DE69132370T2

DE69132370T2 - Methode zur herstellung von eicosapentansäuren

Info

Publication number: DE69132370T2
Application number: DE69132370T
Authority: DE
Inventors: Raymond Gladue; John Kyle
Original assignee: Martek Corp
Current assignee: Martek Corp
Priority date: 1990-03-21
Filing date: 1991-03-20
Publication date: 2001-03-29
Anticipated expiration: 2011-03-21
Also published as: US5244921A; WO1991014427A1; EP0521104A1; DE69132370D1; US5567732A; CA2078664A1; ATE195420T1; JPH05505726A; EP0521104A4; EP0521104B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf Speiseöle, die Omega-3-Fettsäuren, insbesondere Eicosapentaensäure (EPA), enthalten. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf Verfahren zur Herstellung von EPA in kommerziell rentablen Ausbeuten.
Es ist bekannt, dass Omega-3-Fettsäuren eine günstige Wirkung haben, indem sie die Häufigkeit von koronarer Herzkrankheit reduzieren. Der Metabolismus von Omega-3-Fettsäuren ist nicht bekannt. Obwohl man also weiß, dass diese Säuren günstige Wirkungen haben, sind genaue klinische Dosen und Wirksamkeiten nicht bekannt.
Omega-3-Fettsäuren einschließlich EPA findet man in den Ölen von Kaltwasser-Meeresfischen. Tatsächlich ist dies die primäre Quelle für kommerziell erhältliches EPA. Man glaubt, dass die Omega-3-Fettsäuren, die man in Fischen findet, aus Phytoplankton stammen, das die Grundlage der marinen Nahrungskette bildet. Diese Vermutung beruht auf der Tatsache, dass viele Phytoplanktonarten offenbar Ölreserven enthalten, die variable Mengen an EPA enthalten.
Von bestimmten marinen Mikroorganismen ist bekannt, dass sie EPA enthalten. Zum Beispiel fand Yazawa et al., J. Biochem., 103: 5-7 (1988), 88 Stämme von Gram-negativen Bakterien, die EPA erzeugten. US 4,615,839 (Seto et al.) offenbart die Kultivierung einzelliger Grünalgen in offenen Bassins und die anschließende Gewinnung von EPA aus diesen Mikroalgen.
Es ist zwar bekannt, dass Omega-3-Fettsäuren medizinisch verwendbar sind, doch sind mit ihrer Verwendung Probleme verbunden. Wegen ihrer Assoziation mit Fischölen ist mit diesen Säuren oft ein fischiger Geruch und ein unangenehmer Geschmack verbunden. Außerdem enthalten Fischöle zwar EPA, doch sind viele dieser Öle aufgrund der Gegenwart von kontaminierenden Begleitstoffen, wie PCB, sowie einer hohen Konzentration an oxidationsempfindlichen mehrfach ungesättigten Fettsäuren, von denen einige von der des EPA verschiedene und sogar antagonistische biologische Wirkungen zeigen, für den Menschen nicht genießbar. Weiterhin enthalten Öle von vielen Fischen, insbesondere Fischen aus tropischen Gewässern, auch erhebliche Mengen Arachidonsäure, die eine biologische Wirkung zeigt, die gegenüber der von EPA antagonistisch ist. Während die Herstellung von Omega-3-Fettsäuren in Mikroorganismen die Probleme mit den Kontaminanten beseitigen würde, steht kein kommerziell annehmbares und ökonomisch durchführbares Verfahren zur Herstellung großer Mengen dieser Säuren in Mikroorganismen zur Verfügung.
Isotopenmarkiertes EPA wäre sehr nützlich, um den Weg des Omega-3- Fettsäure-Metabolismus aufzuklären. Markiertes EPA in ausreichenden Mengen, um solche Forschungen durchzuführen, war jedoch bisher nicht erhältlich.
Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, EPA in Mikroorganismen mit einem kommerziell durchführbaren Verfahren herzustellen, so dass man kommerziell annehmbare Ausbeuten erhält.
Weiterhin ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, aus diesem Kultivierungsprozess isotopenmarkiertes EPA in ausreichenden Mengen herzustellen, um den Metabolismus von Omega-3-Fettsäuren untersuchen zu können.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Kultivierung von Mikroorganismen in einem Bioreaktor, das Induzieren der Erzeugung von Speiseölen, die Omega-3-Fettsäuren enthalten, bei diesen Mikroorganismen und die Gewinnung dieser Öle und/oder Fettsäuren. Die Erfindung betrifft auch neue Öle, die Omega-3-Fettsäuren enthalten, aber nicht die zusätzlichen mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten, die mit Fischölen verbunden sind, auf Kieselalgen, die im Vergleich zu Kieselalgen des Wildtyps, die in freier Natur wachsen, und zu mutanten Kieselalgen erhöhte Mengen an Omega-3-Fettsäuren aufweisen. Typischerweise sind diese Öle weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass sie zweiphasige Schmelzmuster aufweisen. Weiterhin werden isotopenmarkierte Omega-3-Fettsäuren und deren Herstellung offenbart.
Die vorliegende Erfindung stellt ein ökonomisches Verfahren zur Gewinnung von Speiseölen mit günstigen organoleptischen Eigenschaften bereit, die EPA enthalten, ohne wesentliche Mengen an anderen mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu enthalten. Außerdem erlaubt dieses Verfahren die Kultivierung von Kieselalgen bis zu größeren Zelldichten, als sie bei Verfahren des Standes der Technik typischerweise erreicht werden. Die nach diesem Verfahren hergestellten Speiseöle sind frei von Umweltkontaminanten, die man in EPA-haltigen Ölen aus anderen Quellen häufig findet.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Einzeller-Speiseöls bereit, das Eicosapentaensäure (EPA) enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es das Kultivieren von heterotrophen Kieselalgen in einem Bioreaktor, der eine Nährlösung enthält, die auch Silicat und verfügbaren Stickstoff beinhaltet, das Induzieren des Eintritts der Kieselalgen in eine oleogene Phase, wobei die Kieselalgen wenigstens etwa 20% ihrer Biomasse als Speiseöl synthetisieren, und das Gewinnen des Speiseöls umfasst; weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass dem Bioreaktor während der Wachstumsphase der Kultur Kieselsäure, vorzugsweise Metasilicat, zugeführt wird.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Biomassenakkumulation bei Nitzschia alba während ihrer Wachstums- und oleogenen Phase.
Fig. 2 zeigt das Verfahren der Markierung von EPA mit ¹³C oder Deuterium.

