<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Poly-D- (-)-3-hydroxybuttersäure mit einem hohen Ertragskoeffizienten und einer verbesserten Anreicherung von PHB im bakteriellen Zellmaterial, bei dem ein Mikroorganismus in zwei getrennten, aufeinanderfolgenden Fermentierungsstufen kontinuierlich gezüchtet wird.
Es ist seit längerer Zeit bekannt, dass eine Vielzahl von Mikroorganismen prokaryotischer Natur imstande ist, PHB als Speicherstoff für Energie und Kohlenstoff zellintern anzuhäufen. Die aus dem Zellmaterial des Mikroorganismus isolierte PHB ist ein thermoplastischer Polyester mit günstigen physikalischen Eigenschaften, die seine Verwendung für ähnliche Zwecke erwarten lassen, für welche heute beispielsweise Polyäthylen oder Polystyrol zur Verfügung stehen. Gegenüber diesen heute gebräuchlichen Polymeren hat die PHB aber den Vorteil, dass sie auf biotechnologischem Weg zugänglich und auf biologischem Weg auch wieder abbaubar ist.
Es ist auch schon bekannt, dass die aerobe Kultivierung von PHB-speichernden Mikroorganismen durch die spezifische Zusammensetzung des Nährmediums bevorzugt in Richtung von Zellteilung und Wachstum oder in Richtung von zellinterner PHB-Speicherung gesteuert werden kann. Eine Anreicherung von PHB in den Zellen des Mikroorganismus wird bei den bekannten Verfahren dann erreicht, wenn im Nährmedium die Konzentration der Kohlenstoffquelle im Verhältnis zum Angebot an andern für das Wachstum erforderlichen Nährstoffen, beispielsweise Stickstoff und Phosphor, gross ist und die Züchtung des Mikroorganismus beispielsweise unter ammoniumlimitierten Wachstumsbedingungen erfolgt.
Ein auf diesen Erkenntnissen beruhendes zweistufiges Verfahren zur Herstellung von PHB ist
EMI1.1
schliesslich einer vollständigen und ausreichenden Versorgung mit Stickstoff und Phosphor, gezüchtet, bis die Mikroorganismenpopulation eine Konzentration von vorzugsweise 20 bis 25 g Biomasse/l Kulturflüssigkeit erreicht hat, ohne dass in dieser Wachstumsphase eine zellinterne PHB-Speicherung auftritt. Die vollständige Unterbrechung der Stickstoff- und/oder Phosphorversorgung des Kulturmediums in der zweiten Fermentationsstufe bewirkt dann einen Stillstand der Reproduktion und des Bakterienwachstums, wobei erst in dieser Phase zellintern PHB-Speicherung eintritt. Nach Angaben in der EP-A-15669 werden bei diesem Verfahren Biomassen mit einem PHB-Gehalt von höchstens 25 bis 47 Gew.-% des Zelltrockengewichts erhalten.
In der EP-A-46344 ist ein demgegenüber verbessertes Fermentationsverfahren für die Herstellung von PHB beschrieben, welches auf einer kontinuierlichen aeroben Kultivierung von Mikroorganismen des Species Alcaligenes eutrophus beruht. Nach den dort gemachten Angaben gelingt es bei diesem Verfahren ein kontrolliertes Wachstum der Mikroorganismenpopulation und gleichzeitig eine zellinterne PHB-Anreicherung dadurch zu erzielen, dass im Gegensatz zum Verfahren der EP-A-15669 die Versorgung mit den für das Wachstum essentiellen Nähr- und Spurenstoffen, insbesondere die Versorgung mit Stickstoff, von Beginn der Kultivierung an beschränkt wird.
Als Verfahrensvariante ist auch vorgesehen, die Kulturflüssigkeit mit dem Mikroorganismus,
EMI1.2
wobei jene Nährstoffkomponente, deren Konzentration schon in der ersten Stufe zur Eindämmung des Wachstums beschränkt wurde, in der zweiten Stufe der Nährlösung überhaupt nicht mehr zugesetzt wird, da während der Speicherphase ein Wachstum überhaupt nicht mehr erwünscht ist.
Mit dem Verfahren der EP-A-46344 ist zwar eine bessere Ausnutzung der Kohlenstoffquelle im Nährmedium und eine verbesserte Speicherung der PHB erreicht, es erweist sich aber als nachteilig, dass durch die Unterversorgung mit wachstumsessentiellen Nährstoffen sowohl die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit als auch die PHB-Bildungsgeschwindigkeit deutlich herabgesetzt wird.
