DE2704070A1

DE2704070A1 - Verfahren zur herstellung von vitamin b tief 12

Info

Publication number: DE2704070A1
Application number: DE19772704070
Authority: DE
Inventors: Yasuo Fujiwara; Ichiro Kojima; Hiroshi Sato
Original assignee: Nippon Oil Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1976-02-05
Filing date: 1977-02-01
Publication date: 1977-08-18
Also published as: JPS5849236B2; GB1521456A; US4119492A; JPS5294498A

Description

KRAUS & WEISERT

PATENTANWÄLTE 2 7 O A O 7 O

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-INQ. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-BOOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-79 7078 · TELEX OS-212156 kpat d

TELEGRAMM KRAUSPATENT

F 5OOA-K32 * 1453 AW/MY

NIPPON OIL COMPANY, LTD., Tokyo / Japan

Verfahren zur Herstellung von Vitamin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B₁₂ durch Fermentationsverfahren. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Vitamin B₁₂ in verbesserter Ausbeute erhalten. Es werden Vitamin B₁₂ bildende Mikroorganismen des Genus Arthrobacter einschließlich eines neuen Stamms verwendet. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Bildung von Vitamin B₁₂ nach einem Fermentationsverfahren» bei dem Vitamin B₁₂ in erhöhter Ausbeute bzw. erhöhtem Output mit niedrigen Kosten und zusätzlichen Vorteilen bei dem Verfahren erhalten wird. Es wird ein Kulturmedium verwendet, das spezifische, leicht in konstanten Mengen verfügbare Kohlenstoff quellen enthält. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B₁₂ nach einem Fermentationsverfahren, bei dem ein Vitamin B₁₂ bildender Mikroorganismus des Genus Arthrobacter bei aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das mindestens eine Verbindung aus der Gruppe Alkohole mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen und Ketone enthält und bei dem das Vitamin B₁₂ aus der Kulturbrühe isoliert wird.

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- Ψ.

Vitamin B₁₂ bildende Mikroorganismen, die zu dem Genus Propionibacterium, Bacillus, Corynebacterium, Arthrobacter, Rhodopseudomonas, Protaminobacter, Streptomyces, Rhodospirillum, Actinomyces, Selenomonas und Nocardia gehören, sind gut bekannt. Einige dieser Mikroorganismen verwenden Kohlenhydrate als Kohlenstoffquelle. Einige der anderen Mikroorganismen vom Genus Corynebacterium, Arthrobacter, Pseudomonas und Nocardia verwenden Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle. Es sind weiterhin Mikroorganismen des Genus Pseudomonas und Protaminobacter bekannt, die Vitamin B₁₂ unter Verwendung von Methanol, einem C₁-AIkOhOl, als Kohlenstoffquelle bilden.

In der Literatur finden sich jedoch keinerlei Hinweise, daß ein einen C₂-C^-AIkOhOl und/oder ein Keton als Kohlenstoffquelle enthaltendes Kulturmedium bei der Herstellung von Vitamin B₁₂ unter Verwendung bekannter Vitamin B₁₂ bildender Mikroorganismen einschließlich solcher des Genus Arthrobacter, wie sie bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, verwendet werden kann.

Bei der fermentativen Herstellung von Vitamin B₁₂ sind die Kohlenhydrate zur Zeit die am häufigsten und meisten verwendeten Kohlenstoffquellen. Da sie jedoch natürlichen Ursprungs sind, sind ihre Kosten und die vorrätigen Mengen nicht immer stabil. Diese Materialien sind technisch für die fermentative Herstellung von Vitamin B₁₂ somit nicht geeignet. Für technische Verfahren ist die Verwendung von Kohlenstoffquellen wie Alkoholen und Ketonen, die leicht als petrochemische Produkte mit niedrigen Kosten verfügbar sind und in konstanten Mengen geliefert werden können, sehr vorteilhaft. Werden als Kohlenstoffquellen mit Wasser unmischbare oder in Wasser unlösliche Kohlenwasserstoffe verwendet, so ist die Trennung der Vitamin B₁₂ enthaltenden Zellen aus der Kulturbrühe besonders schwierig, da die Kohlenwasserstoffe in ihr verbleiben. Wird

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• -Γ*
Methanol als Kohlenstoffquelle verwendet, so können die Schwierigkeiten, die bei der Abtrennung des Produktes auftreten, vermieden werden, da es eine gute Löslichkeit in Wasser besitzt. Bei der Kultivierung unter Belüftung erhöht sich jedoch die Menge an Methanol, die verdampft, da es einen niedrigen Siedepunkt hat. Bei der Durchführung einer stabilen Kultivierung ist dies nachteilig.