Ausführliche Beschreibung der besten Ausführungsform der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Kieselalgen, die in der Lage sind, EPA zu erzeugen, in einem Fermenter kultiviert, der eine Nährlösung enthält, in der solche Mikroorganismen wachsen können. In ihrer natürlichen Umgebung findet man heterotrophe Kieselalgen epiphytisch auf Meerespflanzen wachsend. Dementsprechend ist Meerwasser ein annehmbares Medium für die Nährlösung. Das Meerwasser kann entweder natürlich, gefiltert oder eine künstliche Mischung sein und kann dabei jeweils bis auf 1/4 der Stärke verdünnt oder auf das Doppelte konzentriert werden. Mikronährstoffe können hinzugefügt werden und auch erforderlich sein, insbesondere wenn das Meerwasser ein künstliches Gemisch ist. Solche Mikronährstoffe sind dem Fachmann bekannt und von kommerziellen Lieferanten leicht erhältlich. Zusätzlich wird ein speziell für die Zucht von Kieselalgen bestimmtes Wachstumsmedium hinzugefügt. Ein bevorzugtes Wachstumsmedium ist in Tabelle 1 dargestellt. Man sollte sich darüber im klaren sein, dass Variationen dieses Wachstumsmediums im Bereich der Fähigkeiten des Fachmanns auf diesem Gebiet liegen. Tabelle 1 Zusammensetzung des Wachstumsmediums Für 2 · 30-I-Fermenter und für 2 · 350-I-Fermenter benötigte Bestandteile.
In der vorliegenden Erfindung kann jede heterotrophe Kieselalge verwendet werden, die EPA zu erzeugen vermag. Außerdem werden vorzugsweise heterotrophe Kieselalgen verwendet. Für die Zwecke dieser Beschreibung bedeutet der Ausdruck "heterotrophe Kieselalgen" solche Kieselalgen, die in der Lage sind, im Dunkeln von einem bestimmten Kohlenstoffsubstrat zu leben. Für verschiedene Spezies können verschiedene Kohlenstoffsubstrate verwendet werden, und solche Substrate können vom Fachmann leicht bestimmt werden. Zu den bevorzugten Kieselalgengattungen gehören Nitzschia, Cyclotella und Navicula. Innerhalb der Gattung Nitzschia sind die farblosen Spezies besonders bevorzugt. Insbesondere Nitzschia alba ist für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders gut geeignet. In dieser Erfindung sollen Wildstämme, Mutanten oder rekombinant konstruierte Mikroorganismen verwendet werden, die erhöhte Mengen an EPA erzeugen, wenn sie gemäß der vorliegenden Erfindung kultiviert werden. Geeignete Kieselalgen können von der Oberfläche von Meerespflanzen isoliert werden, wo sie epiphytisch wachsen. Eine Probe eines Stammes von Nitzschia alba, einer besonders bevorzugten Spezies, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Md., hinterlegt, und es wurde ihr die Zugriffsnummer 40775 zugeordnet.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Kultivierung von Kieselalgen in einer viel höheren Zelldichte, als sie früher erreichbar war. Der Ausdruck "Zelldichte" bezieht sich auf die in dem Fermenter vorhandene Menge an Biomasse. Typischerweise betragen Zelldichteakkumulationen bei der Kultivierung von Kieselalgen in offenen Bassins etwa 0,2-1 Gramm Trockengewicht/Liter. Dagegen werden bei Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung und Kultivieren der Kieselalgen in einem Fermenter Biomassendichten von 40-50 Gramm Trockengewicht/Liter erhalten. Eine derart hohe Zelldichte trägt zur verstärkten Erzeugung von EPA-haltigen Speiseölen bei.
Zusammen mit Meerwasser wird das Wachstumsmedium im folgenden als Nährlösung bezeichnet. Die Nährlösung enthält typischerweise auch verfügbaren Stickstoff. "Verfügbarer Stickstoff" bedeutet Stickstoff in einer Form, die für die Verwendung durch Kieselalgen bei der Biosynthese stickstoffhaltiger Moleküle geeignet ist. Beispiele für geeignete Formen solchen Stickstoffs sind Natriumnitrat oder Kaliumnitrat. Natriumnitrat wird bevorzugt. Um eine Menge an Kieselalgenbiomasse zu erhalten, die gleich etwa 50 g/Liter Lösung ist, sollten etwa 3 bis etwa 4 Gramm Natriumnitrat pro Liter Lösung zugeführt werden. Das Nitrat kann bei der Sterilisation des anfänglichen Medium zugegen sein und braucht nicht danach hinzugefügt zu werden.
