DE3445445C2

DE3445445C2 -

Info

Publication number: DE3445445C2
Application number: DE3445445A
Authority: DE
Inventors: Yumiko Manoh; Akira Yokohama Jp Seto
Original assignee: NISSHIN OIL MILLS Ltd TOKIO/TOKYO JP
Current assignee: NISSHIN OIL MILLS Ltd TOKIO/TOKYO JP
Priority date: 1983-12-14
Filing date: 1984-12-13
Publication date: 1987-07-23
Also published as: GB2152042B; GB2152042A; DE3445445A1; JPS60126091A; US5026644A; GB8431200D0; JPS639835B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Lipoid-Mischung mit einem hohen Gehalt an γ-Linolensäure gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

6,9,12-Octadecatriensäure oder γ-Linolensäure (nachfolgend als GLA bezeichnet) ist eine Fettsäure, die in einem lebenden Organismus aus Linolsäure synthetisiert wird. GLA wird in Prostaglandin E₁, F₁, E₂ oder F₂ über bishomo-γ-Linolensäure umgewandelt. Es wurde kürzlich gefunden, daß die in vivo-Umwandlungsreaktion von Linolsäure in GLA durch Altern, Alkoholtrinken und Vitaminmangel gehindert wird. Ein Ungleichgewicht an Prostaglandin aufgrund eines GLA-Mangels wird als ein Faktor angesehen, der Allergien, Thrombose oder Krebs verursacht.

GLA, die daher wichtig für die Gesundheit lebender Organismen ist, wird aus Pflanzensamen, wie den Samen der gelben Schlüsselblume gewonnen. Jedoch ist GLA in den Samen der gelben Schlüsselblume in geringer Menge enthalten und macht höchstens 10 Gew.-% des Gesamtfettsäuregehalts aus. Weiterhin enthält das Pflanzensamenöl auch etwa 70%, bezogen auf Gesamtfettsäure, an Linolsäure. Wenn GLA durch Reinigung eines Fettsäuregemischs erhalten wird, welches aus Pflanzensamenöl durch Lösungsmittelfraktionierung oder auf ähnliche Weise erhalten wird, kann GLA nicht auf einfache Weise von der Linolsäure abgetrennt werden, da sich die beiden Komponenten ähnlich verhalten.

Es wurde vorgeschlagen, GLA aus den Lipoiden von Mikroorganismen zu gewinnen. Siehe z. B. R. O. Mumma, Lipids, 6, 584 (1971); R. Shaw, Biochem. Biophys. Acta. 98, 230 (1965); und Suzuku et al, Yukagaku, 30, 863 (1981). Jedoch ist der GLA-Gehalt der in diesen Artikeln erwähnten GLA-produzierenden Mikroorganismen niedrig und beträgt höchstens 10 bis 20% des Gesamt-Lipoidgehalts. In der japanischen Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 58-22 199 wird berichtet, daß, wenn Schimmelpilze der Gattung Mortierella in einem Medium kultiviert werden, dem ein Kohlenwasserstoff zugesetzt wird, die kultivierten Pilze einen GLA-Gehalt von 20% oder mehr, bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt aufweisen. Jedoch wachsen Schimmelpilze der Gattung Mortierella langsam und besonders langsam bei einer niedrigen Temperatur, die für sie zur Bildung von GLA am förderlichsten ist. Daher ist die GLA-Produktivität dieser Pilze niedrig.

Es ist daher ein Gegenstand der Erfindung, ein neues Verfahren zur Herstellung einer Lipoid-Mischung aus kultivierten Mikroorganismen bereitzustellen, die eine hohe Konzentration an GLA enthält.

Obiges Ziel der Erfindung wird durch ein Verfahren zur Herstellung einer Lipoid-Mischung mit einem hohen Gehalt an γ-Linolensäure erreicht, nämlich durch Züchten eines Schimmelpilzes bei Temperaturen von 15 bis 30°C in einem schwach sauren bis neutralen wäßrigen Nährmedium, das 3 bis 20% seines Gewichts an verwertbarem Kohlenstoff enthält, und Gewinnung der Lipoidmischung aus dem gezüchteten Schimmelpilz, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Schimmelpilz Schimmelpilze der Gattung Cunninghamella züchtet. Die Ansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Eine Fettsäuremischung, die eine hohe Konzentration an GLA enthält, kann durch Verseifung der so erhaltenen Lipoid-Mischung erhalten werden.