Ein weiterer Nachteil bei diesem Verfahren ist darin zu sehen, dass bei der Species Alcaligenes eutrophus der optimale Temperaturbereich für die Fermentierung verhältnismässig tief liegt.
Der Mikroorganismus muss daher unter starker Kühlung bei 30 bis 34 C in einem Temperaturbereich gezüchtet werden, in dem sowohl Wachstum als auch PHB-Speicherung langsamer verlaufen, als es bei Mikroorganismen mit einer grösseren Thermotoleranz, die bei höherer Temperatur kultiviert werden können, der Fall ist.
<Desc/Clms Page number 2>
Aus den genannten Gründen wird daher bei den bekannten Verfahren die Wirtschaftlichkeit der PHB-Herstellung durch die langen Verweilzeiten und die entsprechend niedrigen Verdünnungsraten beim kontinuierlichen Betrieb des Fermenters beeinträchtigt.
Als Kohlenstoffquelle unter den Kohlehydraten dient beim Verfahren der EP-A-46344 in erster Linie Fructose und nur für den Fall, dass spezielle vom Stamm Alcaligenes eutrophus H 16 abgeleitete Mutanten verwendet werden, kann auf Glucose als Nährstoffquelle ausgewichen werden. Neben dem Umstand, dass die Züchtung und Auslese der Mutanten aus dem Elternstamm arbeitsaufwendig ist, wird durch den Einsatz dieser Mutanten das Angebot an verwertbaren Nährstoffquellen, die eine wirtschaftliche Herstellung von PHB ermöglichen würden, nicht wesentlich erweitert, da die in grosser Menge zur Verfügung stehenden Disaccharide, die als Hauptlieferant für Glucose dienen, beispielsweise die in der Melasse oder industriellen Zuckerlösungen enthaltene Saccharose, auch für die von Alcaligenes eutrophus H 16 abgeleiteten Mutanten nicht verwertbar sind.
Neben Alcaligenes eutrophus werden in der EP-A-46344 zwar auch noch andere Species der Gattung Alcaligenes als brauchbar für die PHB-Speicherung erwähnt, beispielsweise Alc. faecalis, Alc. ruhlandii, Alc. latus, Alc. aquamarinus, jedoch werden für keine dieser Species nähere Angaben über Züchtungs- und Anreicherungsbedingungen gemacht und die Durchführung der Erfindung ist in der Beschreibung und in den Beispielen nur mit Stämmen von Alcaligenes eutrophus geoffenbart.
Demgegenüber liegt dieser Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein wirtschaftliches zweistufiges Verfahren zur kontinuierlichen fermentativen Herstellung von PHB mit einem hohen Ertragskoeffizienten und einer verbesserten Anreicherung von PHB im Zellmaterial des Mikroorganismus unter Ausnutzung von billigeren Kohlenstoffquellen zu schaffen, bei dem die den bekannten Verfahren anhaftenden Nachteile vermieden werden.
Bei der Lösung dieser Aufgabe hat sich nun überraschenderweise gezeigt, dass ein sehr rasches Wachstum der Mikroorganismenpopulation mit gleichzeitiger effektiver PHB-Speicherung bei einer hohen Verdünnungsrate erzielt werden und die Abhängigkeit des Mikroorganismus von der Natur der verwertbaren Kohlenstoffquelle weitgehend beseitigt werden kann, wenn man Stämme von Alcaligenes latus oder deren Mutanten im Temperaturbereich von 36 bis 42 C in einem zweistufigen Fermentationsverfahren unter Bedingungen kultiviert, die bisher für die fermentative Herstellung von PHB nicht bekannt waren.
Zu den wesentlichen Merkmalen dieses neuen verbesserten Produktionsverfahrens für PHB gehört, dass man im Gegensatz zum bekannten Stand der Technik durch eine unbeschränkte Nährstoffversorgung, einschliesslich einer vollständigen und ausreichenden Versorgung mit Stickstoff und Phosphor, die Reproduktion und das rasche Wachstum der Mikroorganismenpopulation fördert und überraschenderweise gleichzeitig eine wirksame intrazelluläre PHB-Speicherung erzielt, ohne dass man die Kultur wachstumslimitierenden Bedingungen unterzieht.