Die Anmelderin hat überraschenderweise ein Verfahren zur fermente ti ven Herstellung von Vitamin B₁₂ entwickelt, bei dem die Nachteile der bekannten Verfahren nicht auftreten, überraschenderweise wurde ein neuer Stamm Arthrobacter hyalinus isoliert, der zum Genus Arthrobacter gehört. Es wurde gefunden, daß dieser Vitamin B₁₂ bildende Mikroorganismus mit Vorteil in einem Kulturmedium gezüchtet bzw. kultiviert werden kann, das als Kohlenstoff quelle mindestens eine Verbindung aus der Gruppe Alkohole mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen und Ketone enthält, die als petrochemische Produkte mit niedrigen Kosten leicht verfügbar sind, in konstanten Mengen geliefert werden können und die durch Verdampfung während der belüfteten Kultivierung nicht verlorengehen. Beispielsweise wurde gefunden, daß dieser Mikroorganismus die Fähigkeit besitzt, Vitamin B₁₂ in großen Mengen zu bilden.

Es wurde weiterhin gefunden, daß der gleiche Vorteil erreicht werden kann, wenn man bekannte, Vitamin B₁₂ bildende Mikroorganismen des Genus Arthrobacter in einem Kulturmedium züchtet bzw. kultiviert, das mindestens eine Verbindung aus der Gruppe Alkohole mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen und Ketone als Kohlenstoffquelle enthält.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein technisch vorteilhaftes Fermentationsverfahren zur Herstellung von Vitamin B₁₂ zu schaffen, bei dem Vitamin B₁₂

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bildende Mikroorganismen des Genus Arthrobacter verwendet werden.

Erfindungsgemäß soll weiterhin ein neuer Vitamin B^₂ liefernder Stamm vom Genus Arthrobacter gefunden werden, der bei der fermentativen Bildung von Vitamin B₁₂ verwendet werden kann.

Beispiele von bekannten Vitamin B₁₂ bildenden Mikroorganismen des Genus Arthrobacter umfassen Arthrobacter simplex (ATCC 6946), Arthrobacter tumescens (der am Institute f>r Fermentation, Osaka, Japan, unter der Hinterlegungsnummer IFO 12960 hinterlegt wurde) und Arthrobacter globiformis (ATCC 8010). Der neue Stamm Arthrobacter hyalinus, der von der Anmelderin isoliert wurde, wurde am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 3125 hinterlegt. Dieser Stamm wurde ebenfalls bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) mit der Hinterlegungsnummer DMS Nr. 867 und bei ATCC mit der Nr. 31 263 hinterlegt.

Arthrobacter hyalinus besitzt die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften, die in der Beschreibung von "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7· Edition, nicht festgestellt werden konnten. Er wurde daher als neuer Stamm identifiziert, der zum Genus Arthrobacter gehört und auch so bezeichnet wurde.

Mikrobiologische Eigenschaften von Arthrobacter hyalinus

(1) Morphologische Eigenschaften

Morphologie: Bei der ersten Züchtungsstufe lange, kurvenförmige Stäbchen mit einer Größe von 0,8 χ bis 5 Mikron, einige von ihnen in V-Form; bei

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->■

der späteren Kultivierungsstufe ändern sie sich zu kurzen Stäbchen mit einer Größe von 1,2 χ 1,5 Mikron. Motilität: keine

