DE2452502B2

DE2452502B2 - Verfahren zur zuechtung aethanol assimilierender hefen

Info

Publication number: DE2452502B2
Application number: DE19742452502
Authority: DE
Inventors: Teizi Niigata Urakami (Japan)
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1973-11-09
Filing date: 1974-11-05
Publication date: 1977-05-26
Also published as: US3929578A; DE2452502A1; JPS5071881A; IT1024777B; GB1433473A; JPS5328984B2; CA1036088A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung Äthanol assimilierender Hefen der Gattungen Pichia, Candida, Saccharomyces, Hansenula, Torulopsis oder Lipomyces bei einem pH-Wert von 2,0 bis 5,0 und einer Temperatur von 25 -48° C in einer Kulturflüssigkeit unter Verwendung von Äthanol als Hauptkohlenstoffquelle.

Es ist bereits bekannt, daß verschiedene Mikroorganismen Äthanol assimilieren können; jedoch sind Untersuchungen über Fermentationen, die auf die Züchtung der Mikroorganismenzellen unter Verwendung von Äthanol als Hauptkohlenstoffquelle gerichtet sind, nur in geringem Umfang durchgeführt worden.

Es ist bekannt, daß die Äthanolkonzentration eines Mediums zur Herstellung von Hefezellen durch Züchtung von Hefen unter Verwendung von Äthanol als einer Kohlenstoffquelle 2, Gew.-% oder mehr, am besten 3—8 Gew.-°/o, betragen soll. Wenn ein Medium eine solch große Äthanolmenge enthält, verdampft das Äthanol während der Züchtung. Eine Kulturbrühe, die von Hefezellen befreit wurde, jedoch noch Äthanol enthält, besitzt als Abwasser einen hohen biochemischen Sauerstoffbedarf. Es ist daher notwendig, das Äthanol aus der von den Hefezellen befreiten Kulturbrühe zurückzugewinnen oder zu entfernen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein verbessertes, neues Verfahren der eingangs genannten Art zur Verfügung zu stellen, das eine hohe Zellausbeute ergibt. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren der eingangs genannten Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Hefen bei einer Äthanolkonzentration von höchstens 0,8 Gew.-%, einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 0,1 bis 30 ppm und einer Konzentration an gelöstem Kohlendioxid von 0,38 bis 380 ppm züchtet.

Der Patentanspruch 2 beinhaltet eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt es, Äthanol assimilierenden Hefen der vorgenannten Gattungen bei höherer Produktivität in höherer als bisher erreichter Ausbeute ohne die Gefahr einer Bakterien-Kontamination zu züchten. Die so erhaltenen Hefen können direkt oder nach entsprechenden Vorbehandlungen als Nahrungsmittel oder für Futterzwecke oder als Rohmaterialien zur Extraktion wertvoller Substanzen wie Nukleinsäuren, Vitaminen, Coenzymen, Proteinen und Lipiden verwendet werden. Im erfindungsgemäßen Verfahren können auch Hefen der Arten

Candida alcomigas, Torulopsis methanothermo, Torulopsis enokii, Torulopsis methanophiles, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula alcolica, Saccharomyces steinen, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces carlsbergensis, Pichia farinosa, Candida utilis oder Lipomyces sparkey

gezüchtet werden, wobei innerhalb dieser Arten die Stämme

Candida alcomigas Ya-23

(FERM P-1973;NRRL Y-8023),

Torulopsis methanothermo U-22

(FERM P-2336; ATCC Nr. 20 434),

Torulopsis enokii Y-113

(FERM P-2064; ATCC Nr. 20 432),

Torulopsis methanophiles T-106

(FERM P-1928; ATCC Nr. 20 433),

Saccharomyces cerevisiae ellipsoideus

(IAM 4140),

Saccharomyces cerevisiae (Brothefe)

(OUT 7871),

Hansenula alcolica UM-88

(FERM P-2065;NRRL Y-8025),

Saccharomyces steinen (OUT 7911), Saccharomyces uvarum (OUT 7828)^ Saccharomyces carlsbergensis (OUT 7929), Pichia farinosa miso mogi (IAM 4526), Candida utilis (OUT 6020) und

Lipomyces sparkey (OUT 6269)
besonders gut sind.