Es wurde gefunden, dass unter diesen Bedingungen die PHB-Herstellung in besonders produktiver Weise durchgeführt und eine gute Ausnutzung der Kohlenstoffquelle im Nährmedium erreicht werden kann, wenn man den Mikroorganismus kontinuierlich in zwei getrennten, aufeinanderfolgenden Kulturstufen bei unbeschränkter Nährstoffversorgung züchtet, in der zweiten Stufe aber die Züchtung bei einem gegenüber der ersten Stufe geringeren Gelöstsauerstoffgehalt im Nährmedium fortsetzt.
Auf diese Weise entstehen innerhalb von kürzeren Verweilzeiten im Fermenter Biomassen mit einer bedeutend besseren Anreicherung an PHB als es dem Stand der Technik entspricht, wodurch die Herstellung und Isolierung der PHB auf wirtschaftlichere Weise, als es bisher möglich war, gelingt.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Poly-D- (-)-3-hydroxybuttersäure durch aerobe Kultivierung eines Mikroorganismus der Gattung Alcaligenes in einem wässerigen Kulturmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor, sowie das für das Wachstum des Mikroorganismus erforderliche Angebot an Spurennährstoffen enthält, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Stamm von Alcaligenes latus oder eine von diesem Mikroorganismus abgeleitete, PHB-speichernde Mutante bei vollständiger und für das Wachstum des Mikroorganismus optimaler Nährstoffversorgung unter
<Desc/Clms Page number 3>
unlimitierten Wachstumsbedingungen im Temperaturbereich von 36 bis 42 C in zwei getrennten,
aufeinanderfolgenden Fermentierungsstufen unter sterilen Bedingungen kontinuierlich züchtet, indem man die in der ersten Stufe bei einem Gelöstsauerstoffgehalt von 25 bis 50% des Sättigungswertes für Luft gezüchtete, PHB-hältige Mikroorganismenpopulation zusammen mit der Kulturlösung kontinuierlich in eine zweite Fermentierungsstufe überführt, in der die Züchtung bei einem Gelöstsauerstoffgehalt von 8 bis 15% des Sättigungswertes für Luft fortgesetzt wird, und aus der dabei erhaltenen Biomasse die PHB auf übliche Weise durch Extraktion gewinnt.
Zur Durchführung des Verfahrens eignen sich alle bekannten Stämme von Alcaligenes latus, beispielsweise die Stämme DMS (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) Nr. 1122, DSM Nr. 1123 oder DSM Nr. 1124.
Die morphologischen Eigenschaften dieser Stämme sind in der Literatur bei Palleroni et al. im Int. Journ. of Systematic Bacteriology 28,416 bis 428,1978 beschrieben und in Katalogen von Kultursammlungen, beispielsweise in der American Type Culture Collection (ATCC), verzeichnet. Kulturproben der durch DSM-Nummern identifizierten Mikroorganismen sind von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen in Göttingen der Gesellschaft für biotechnologische Forschung, MBH in Stöckheim, Deutsche Bundesrepublik, für den Fachmann frei erhältlich.
Für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eignen sich auch die PHB-speichernden Mutanten der Stämme von Alcaligenes latus, die durch übliche Verfahren aus den Elternstämmen erhalten worden sind.
Stämme von Alcaligenes latus haben die für eine wirtschaftliche PHB-Produktion vorteilhafte Eigenschaft, dass sie in der Lage sind, eine breite Palette von Kohlenstoffquellen zum Wachstum und zur PHB-Speicherung zu verwerten. Als Kohlenstoffquellen sind beispielsweise zu nennen Koh-
EMI3.1
lösliche Salze der Glucon-, 2-Keto-glucon-, Ameisen-, Essig-, Butter-, Isobutter-, L-Malon-, D- (-)-Wein-, Aconit-, Itacon-, m-Hydroxybenzoe-, p-Hydroxybenzoe-, Gentisin-, Protocatechuund Mandelsäure ; Alkohole wie n-Propanol, Isopropanol, 2, 3-Butylenglycol, Propylenglykol, Propylenglykol, Glycerin ; Aminosäuren, wie ss-Alanin, L-Alanin, L-Serin, L-Threonin, L-Leucin, L-Citrullin, L-Irnithin, L-Aminobutyrat, L-Aspartat, L-Asparagin, L-Glutamat, L-Prolin, Hippurat, Sarcosin und Creatin ; oder auch Amine, wie Butylamin.