Gram-Färbung: positiv oder negativ. . . . ■ ^j-· Bildung von Sporen: nein (2)Eigenschaften bei der Kultivation Nähr-Agar-Plattenkultur: Periphere Kante ausgezackt,

gewölbt, transparent, feucht glänzend Nähr-Agar-Schrägkultur: Wachstum schlecht, fadenförmig,

transparent, feucht glänzend Nährflüssigkeitskultur: trübe

(3)Physiologische Eigenschaften Wachsturnstemperatur: 25 bis 35°C Wachstums-pH: 6 bis 9 Sauerstoffbedarf: fakultativ aerob Verflüssigung bei der Gelbildung: nein

Lackmusmilch: wird etwas alkalisch und wird sehr langsam peptonisiert

Indol: nicht gebildet S chwefelwasserstoff: gebildet Reduktion von Nitraten: nein Catalase: nicht gebildet Urease: gebildet

Säurebeständigkeit: negativ Zersetzung von Stärke: nein

Fermentierbarkeit von Zucker: es werden weder Säuren noch Gase gebildet aus Glycerin, Arabinose, Xylose, Fructose, Galactose, Glucose, Mannit, Sorbit, Lactose, Maltose, Saccharose und Raffinose

Asparagin: wird nicht zersetzt Citronensäure: wird nicht zersetzt.

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Erfindungsgemäß wird ein Vitamin B₁₂ bildender Mikroorganismus des Genus Arthrobacter in einem Kulturmedium gezüchtet und Vitamin B₁₂ kann entweder direkt oder indirekt aus der Kulturbrühe abgetrennt werden.

Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Kulturmedium kann zusätzlich zu den Kohlenstoff- und Stickstoffquellen anorganische Salze und Antischaummittel enthalten.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird als Kohlenstoffquelle mindestens eine der folgenden Terbindungen verwendet: Alkohole mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen und Ketone. Beispiele bevorzugter Kohlenstoffquellen sind Äthylalkohol, n-Propanol, i-Propanol, Äthylenglyko1, Propylenglyko1, Glycerin und Aceton. Andere Kohlenstoffquellen wie η-Paraffin, Kohlenhydrate und Öle und Fette können mitverwendet werden. Häufig wird bei gleichzeitiger Verwendung von anderen Kohlenstoffquellen die Ausbeute erhöht.

Stickstoffquellen, die in dem Kulturmedium enthalten sein können, umfassen z.B. Maiswasser bzw. Maiseinweichmwasser, Hefextrakt, Pepton, zerkleinertes Fischpulver, pflanzliche Proteine, Sojabohnenabfälle, ein trockenes Pulver aus einem Malzabfall,der bei der Whiskeyherstellung anfällt (SUNGROWTH, ein Produkt der Sun Growth Co., Ltd.), Ammoniumsalze, Nitratsalze und Harnstoff.

Beispiele anorganischer Salze sind Kobaltsalze, Phosphatsalze, Magnesiumsalze, Mangansalze, Zinksalze, Calciumsalze, Molybdänsalze und Kupfersalze. Auf die Zugabe von Mangansalzen kann man verzichten, wenn ihre Anwesenheit bei der Herstellung von Vitamin B₁₉ nachteilig ist. Man kann weiterhin als

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•J.

Aktivator für die Vitamin B^-Bildung eine Vitamin B_i2-Vorstufe wie 5,6-Dimethylbenzoimidazol zugeben.

Die Zusammensetzung des Kulturmediums kann je nach Bedarf variieren. Die erforderlichen Bestandteile können während der Kultivierung als Ergänzung zugegeben werden. Beispielsweise können die Kohlenstoffquellen nacheinander in kleinen Teilen zugegeben werden, so daß keine Erhöhung in der Wachstumsrate in der logarithmischen Wachstumsphase stattfindet. Sie können ebenfalls in kleinen Anteilen bei der Vitamin B_i2-Bildungsphase zugegeben werden.

Die Kultivierung erfolgt bei aeroben Bedingungen, z.B. unter Belüftung und Rühren. Die Kultivierungstemperatur beträgt im allgemeinen etwa 20 bis etwa 4O⁰C, und der pH-Wert beträgt etwa 4 bis etwa 9,5. Die Kultivierungszeit beträgt normalerweise etwa 2 bis 8 Tage und kann entsprechend den Änderungen in den anderen Kultivierungsbedingungen geändert werden.