Nach der Sterilisation wird in das Medium außerdem eine ausreichende Menge Kieselalgen gegeben, um den Fermenter zu impfen. Diese anfänglichen Kieselalgen werden hier als "Impfkieselalgen" bezeichnet. Im allgemeinen werden Impfkieselalgen erhalten, indem man Kieselalgen auf Agarplatten züchtet und Zellen von den Agarplatten in Röhrchen überträgt, die 2-5 ml Kulturmedium enthalten. Nach einer Wachstumsperiode werden die Zellen in den Röhrchen wiederum verwendet, um 50 ml Medium in einem 250-ml-Schüttelkolben zu beimpfen. Der Inhalt des beimpften Schüttelkolbens wird als Impfmasse für einen 2-Liter- Fermenter verwendet. Bei Produktionsdurchläufen wird Impfkulturmedium vorzugsweise in Volumina von etwa 5 bis 10% des Volumens des Fermenters verwendet. In einen 300-Liter-Fermenter würde man zum Beispiel vorzugsweise etwa 15 bis 30 Liter Impfkulturmedium geben.
Während die Kieselalgen kultiviert werden, werden ihnen sowohl Silicat als auch Kohlenstoff zugeführt. Eine bevorzugte Form von Silicat ist Metasilicat, Na&sub2;SiO&sub3;. Metasilicat hat sowohl eine Pentahydrat- als auch eine Nonahydratform. Beide Formen sind für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung annehmbar. In einer Nährlösung mit einem typischen pH-Wert und Salzgehalt, die das Wachstum von Kieselalgen erlauben, bilden Metasilicate bei Konzentrationen von über etwa 250 mg/l irreversibel einen polymeren Niederschlag. Solche Niederschläge sind inakzeptabel, da die Silicate dann für die Verwendung durch die Kieselalgen nicht mehr zur Verfügung stehen. Dieses bisher ungelöste Problem wird in der vorliegenden Erfindung dadurch überwunden, dass vorzugsweise etwa 5 bis etwa 7 g Metasilicat pro Liter Nährlösung in den Fermenter gegeben werden. Die unerwünschte Fällung wird vermieden, indem man das Metasilicat in einer kontrollierten Menge in den Fermenter gibt. Das Metasilicat kann portionsweise im Chargenbeschickungsmodus zugegeben werden. Vorzugsweise wird es in einer kontinuierlichen Gradientenzufuhr zugegeben. Eine kontinuierliche Gradientenzufuhr entspricht einer geringeren Zugaberate als im Chargenbeschickungsmodus, worüber sich der Fachmann im klaren sein wird. Der Fachmann, der über diese Erfindung verfügt, kann ohne unzumutbare Experimente geeignete Zugaberaten für Silicat leicht bestimmen.
Während der Wachstumsphase der Kieselalgen wird das Verhältnis von Silicat zu Kohlenstoff vorzugsweise konstant gehalten. Daher können diese beiden Nährstoffe während der gesamten Kultivierung in Abständen zusammen zum Ansatz gegeben werden. Wenn man zum Beispiel Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet, beträgt das Verhältnis von Glucose zu Metasilicat vorzugsweise etwa 10 g bis 35 g Glucose pro Gramm Metasilicat. Ein besonders bevorzugtes Verhältnis ist etwa 20 g Glucose pro Gramm Metasilicat. Der Fachmann kann annehmbare Verhältnisse bei Verwendung anderer Kohlenstoffquellen, wie hydrolysierter Molke oder Stärke, leicht berechnen.
Alternativ dazu kann die Kohlenstoffquelle auch diskontinuierlich zugegeben werden, d. h. zu Beginn der Fermentierung wird genügend Kohlenstoffquelle für eine vollständige Charge hinzugefügt. Wenn diese Alternative gewählt wird, wird das Metasilicat langsam zur Fermentierung gegeben, wobei man die Wachstumsrate der Kieselalgen effektiv steuert. Typische Wachstumsraten entsprechen einer Verdoppelung der Biomasse alle 4-8 Stunden.