Gemäss ihren Eigenschaften als fakultativ chemolithoautotrophe Mikroorganismen sind die Stämme von Alcaligenes latus aber auch noch in der Lage, neben den bisher aufgezählten Kohlenstoffquellen Kohlendioxyd zu verwerten, wenn Kohlendioxyd in einem Gemisch mit Wasserstoff und Sauerstoff zusammen als einzige Kohlenstoffquelle angeboten wird.
Da die Wirtschaftlichkeit eines biotechnologischen Verfahrens zur Herstellung von PHB sehr wesentlich vom Preis der Kohlenstoffquelle im Nährsubstrat abhängt, ist die Verweilzeit einer so grossen Anzahl von Verbindungen beim erfindungsgemässen Fermentierungsverfahren von grossem Vorteil, da auf die jeweils billigste Kohlenstoffquelle ausgewichen werden kann.
Die ausgezeichnete Verwertbarkeit der leicht zugänglichen Disaccharide ist mit Rücksicht auf die Verfügbarkeit des Nährsubstrats und die Wirtschaftlichkeit der PHB-Herstellung ein überraschendes und vorteilhaftes Merkmal des erfindungsgemässen Verfahrens. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dem Mikroorganismus Saccharose, die in industriellen Zuckerlösungen, beispielsweise Grünsirup, oder in Abfallprodukten der Zuckergewinnung, beispielsweise Rübenmelasse, enthalten ist, als Kohlenstoffquelle angeboten, wobei wieder die Kultivierung des Stammes Alcaligenes latus DSM Nr. 1123 mit Saccharose wegen der hohen PHB-Produktbildungsgeschwindigkeit besonders vorteilhaft ist.
Werden dem Mikroorganismus aus der Gruppe assimilierbarer Kohlenstoffverbindungen solche angeboten, die zugleich Stickstoff im Molekül haben, kann der Kohlenstoff- und Stickstoffbedarf aus derselben Quelle gedeckt werden. Als Stickstoffquelle werden von den Alcaligenes latus-Stämmen auch noch Ammoniak, Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat, und Nitrate verwendet. Weiters kann der notwendige Stickstoffbedarf auch durch den Stickstoffgehalt von industriellen und biologischen Abwässern weitgehend gedeckt werden.
Die Zusammensetzung der Nährlösung hinsichtlich ihrer weiteren mineralischen Komponenten
<Desc/Clms Page number 4>
umfasst Phosphor, beispielsweise in Form von Natriumhydrogenphosphat oder Kaliumhydrogenphosphat, Magnesium, beispielsweise als Magnesiumsulfat, Calcium beispielsweise als Calciumchlorid und Eisen beispielsweise in Form von Eisen (11 I) -chlorid, Eisensulfat oder Eisen (III)-ammoniumcitrat.
Weitere Spurenmineralstoffe, die für das Wachstum essentiell sind, können dem Nährmedium bevorzugt in Form einer Spurenlösung zugegeben werden, die beispielsweise folgende Zusammensetzung hat : ZnS0... 7H2O 100 mg/l
EMI4.1
4H2C)CuSOt. 5HzO 10 mg/l Nicl 2. 6H 20 20 mg/l NaMo0... 2H : 0 30 mg/l
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geht man zweckmässigerweise so vor, dass man zunächst eine oder mehrere Vorkulturen, beispielsweise in einem flüssigen Nährmedium, herstellt und dann eine im Produktionsfermenter vorbereitete Nährlösung der angegebenen Zusammensetzung mit der gut angewachsenen Vorkultur im Verhältnis von etwa 1 : 5 bis 1 : 15 impft.
Während der gesamten Dauer der Kultivierung wird in beiden Stufen der Fermentierung durch die Ergänzung der verbrauchten Nährsubstrate dafür Sorge getragen, dass die Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor, sowie für sämtliche organischen und anorganischen Spurennährstoffe in der für das Bakterienwachstum optimalen Konzentration gehalten werden. Unter optimaler Nährstoffversorgung im Sinne der Erfindung ist die Züchtung des Mikroorganismus in einem Kulturmedium zu verstehen, das über die gesamte Dauer der Fermentierung hinweg alle Komponenten des vollständigen Nährstoffangebotes in solchen Konzentrationen enthält, dass in der Kultur unlimitierte Wachstumsbedingungen herrschen und der Mikroorganismus keinen Mangel und keine Beschränkung in der Versorgung mit wachstumsessentiellen Nährstoffen, beispielsweise mit Stickstoff oder Phosphor, erfährt.