Wenn Hefen der vorgenannten Gattungen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung einer Äthanolkonzentration in der Kulturflüssigkeit von nicht mehr als 0,8 Gew.-% gezüchtet werden, beträgt die Wachstums-Induktionsperiode bei absatzweiser Züchtung 3-5 Stunden oder weniger; wenn jedoch die Äthanolkonzentratton über 0,8 Gew.-% liegt, verlängert sich die Wachstums-Induktionsperiode. Sie beträgt z. B. bei einer Äthanolkonzentration von 3 Gew.-°/o 10-20 Stunden.

Wenn Hefezellen aerob gezüchtet werden, ist gewöhnlich Sauerstoff erforderlich. Wenn die Konzentration des Kulturmediums an gelöstem Sauerstoff geringer ist als der erfindungsgemäße obere Wert von 30 ppm, wird die Vermehrungsfähigkeit der Hefen erniedrigt. Dadurch sinkt nicht nur die Produktivität, sondern auch die Zellausbeute, bezogen auf das verbrauchte Äthanol. Die bevorzugte Konzentration an gelöstem Sauerstoff kann durch Einstellen der Luftzufuhr zum Züchtungsgefäß und/oder durch die Anzahl der Rührbewegungen in der Zeiteinheit im Falle einer unter Rühren durchgeführten Züchtung aufrechterhalten werden.

Im allgemeinen wird Luft mit einem Gehalt von 0,03 Vol.-% Kohlendioxid als Sauerstoffquelle verwendet. Bei der Züchtung wird jedoch eine große Kohlendioxidmenge freigesetzt, und damit steigt der Partialdruck des Kohlendioxids in der Gasphase des Züchtungsgefäßes, d. h. die Kohlendioxidkonzentration der Kulturflüssigkeit steigt entsprechend an. Selbst wenn das Kohlendioxid mit konstanter Geschwindigkeit gebildet wird, hängt die Kohlendioxidkonzentration der Kulturflüssigkeit von der Geschwindigkeit der Luftzufuhr, von der Sauerstoffkonzentration in der Gasphase,

von der Züchtungstemperatur, dem Züchtungsdruck usw. ab. Da die Hefezellen kaum Kohlendioxid verbrauchen, kann die Kohlendioxidkonzentration der Kulturflüssigkeit aus dem Kohlendioxid-Partialdruck in der Gasphase des Züchtungsgefäßes, der Züchtungstemperatur und dem Züchtungsdruck berechnet werden. Auf diese Weise wurde auch die erfindungsgemäße Kohlendioxidkonzentration der Kulturflüssigkeit berechnet

Die Wachstums-Induktionsperiode wird erhöht, und die Produktivität und Ausbeute werden erniedrigt, wenn z. B. die Kohlendioxidkonzentration in der Gasphase des Züchtungsgefäßes auf Werte unter 0,03 Vol.-% oder über 30 Vol.-% eingestellt wird. (Die Konzentration an gelöstem Kohlendioxid in der Kühlflüssigkeit beträgt entsprechend weniger als 038 ppm oder mehr als 380 ppm.) Hefezellen können mit höherer Produktivität in höherer Ausbeute erhalten werden, wenn die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Kulturflüssigkeit auf 038 bis 380 ppm eingestellt wird.

Die Beziehungen zwischen der Kohlendioxidkonzentration in der Gasphase eines Züchtungsgefäßes und der Kohlendioxidkonzentration der Kulturflüssigkeit bei Züchtungstemperaturen von 25, 30, 35, 40 und 45° C unter Atmosphärendruck sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengestellt und in der Zeichnung dargestellt. Die Zeichnung zeigt die Beziehungen zwischen der Kohlendioxidkonzentration in der Gasphase in % und der Konzentration des gelösten Kohlendioxids im Kulturmedium in ppm bei 25, 30,35. 40 und 45⁰C unter Atmosphärendruck.