In der vorliegenden Erfindung kann jeder Fermentertyp verwendet werden, doch bilden Rührkesselfermenter mit herkömmlichem Rushton- Turborührwerk eine bevorzugte Ausführungsform. Bei solchen Turbinen erfolgt das Rühren durch Drehen einer Welle mit vorstehenden flachen Flügeln, um eine maximale Belüftung zu erreichen. Vorzugsweise wird die Rotationsgeschwindigkeit auf einer Geschwindigkeit von weniger als 250 cm/s an der Spitze der Welle gehalten. Dadurch, dass man die Geschwindigkeit auf weniger als 250 cm/s hält, wird die Wahrscheinlichkeit einer Scherung oder anderen Beschädigung der Kieselalgen reduziert. Ein besonders bevorzugter Fermenter für die Kultivierung im großen Maßstab ist ein Mischluftfermenter. Solche Fermenter sind dem Fachmann wohlbekannt und vermeiden eine potentielle Schädigung durch Scherung.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden heterotrophe Kieselalgen in Fermentern kultiviert, wie es oben beschrieben ist. Während phototrophe Mikroorganismen typischerweise etwas EPA erzeugen, wenn sie zum Beispiel in offenen Bassins kultiviert werden, wurde unerwarteterweise gefunden, dass man heterotrophe Kieselalgen induzieren kann, in eine oleogene Phase einzutreten, wobei sie ein Einzelleröl erzeugen, das EPA enthält. Fig. 1 zeigt die erhöhte Produktion von Biomasse während der Oleogenese. Etwa 40 bis 50% dieser Biomasse kann der Ölerzeugung zugeschrieben werden. Die Induktion der Oleoge nese kann ausgelöst werden, indem man dem Mikroorganismus bestimmte Nährstoffe vorenthält. Insbesondere ist bekannt, dass eine Beschränkung der Verfügbarkeit von Stickstoff bei vielen ölerzeugenden Mikroben die Oleogenese auslöst. Außerdem ist bekannt, dass eine Beschränkung der Verfügbarkeit von Silicium bei Kieselalgen eine Oleogenese auslöst; Borowitzka, "Micro-Algal Biotechnology", Cambridge University Press (1988). In der vorliegenden Erfindung wurde jedoch entdeckt, dass der richtige Zeitpunkt des Herstellens eines Siliciummangelzustands die Erzeugung von EPA-haltigem Speiseöl durch die Kieselalge wesentlich erhöht.
Nach etwa 24 bis 48 Stunden Kultur haben die Kieselalgen den verfügbaren Stickstoff im Wachstumsmedium aufgebraucht. Zu diesem Zeitpunkt haben sie typischerweise eine Biomassedichte von 20 bis 30 g/l, erreicht, die als Masse des gefriergetrockneten Zellsediments aus einem bekannten Kulturvolumen gemessen werden kann. Selbstverständlich ist dieser Zeitraum etwas flexibel, da er zum Teil von der anfangs zugegebenen Stickstoffmenge und von der zugeführten Siliciummenge abhängt. Noch mehrere Stunden nach dem Auftreten des Stickstoffmangels werden den Kieselalgen weiterhin Silicat und Glucose zugeführt. Diese zusätzlichen Nährstoffe können entweder kontinuierlich oder portionsweise zugegeben werden, doch werden die Nährstoffe vorzugsweise portionsweise zugegeben. Im allgemeinen beträgt der Zeitraum dieser abschließenden Silicatzufuhr etwa 12 bis etwa 24 Stunden und ist beendet, wenn insgesamt etwa 5 g/l, Metasilicat zu der Kultur gegeben wurden. Dann treten die Kieselalgen in eine oleogene Phase ein, wobei erhöhte Mengen von EPA- haltigen Speiseölen schneller synthetisiert werden. Die oleogene Phase kann unterschiedlich lange fortgesetzt werden, hat jedoch vorzugsweise eine Dauer von etwa 12 Stunden bis etwa 36 Stunden. Vorzugsweise lässt man die oleogene Phase etwa 24 Stunden lang andauern. Während dieser Phase wird EPA als Einzelleröl erzeugt. Für die Zwecke dieser Beschreibung bedeutet "Einzelleröl" ein Triglyceridprodukt eines einzelligen Mikroorganismus. Die genaue Zeitdauer der oleogenen Phase hängt vom Typ des kultivierten Mikroorganismus und der verfügbaren Nährstoffzufuhr ab und kann vom Fachmann bestimmt werden. Im Falle von Nitzschia alba beginnen die Ausbeuten abzunehmen, wenn dieses Stadium länger als etwa 24 bis 36 Stunden dauert. Das Ernten zur Gewinnung des EPA- haltigen Öls kann sofort im Anschluss an die oleogene Phase erfolgen.
