DE2017374C3

DE2017374C3 - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure

Info

Publication number: DE2017374C3
Application number: DE2017374A
Authority: DE
Inventors: Muneharu Doi; Masakuzu Kikuchi; Yoshio Nakao; Masaru Hyogo Suzuki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1969-04-15
Filing date: 1970-04-11
Publication date: 1979-01-04
Also published as: NL166982C; NL166982B; FR2043324A5; JPS5133997B1; DE2017374A1; NL7005365A; BE749011A; DE2017374B2; CA926796A; US3654078A; GB1292927A

Description

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Die Erfindung betrifft die Herstellung von L-Glutaminsäure nach einem verbesserten Verfahren, bei dem ein Mikroorganismus, der L-Glutaminsäure bildet und Glycerin zum Wachstum erfordert in einem Kulturmedium, das η-Paraffin als Hauptkohlenstoffquelle enthält, kultiviert wird.

Es gibt zahlreiche Mikroorganismen, die L-GIutaminsäure durch Fermentation aus Normalparaffinen zu bilden vermögen. Diese Mikroorganismen behalten jedoch die hierbei gebildete L-Glutaminsäure in den Zellen und geben sie nicht aus den Zellen in die Kulturbrühe ab, so daß mit diesen Mikroorganismen schlechte Ausbeuten an L-Glutaminsäure erhalten werden.

Es wurde darüber berichtet, daß die Ausbeute an L-Glutaminsäure erhöht wird, wenn gewisse Mikroorganismen während des Fermentationsprozesses mit Penicillin behandelt werden. Das bekannte Verfahren ist jedoch noch unbefriedigend in bezug auf die Ausbeute. Außerdem spielen der Zeitpunkt des Zusatzes und die zugesetzte Penicillinmenge eine äußerst wichtige Rolle, und die Festlegung dieser Bedingungen ist sehr schwierig. Ferner treten während des Fermentations-Prozesses verschiedene Nebenprodukte auf, deren Abtrennung von der gewünschten L-Glutaminsäure schwierig ist.

Die US-PS 34 36 308 beschreibt die Züchtung eines L-Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismus, der ein wilder Stamm ist, in Gegenwart von einem oder mehreren spezifischen Estern. Der Mikroorganismus benötigt diese spezifischen Ester für sein Wachstum nicht Daher ist es unmöglich, die Menge der Zellen durch die Menge des spezifischen Esters zu kontrollieren. Um die Menge der Zellen zu kontrollieren ist es daher nötig, alle Rohmaterialien des Züchtungsmediums sowie die anderen Züchtungsbedingunger. zu kontrollieren.

Diesen Nachteil vermeidet die vorliegende Erfindung gemäß der Mikroorganismen, die Glyzerinverbindungen benötigen und die spezielle Mutanten sind, verwendet werden, wobei diese speziellen Mutanten Glyzerinverbindungen für ihr Wachstum benötigen. Daher kann gemäß vorliegender Erfindung die Menge der Zellen allein durch die Menge der Glyzednverbindung, die zum Kulturmedium zugegeben wird, kontrolliert werden. Daraus ergibt sich der überraschende technische Fortschritt der vorliegenden Erfindung.

Es wurde nun gefunden, daß

1) Mikroorganismen, die L-Glutaminsäure bilden. Glycerin zum Wachstum benötigen und in einem Medium wachsen, das Normalparaffine als Hauptkohlenstoffquelle enthält, erhalten werden können und daß

2) diese Mikroorganismen, die Glycerin zum Wachstum benötigen, L-Glutaminsäure in der Kulturlösung in hoher Ausbeute durch Fermentation aus Normalparaffinen anzuhäufen vermögen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen L-glutaminsäurebildenden Mikroorganismus, der zur Gattung Corynebacterium gehört und Glyzerin zum Wachstum benötigt, in einem Kulturmedium, das Normalparaffine als Hauptkohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und eine Glyzerinverbindung aus der aus Glyzerin, Phosphorsäureglyzerinester, Ester von Glyzerin mit Fettsäuren, Aldehyden des Glyzerins, Carbonsäuren des Glyzerins und Halogeniden des Glyzerins bestehenden Gruppe enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet bis eine wesentliche Menge L-Glutaminsäure gebildet worden ist, und die auf diese Weise gebildete L-Glutaminsäure aus der Kulturbriihe isoliert.