Tabelle I

Züchtungs	COi-	COj-
temperatur	Konzentration	Konzentration
	in der Gasphase	der KulturflUssig- keit
⁰C	Gew.-%	ppm
25	30	447
30	30	380
35	30	349
40	30	312
45	30	282

Bei der Züchtung von Hefen ist es notwendig, die Kontamination durch andere Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, zu vermeiden; das Wachstum von Bakterien kann durch Einstellen der Kulturflüssigkeit auf pH 2—5 beträchtlich reduziert werden. Auf diese Weise ist es möglich, die Kontamination durch Bakterien zu vermeiden. Wenn eine Kontamination durch Bakterien auftritt, wird das als Substrat dienende Äthanol von den kontaminierenden Bakterien verbraucht, und es sinkt nicht nur die Ausbeute an Hefezellen, sondern es treten auch zahlreiche Probleme bei der Züchtung auf. Die Kontamination ist insbesondere unvorteilhaft, wenn die Hefezellen als Nahrungsmittel oder zu Futterzwecken verwendet werden. Die Hefezellen können jedoch mit einer höheren Produktivität in höherer Ausbeute ohne Kontamination durch Bakterien erhalten werden, indem das Kulturmedium auf pH 2 bis 5 eingestellt wird.

Die Temperatur zur Züchtung von Hefen beträgt im erfindungsgemäBen Verfahren 25—48°C. Aus diesem Temperaturbereich wird je nach den einzelnen verwendeten Stämmen eine optimale Temperatur ausgewählt Im Falle der Verwendung von Hefen, die zu den Gattungen Saccharomyces, Torulopsis, Pichia und Candida gehören, können im Vergleich zur Züchtung bei Temperaturen unter 37°C fast gleiche Produktivitäten und Ausbeuten selbst bei Temperaturen von 37—48⁰C erhalten werden. Daher kann die während der Züchtung gebildete Wärme mit geringen Kosten durch Durchführen der Züchtung bei 37 bis 48°C abgeführt werden; weiterhin kann dadurch die Gefahr der Kontamination durch andere Hefen und Bakterien

■ο herabgesetzt werden.

Wie bereits erwähnt, kann die Kontamination durch andere Hefen und Bakterien vollständig eleminiert werden, indem die Züchtung bei pH 2—5 und bei Temperaturen von 37 bis 48*C durchgeführt wird. Auf

diese Weise können Hefezellen für Nahrungs- und Futterzwecke erhalten werden.

Als Stickstoffquelle können anorganische Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumsalze und Nitrate, und organische Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff oder

organische Stickstoffverbindungen enthaltende Gemische, wie Maisquellenwasser, Kasein, Hefeextrakt und Fleischextrakt, verwendet werden. Weiterhin können zur Züchtung anorganische Salze, wie Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Phosphate, Mangansalze, Zinksalze,

Eisensalze und Kupfersalze, und, falls notwendig, für das Wachstum notwendige oder wachstumsfördernde Substanzen, wie Vitamine und Aminosäuren, verwendet werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann die Züchtung

absatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Wenn ein Ammoniumsalz als Stickstoffquelle verwendet wird, werden die Ammoniumionen für das Wachstum der Zellen verbraucht, wodurch der pH des Kulturmediums erniedrigt wird. Um den pH konstant zu halten, ist es notwendig, dem Kulturmedium Ammoniak, Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid zuzusetzen.

Nach dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren werden von kontaminierenden Mikroorganismen freie Hefezellen mit höherer Produktivität in höhere Ausbeute erhalten. Nach Beendigung der Züchtung werden die Hefezellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt und, falls notwendig, gewaschen, wobei eine feuchte Zellmasse erhalten wird. Die erhaltenen feuchten Zellen werden getrocknet und so wie sie sind oder nach weiteren Behandlungen zu Futterzwecken verwendet Die in den Zellen enthaltenen Substanzen wie Nukleinsäuren, Vitamine, Coenzyme, Proteine und Lipide werden aus den erhaltenen Zellen in Form von Reinsubstanzen oder in Form von

so Gemischen extrahiert und können in Nahrungsmitteln, Futtermitteln, Medikamenten und Rohmaterialien für die Industrie verwendet werden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

