Yeasts, a taxonomic Study" 1970.

Die physiologischen Merkmale des Stammes SP M 180 cc sind folgende:

1. Fermentative Nutzung einiger C-Quellen

D-Glucose +

D-Galactose -

Saccharose (Rohrzucker) Maltose
Trehalose

Lactose -

- A - 1A-50

D-Glucose +

D-Galactose _

1-Sorbose -

Saccharose (Rohrzucker)

Maltose _

Cellobiose +

Trehalose

Lactose -

Melibiose -

Raffinose

Melecitose -

Inulin

Stärke

D-XyIose +

1-Arabinose +

D-Arabinose

D-Ribose + (schwach)

1-Rhamnose -

Äthanol +

Glycerin -

Erythrit

Ribitol (Adonit) +

Galacticol (vgl. Merck-Index, 8. Auflage)

D-Mannit +

D-Glucitoi (Sorbit) +

Milchsäure -

Bernsteinsäure -

Citronensäure -

Inosit -

Nitrat

kein Vitamin

bei 37°C + (schwach)

80^R?R/ini4

- # - ^ 1A-50 246

Der Vergleich der physiologischen Eigenschaften des Stammes SP M 180 cc mit den Eigenschaften, wie sie in der Untersuchung von Lodder a.a.O. und in dem Buch "A new Key to the Yeasts" von J.A. Barrett und R.J. Pankhurst, 1974, angegeben sind, zeigt, daß der neue Stamm SP M 180 cc sich von allen in diesen Druckschriften beschriebenen Hefearten unterscheidet.

In der technischen sowie in der Patentliteratur sind bisher zahlreiche Hefen beschrieben worden, die in der Lage sind, Methanol nutzbar zu machen (vgl. CL. Cooney und D.W. Le vine in "Single-Cell Protein II" - MIT Press, 1975), aber die Eigenschaften des Stammes SP M 180 cc unterscheiden sich von den Eigenschaften aller anderen bisher bekannt gewordenen Stämme.

Ein Merkmal sui generis des neuen Stammes ist seine Fähigkeit, Methanol wirksamer zu assimilieren als Äthanol. Der ■Stamm kann sowohl in diskontinuierlichen wie in kontinuierlichen Kulturen gezüchtet werden, seine Eigenschaften werden aber in kontinuierlichen Kulturen besser ausgenützt.

Weiterhin kann aufgrund der Fähigkeit, ein Pseudomycelium zu bilden, eine Kultur erhalten werden, die sich sehr leicht absetzt; dieses Merkmal oder diese Eigenschaft kann bei der Ausführung der kontinuierlichen Kultur mit partieller Rückspeisung der Biomasse genutzt werden, eine Tatsache, die einen höheren stündlichen Ausstoß ermöglicht. Das leichte Absetzen erleichtert darüberhinaus das Sammeln oder Isolieren der Biomasse.

In der Praxis besteht das Verfahren darin, daß man mit dem Stamm SP M 180 cc ein Kulturmedium bzw.Nährboden beimpft, der die wesentlichen Elemente (N, P, K, Mg, Fe, Ca), die Wuchsfaktoren (Hefeextrak~e und Biotin), mineralische Spurenelemente sowie Methanol als Quelle für Kohlenstoff und Energie enthält. Der Nährboden wird unter Rühren bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 35°C, vorzugsweise 30 bis 33°C, und bei

809R76/10U

- ir - 1A-50

? 7 ^i 7 ft 7 einem pH von 2,5 bis 6,5, vorzugsweise 4 bis 4,5, inkubiert, wobei kontinuierlich mit einem sauerstoffhaltigen Gasgemisch, beispielsweise Luft, belüftet wird.

Die Hefezellen, die sich zu Lasten der zur Verfügung gestellten Nährstoffe vermehren, werden mittels Sedimentation und Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und unter Erwärmen getrocknet. Die erhaltene Biomasse kann unmittelbar als solche als Protein-Integrator für Nahrungsmittel und Tierfutter verwendet werden, oder es können wertvolle Stoffe daraus extrahiert werden, beispielsweise Proteine, Aminosäuren und Nucleinsäuren.

Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung:

Beispiel 1

Es wurden 500 ml Erlenmeyer-Kolben bereitgestellt, die jeweils 50 ml des folgenden Nährbodens enthielten:

KH₂PO₄ 2,0 g/l

.H₂O 2,0 g/l

₄₂O₄ 5,0 g/l

FeSO₄.7H₂O 2,0 mg/1

CaCl₂ 2,0 mg/1

ZnSO₄.7H₂O 2,0 mg/1

Hefe-Extrakt 200,0 mg/1

Biotin 25,0 /Ug/1

Spurenelemente (Lösung) 1 ml/1

Die Lösung der Spurenelemente, hergestellt in verdünn ter HCl (1 ml konz. HCl in 1 1 Wasser) ,hatte folgende Zusammensetzung :

CuSO₄.5H₂O 200 mg/1

H₃BO₃ 500 mg/1

- T - 1Α-50 246

MnSO₄.H₂O 500 mg/1

KI 10 mg/1

CoCl₂.6H₂O 10 mg/1

MoO₃ 10 mg/1

Der pH-Wert des Nährbodens wurde auf 5,0 gebracht, die Kolben wurden dann 20 Minuten bei 116°C sterilisiert. Zu 2 Kolben wurden jeweils 0,75 ml (1,9 Volumen-%, bezogen auf das Volumen) Methanol gegeben und die Kolben dann mit dem Stamm SP M 180 cc in Schrägkultur beimpft. Die Kolben wurden 72 Stunden auf einer rotierenden Rührvorrichtung inkubiert (220 UpM, Durchmesser der Verschiebung 3,5 cm), wobei die Temperatur von 32,5°C thermostatisch gesteuert bzw. überwacht wurde.