Es ist sehr überraschend für den Fachmann, daß es Mikroorganismen gibt, die Glycerin zum Wachstum benötigen, da Glycerin eine der wichtigsten Substanzen im Stoffwechsel der Mikroorganismen ^:-t und angenommen wird, daß es überaus schwierig ist, den Stoffwechsel'veg am Punkt des Glycerins abzuschneiden.

Es ist jedoch 'eicht. Mikroorganismen, wie sie beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, zu erhalten, indem bekannte Stämme, die L-Glutaminsäure bilden, mit an sich bekannten mutagenen Mitteln behandelt werden. Solche Mittel sind beispielsweise Bestrahlung mit Ultraviolettlicht oder Röntgenstrahlen, Behandlung mit chemischen Mutagenen wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin oder salpetriger Säure. Die Eigenschaft der so behandelten Mikroorganismen, Glycerin zum Wachstum zu benötigen, wird in einer Weise ähnlich den routinemäßig durchgeführten Methoden zur Isolierung von auxotrophen Mutanten bestätigt, indem nachgeprüft wird, daß der Mikroorganismus in einem Mangelmedium, das kein Glycerin enthält, nicht wächst, der gleiche Mikroorganismus aber wachsen kann, wenn das Medium durch Glycerin

ergänzt wird.

Der auf diese Weise gewonnene Mikroorganismus stimmt gewöhnlich mit dem entsprechenden Ursprungsrnikroorganismus in den allgemeinen mikrobiologischen Eigenschaften, abgesehen vom Glycerinbedarf zum Wachstum, vollständig überein.

Die Ursprungsstämme, aus denen die auxotrophen Mutanten abzuleiten sind, sind in der Natur weit verbreitet, z. B. unter der Gattung Corynebacterium, insbesondere beispielsweise Corynebacterium alkanolyticum und Corynebacterium hydrocarboclastus.

Es ist zu bemerken, daß Corynebacterium alkanolyticum eine neue Spezies ist, die von der Anmelderin erhalten wurde.

Corynebacterium alkanolyticum hat die folgenden Merkmale, nach denen der Mikroorganismus als neue Spezies gemäß der Beschreibung in Manual of Microbiological Methods, Society of American Bacteriologists (1957) identifiziert wird.

I) Morphologische Eigenschaften

Gerade bis leicht gekrümmte Stäbchen, einige in V-Form, mit metachromatischen Granula;

0,8 bis 1,0 - 1,5-4,0 μ;

pleomorph; keine Sporenbildung; unbeweglich; grampositiv; säurefest; Farbbildung negativ.

II) Kulturmerkmale

1) Kolonien auf Nähragarplatte:

cremig oder blaßorangefarben, wellig, erhaben, fleckenartig.

2) Schrägagar:

cremig oder blaßorangefarben, fadenförmiges Wachstum.

3) Nährbrühe:

leicht trübe mit Sediment; keine Pellicula.

4) Nähragar-Stichkultur:
Oberflächenwachstum; Fadenform.

5) Kartoffel:

cremig, leichtbräunlich-orangefarben.

III) Physiologische Eigenschaften

1) pH-Wert 5,0 bis 9,0.

2) Temperatur 15 bis 37° C.

3) Sauerstoff: aerob.

in 4) Gelatine-Stichkultur: keine Verflüssigung.

5) Stärke: nicht hydrolysiert

6) Cellulose: nicht angegriffen.

7) Urease: gebildet.

8) Indol: nicht gebildet.

is 9) Ammoniak in Peptonmedien: nicht gebildet

10) Schwefelwasserstoff: gebildet

11) Nitrite aus Nitraten: gebildet

12) Lackmusmilch: unverändert

13) Acetylmethylcarbinol: nicht gebildet.
14) Methylrottest: negativ.

15) Katalase: positiv.

16) Säuren aus Fmctose.