In vier 1-Liter-Gefäße werden 500 ml eines Kulturmediums gegeben, das 4 g KH₂PO₄,3 g (NHO₂SO₄,0,4 g MgSO₄ · 7 H₂O, 0,2 mg FeSO₄ · 7 HA 5 mg CaCl₂ · 2 H₂O, 0,5 mg MnSO₄ - 4 H₂O und 1 ml eines flüssigen Vitamingemisches in 11 entsalztem Wasser enthält und einen pH-Wert von 4,5 hat. Die Medien werden 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Anschließend wird jedes Medium mit 4 g Äthanol versetzt. Die so hergestellten Medien werden dann mit 2 Vol.-% einer in einem Anzuchtmedium mit der vorgenannten Zusammensetzung bei 37°C vorgezüchteten Kultur von Pichia farinosa miso mogi (IAM 4526) beimpft. Die Züchtung erfolgt absatzweise unter Atmosphärendruck mit einet

Belüftungsgeschwindigkeit von 200 ml/min bei pH 4,5 unter Belüftungsrühren. Die Züchtungstemperaturen betragen (1) 34⁰C, (2) 37⁰C, (3) 40⁰C und (4) 42°C. Während der Züchtung betrug die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in den Kulturmedien 3—8 ppm und die Kohlendioxid-Konzentration in der Gasphase 0,03 bis 1,0% (die Kohlendioxidkonzentration der Kulturflüssigkeit betrug 0,38 bis 12,7 ppm). Die Zellausbeute auf der Basis des verbrauchten Äthanols und die Generationszeit bei den jeweiligen Temperaturen ist in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II	Züchtungs- Zellausbeute	I	%	! Generations
Gefäß	temperatur	79,6	zeit
Nr.	"C	71,2	Std.
	34	72,3	2.1
1	37	70,7	1,7
2	40	Beispiel 2	2,3
3	42		3,2
4

Tabelle III	Äthanol	Wachstums	Zellkonzen
Gefäß	konzentration	induktions	tration
Nr.	in der Kultur	periode
	flüssigkeit
	Gew.-o/o		O. D. 610 ηιμ
	0,2	4,0	3,0
1	0,5	4,0	3,1
2	0,8	4,0	2,9
3	1,0	4,5	2,3
4	1,5	5,0	2,1
5	2,0	6,0	1,8
6	4,0	11,0	0,5
7

In sieben 1-Liter-Gefäße werden 500 ml eines Kulturmediums mit derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 1 gegeben. Die Medien werden dann 20 Minuten bei 120° C sterilisiert, jedes der so hergestellten Medien wird anschließend mit 2 Gew.-% einer in einem Anzuchtmedium mit der vorgenannten Zusammensetzung, das 0,8 Gew.-% Äthanol enthält und einen pH-Wert von 4,5 hat, bei 30⁰C vorgezüchteten Kultur von Pichia farinosa miso mogi (IAM 4526) beimpft. Die Züchtung erfolgt unter Atmosphärendruck bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 200 ml/min, einem pH-Wert von 4,5 und einer Züchtungstemperatur von 30° C unter Belüftungsrühren, wobei die Athanolkonzentration der Kulturmedien (1) 0,2 Gew.-%, (2) 0,5Gew.-%, (3) 0,8Gew.-%, (4) l,0Gew.-%, (5) l,5Gew.-%, (6) 2Gew.-%, (7) 4,0Gew.-% eingestellt wird. Während der Züchtung betrug die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in den Kulturmedien 3 bis 8 ppm und die Kohlendioxidkonzentration in der Gasphase 0,03 bis 1,0 Vol.-% (das gelöste Kohlendioxid in der Kulturflüssigkeit betrug 0,38 bis 12,7 ppm). Die Wachstums-Induktionsperioden und Zellkonzentrationen der Kulturflüssigkeit nach Beginn der Züchtung bei Durchführung der Züchtung bei den vorgenannten Äthanolkonzentrationen sind in Tabelle III zusammengestellt.

Beispiel 3

In ein 3-Liter-Gefäß wird ein Liter des Kulturmediums mit der im Beispiel 1 beschriebenen Zusammensetzung gegeben. Das Kulturmedium wird 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Anschließend wird das Kulturmedium mit 8 g Äthanol versetzt Das so hergestellte Kulturmedium wird mit 2 Vol.-% einer in einem Anzuchtmedium mit der vorgenannten Zusammensetzung bei 30⁰C und pH 4,5 vorgezüchteten Kultur von Torulopsis enokii Y-113 (FERM P-1973; ATCC Nr. 20432) beimpft. Die Züchtung wird absatzweise bei 30⁰C und pH 4,5 durchgeführt. Die weitere Züchtung erfolgt kontinuierlich in einem Kulturmedium mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung bei 30⁰C und pH 4,5, wobei die Konzentrationen des in der Kulturflüssigkeit gelösten Sauerstoffs auf 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 20, 30 und 35 ppm durch Ändern des Sauerstoff-Stickstoff-Verhältnisses der Gasgemische, der Belüftungsgeschwindigkeit, des Züchtungsdrucks und der Anzahl der Rührbewegungen in der Zeiteinheit eingestellt wird.