Die optimale Versorgung mit Stickstoff für das Bakterienwachstum wird nach der Methode von Warburg beschrieben in Manometric Techniques von Umbreit W. W., Burris R. H., Stauffer J. S., Burges Publishing Company, Minneapolis, USA, 1964 am Warburg Respirator bestimmt. Für die Stämme von Alcaligenes latus ist die optimale Stickstoffversorgung, ohne für das Wachstum limitierende Bedingungen zu schaffen, in der Regel dann gegeben, wenn im Kulturmedium während der
EMI4.2
ders bevorzugt ist.
Für die optimale Phosphorversorgung ist eine Konzentration von mindestens 500 mg/l Phosphor empfehlenswert, wobei die Einhaltung einer Konzentration von 600 mg bis 1, 2 g/l wieder besonders bevorzugt ist.
Als Kohlenstoffquelle enthält eine für das Verfahren optimale Nährlösung beispielsweise von 1, 5 bis 40 g Saccharose/l des Kulturmediums, wobei in der ersten Fermentationsstufe eine Konzentration von 4 bis 10 g/l Saccharose besonders bevorzugt ist. Bei der Kultivierung von Stämmen von Alcaligenes latus unter den erfindungsgemässen Bedingungen tritt überraschenderweise keine ausgeprägte Speicherphase für PHB in Abhängigkeit von der Nährstofflimitierung, beispielsweise durch Unterversorgung mit Stickstoff, auf, sondern es ist eine mit dem Wachstum assoziierte, äusserst effiziente PHB-Anreicherung unter für den Mikroorganismus günstigen Wachstumsbedingungen bei vollständiger Nährstoffversorgung zu beobachten.
Die wachstumsassoziierte PHB-Speicherung bei uneingeschränkter Nährstoffversorgung hat den Vorteil, dass weder spezifische Wachstumsgeschwindigkeiten noch die PHB-Produktbildungsgeschwin-
<Desc/Clms Page number 5>
digkeiten durch Nährstoffmangel herabgesetzt werden und daher eine grössere Konzentration an Biomasse mit einer besseren PHB-Anreicherung innerhalb von wesentlich kürzeren Fermentierzeiten gebildet wird, als es bei den bekannten Verfahren, die unter limitierter Nährstoffversorgung arbeiten, der Fall ist.
Auf Grund dieser hohen Wachstums-und Produktbildungsgeschwindigkeiten werden beim erfindungsgemässen Verfahren in der ersten Fermentierungsstufe bei einer PHB-Speicherung von mehr als 70 Gew.-% des Zelltrockengewichts, beispielsweise Verdünnungsraten D von 0, 30 bis 0, 41 h-1 erreicht und in der zweiten Stufe immerhin noch solche von 0, 28 bis 0, 33 h-l.
EMI5.1
EMI5.2
nuierlichen Zulaufverfahren in den Fermenter, der bevorzugt ein Fermentierkessel ist, eingebracht, bis das maximale Arbeitsvolumen des Fermenters erreicht ist.
Nach Erreichen des maximalen Arbeitsvolumen wird das Verfahren kontinuierlich weitergeführt, indem der Kultur einerseits in konstantem Strom frische Nährlösung zugeführt und anderseits dem Fermenter eine dem Zufluss äquivalente Menge der Nährlösung mit der gebildeten, PHB-hältigen Mikroorganismenpopulation entnommen und in den zweiten Fermenter übergeführt wird.
Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen, beispielsweise unter Sauerstoff- oder Luftzufuhr, wobei zweckmässigerweise der Gelöstsauerstoffgehalt durch Variation der eingetragenen Luftoder Sauerstoffmenge pro Zeiteinheit in der ersten Stufe in einem Bereich von 25 bis 50% des Sättigungswertes für Luft gehalten wird. Zur Förderung von ungestörtem Wachstum und PHB-Anreicherung ist es vorteilhaft, sterile Luft in das gerührte Kulturmedium einzutragen. Es ist auch möglich, durch Variation der Rührerdrehzahl den Gelöstsauerstoffgehalt im gewünschten Bereich zu halten.
Die Verdünnungsraten werden unter den angegebenen Bedingungen zweckmässigerweise so gewählt, dass die Mikroorganismenpopulation im ersten Fermenter nach Erreichen eines stabilen Gleichgewichtszustandes auf einer Konzentration von etwa 15 bis 25 g bakterieller Trockenmasse/l
EMI5.3
des Verfahrens besonders vorteilhaft ist.