Eine Sauerstoffkonzentration, die größer ist als die für die aerobe Atmung der Zellen erforderliche, verstärkt das Wachstum und die EPA-Synthese der Kieselalgen. Der erhöhte Sauerstoffwert wird durch hohe Belüftungsraten, direktes Einleiten von O&sub2; oder Druckbeaufschlagung des Fermenters erreicht. Es gibt eine direkte Korrelation zwischen der Konzentration an gelöstem Sauerstoff und der EPA-Synthese, da O&sub2; ein Substrat für die EPA-Synthese ist. Bei einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 30% Luftsättigung betragen die typischen EPA-Mengen in dem Öl etwa 2 bis etwa 3%. Bei einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 50% Luftsättigung nimmt der EPA-Gehalt des Öls auf etwa 4-5% zu.
Die Kultivierung kann bei jeder Temperatur erfolgen, bei der Kieselalgen gezüchtet werden können. Ein bevorzugter Temperaturbereich ist etwa 15ºC bis etwa 40ºC. Eine zweckmäßige und ökonomische Temperatur für die Durchführung der Kultur ist 30ºC. Hierin liegt ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber zum Beispiel der Kultivierung in offenen Bassins, die Witterungsextrema ausgesetzt sind. Bei Temperaturen am unteren Ende des obigen Bereichs wird die EPA-Menge in bezug auf ungesättigte Fettsäuren häufig verbessert, doch senken solche Temperaturen auch die Gesamtproduktivität. Die höchsten Produktivitätsra ten, wenn man sie anhand der Geschwindigkeit der Verdoppelung der Biomasse mist, treten bei etwa 30ºC auf.
Die Kultivierung kann über einen breiten pH-Bereich hinweg durchgeführt werden. Ein bevorzugter pH-Wert beträgt etwa 7,0 bis etwa 8,5. Dieser pH-Bereich kann durch die Zugabe von konzentrierter Silicatlösung mit einem pH-Wert von etwa 12 aufrechterhalten werden. Falls eine Einstellung des pH-Werts über das hinaus, was die Zugabe von Silicat bewirkt, erforderlich ist, kann entweder Natrium- oder Kaliumhydroxid in einer Menge, die eine Einstellung des pH-Werts bewirkt, hinzugefügt werden.
In dieser Erfindung können auch mutante Stämme von Kieselalgen eingesetzt werden, die erhöhte Mengen von EPA, geringere Mengen an gesättigten Fettsäuren oder beides aufweisen. Techniken zur Gewinnung von mutanten Stämmen, wie Behandlung mit einem Mutagen und Durchmusterung nach Nachkommen mit den gewünschten Merkmaien, sind dem Fachmann bekannt. Die hier verwendeten Ausdrücke "erhöht" oder "geringer" bedeuten eine größere bzw. kleinere Menge als die Menge, die man gewöhnlich bei Kieselalgen des Wildtyps findet.
Kieselalgen, die etwa 40% Triglyceride als Biomasse umfassen, bilden einen Bestandteil dieser Erfindung. Typischerweise findet man, dass Kieselalgen des Wildtyps etwa 5 bis etwa 20% Triglyceride als Biomasse umfassen. Da ein Teil dieser Erfindung auf der Erkenntnis beruht, dass Kieselalgen mit Erfolg in wirtschaftlicher Weise so kultiviert werden können, dass sie große Mengen an Einzelleröl erzeugen, gilt die Kultivierung solcher Kieselalgen zur Gewinnung von irgendeinem Einzelleröl als innerhalb des Rahmens dieser Erfindung liegend. Zum Beispiel weisen Wildtyp-Kieselalgen der Spezies Nitzschia alba typischerweise weniger als etwa 3% EPA und 40-60% gesättigte Fettsäuren auf. Dieselbe Spezies weist in der vorliegenden Erfindung typischerweise etwa 3-5% EPA und 50% gesättigte Fettsäuren auf. Dieser erhöhte Prozentsatz an EPA ist wünschenswert.
Außerdem zeigen die Triglyceride der vorliegenden Erfindung ein zweiphasiges Schmelzmuster. Da Kieselalgen keine Tiere sind, ist ein solcher Effekt nicht zu erwarten, wie der Fachmann bestätigen wird. Ein solches Schmelzmuster zeigen Milchfette, wie Butter, doch wurde bisher über kein solches Muster bei einem Einzelleröl von irgendeinem primären Erzeuger berichtet. Dementsprechend bilden Einzelleröle, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt sind und Triglyceride enthalten, die ein zweiphasiges Schmelzmuster aufweisen, ebenfalls einen Bestandteil dieser Erfindung.
Ein bevorzugtes Öl, das mit dem Verfahren dieser Erfindung hergestellt wird, hat die folgende Fettsäurezusammensetzung.