Bei 0,1 bis 30 ppm beträgt die Zellausbeute für eine durchschnittliche Retentionszeit von 4 Stunden 80—85%; bei 0,05 und 35 ppm stellt sich jedoch für eine durchschnittliche Retentionszeit von 4 Stunden kein stationärer Zustand ein, und die Zellausbeuten betragen für eine durchschnittliche Retentionszeit von 6 Stunden 65—75%. In jeder dieser Züchtungen betrug die Äthanolkonzentration in der Kulturflüssigkeit weniger als 0,1 Gew.-% und die Kohlendioxidkonzentration in der Gasphase 0,4 bis 1,6 Vol.-% (die Kohlendioxidkonzentration der Kulturflüssigkeit betrug 5—20 ppm). Der pH wird durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak zur Kulturflüssigkeit eingestellt.

Beispiel 4

In drei 1-Liter-Gefäße werden 500 ml eines Kulturmediums mit der im Beispiel 1 beschriebenen Zusammensetzung gegeben. Die Kulturmedien werden dann 20 Minuten bei 120° C sterilisiert Anschließend wird jedes Kulturmedium mit 4 g Äthanol versetzt Dann wird jedes Kulturmedium mit 2 Vol.-% einer in einem Anzuchtmedium mit der vorgenannten Zusammensetzung bei 30⁰C und pH 4,5 vorgezüchteten Kultur von Hansenula alcolica UM-88 (FERM P-2065; NRRL Y-8025) beimpft Die Züchtung erfolgt absatzweise unter Atmosphärendruck bei einer Züchtungstemperatur von 30° C, pH 4,5, einer Belüftungsgeschwindigkeit mit Luft oder einem Kohlendioxid-Luft-Gemisch von 500 ml/min und einer Kohlendioxid-Konzentration in der Gasphase (Kohlendioxid-Konzentration der Kulturflüssigkeit) von (1) 0,03 bis 0,2 Vol.-% (038 bis 2,54 ppm) und (2) 1,0 Vol.-% (12,7 ppm). In jeder dieser Züchtungen betrug die Generationszeit 2 Stunden und die Zellausbeute auf der Basis des verbrauchten Äthanols etwa 82%. Der pH wird durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak zu der Kulturflüssigkeit eingestellt

Beispiel 5

In einem 3-Liter-Gefäß wird 11 eines Kulturmediums mit derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 1 gegeben. Das Kulturmedium wird dann 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert Sodann wird das Kulturmedium mit 8 g Äthanol versetzt Das so hergestellte Kulturmedium wird mit 2 Vol.-°/o einer in einem Anzuchtmedium mit der vorgenannten Zusammensetzung bei 30° C und pH 4,5 vorgezüchteten Kultur von Hansenula alcolica

UM-88 (FERM P-2065; NRRL Y-8025) beimpft. Die weitere Züchtung wird in einem Kulturmedium mit der vorgenannten Zusammensetzung bei 30⁰C und pH 4,5 kontinuierlich unter Atmosphärendruck durchgeführt.