Der zweite Fermenter kann die gleiche Form wie der erste haben und als Rührkessel ausgebildet sein. Da die Verdünnungsrate in der zweiten Fermentierungsstufe in der Regel geringer als in der ersten Stufe ist, muss zur Aufrechterhaltung des kontinuierlichen Betriebes die Züchtung des Mikroorganismus in der zweiten Stufe in einem grösseren Fermenter fortgesetzt werden, dessen Arbeitsvolumen so bemessen ist, dass den unterschiedlichen Verdünnungsraten in der ersten und zweiten Stufe und dem zusätzlichen Nährstoffzulauf Rechnung getragen wird.
Die im Zulauf aus dem ersten Fermenter enthaltene Restkonzentration an Nährstoffen wird durch Zugabe von frischen Nährstoffen laufend so weit ergänzt, dass auch in der zweiten Stufe eine optimale und vollständige Nährstoffversorgung gewährleistet ist. Durch diese Massnahme wird erreicht, dass die Wachstumsphase während der gesamten Dauer der Fermentierung aufrecht erhalten wird und die zellinterne PHB-Speicherung wachstumsassoziiert mit hoher Geschwindigkeit erfolgt.
Ausserdem ist unter Wachstumsbedingungen überraschenderweise eine relative Vergrösserung der speichernden Zellen in der zweiten Fermentierungsstufe zu beobachten, so dass die Abtrennung der Biomasse aus der Nährlösung einfacher durchzuführen ist. Dadurch können die Zellmassen beispielsweise durch einfaches Filtrieren gut abgetrennt werden und man kann sich aufwendigere Einrichtungen, beispielsweise die Anschaffung von Zentrifugen für den Trennvorgang, ersparen.
Da in der zweiten Fermentationsstufe der Zeitpunkt des grössten expotentiellen Wachstums der Mikroorganismenpopulation bereits überschritten ist, kann es vorteilhaft sein, die Nährstoffkonzentrationen an der unteren Grenze der oben für die optimale Nährstoffversorgung angegebenen Bereiche zu halten, um eine möglichst gute Nutzung der eingesetzten Nährstoffe zu erzielen.
<Desc/Clms Page number 6>
Die Zusammensetzung des Nährmediums und der Zulauf der frischen Nährstoffe werden in der zweiten Fermentierungsstufe daher vorteilhafterweise so geregelt, dass die Konzentration der Kohlenstoffquelle in der Kulturflüssigkeit den Wert von etwa 1, 5 g Saccharose/l Kulturflüssigkeit nicht unterschreitet, wobei eine Konzentration von 1, 5 bis 2, 5 g wieder besonders bevorzugt ist. Die Stickstoffkonzentration beträgt mindestens 45 mg, bevorzugt aber etwa von 50 bis 60 mg/l Kulturflüssigkeit.
Der Gelöstsauerstoffgehalt der Nährlösung wird in der zweiten Fermentierungsstufe auf 8 bis 15%, bevorzugt auf 8 bis 10% des Sättigungswertes für Luft abgesenkt. Die Absenkung des Gelöstsauerstoffgehalts hat den Vorteil, dass einerseits die Kosten für den Sauerstofftransfer verringert werden und gleichzeitig die Kohlenstoffquelle im Nährmedium besser ausgenutzt werden kann. Die bessere Ausnutzung der Nährstoffquelle ist vor allem deshalb von Bedeutung, weil dadurch die Restkonzentration an Kohlenstoff im Ablauf nach Ende der Fermentierung wesentlich verringert werden kann.
Unter den Bedingungen des erfindungsgemässen Verfahrens ist der Mikroorganismus imstande, den PHB-Gehalt in den Zellen bis zu etwa 84 Gew.-% des Zelltrockengewichts anzureichern. Bei der praktischen Durchführung des Verfahrens wird in der zweiten Fermentierungsstufe die Verdünnungsrate zweckmässigerweise so eingestellt, dass die Mikroorganismenpopulation auf eine Konzentration von 15 bis 35 g Zelltrockengewicht/l Kulturflüssigkeit bei einem PHB-Gehalt von 70 bis 80 Gew.-%, vorzugsweise von 75 bis 80 Gew.-% des Zelltrockengewichts angereichert wird.