Wie oben diskutiert, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, um zuverlässig und reproduzierbar große Mengen eines EPA-haltigen Öls zu erhalten. Typischerweise synthetisieren die Kieselalgen in einer Ausführungsform der Erfindung wenigstens etwa 20% ihrer Biomasse als Speiseöl. Da das Speiseöl ein Einzelleröl ist, ist seine Gewinnung stark erleichtert. Nach der oleogenen Phase können die Kieselalgen nach dem Fachmann bekannten Techniken nass oder trocken extrahiert werden, wobei ein lipidhaltiger Komplex entsteht. Nach der Extraktion kann dieser Lipidkomplex zur Gewinnung von EPA mit Hilfe von bekannten Techniken weiter aufgetrennt werden. Bei dem bevorzugten Trockenextraktionsverfahren wird Hexan als Extraktionslösungsmittel verwendet. Die Zellen werden zuerst abzentrifugiert, und vor der Extraktion mit Hexan wird das Zellsediment gefroren und lyophilisiert. Eine solche Extraktion erfordert nur wenig oder keine physikalische Zerlegung der Zellen. Die Extraktion mit Hexan bei 40ºC in einem Volumen-Masse-Verhältnis von Hexan zu trockener Biomasse von etwa 4 : 1 liefert mehr als etwa 95% des Öls innerhalb von etwa 0,5 Stunden. Wenn anstelle getrockneter Zellen eine feuchte Zellpaste verwendet wird, ist ein Gemisch von Ethanol und Hexan das bevorzugte Extraktionsmedium.
Das Speiseöl der vorliegenden Erfindung enthält neben EPA noch andere Fettsäuren. Diese anderen Lipide gehören überwiegend zu nur drei Typen, Palmitinsäure (16 : 0), Oleinsäure (18 : 1) und Myristinsäure (14 : 0), wodurch das Reinigungsverfahren vereinfacht wird. Dagegen enthalten Fischöle neben EPA noch eine Vielzahl anderer Fettsäuren.
Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung können ausreichende Mengen an EPA mit ausreichender Reinheit erhalten werden, um Forschungen über den EPA-Metabolismus durchzuführen. Durch Mitverwendung eines Isotops in der Nährlösung wird markiertes EPA dementsprechend von den Kieselalgen synthetisiert und kann gewonnen werden. Wenn die Marker vom Typ, der als "stabile Isotope" bekannt ist, wie Deuterium oder Kohlenstoff-13, oder Radioisotope wie Tritium oder Kohlenstoff-14 sind, werden die Marker in das EPA eingebaut, das dann in Tracerstudien bei Tieren oder Menschen oder anderen Forschungen verwendet werden kann. Man sollte sich darüber im klaren sein, dass man nicht nur eine in Abwesenheit von Lichtquellen wachsende heterotrophe Kieselalge mit einem markierten Kohlenstoffsubstrat, wie ¹³C-Glucose oder ¹&sup4;C-Glucose, versorgen kann, sondern auch eine autotrophe photosynthetisierende Kieselalge mit ¹³CO&sub2; oder ¹&sup4;CO&sub2; versorgen kann. In beiden Fällen kann D&sub2;O oder ³H&sub2;O zugeführt werden. Autotrophe Kieselal gen müssen außerdem einer Lichtquelle ausreichender Intensität ausgesetzt werden, um die Photosynthese zu erleichtern. Zu den geeigneten photosynthetisierenden Spezies gehören solche der Gattungen Cyclotella, Navicula, Phaeodactylum und Monodus. Diese Organismen sind für die Erzeugung von markiertem EPA bevorzugt, da sie autotroph sind und größere Mengen an EPA enthalten als Nitzschia alba.
Das nach den Verfahren dieser Erfindung erzeugte Öl und das daraus gewonnene EPA haben wenigstens zum Teil auch günstige Wirkungen bei der Behandlung von Hautstörungen, wie Psoriasis. Es wurde berichtet, dass die Verwendung von EPA aus Fischöl eine günstige Wirkung auf durch Psoriasis verursachte Hautschädigungen hat. Dementsprechend fallen auch Kosmetika, die das Einzelleröl dieser Erfindung oder das daraus gewonnene EPA enthalten, in den Rahmen dieser Erfindung. Insbesondere Hautbehandlungen, Lotionen oder Cremes, die das Einzelleröl enthalten, werden in Betracht gezogen. Diese hätten einen olfaktorischen Vorteil gegenüber EPA-haltigen Fischölen und enthielten auch nicht die anderen Kontaminanten, die man in Fischöl findet.
Nachdem die vorliegende Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird nun auf das folgende nichteinschränkende spezielle Beispiel Bezug genommen.