Die kontinuierliche Züchtung wird so durchgeführt, daß die Kohlendioxidkonzentration in der Gasphase (Kohlendioxidkonzentration des Kulturmediums) auf lVol.-% (12,7 ppm) 3Vol.-% (38 ppm), 5Vol.-% (63,5 ppm), 10Vol.-% (127 ppm), 20Vol.-% (254 ppm), 30Vol.-% (380 ppm) und 35 Vol.-% (444,5 ppm) durch Verändern des Luft-Kohlendioxid-Verhältnisses in dem Gasgemisch und der Belüftungsgeschwindigkeit eingestellt. Bei Kohlendioxidkonzentrationen in der Gasphase von 1 bis 30 Vol.-% (Kohlendioxidkonzentrationen der Kulturflüssigkeit von 12,7 bis 380 ppm) beträgt die Zellausbeute 75 bis 80% für eine durchschnittliche Retentionszeit von 4 Stunden. Bei der Kohlendioxidkonzentration in der Gasphase von 35 Vol.-¹Vo (Kohlendioxidkonzentration der Kulturflüssigkeit 444,5 ppm) wird der stationäre Zustand für eine durchschnittliche Retentionszeit von 4 Stunden nicht erreicht, und die Zellausbeute beträgt 60 bis 70% für eine durchschnittliche Retentionszeit von 6 Stunden. In jeder Züchtung liegt die Äthanolkonzentration der Kulturflüssigkeit unter 0,1 Gew.-%. Die Konzentration des in der Kulturflüssigkeit gelösten Sauerstoffs beträgt 2-4 ppm. Der pH wird durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak zur Kulturflüssigkeit eingestellt

Beispiel 6

In ein 10-Liter-Gefäß werden 51 eines Kulturmediums gegeben, das 4 g KH₂PO₄, 3 g (NH₄J₂SO₄, 1,0 g MgSO₄ 7 H₂O, 1,0 mg FeSO₄ 7 H₂O, 80 mg CaCI₂ · 2 H₂O, 2,0 mg MnSO₄ · 4 H₂O und 3 ml eines flüssigen Vitamingemisches enthält und einen pH von 3,5 hat Nach der Sterilisation des Kulturmediums während 20 Minuten bei 120⁰C wird das Kulturmedium mit 20 g Äthanol versetzt. Das so hergestellte Kulturmedium wird dann mit 2 Vol.-% einer in einem Anzuchtmedium mit der vorgenannten Zusammensetzung, das 0,8Gew.-% Äthanol enthält, bei 30° C vorgezüchteten Kultur von Candida alcomigas Ya-23 (FERM P-1973; NRRL Y-8023) beimpft. Die Kühlflüssigkeit wird kontinuierlich mit Äthanol versetzt und zwar mit einer solchen Menge, die der Menge des verbrauchten Äthanols entspricht, so daß die Äthanol· konzentration der Kulturflüssigkeit bei 0,1 bis 0,2 Gew.-% gehalten wird. Wenn die zugesetzte Äthanolmenge 300 g erreicht hat, wird die Züchtung auf eine kontinuierliche Züchtung umgestellt, und das 30 g Äthanol/Liter enthaltende Medium wird zu dem 10-Liter-Gefäß gegeben. Die kontinuierliche Züchtung wird bei einer Äthanolkonzentration der Kulturflüssigkeit von 0,01 Gew.-%, einer Konzentration von gelöstem Sauerstoff in der Kulturflüssigkeit von 2 ppm, einer Kohlendioxidkonzentration in der Gasphase von 8 VoL-% (Kohlendioxidkonzentration der Kulturflüssigkeit 102 ppm) bei pH 3,5 und einer Züchtungstemperatur von 30⁰C unter Atmosphärendruck während einer durchschnittlichen Retentionszeit von 4 Stunden durchgeführt, wobei 6,1 g Hefezellen/Liter · Std. erhalten werden. Der pH wird durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak zur Kulturflüssigkeit eingestellt.

Beispiel 7

Es wird eine kontinuierliche Züchtung unter den im Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Torulopsis methanothermo U-22 (FERM P-2336; ATCC Nr. 20434) anstelle von Candida alcomigas Ya-23 (FERM P-1973; NRRL Y-8023) verwendet und die Züchtungstemperatur 44° C, der pH 4,5 und die Kohlendioxidkonzentration in der Gasphase 10Vol.-% (Kohlendioxidkonzentration des Kulturmediums 104 ppm) beträgt wobei 5,2 g Hefezellen/Liter · Std. erhalten werden.

Beispiel 8

Es wird eine kontinuierliche Züchtung unter den im Beispiele beschriebenen Bedingungen durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Hansenula alcolica UM-88 (FERM P-2065; NRRL Y-8025) anstelle von Candida alcomigas Ya-23 (FERM P-1973; NRRL Y-8023) verwendet wird, wobei 63 g Hefezellen/Liter - Stunde erhalten werden.