17) Keine Säuren aus Glucose, Galactose, Mannose, D-Xylose, D-Arabinose, Saccharose, Lactose, MaI-tose, Mannit, Sorbit und Glycerin.

18) Assimilation:

Glucose, Gluconat, Citrat, Succinat. Propionat, Pyruvat Acetat -Undecan, Dodecan, Tridecan, Tetradecan, Pentadecan, Hexadecan, Heptadecan und Octadecan.

19) Nicht assimiliert werden «-Ketoglutarsäure, Acetaldehyd und Phenol.

Corynebacterium alkanolyticum ähnelt den zu Corynebacterium hydrocarboclastus oder Corynebacterium petrophilum gehörenden Stämmen, unterscheidet sich jedoch von den letzteren beiden in den folgenden Eigenschaften:

Corynebacterium
alkanolyticum
(IFO 12 647)

Corynebacterium
hydrocarboclastus

Corynebacterium
petrophilum

Temperatur
Lackmusmilch

Reduktion von
Nitraten

H₂S-Bildung
Größe, μ

15-37°C, gutes
Wachstum bei 37° C

unverändert

0,8-1,0· 1,5-4,0

Von den Erfindern erhaltene Mutanten, die Glycerin zum Wachstum benötigen, sind beispielsweise

Corynebacterium alkanolyticum
GL-21 (IFO 12923)

Corynebacterium hydrocarboclastus
GL-18(IFO 12924)

Corynsbacterium hydrocarboclastus
GL--23 (IFO 13148)

Diese Stämme sind beim Institute for Fermentation Osaka, Japan, unter den oben" in Klammern angegebenen Nummern hinterlegt.

Der Nährstoffbedarf dieser repräsentativen Glycerin benötigenden Stämme Und ihrer Ursprungsstämme 15-33°C, schlechtes
Wachstum bei 37° C

alkalisch, Lackmus
reduziert

0,6-0,8 · 2,0-4,0

15 bis 35° C

unverändert

0,4-0,6 · 0,7-0,9

wurde mit folgenden Ergebnissen untersucht:
Minimalmedium

0,5% n-Paraffingemisch*), 0,5% Ammoniumsulfat, 0,3% Ammoniumnitrat, 0,1% Harnstoff, 0,25% Dikaliumphosphat, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,005% Eisen(II)-sulfat, 0,002% Mangansulfat, 0,01 % Calciumchlorid.

*) Das n-Paraffingemisch hat folgende Zusammensetzung!

Ci₂H₂₆ 4,4Vol.<%

Ci₂H₂₈ 5,8 VoL-%

Ci₄H₃₀ 13,4Vol.*%

Ci₅H₃₂ 59,7 VoL-%

Ci₆H₃₄ 16,7 VöL-%

Zusätze

A) Gemisch von Nucleinbasen Adenin, Guanin, Hypoxanthin, Thymin, Uracil, Cytosin, je 500ji/ml Wasser.

B) Gemisch von Vitaminen:

Vitamin B| 2,0, Vitamin BjS₁O, p-Aminobenzoesäure 1,0, Nicotinsäure 1,0, Calciumpantothenat 1,0, Pyridoxin 1,0, Folsäure 0,1, Cholin 20, Inosit 10, Vitairin K 10, Vitamin Bi₂10-³ mg/1 Wasser,

C) Casaminosäuren+Tryptophan;

Gemisch von vitaminfreien Casaminosäuren (im Handel erhältlich):

95 g und 5 g Tryptophan.

D) Glucose.

E) Fructose.

F) Xylose.

G) Ribose.
H) Glycerin.

I) Gemisch von (B) und (H).

Mengen der Zusätze pro Liter Minimalmedium:

A. 100 ml

B. 100 ml

C. Ig

D. 0,2 g

E.
F.
G.
H.
I.

0,5 g

100 ml (B) und

0,5 g (H)

Kulturbedingungen

In Reagenzgläser werden aliquote Teile von je 5 ml des Minimalmediums oder des Minimalmediums mit den genannten Zusätzen aufler dem Zusatz (B) gegeben. Dann wird in einem Autoklav 10 Minuten bei einem Druck von 1 Atmosphäre sterilisiert Im Falle des Zusatzes (B) wird das Kulturmedium hergestellt, indem der Zusatz einer Seitz-Filtration unterworfen und der so sterilisierte Zusatz dem autoklavierten Minimalmedium zugesetzt wird. Die Reagenzgläser werden mit den Testmikroorganismen geimpft, worauf 4 Tage unter Schütteln bei 28° C bebrütet wird.