Die Stämme von Alcaligenes latus sind im Gegensatz zur Species Alcaligenes eutrophus überraschenderweise thermotoleranter. Diese erhöhte Thermotoleranz zeigt sich darin, dass der optimale
EMI6.1
neben der beschleunigenden Wirkung auf Wachstum und PHB-Speicherung den Vorteil, dass die Kühlkosten während der Fermentierung erheblich gesenkt werden können. Die Einsparung an Kühlkosten durch die Züchtung bei höherer Temperatur in Verbindung mit kürzeren Verweilzeiten fällt besonders ins Gewicht, da die Kühlkosten in der Regel die Hälfte der Energiekosten betragen, die beim Betrieb eines Fermenters anfallen.
Der PH-Wert der Nährlösung wird während der gesamten Dauer der Fermentation durch laufende Zugabe von Pufferlösung, beispielsweise von Phosphatpufferlösung oder von wässeriger Base, beispielsweise Kalium- oder Natriumhydroxydlösung vorteilhafterweise auf Werte zwischen 6, 5 und 7, 5, bevorzugt auf Werte von 6, 8 bis 7, 2 eingestellt.
Unter den angegebenen Bedingungen kann der kontinuierliche Betrieb des Verfahrens über Wochen aufrecht erhalten werden, ohne dass sich in der Zusammensetzung der erhaltenen Biomasse oder beim Ertragskoeffizienten Änderungen ergeben.
Bei der Verwendung von Kohlehydraten als Kohlenstoffquelle werden beim erfindungsgemässen Verfahren Ertragskoeffizienten Y xIs = 0, 42 bis 0, 46 in beiden Verfahrensstufen erzielt, d. h. pro Gramm des eingesetzten Kohlehydrats werden 0, 42 bis 0, 46 g Zelltrockengewicht in Form von PHB- - hältiger Biomasse gewonnen.
Im Ausmasse des Zulaufs in den zweiten Fermenter wird Kulturlösung mit der an PHB angereicherten Mikroorganismenpopulation entnommen und die Zellmassen durch übliche Trennmethoden, wie Dekantieren oder Zentrifugieren, bevorzugt aber durch Filtrieren abgetrennt und daraus die PHB auf übliche Weise durch Extrahieren gewonnen, beispielsweise nach dem Verfahren der US-PS Nr. 4, 101, 533.
Die von der Biomasse befreite Nährlösung enthält in der Regel nur mehr geringe Nährstoffkonzentrationen.
Zur Ausnutzung der zurückbleibenden Nährstoffe kann die von Zellen befreite Nährlösung im Kreislauf in den ersten Fermenter zurückgeführt, zur Erreichung der optimalen Nährstoffkonzentration mit frischer Nährlösung versetzt und für weitere Züchtungen verwendet werden.
Im folgenden Beispiel ist die Erfindung näher erläutert :
Beispiel : In einem sterilen Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 15 l werden 10 l eines Nährmediums I mit einem Gehalt von 1, 5 g/l (NH ) 2S02 und 15 g/l Saccharose steril filtriert vorgelegt und mit 1 l einer gut angewachsenen Vorkultur von Alcaligenes latus DMS Nr. 1123 beimpft.
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
:CaCl2. 2H20 0, 02 g/l
Spurenlösung : 2 ml/l
Fe III-NH4-Citrat : 0, 05 g/l Die Spurenlösung hat folgende Zusammensetzung : ZuSO,. 7H2O : 100 mg/l MnCI2. 4H2O : 30 mg/l H gBOg : 300 mg/I
EMI7.2
Bereich zwischen 28 und 30% des Sättigungswertes für Luft gehalten, die Arbeitstemperatur beträgt 37 C.
Während der Fermentation wird der PH-Wert der Nährlösung durch automatische Titration mit einer 10%igen sterilen wässerigen NaOH-Lösung bei 7, 0 konstant gehalten.
Im weiteren Verlaufe der Züchtung werden die Nährsubstrate mittels eines kontinuierlichen Zulaufverfahrens durch einen den Verbrauchsgeschwindigkeiten und der Verdünnung angepassten Zulauf mit frischen Nährlösungen konstant gehalten. Die frischen Nährlösungen bestehen aus Saccharoselösung mit einer Konzentration von 300 g/l, (NH4)2SO4-Lösung mit einer Konzentration von 200 g/l und frischem Medium I.
Wenn das maximale Arbeitsvolumen des Reaktors erreicht ist, wird eine kontinuierliche Arbeitsweise in der Form eingerichtet, dass der Kultur einerseits in konstantem Strom frische Nährlösung zugeführt wird, anderseits eine dem Zufluss äquivalente Menge an Nährlösung entnommen und im kontinuierlichen Strom in einen zweiten Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 25 l überführt wird. Die frisch zugeführte Nährlösung enthält Saccharose in einer Konzentration von 40 g/l, (NH4)2SO4 in einer Konzentration von 4, 6 g/l und frisches Medium I in der oben angegebenen Zusammensetzung.