Andere Kolben, die den gleichen Nährboden mit Zusatz von 1 Vol.-96 Methanol, 2 Vol.-% Äthanol und 2 % Gew./Vol. Glucose enthielten, wurden mit jeweils 5 ml der obigen Vorkultur beimpft. Nach 24-stündiger Inkubation wurden zu jedem Kolben weitere 1 Vol.-% Methanol gegeben. Nach insgesamt 28-stündiger Inkubation wurde der Inhalt an Biomasse der einzelnen Kolben gemessen und folgende Ergebnisse erhalten:

Substrat optische Dichte trockene Biomasse (1:10) bei 660 nm g/l Proteine

Glucose	0,340	3,99	54,5
Methanol	0,270	3,68	51,0
Äthanol	0,095	1,18	54,1

Der Proteingehalt war mit Hilfe der Biuret-Methode bestimmt worden.

Beispiel 2

Ein Fermenter mit Nutzvolumen etwa 8 1, der den Nährboden gemäß Beispiel 1 enthielt, wurde mit einer Suspension des Stammes SP M 180 cc beimpft. Die Temperatur des Fermenters wurde thermostatisch bei 32,5°C gehalten; außerdem wurde Methanol zugegeben, um sicherzustellen, daß die Restkonzentration in der

809826/10U

Λ*

-· 6 - 1Α-50 246

Bouillon zu keinem Zeitpunkt 1 Vol.-^ überstieg. Nachdem die Kultur zufriedenstellend gewachsen war, wurde mit der kontinuierlichen Zuspeisung des sterilen Nährbodens in den Fermenter begonnen; der sterile Nährboden enthielt 29,6 g/l Methanol ; gleichzeitig wurde eine Menge Nährboden-Kultur abgezogen, die gleich war der zugesetzten Menge Nährboden. Die Einspeisungsmenge und Abzugsmenge wurden zunehmend erhöht, bis eine Verdünnungsgeschwindigkeit (D = Strömungsgeschwindigkeit bei der Einspeisung zu Volumen der Kultur) von 0,166 h erreicht worden war. Unter diesen Bedingungen enthielt der abgezogene Strom 10,28 g/l trockene Biomasse sowie 146 ppm Rest-Methanol, mit einer Ausbeute von 35 % und einer stündlichen Erzeugung von 1,72 g/l Biomasse. Die so erhaltene Biomasse enthielt 55,6 % Proteine (Biuret-Test).

Beispiel 3

Ein Fermenter, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde mit einem Absetztank für den abgezogenen Strom verbunden,· ein Teil des Nährboden-Kultur-Gemisches, angereichert mit Biomasse, wurde regelmäßig in den Fermenter zurückgespeist. Durch Zugabe von frischem Nährboden zu dem Fermenter, der 24 g Methanol/l enthielt, mit einer solchen Strömungsgeschwindigkeit, daß eine Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,267 h erreicht wurde, erzielte man in dem nicht zurückgeführten Teil, der aus dem Absetztank abgezogen wurde, eine Nährboden-Kultur, die 7»80 g/l Biomasse und 120 ppm Restmethanol enthielt, mit einer Ausbeute von 32,5 % und einem stündlichen Ausstoß von 2,08 g/l. Die auf diese Weise erhaltene Biomasse enthielt 53»0 % Proteine (Biuret-Test).

⁷²³¹ 809826/10U

Claims (5)

DH. ING. F. AVUKSTIIOFF 8OOO M Ü N ClI KN OO DH. K. ν. I'KCllMANN HOIIW1.IOKKSTHANSK 2 DH. INCJ. II. UKlIHKNS """'" <Οββ' °°203Χ TKl-KX 324070 DlPJ*. IN(ML (a)KTZ TKLKIIIIAMMR 1 PHUTKOTPATKNT nONCHEV 11 Jj. IHVi, J\. ll\/l'.l/J PATENTANWÄLTE £ j Q J Q / j 1A-50 246 ν Anm.: Snamprogetti S.p.A, Patentansprüche

1. Hefestamm der Gattung Candida Nr. NRRL-Y 11062

2. Verfahren zur Herstellung von Biomassen mit hohem Proteingehalt, dadurch gekennzeichnet , daß man den Stamm der Gattung Candida nach Anspruch 1 in an sich bekannter Weise züchtet und die erhaltenen Hefezellen isoliert.

3. Verfahren zur Herstellung von Biomassen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man die Reaktion auf einem Nährboden durchführt, der aus einer Salzlösung besteht, welche als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle Methanol enthält.

4. Verfahren zur Herstellung von Biomassen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß man die Fermentation bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 35°C durchführt.

5. Verfahren zur Herstellung von Biomassen nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man die Fermentation bei einem pH-Wert von 2,5 bis 6,5 durchführt.

809826/1014 ₆₂₃₁ ORIGINAL INSPECTED