Die hierbei erhaltenen Erge¹· ..isse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt, in der das Ze^:chen (+ ) bedeutet, daß der jeweilige Mikroorganismus auf dem entsprechenden Zusatzmittel wächst, und das Zeichen ( —) bedeutet, daß der jeweilige Mikroorganismus nicht auf dem Zusatzmittel wächst

Tabelle 1

Zusatz Corynebacterium

alcanolyticum

Ursprungsstamm GL-21

Corynebacterium hydrocarboclastus Ursprungsstamm GL-18

Corynebacterium
hydrocarboclastus

Ursprungsstamm
(Thiamin benötigender Stamm)

GL-23

Ohne Zusatz

4-

-1-

Abgesehen davon, daß die obengenannten Mutanten im Gegensatz zu den Ursprungsstämmen Glycerin zum Wachstum benötigen, sind ihre mikrobiologischen Eigenschaften mit dinen der Ursprungsstämme identisch.

Beir.i Verfahren gemäß der Erfindung werden Kohlenwasserstoffe, insbesondere Normalparaffine als Hauptkohlenstoffquelle verwendet. Besonders bevorzugt werden Kohlenwasserstoffe mit etwa 10 bis 20 C-Atomen, z. B.Tetradecan, Hexadecan, Octadecan und n-Paraffingemische, die im Bereich von 220 bis 290⁰C sieden.

Geeignet sind außer den wesentlichen Kohlenwasserstoffen natürlich auch beliebige andere übliche Kohlenstoffquelien, z. B. Kohlehydrate (z. B. Glucose, Stärke und Melasse), Äthanol Essigsäure, Fumarsäure und Maleinsäure. Der Zusatz einer geringen Menge MäisqUellwassef öder Hefeexträkt ist ebenfalls wirk- »am.

Als Stickstoffquellen sind die Materialien geeignet, die bisher als giJignet für die Herstellung von L-Glutaminsäure bekannt sind. Geeignet sind beispielsweise Ammoniak, Ammoniumsalze (z. B. Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid), Nitrate (z. B. Ammoniumnitrat und Kaliumnitrat) und Harnstoff.

Gegebenenfalls können dem Kulturmedium anorganische Salze (z. B. Kaliurndihydrogenphosphat uikaliurnphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen(ll)-sulfat, Mangansulfat), Vitamine (z. B. Vitamin Bi, Vitamin B₂, p-Aminobenzoesäure und Nicotinsäure) und andere wachstumsfördernde Materialien (z. B. Pepton und Fleischextrakt) zugesetzt werden.

Das Kulturmedium kann in beliebiger Form verwendet werden, jedoch ist ein flüssiges Medium im allgemeinen vorteilhaft. Bei Verwendung eines flüssigen Mediums können beliebige Kulturverfahren unter Schütteln, Rühren u. dgl. ungewandt werden, jedoch ist die sog. aerobe Submersliultur für die Großherstellung am Vorteilhaftesten.

Als Glycerin /erbindungen kommen für das Verfahren gemäß der Erfindung Glycerin als solches und seine Analogen in Frage, die für die Mutanten als Ersatz für

Glycerin geeignet sind. Analoge Gtycerinverbindungen sind beispielsweise die entsprechenden Phosphorsäureester (z. B. Glycerophosphorsäure, Lecithin, Cephalin, Phosphatidyläthanolarriin), die entsprechenden Fettsäureester (z, B. Mono-, Di- oder Triglyceride aus Glycerin und Fettsäuren wie Stearinsäure, Oleinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure od. dgl., acetylierte Monoglyceride der obengenannten Fettsäuren und Propylenglykolstearat), die entsprechenden Halogenide (z. B. Glycerin-Ä-monochlorhydrin, Glycerin-a.a'-dichlorhydrin), entsprechende Aldehyde (z. B. Glyceraldehyd) und die entsprechenden Carbonsäuren (z. B. Glycerinsäure).