Die Abtrennung des Vitamins B₁₂ aus dem Fermentationsprodukt kann in an sich bekannter Welse erfolgen. Da sich das Vitamin B₁₂ hauptsächlich in den Zellen der Mikroorganismen anreichert, ist es bevorzugt, zuerst die Kulturbrühe zur Isolierung der Zellen zu zentrifugieren. Soll es als Cyano-Typ Vitamin B₁₂ abgetrennt werden, so wird ein Cyanion zu den Zellen zugegeben, und nach der Einstellung des pH-Wertes auf 5 mit einer Säure wie Schwefelsäure wird das Gemisch in einem wäßrigen Medium bei 80 bis 100⁰C gehalten. Soll es aus der Kulturbrühe als Co-Enzym-Typ Vitamin B₁₂ (5,6-Dimethylbenzimidazolcobamid-Co-Enzym) und als Hydroxyl-Typ Vitamin B₁₂ abgetrennt werden, so können die Zellen in an sich bekannter Weise mit einem Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol, Aceton oder Pyridin in ein wäßriges Medium an einem dunklen Ort extrahiert werden. Die Extraktions temperatur kann Zimmertemperatur sein, aber das Extraktionssystem kann auch auf etwa 1OO°C erhitzt werden.

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• /ο-

Das aus der Kulturbrühe extrahierte Vitamin B₁₂ kann in an sich bekannter Weise durch geeignete Kombination bekannter Verfahren wie Extraktion mit Phenol, Adsorption mit Aktivkohle oder Säulenchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschharz oder Cellulose gereinigt werden.

Die. folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

10 ml eines sterilisierten Kulturmediums, das entionisiertes reines Wasser und pro Liter Wasser 10 ml Isopropanol, 3 g Pepton, 1 g Hefeextrakt, 3 g NH₄NO₃, 1,5 g Na₂HPO₄.12H₂O, 0,4 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄.7H₂O, 10 mg FeSO₄.7H₂O, 10 mg MnSO₄. 4H₂O, 10 mg ZnSO₄.7H₂O, 5 mg Co(NO₃)₂, 50/Ug CuSO₄.5H₂O, 10/Ug MoO, und 5 g CaCO, enthält, werden mit Arthrobacter hyalinus (FERM-P 3125) (DSM 867) in einem Reagenzglas mit einem Innendurchmesser von 20 mm inokuliert. Man kultiviert dann 5 Tage unter Schütteln bei 30°C. Die Konzentration an dem in der Kulturbrühe gebildeten Vitamin B₁₂ beträgt 200/ug/l.

Beispiel 2

Beispiel 1 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß das Mangansalz aus dem Kulturmedium weggelassen wird. Die Konzentration an gebildetem Vitamin B₁₂ beträgt 350/ug/l.

Beispiel 3

Beispiel 1 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß die verschiedenen Kohlenstoff quellen, wie sie in Tabelle I aufgeführt sind, anstelle von Isopropaiiol verwendet werden. Die Konzentrationen an gebildetem Vitamin B₁₂ und die Zellkonzentrationen werden bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt.

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	^OD61O nyu ⁼	- 9 -	L ι υ *+ u / u	Vitamin B₁₂
	Beispiel 4	*** AA.**		(/ug/1)
	Tabelle I		370
Bildung von Vitamin B. I	I₂ durch Arthrobacter hyalinus	240
Kohlenstoffquelle	Zellen	92
	<^OD61O m/u*	81
Äthylalkohol	12	83
n-Propanol	17	180
Äthylenglykol	3,4	bestimmt mit Licht mit
Propylenglykol	5,3	einer Wellenlänge von 610 m/U.
Glycerin	4,0
Aceton	7,6
optische Dichte,

Beispiel 2 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß 3,0 g trockenes Pulver von Malzwhiskeyabfall (SUNGRDWPH, ein Produkt der Sun Growth Co., Ltd.) anstelle von Pepton verwendet werden. Die Konzentration an gebildetem Vitamin B₁₂ beträgt 420 /ug/1 .