Beispiel 9

Es wird eine kontinuierliche Züchtung unter den im Beispiele beschriebenen Bedingungen durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Saccharomyces steinen (OUT 7911) anstelle von Candida alcomigas Ya-23 (FERM P-2065; NRRL Y-8025) verwendet wird, wobei 6,0 g Hefezellen/Liter · Stunde erhalten werden.

Beispiel 10

Es wird eine kontinuierliche Züchtung unter den im ίο Beispiele beschriebenen Bedingungen durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Saccharomyces uvarumi (OUT 7824) anstelle von Candida alcomigas Ya-23 (FERM P-2065; NRRL Y-8025) verwendet wird, wobei 6,1 g Hefezellen/Liter ■ Stunde erhalten werden.

Beispiel Il

Es wird eine kontinuierliche Züchtung unter den im Beispiele beschriebenen Bedingungen durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Saccharomyces carlsbergensis (OUT 7929) anstelle von Candida alcomigas Ya-23 (PERM P-2065; NRRL Y-8025) verwendet wird, wobei 5,8 g Hefezellen/Liter · Stunde erhalten werden.

Beispiel 12

Es wird eine kontinuierliche Züchtung unter den im Beispiele beschriebenen Bedingungen durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Torulopsis methanophiles T-106 (FERM P-1928; ATCC Nr. 20433) anstelle von Candida alcomigas Ya-23 (FERM P-2065; NRRL Y-8025) verwendet wird und die Züchtung bei einer durchschnittlichen Retentionszeit von 12 Stunden, einer Äthanolkonzentration des Kulturmediums von 0,01 Gew.-%, einer Konzentration von gelöstem Sauerstoff im Kulturmedium von 3 ppm, einer Kohlendioxid-Konzentration in der Gasphase von 3 VoL-% (Kohlendioxid-Konzentration des Kulturmediums 38 ppm) durchgeführt wird, wobei 2,0 g Hefezellen/Liter · Stunde erhalten werden.

Beispiel 13

Es wird eine kontinuierliche Züchtung unter den im Beispiel6 beschriebenen Bedingungen durchgeführt mit der Ausnahme, daß Saccharomyces cerevisiae ellipsoideus (IAM 4140) anstelle von Candida alcomigas Ya-23 (FERM P-2065; NRRL Y-8025) verwendet wird, wobei 6,0 g Hefezellen/Liter · Stunde erhalten werden.

709 521/262

Beispiel 14

Es wird eine kontinuierliche Züchtung unter den im Beispiele beschriebenen Bedingungen durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Saccharomyces cerevisiae (Brothefe) (OLIT 7871) anstelle von Candida alcomigas Ya-23 (FERM P-2065; NRRL Y-8025) verwendet wird, wobei 5,9 g Hefezellen/Liter · Stunde erhalten werden.

Beispiel 15

Es wird eine kontinuierliche Züchtung unter den im Beispiele beschriebenen Bedingungen durchgeführt,

10

mit der Ausnahme, daß Candida utilis (OUT 6020) anstelle von Candida alcomigas Ya-23 (FERM P-2065; NRRL Y-8025) verwendet wird, wobei 6,1 g Hefezellen/ Liter ■ Stunde erhalten werden.

Beispiel 16

Es wird eine kontinuierliche Züchtung unter den im Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Lipomyces sparkey (OUT 6269) anstelle von Candida alcomigas Ya-23 (FERM P-2065; NRRL Y 8025) verwendet wird, wobei 5,8 g Hefezellen/ Liter - Stunde erhalten werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Züchtung von Äthanol assimilierenden Hefen der Gattungen Pichia, Candida, s Saccharomyces, Hansenula, Torulopsis oder Lipomyces bei einem pH-Wert von 2,0 bis 5,0 und einer Temperatur von 25-48° C in einer Kulturflüssigkeit unter Verwendung von Äthanol als Hauptkohlenstoffquelle, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hefen bei einer Äthanolkonzentration von höchstens 0,8 Gew.-%, einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 0,1 bis 30 ppm und einer Konzentration an gelöstem Kohlendioxid von 0,38 bis 380 ppm züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hefen bei einer Äthanolkonzentration von nicht mehr als 0,1 Gew.-% züchtet.