Um zu bestimmen, welche Stämme die Bedingungen eines hohen Lipoid-Gehalts, eines hohen GLA-Gehalts in dem Lipoid und ein rasches Wachstum erfüllen, haben die Erfinder Stämme aus einem Katalog einem Suchtest unterworfen. Als Resultat hiervon wurde gefunden, daß Cunninghamella elegans (nachfolgend als C. elegans bezeichnet; Hinterlegungsnummern NRRL-1378, 1379, 1380 und 1381) diese Forderungen am besten erfüllten. Als ein Ergebnis weiterer Studien wurde auch gefunden, daß andere Schimmelpilze der Gattung Cunninghamella als C. elegans im wesentlichen die obigen Bedingungen erfüllen und daß die Kultivierung solcher Schimmelpilze in einem spezifischen Kulturmedium eine Lipoid-Mischung liefern kann, die einen hohen GLA-Gehalt aufweist.

Die Schimmelpilze der Gattung Cunninghamella, die hierin benutzt werden sollen, gehören zu Mucorales von Zygomyceten. Sie haben grau-weiße Hyphen und sind aerobisch. Die geeignete Wachstumstemperatur ist 15 bis 30°C.

Diese Pilze sind alle bei NRRL hinterlegt und in deren Katalog beschrieben. C. elegans ist besonders bevorzugt. Jedoch können auch Cunninghamella blackesleeana, Hinterlegungsnummer NRRL-1373, und Cunninghamella echinulate, Hinterlegungsnummer NRRL-1383, verwendet werden. Es wurde bestätigt, daß diese Schimmelpilze der Gattung Cunninghamella keine toxische Substanz, wie Aflatoxin, produzieren.

Diese Schimmelpilze können im allgemeinen mittels ruhender Kultur, Schüttelkultur oder belüfteter Rührkultur unter Verwendung eines flüssigen Kulturmediums gezüchtet werden. Das zu verwendende Kulturmedium ist lediglich dadurch eingeschränkt, daß es Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten muß. Jedoch wird ein Kulturmedium bevorzugt angewendet, welches eine relativ hohe Konzentration an einer Kohlenstoffquelle enthält.

Eine organische Kohlenstoffquelle wie Glukose oder Natriumacetat wird bevorzugt. Eine solche Kohlenstoffquelle ist bevorzugt in einer Menge von 3 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Kulturmediums, vorhanden. Besonders bevorzugt enthält das Kulturmedium eine solche Kohlenstoffquelle in einer Menge von 5 bis 15 Gew.-%.

Eine Stickstoffquelle kann eine Quelle organischen Stickstoffs sein, wie Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton oder Harnstoff; oder eine Quelle anorganischen Stickstoffs, wie Nitrat oder Ammoniumsulfat. Bevorzugt ist die Stickstoffquelle im Kulturmedium in einer Menge von 0,5 bis 2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Kulturmediums, enthalten.

Das verwendete Kulturmedium ist wäßrig-flüssig. Das flüssige Kulturmedium kann durch Auflösen der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in Wasser hergestellt werden. Bevorzugt ist das flüssige Kulturmedium schwach sauer oder neutral (pH 4,0 bis 6,0). Wenn Vitamine, wie Vitamin B6 oder Biotin, dem Kulturmedium zugegeben werden, wird das Wachstum der Schimmelpilze erleichtert. Bevorzugt werden Vitamin B6 und Biotin dem Medium in Mengen von 0,1 bis 0,5 mg% und 0,001 bis 0,005 mg% zugegeben. Andere Quellenelemente können im Medium enthalten sein. Solche Quellenelemente umfassen eine Phosphorquelle (z. B. Kaliumdihydrogenphosphat), eine Natriumquelle (z. B. Natriumchlorid), eine Magnesiumquelle (z. B. Magnesiumsulfat), eine Eisenquelle (z. B. Eisen(II)-Sulfat), eine Calciumquelle (z. B. Calciumchlorid), eine Kupferquelle (z. B. Kupfersulfat), eine Zinkquelle (z. B. Zinksulfat) oder eine Manganquelle (z. B. Manganchlorid).

Wenn Schimmelpilze der Gattung Cunninghamella unter Verwendung eines oben beschriebenen Kulturmediums kultiviert werden, werden die Schimmelpilze im allgemeinen in einer Menge von 0,5 bis 5 g/l des Mediums eingeimpft. Die Kultivierung wird bevorzugt innerhalb eines Temperaturbereichs von 15 bis 30°C durchgeführt, die Kultivierungsdauer ist 4 bis 15 Tage.