Beispiel 5

Arthrobacter hyalinus wird in drei 500 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert, die je 100 ml sterilisiertes Kulturmedium enthalten, das 10 ml Isopropanol, 3 g Pepton, 1 g Hefeextrakt, 3 g NH₄NO₃, 1,5 g Na₂HPO₄.12H₂O, 0,4 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄.7H₂O, 10 mg FeSO₄.7H₂O, 10 mg ZnSO₄.7H₂O, 5 mg Co(N0,)₂, CuSO₄.5H₂O, 10/Ug MoO₃ und 5 g CaCO, enthält. Man kul°

tiviert 2 Tage unter Schütteln bei 30°C. Die erhaltene KulturbrUhe wird als Impfmaterial zurückbehalten.

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5 1 Kulturmedium, das entionisiertes reines Wasser und pro Liter Wasser 10 ml Isopropanol, 3 g Pepton, 1 g Hefeextrakt, 9 ml Maiswasser bzw. Maiseinweichwasser, 12 g NH₄NO.*, 1,5 g Na₂HPO₄.12H₂O, 1,9 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄.7H₂O, 10 mg FeSO₄.7H₂O, 10 mg ZnSO₄.7H₂O, 5 mg Co(N0,)₂, 50/Ug CuSO₄.5H₂O, 10/Ug MoO,, 6 g CaCO, und 0,5 ml eines Antischaummitteis enthält, werden in einem 10 1 Fermentationstank hergestellt und sterilisiert. Dann werden 3OO ml des wie oben beschrieben hergestellten Impfmaterials in dem Kulturmedium inokuliert und dann wird 60 h bei 32⁰C unter Rühren bei 600 U/min gezüchtet, während man aseptische Luft in einer Rate von 2,5 l/min durchleitet. Während des Fermentationsverlaufs werden die Zellen 30 h in der logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet, wobei das Isopropanol so zugegeben wird, daß seine Konzentration in der Kulturbrühe nicht über 3,0 ml/l liegt. Anschließend wird bei der Vitamin B₁₂ bildenden Phase die Menge an zugegebenem Isopropanol so kontrolliert, daß der pH-Wert der Kulturbrühe bei 7 bis 8 liegt. Die Konzentration an gebildetem Vitamin B₁₂ erreicht 1,100/ug/l. Die verbrauchte Menge an Isopropanol beträgt 33 ml/1 Kulturbrühe.

5,3 1 der entstehenden Kulturbrühe werden bei 10 000 G zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Die Extraktion von Vitamin B₁₂ aus den Zellen und seine Reinigung erfolgen in an sich bekannter Weise. Insbesondere wird Isopropanol zu den Zellen in einer Menge zugegeben, die der vierfachen Menge der letzteren entspricht. Das Gemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur an einem dunklen Ort stehengelassen. Die entstehende Zellensuspension in Isopropanol wird bei 10 000 G zur Abtrennung von Isopropanolextrakt zentrifugiert. Das Isopropanol wird aus dem Extrakt verdampft und der Rückstand wird mit einer 8O9iigen wäßrigen Lösung aus Phenol zur überführung des Vitamins B₁₂ in die untere Phenolschicht extrahiert. Die Phenolschicht wird ein Mal mit Wasser gewaschen und dann wird ein Ge-

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misch aus gleichen Volumina Äther und Wasser wird zur Überführung des Vitamins B₁₂ in die wäßrige Phase zugegeben. Die entstehende wäßrige Lösung aus Vitamin B₁₂ wird durch Säulenchromatographie unter Verwendung von TEAE-cellulose gereinigt. Die Vitamin B₁₂ enthaltenden Fraktionen werden konzentriert und Aceton wird zugegeben; man erhält 2,8 mg Vitamin B₁ ,,-Kristalle. Dieses Vitamin B₁₂ ist ein Vitamin B₁₂ des Co-Enzym-Typs.