Beispiel

In einen herkömmlichen 30-Liter-Rührtankfermenter (STF) gibt man das Nährmedium von Tabelle 1, aber ohne die Vitamine, Glucose und das Silicat. Der Fermenter wird mit einem Turborührwerk des Rushton-Typs ausgestattet. Der STF und das Medium werden sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Mediums auf etwa 30ºC werden die Vitamine zugesetzt, und dann werden ausreichende Mengen 40%iges Glucosesirup hinzuge fügt, so dass man eine Glucosekonzentration von etwa 80 g/l erhält. Dann wird konzentriertes Natriummetasilicat-Pentahydrat (100 g/l,) hinzugefügt, so dass man eine Gesamtsilikatkonzentration von etwa 200 mg/l, erhält. Dann wird die Impfkultur in einer Menge hinzugefügt, die ungefähr gleich 5% des Gesamtvolumens des Fermenters ist, z. B. 1,5 Liter/30 Liter. Man beginnt zu rühren, wobei die Geschwindigkeit der Spitze auf 85-90 cm/s eingestellt ist, und es wird begonnen, luft mit 1 VVM einzuleiten. Im Verlaufe von etwa 16 Stunden wird eine zusätzliche Charge konzentriertes Metasilicat (0,53 Liter) hinzugefügt, und die Rührgeschwindigkeit wird auf 126 cm/s erhöht. Etwa im Verlauf der nächsten 24 Stunden wird weiteres konzentriertes Silicat (0,83 Liter) hinzugefügt. Die Rührgeschwindigkeit wird wiederum auf etwa 180-185 cm/s erhöht. Etwa im Verlauf der nächsten 3 Stunden werden weitere 0,15 Liter konzentriertes Metasilicat hinzugefügt. Die Gesamtmenge des hinzugefügten Metasilicats beträgt also etwa 156 Gramm oder etwa 1,6 Liter konzentrierte Lösung. Nach etwa 48 Stunden wird weitere Glucose (etwa 5 Liter) hinzugefügt, was eine Gesamtglucosezugabe von etwa 4,8 kg oder etwa 12 Liter 40%igen Glucosesirup ergibt. Man lässt die Kultur noch weitere 16 Stunden wachsen, wobei man die Rührgeschwindigkeit und die Belüftungsrate beibehält. Dann wird der Fermenter abgeerntet, wobei man eine Sharpless- Durchlaufzentrifuge verwendet, die eine Biomassedichte von ungefähr 45- 48 Gramm Trockengewicht pro Liter erzeugt. Das resultierende Sediment mit etwa 20-38% Feststoffanteil wird entnommen und auf etwa -20ºC gefroren. Ein Vakuumhordentrockner wird verwendet, um Wasser aus dem Sediment zu entfernen. Dann wird das Einzelleröl-Sediment mit Hexan extrahiert. Das Hexan wird anschließend durch Destillation entfernt, wobei das extrahierte Einzelleröl zurückbleibt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Einzeller-Speiseöls, das Eicosapentaensäure (EPA) enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es das Kultivieren von heterotrophen Kieselalgen in einem Bioreaktor, der eine Nährlösung enthält, die auch Silicat und verfügbaren Stickstoff beinhaltet, das Induzieren des Eintritts der Kieselalgen in eine oleogene Phase, wobei die Kieselalgen wenigstens etwa 20% ihrer Biomasse als Speiseöl synthetisieren, und das Gewinnen des Speiseöls umfasst;

weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass dem Bioreaktor während der Wachstumsphase der Kultur Kieselsäure, vorzugsweise Metasilicat, zugeführt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Zuführen der Kieselsäure fortgesetzt wird, nachdem die Kieselalgen den verfügbaren Stickstoff aufgebraucht haben.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kieselalgen Nitzschia sp. umfassen und die Kieselalgen vorzugsweise farblose Spezies von Nitzschia umfassen.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ab dem Zeitpunkt des Einleitens der oleo genen Phase bis zur Ernte eine Sauerstoffkonzentration aufrechterhalten wird, die größer ist, als es für eine aerobe Atmung der Zellen in dem Fermenter erforderlich ist.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur bei einer Temperatur von 15ºC bis 40ºC, vorzugsweise bei etwa 30ºC, durchgeführt wird.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,5 erfolgt.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Induktion eine Einschränkung der Kieselsäurezufuhr umfasst, so dass ein Zustand des Siliciummangels entsteht.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitdauer der oleogenen Phase 12 Stunden bis 36 Stunden beträgt.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass 12 bis 24 Stunden vor der Silicatverknappung der Kieselalgen in dem Fermenter ein Stickstoffmangel verursacht wird.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Fermenter ein Medium enthält, das Meerwasser umfasst.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium Mikronährstoffe umfasst.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Fermenter einen Rührkesselfermenter mit Turborührwerk umfasst.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Geschwindigkeit der Turbine an ihrer Spitze kleiner als etwa 250 cm/s ist.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Fermenter ein Mischluftfermenter ist.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der gelöste Sauerstoff etwa 50% der Luftsättigung umfasst.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Metasilicat in einer Menge von 5 g bis 7 g pro Liter Kulturmedium in den Fermenter gegeben wird.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Metasilicat in einem kontinuierlichen Gradientenzufuhr- oder einem Chargenzufuhrmodus in den Fermenter gegeben wird.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Metasilicat den Kieselalgen in Verbindung mit einer Kohlenstoffquelle zugeführt wird.