Der Anteil der Glycerinverbindung im Kulturmedium variiert mit den anderen Bestandteilen im Medium und/oder der Art der Kulturmethoden, jedoch beträgt die Menge gewöhnlich etwa 20 bis 800 y/ml, vorzugsweise 50 bis 500γ/π\\ Medium. Wenn eine der obengenannten analogen Glyeerinverbindungen verwendet wird, ist die Menge als Glycerin selbst auf der gleichen molaren Basis zu berechnen. Es ist jedoch zu bemerken, daß es Analoge gibt, die dem Glycerin als Glycerinersatz nicht äquivalent sind. Von den oben als Beispiel genannten analogen Glyeerinverbindungen können beispielsweise die Di- oder Triglyceride von Fettsäuren in einer Menge erforderlich sein, die über der äquimolaren Glycerinmenge liegt Diese Anomalität hängt teilweise von den Esteraseaktivitäten des verwendeten Mikroorganismus und teilweise von der Art der verwendeten Glyceride selbst ab.

Die Glycerinverbindung kann dem Medium vor Beginn der Kultivierung auf einmal oder zu geeigneten Zeitpunkten während der Kultivierung auf einmal oder in mehreren Portionen so zugesetzt werden, daß die Gesamtmenge des Glycerins oder seiner analogen Verbindung im obengenannten Bereich liegt

Nachstehend sind die Ergebnisse von Untersuchungen über die Beziehung zwischen der einem vereinfachten Kulturmedium zugesetzten Glycerinmenge und der Menge der L-Glutaminsäure genannt, die im Medium durch die oben als Beispiel genannten, Glycerin zum Wachstum benötigenden Mutanten angehäuft wurde.

Unterschiedliche Glycerinmengen wurden portionsweise einem Kulturmedium zugesetzt, das 10% n-Hexadecan, 3% Ammoniumsulfat, 0,25% Dikaliumphosphat, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat 0,005% Eisen(II)-sulfat und 0,002% Mangansulfat enthielt Nach Einstellung auf pH 7,0 wurden aliquote Teile von je 20 ml jedes Mediums in 200-ml-Kolben gegeben. Die Kolben wurden 10 Minuten bei 120⁰C sterilisiert Calciumcarbonat das vorher 4 Stunden bei 150° C sterilisiert worden war, wurde in jeden Kolben in einer solchen Menge gegeben, daß seine Konzentration 4,0% betrug. Die geimpften Medien wurden 96 Stunden bei 28° C bebrütet Während dieser Zeit wurde wäßriges Ammoniak von Zeit zu Zeit zugesetzt Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 genannt

Tabelle 2

Glycerinzusatz

Testmikroorganismus Corynebacterium Corynebacterium

alkanolyticum
GL-21

mg/ml

hydrocarboclastus GL-18

mg/ml

3a

10,1

3,4 10,8 Glycerinzusalz

y/ml

Teslmikroorganisrhus

Corynebacterium Corynebacterium alkanolyticum hydrocarboclastus

GL-21 GL-18

mg/ml

30
50

75
100
150
200
300

500

800

1000

17,2
35,8
51,2
60,5
68,3
60,6
40,7
25,0
10,7
3,0

16,7 35,1 50,7 58,3 64,4 59,2 40,1 24,2 10,1 2,9

Bei Verwendung einiger Glycerinderivate an Stelle 2ö von Glycerin würden die folgenden Ergebnisse eniäiicii: Auf die vorstehend beschriebene Weise würde Corynebacterium alkanolyticum GL-21 unter Verwendung der in Tabelle 3 genannten Glycerinderivate an Stelle von Glycerin kultiviert Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt. Hier sind die zugesetzten Mengen der Glycerinderivate als Glycerin gerechnet