Beispiel 6

Arthrobacter hyalinus wird in einem Reagenzglas mit einem Innendurchmesser von 20 mm, das 10 ml sterilisiertes Kulturmedium enthält inokuliert. Das Kulturmedium besteht aus entionisiertem reinem Wasser und pro Liter Wasser 10 ml Isopropanol, 10 ml n-Paraffin, 3 g Pepton, 3 g SUNGROWTH (ein trockenes Pulver aus Malzwhiskeyahfallen, ein Produkt der Sun Growth Co., Ltd.), 3 g NH₄NO₃, 1,5 g Na₂HPO₄.12H_£0, 0,4 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄.7H₂O, 10 mg FeSO₄.7H₂O, 10 mg ZnSO₄.7H₂O, 5 mg Co(N0,)₂, 5OyUg CuSO₄.5H₂O und 10 /Ug MoO,, Man kultiviert 5 Tage unter Schütteln bei 30⁰C. Die Konzentration an in der Kulturbrühe gebildetem Vitamin B₁₂ beträgt 1240 /Ug/l.

Beispiel 7

Beispiel 3 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß Arthrobacter simplex (ATCC 6946) anstelle von Arthrobacter hyalinus verwendet wird. Die Konzentration an gebildetem Vitamin B₁₂ und die Zellkonzentrationen werden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.

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	- «--	2704070
	' /ty/
	Tabelle II
Bildung von Vitamin B.	■Ρ durch Arthrobacter	simplex
Kohlenstoffquelle	Zellen	Vitamin B₁₂ (/ug/l)
Äthylalkohol	3,2	51
n-Propanol	10,0	103
i-Propanol	3,1	84
Äthylenglykol	3,2	92
Propylenglykol	11,9	124
Glycerin	7,7	89
Aceton	3,1	134

n-Paraffin 19,0 130

Beispiel 8

Beispiel 2 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß Arthrobacter tumescens (IFO 12960) anstelle von Arthrobacter hyalinus und 10 ml Glycerin anstelle von Isopropanol verwendet werden. Die Konzentration an gebildetem Vitamin B₁₂ beträgt 134/Ug/l und die Zellkonzentration beträgt 17,4 (ODg_{10 m u} )·

Beispiel 9

Beispiel 2 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß Arthrobacter globiformis (ATCC 8010) anstelle von Arthrobacter hyalinus und 10 ml Aceton anstelle von Isopropanol verwendet werden. Die Konzentration an gebildetem Vitamin B₁₂ beträgt 91/ug/l und die Zellkonzentration beträgt 2,90 (ODg_{10 m u}).

Bei den obigen Beispielen wird das Vitamin B₁₂ in der Kulturbrühe nach dem folgenden Mikroorganismus-Bestimmungsverfahren bestimmt. Kaliumcyanid wird in die verdünnte Kulturbrühe gegeben, und nach Einstellen des pH-Wertes auf 5 wird das Gemisch 15 min zum Umwandlung von Vitamin B₁₂ in Cyanocobalamin gekocht. Es wird dann quantitativ unter Verwendung von Lactobacillus leichmannii (ATCC 7830) bestimmt.

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Claims

Patenten g,p r ü c h e

Verfahren zur Herstellung von Vitamin B₁₂, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Vitamin B₁₂ bildenden Mikroorganismus des Genus Arthrobacter unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium züchtet, das mindestens eine Verbindung aus der Gruppe Alkohole mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen und Ketone enthält, und das Vitamin B₁₂ aus der Kulturbrühe abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40° C durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 9»5 durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung aus der Gruppe Äthylalkohol, n-Propanol, i-Propanol, Äthylenglykol, Propylenglykol, Glycerin und Aceton ausgewählt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Vitamin B₁₂ bildender Mikroorganismus Arthrobacter simplex verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Vitamin B₁₂ bildender Mikroorganismus Arthrobacter tumescens verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Vitamin B₁₂ bildender Mikroorganismus Arthrobacter globiformis verwendet wird.

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8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Vitamin B^ bildender Mikroorganismus Arthrobacter hyalinus verwendet wird.

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