19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle Glucose umfasst.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Glucose zu Metasilicat 10 g bis 35 g Glucose pro Gramm Metasilicat beträgt, vorzugsweise von etwa 20 g Glucose pro Gramm Metasilicat aufwärts.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung eine Kohlenstoffquelle umfasst, die aus Glucose, hydrolysierter Molke oder hydrolysierter Stärke ausgewählt ist.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Stickstoff in Form von Natriumnitrat oder Kaliumnitrat vorliegt.

23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Stickstoff in Form von Natriumnitrat vorliegt und das Natriumnitrat in der Nährlösung in einer Konzentration von 3 g bis 4 g pro Liter Lösung vorhanden ist.

24. Mutante heterotrophe Kieselalgen, die Öl mit EPA-Gehalten von mehr als 5% aufweisen.

25. Heterotrophe Kieselalge, dadurch gekennzeichnet, dass sie etwa 40% ihrer Biomasse als Triglyceride umfasst.

26. Kieselalge gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Triglyceride ein zweiphasiges Schmelzmuster aufweisen.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung wenigstens ein Substrat umfasst, das ein aus ¹³C, ²H, ¹&sup4;C oder ³H ausgewähltes Isotop, vorzugsweise Deuterium oder Kohlenstoff-13 und besonders bevorzugt D&sub2;O enthält.

28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat [¹³C]-Glucose, [¹&sup4;C]-Glucose, ¹³CO&sub2; oder ¹&sup4;CO&sub2; umfasst.

29. Verfahren zur Herstellung von EPA, dadurch gekennzeichnet, dass es folgendes umfasst:

(a) Kultivieren farbloser Kieselalgen in einem Fermenter, der eine Nährlösung enthält, die wenigstens verfügbaren Stickstoff enthält;

(b) Aufrechterhalten eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff von 10% bis 70% der Luftsättigung in der Nährlösung;

(c) Zugeben von Glucose und Metasilicat zu der Nährlösung, wobei das Verhältnis von Glucose zu Metasilicat 10 : 1 bis 35 : 1 beträgt und 5 bis 7 g Metasilicat pro Liter der Nährlösung zugegeben werden, wobei das Gemisch zugegeben wird, nachdem die Kieselalgen den verfügbaren Stickstoff in der Nährlösung aufgebraucht haben;

(d) Halten der Temperatur der Nährlösung auf 15ºC bis 40ºC;

(e) Halten des pH-Werts der Nährlösung auf 7,0 bis 8,5;

(f) Induzieren einer oleogenen Phase bei den Kieselalgen, indem man die Zugabe von Metasilicat stoppt; und

(g) Gewinnen von EPA-haltigem Öl, nachdem die oleogene Phase zu Ende ist.

30. Verfahren gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Kieselalge eine farblose Spezies von Nitzschia umfasst.

31. Verfahren gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Kieselalge Nitzschia alba umfasst.

32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an gelöstem Sauerstoff wenigstens 50% der Luftsättigung beträgt, das Verhältnis von Glucose zu Metasilicat etwa 20 : 1 beträgt und dieses Gemisch portionsweise während der gesamten Zeit von 12 bis 24 Stunden nach dem Stickstoffmangel hinzugefügt wird, die Temperatur etwa 30ºC beträgt und die oleogene Phase über einen Zeitraum von ungefähr 24 Stunden auftritt.

33. Verfahren zum Erhalten erhöhter Ausbeuten an EPA aus kultivierten Kieselalgen in einem Fermenter, der eine Nährlösung enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es das Kultivieren der Kieselalgen bis zu einer Zelldichte von 40 bis 50 g pro Liter der Nährlösung, das Induzieren einer oleogenen Phase bei den Kieselalgen, wobei das EPA synthetisiert wird, und das Gewinnen des EPA umfasst.

34. Verfahren gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Kieselalge eine heterotrophe Kieselalge, vorzugsweise Nitzschia sp. oder Cyclotella sp., ist und die Nitzschia vorzugsweise eine farblose Spezies, besonders bevorzugt Nitzschia alba, ist.

35. Zustrom für Aquakultur, dadurch gekennzeichnet, dass er Zellen einer heterotrophen Kieselalge, die ein EPA-haltiges Einzelleröl zu erzeugen vermag, umfasst, welche unter heterotrophen Bedingungen mit Induktion der Erzeugung von Einzelleröl kultiviert wurden.

36. Zustrom für Aquakultur gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Aquakultur Garnelen, Fische oder Zooplankton umfasst.

37. Zustrom für Aquakultur gemäß Anspruch 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Kieselalgen Nitzschia sp., vorzugsweise eine farblose Spezies von Nitzschia, umfassen.

38. Nitzschia alba, die die Identifizierungsmerkmale des Stammes aufweist, der bei der American Type Culture Collection hinterlegt wurde und dem die Zugriffs-Nr. 40775 zugewiesen wurde.

39. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, 27 bis 31, 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um die Nitzschia alba gemäß Anspruch 38 handelt.