Tabelle 3

Zugesetzte Menge
des Glycerinderivats

y/m\

Glycerin-a-monochlorhydrin

mg/ml

Glyceraldehyd

mg/ml

35 0	0	0
10	3,1	2,5
20	93	8,1
30	153	13,1
50	30,2	27,4
40 75	50,3	45,1
100	57,2	53,1
150	62,4	58,2
200	57,1	52,1
300	35,4	34,2
45 500	21,2	203
800	9,8	8,8
1000	2,5	13

Die übrigen Kulturbedingungen für die Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung können in üblicher Weise in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des zu verwendenden Mediums, der Kulturmethode and anderen Faktoren gewählt werden. Im allgemeinen liegt jedoch der pH-Wert des Kulturmediums bei etwa 5 bis 8, die Kultivierungstemperatur bei etwa 28 bis 37° C, und die Kultivierungsdauer beträgt 2 bis 5 Tage.

Bei Durchführung der Kultivierung auf die oben beschriebene Weise wird eine wesentliche Menge L-Glutaminsäuire im Kulturmedium angehäuft Die hierbei gebildete L-Glutaminsäure läßt sich nach bekannten Methoden leicht aus der Kulturbrühe isolieren.

Beispielsweise werden die Zellen der Bakterien abfiltriert, worauf die Kulturbrühe vorteilhaft nach Reinigungsmeihoden unter Verwendung eines Ionenaustauschharz^ mit anschließender Einengung und Kristallisation oder nach anderen geeigneten, an sich bekannten Verfahren behandelt wird.

Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Prozensätze der Bestandteile des Kulturmediums sind als Gewicht pro Volumeneinheit ausgedrückt (d. h. als Gewicht in Gramm des gelösten Stoffs pro 100 ml des Kulturmediums), falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Ein wäßriges Kulturmedium, das 10% eines n-Paraffingemisches der später genannten Zusammensetzung, 3,0% Ammoniumsulfat, 0,25% Dikaliumphosphat, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,005% Eisen(II)-sulfat, 0,002% Mangansulfat, 0,001% Zinksulfat und 0,015% Glycerin enthält, wird auf pH 7,0 eingestellt und 10 Minuten bei 120"C sterilisiert. Zum Medium wird Calciumcarbonat, das vorher 4 Stunden bei 150⁰C sterilisiert worden ist, in einer Menge von 4,0% gegeben.

Das Kulturmedium wird dann mit Corynebacterium alkanolyticum GL-21 geimpft und 4 Tage unter Schütteln bei 28° C bebrütet. Während dieser Zeit werden geeignete Mengen an wäßrigem Ammoniak zugesetzt, um den pH-Wert des Mediums im Bereich zwischen 6,6 und 7,0 zu halten. Hierbei werden 70,1 mg L-Glutaminsäure pro ml Kulturbrühe erhalten.

Aus 11 Kulturbrühe werden die Zellen und restliches Paraffin entfernt Die L-Glutaminsäure wird an einem Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp adsorbiert und dann mit wäßrigem 0,1 η-Ammoniak eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und rnit Salzsäure auf pH 3,2 eingestellt, wobei sich Kristalle von L-Glutaminsäure abscheiden. Die Ausbeute aus 1 I Kulturbrühe beträgt 58 g.

Das n-Paraffingemisch hat folgende Zusammensetzung:

Ci₂H₂₆	4,4Vol.-%
C₁₃H₂₈	5,8VoI.-%
C14H30	13,4 Vol.-%
Ci 5H₃₂	59,7 Vol.-%
Ci₆H₃₄	16,7VoI.-%

Beispiel 2

Corynebacterium hydrocarboclastus GL-18 wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise kultiviert Die erhaltene Kulturbrühe enthält 65 mg L-Glutaminsäure pro ml. Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise werden 50 g L-Glutaminsäure aus 11 Kulturbrühe isoliert

Beispiel 3

Ein wäßriges Impfmedium, das 5% des in Beispiel 1 verwendeten n-Paraffingemisches, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,3% Ammoniumnitrat, 0,1% Harnstoff, 0,25% Dikaliumphosphat, 0,1% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% Mangansulfat, 0,005% Eisen(ll)-sulfat, 0,002% Magnesiumsulfat, 0,1% Maisquellwasser und 0,03% Glycerin enthält, wird auf pH 7,0 eingestellt.