Auf diese Weise wird nach einiger Zeit ein stabiler Gleichgewichtszustand erreicht, wobei die Kulturbrühe in der ersten Fermentationsstufe 16,5 g/l trockener Biomasse mit einem PHB-Gehalt von 71 Gew.-% enthält.
EMI7.3
die 26, 64 g/l Ammonsulfat und Saccharose mit einer Konzentration von 236 g/l enthält, versorgt um die Konzentration dieser beiden Substrate auch in dieser Phase nicht limitierend werden zu lassen. Durch diese Massnahmen wird die Wachstumsphase während der gesamten Züchtung aufrechterhalten.
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
durchfluss von 7, 5 l/h entspricht.
Diese kontinuierliche Fermentierung kann über einen Zeitraum von drei Wochen problemlos aufrechterhalten werden, ohne dass sich hinsichtlich der Ertragskoeffizienten Y x/s = 0, 46 oder an der Zusammensetzung der Biomasse Änderungen ergeben.
In der nachfolgenden Tabelle I sind die Betriebsbedingungen bei der kontinuierlichen zwei-
EMI8.2
EMI8.3
<tb>
<tb> Stufe <SEP> 1 <SEP> Stufe <SEP> 2
<tb> Arbeitsvolumen <SEP> 15 <SEP> l <SEP> 25 <SEP> l
<tb> Rührung <SEP> Querblatt <SEP> Querblatt
<tb> Temperatur <SEP> 37 C <SEP> 37 C
<tb> PH-Wert <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 02-Konzentration
<tb> (% <SEP> der <SEP> Luftsättigung) <SEP> 28-30% <SEP> 8-10%
<tb> Verdünnungsrate <SEP> D <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> h-1 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> h-1 <SEP>
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> Saccharose <SEP> Saccharose
<tb> Saccharosekonzentration
<tb> im <SEP> Zulauf <SEP> 40 <SEP> g/l
<tb> Stickstoffquelle <SEP> (NH4)2SO4 <SEP> (NH4)2SO4
<tb> Konzentration <SEP> (NH) <SEP> SQ,
<tb> im <SEP> Zulauf <SEP> 4,6 <SEP> g/l
<tb> Restkonzentration <SEP> Saccharose <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP> g/l <SEP> 2,
<SEP> 1 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Restkonzentration <SEP> (NH,) <SEP> 2SO4 <SEP> 0,45 <SEP> g/l <SEP> 0,085g/l
<tb> Saccharoseverbrauch <SEP> 35, <SEP> 9 <SEP> g/l <SEP>
<tb> (NH4)2SO4-Verbrauch <SEP> 4,15 <SEP> g/l <SEP> Biomassekonzentration <SEP> 16,5 <SEP> g/l <SEP> 35,5 <SEP> g/l
<tb> PHB-Gehalt <SEP> der <SEP> Biomasse <SEP> 71% <SEP> d. <SEP> ZTG <SEP> 79%
<tb> Produktivität <SEP> Biomasse <SEP> 99 <SEP> g/h <SEP> 266, <SEP> 4 <SEP> g/h
<tb> Produktivität <SEP> PHB <SEP> 70, <SEP> 4 <SEP> g/h <SEP> 210, <SEP> 46 <SEP> g/h
<tb> Yx.
<SEP> Saccharose <SEP> 0,46 <SEP> g/g <SEP> 0,46 <SEP> g/g
<tb> y <SEP> (NH4)2SO4 <SEP> 3,98 <SEP> g/g <SEP> 3,98 <SEP> g/g
<tb> (NH4)2SO4-Konzentration <SEP> - <SEP> 26,64 <SEP> g/l
<tb> im <SEP> Teilstromfermenter <SEP> 2- <SEP> (1, <SEP> 5 <SEP> l/h) <SEP>
<tb> Saccharose-Konzentration <SEP> - <SEP> 236 <SEP> g/l
<tb> im <SEP> Teilstromfermenter <SEP> 2- <SEP> (1, <SEP> 5 <SEP> l/h) <SEP>
<tb> Biomasse-Konzentration <SEP> im <SEP> Zulauf <SEP> - <SEP> 13,2 <SEP> g/l
<tb>