Das Kulturmedium wird dann mit Corynebacterium alkanolyticum GL^l geimpft. Das geimpfte Medium wird in einem Tank 24 Stunden bei 28°C bebrütet. Ein 5-1-Anteil der erhaltenen Impfkultur wird in einen 200-1-Tank überführt, der 1001 eines Kulturmediums der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung enthält. Dem Medium wird Calciumchlorid, das vorher 4 Stunden bei 150°C sterilisiert worden ist, in einer Menge von 0,1% zugesetzt.

Das Kulturmedium wird dann 60 Stunden bei 3O⁰C bebrütet, während mit 250 UpM gerührt wird. Während dieser Zeit wird das Medium durch Zusatz geeigneter Mengen an wäßrigem Ammoniak bei pH 7,0 gehalten. Die erhaltene Kulturbrühe enthält 72 mg L-Glutaminsäure pro ml.

Aus 100 1 der Kulturbrühe werden 5,7 kg L-Glutaminsäure auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise isoliert.

Beispiel 4

In einem Kulturmedium der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung, in dem jedoch 0,015% Glycerin durch 0,002% Glyceraldehyd ersetzt worden sind, wird Corynebacterium alkanolyticum GL-21 auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise kultiviert Während der Kultivierungsdauer von 96 Stunden wird Glyceraldehyd in mehreren Portionen zugesetzt, bis seine Endkonzentration 0,015% beträgt. Auf diese Weise werden 55 mg L-Glutaminsäure pro ml Kulturmedium gebildet Aus 1 1 der Kulturbrühe werden 45 g L-Glutaminsäure auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise isoliert.

Beispiel 5

Ein wäßriges Kulturmedium, das 10% des n-Paraffingemisches der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung, 0,2% Maisquellwasser, 0,1% Hefeextrakt 2% Ammoniumsulfat 0,5% Kaliumhydrogenphosphat 0,2% Kaliumdihydrogenphosphat 0,05% Magnesiumsulfat, 0,005% Eisen(II)-sulfat 0,002% Mangansulfat 0,001% Zinksulfat und 0,03% Glycerin enthält, wird auf pH 7,0 eingestellt und 10 Minuten bei 120° C sterilisiert Zum Medium wird Calciumcarbonat, das vorher 4 Stunden bei 150⁰C sterilisiert worden ist, in einer Menge von 4,0% gegeben.

Das Kulturmedium wird dann mit Corynebacterium hydrocarboclastus GL-23 geimpft, worauf die Kultivie-

so rung auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt wird. Die erhaltene Kulturbrühe enthält 66 mg L-Glutaminsäure pro ml. Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise werden 51 g L-GIutaminsäure pro 1 Külturbrühe isoliert

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-GIutaminsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man einen L-glutaminsäurebildenden Mikroorganismus, der zur Gattung Corynebacterium gehört und Glyzerin zum Wachstum benötigt, in einem Kulturmedium, das Normalparaffine als Hauptkohlenstoffquelle, e"'ne Stickstoffquelle, anorganische Salze und eine Glyzerinverbindung aus der aus Glyzerin, Phosphorsäureglyzerinester, Ester von Glyzerin mit Fettsäuren, Aldehyden des Glyzerins, Carbonsäuren des Glyzerins und Halogeniden des Glyzerins bestehenden Gruppe enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge L-Glutaminsäure gebildet worden ist, und die auf diese Weise gebildete L-Glutaminsäure aus der Kulturbrühe isoliert

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus CorynebactCnurn αιιίαΠΟιj tlCUiTi VCrWCiluCu

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium hydrocarboclastus verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium alkanolyticum GL-21 (IFO 12923) verwendet

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium hydrocarboclastus GL-23 (IFO 13148) verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der Glycerinverbindung etwa 20 bis 800 y/ml, bezogen auf Glycerin, beträgt

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mit Paraffinen einer Kohlenstoffzahl von 10 bis 20 arbeitet