Die auf diese Weise gezüchteten Schimmelpilze werden durch Filtration abgetrennt und der Lipoid-Gehalt wird aus dem abgetrennten Schimmelpilz extrahiert. Da das GLA-haltige Lipoid sich während der Züchung nicht in das Medium absondert, braucht das Kulturmedium nicht abgetrennt zu werden.

Die Lipoide können extrahiert werden, indem Glasperlen zu den abgetrennten, feuchten Schimmelpilzen zugegeben und das Gemisch mit einem organischen Lösungsmittel, wie Hexan oder Alkohol homogenisiert wird, damit die Lipoide in den Pilzen in das Lösungsmittel übergehen. Die Lösungsmittelphase, welche die Lipoide enthält, wird durch Filtration gewonnen, und die gewünschten Lipoide werden durch Entfernung des Lösungsmittels aus der Lösungsmittelphase durch Destillation unter vermindertem Druck oder auf ähnliche Weise erhalten. Die Menge des angewendeten Lösungsmittels beträgt im allgemeinen das 2- bis 5fache des Gewichts der feuchten Pilze. Die Homogenisierung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 10 bis 20°C durchgeführt.

Eine andere Methode kann verwendet werden, um die Lipoide zu extrahieren. Nach dieser Methode werden die abgetrennten, feuchten Schimmelpilze in einem Temperaturbereich von -20 bis -40°C gefriergetrocknet. Danach werden die Schimmelpilze in ausreichenden Kontakt mit einem organischen Lösungsmittel, wie einem Gemisch aus Hexan und Isopropanol, Hexan und Ethanol oder Chloroform und Methanol gebracht, damit die Lipoide in das Lösungsmittel übergehen können. Bevorzugt wird das Lösungsmittel in einer Menge von etwa dem 4- bis 10fachen des Gewichts der Pilze angewendet. Die Schimmelpilze werden mit dem Lösungsmittel bei einer Temperatur von bevorzugt 10 bis 20°C und während einer Zeit von 1 bis 3 Stunden in Berührung gebracht. Nach der Extraktion wird die die Lipoide enthaltende Lösungsmittelphase durch Filtration gewonnen, worauf das Lösungsmittel aus der abgetrennten Lösungsmittelphase durch Destillation unter vermindertem Druck oder auf ähnliche Weise entfernt wird.

Ein Fettsäuregemisch, daß durch Verseifung von Lipoiden erhalten werden kann, welche aus auf diese Weise gezüchteten Schimmelpilzen der Gattung Cunninghamella extrahiert worden sind, enthält 20 Gew.-% oder mehr an GLA. Die Fettsäuremischung enthält eine relativ geringe Menge an Fettsäuren wie Linolsäure, welche physikalische Eigenschaften ähnlich denen von GLA aufweist. Daher ist die Reinigung von GLA relativ leicht.

Wenn die auf diese Weise extrahierten Lipoide verseift werden (der Hydrolyse unterworfen werden), wird eine Säure (z. B. eine Mineralsäure wie Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure) oder Alkali (z. B. Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid) in einer Menge von 0,25 bis 0,5 Gew.-Teilen, bezogen auf einen Teil des Lipoids, angewandt, und die Verseifung wird in einem geeigneten organischen Lösungsmittel (z. B. einem Alkohol wie Methanol) vorgenommen. Die Hydrolysetemperatur wird im allgemeinen bei 70 bis 80°C und die Hydrolysezeit bei 30 Minuten bis 2 Stunden ausgewählt. Während der Hydrolyse werden die Lipoide zersetzt und die Fettsäuren freigesetzt. Nachdem das nicht verseifte Material extrahiert und durch ein nicht polares Lösungsmittel, wie Petrolether, entfernt und der Rückstand angesäuert wurde, werden die Fettsäuren mit einem organischen Lösungsmittel, wie Petrolether, extrahiert. Die Extraktion der Fettsäuren wird bevorzugt bei einem Temperaturbereich von 10 bis 20°C vorgenommen. Nach der Extraktion der Fettsäuren wird das Lösungsmittel unter Lieferung einer gewünschten Fettsäuremischung abdestilliert. Wie oben beschrieben, enthält diese Fettsäuremischung GLA in einer Menge von 20 Gew.-% oder mehr. Die Fettsäuremischung enthält andere Fettsäurekomponenten, wie Palmitinsäure, Stearinsäure, Oleinsäure und Linolsäure.

Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Ein wäßriges, organisches Nährmedium einer Zusammensetzung, wie in Tabelle A weiter unten gezeigt, wurde hergestellt.
Hefeextrakt2 g/l Malzextrakt3 g/l Pepton3 g/l Glukose50 g/l Wasseraufgefüllt auf 1 l

1 l dieses Mediums werden mit 0,2 g C. elegans (NRRL-1378) beimpft und die Kultur unter Schütteln durch horizontales Drehen mit 100 Umdrehungen/min bei 27°C während 5 Tagen bebrütet. Nach der Züchtung wurde die Mischung zur Gewinnung der Pilze filtriert, die bei -30°C gefriergetrocknet wurden. 2,5 g der getrockneten Pilze pro Liter Medium wurden erhalten. Die Schimmelpilze wurden mit 20 g eines Lösungsmittelgemisches aus n-Hexan und Isopropanol im Verhältnis von 3 : 2 (Vol./Vol.) vermischt und die Mischung heftig bei 10°C gerührt. Die Lösungsmittelphase wurde durch Filtrieren gewonnen, das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Es wurden so 0,4 g an Lipoiden erhalten.

Zwecks Verseifung wurde ein Gemisch aus 2N NaOH und Methanol einem Teil der Lipoide hinzugegeben. Das Gemisch wurde für 120 min auf 75°C in einem heißen Wasserbad erhitzt. Nach der Entfernung der nicht-verseiften Materialien wurde der Rückstand angesäuert und die Fettsäuren mit Hexan extrahiert. Dann wurde die Lösungsmittelphase abgetrennt und das Lösungsmittel unter Erhalt einer Fettsäuremischung abdestilliert. Die Fettsäuremischung wurde der Methylveresterung nach einer herkömmlichen Methode zur Analyse der Fettsäurezusammensetzung mittels Gaschromatographie unterworfen. Die Analysenergebnisse sind in Tabelle B dargestellt.

Tabelle B (Fettsäurezusammensetzung)

Beispiel 2

Ein wäßriges Kulturmedium wie in Tabelle C gezeigt, wurde hergestellt.
Hefeextrakt2 g/l Ammoniumsulfat1 g/l Glukose70 g/l Vitamin B62 mg/l Biotin0,02 mg/l WasserRest auf 1 l

1 l dieses Nährmediums wurde mit 1,0 g von C. elegans (NRRL-1378) beimpft, worauf unter Schütteln bei 23°C und 100 Umdrehungen/min während 6 Tagen bebrütet wird. Nach der Züchtung wird das Gemisch auf die gleiche Weise wie Beispiel 1 verarbeitet, wobei 3,2 g gefriergetrockneter Pilze erhalten werden. Die Pilze wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 extrahiert, wobei 0,55 g Lipoide erhalten wurden. Die Fettsäurezusammensetzung in den Lipoiden wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise bestimmt, die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle D dargestellt.

Tabelle D (Fettsäurezusammensetzung)

Beispiel 3

Ein wäßriges Kulturmedium der Zusammensetzung in Tabelle E wurde hergestellt.

Tabelle E (Zusammensetzung des Kulturmediums)

Dreißig Liter dieses Kulturmediums wurden in einen Glasfermenter eingebracht und bei einer Temperatur von 120°C und einem Druck von 1,5 kg/cm² sterilisiert. Danach wird das Medium mit 30 g C. elegans (NRRL-1378) beimpft und unter Rühren mittels Einblasen von Luft bei 28°C während 5 Tage kultiviert. Während der Züchung wurde 2N NaOH als wäßrige Lösung zugesetzt, um den pH-Wert des Mediums bei 4,0 oder höher zu halten.

Nach der Züchtung wurde das Medium auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 unter Lieferung von 1480 g an gefriergetrockneten Pilzen verarbeitet. Die Pilze wurden wie in Beispiel 1 unter Lieferung von 520 g Lipoiden extrahiert.

Die so erhaltenen Lipoide wurden unter den gleichen Bedingungen wie denen des Beispiels 1 verseift, wobei 400 g Fettsäuren erhalten wurden. Die Fettsäuren hatten eine Zusammensetzung wie in Tabelle F gezeigt.

Tabelle F (Fettsäurezusammensetzung)

Erfindungsgemäß kann eine Lipoid-Mischung mit einem hohen GLA-Gehalt mittels einfacher Verfahrensweisen hergestellt werden. Da eine Quelle organischen Kohlenstoffs, die garantiert sicher ist, wie Glukose, verwendet werden kann, ist die erhaltene Lipoid-Mischung sicher gegenüber einem Fall, wo Kohlenwasserstoff als Kohlenstoffquelle verwendet wurde. Weiterhin erzeugen Schimmelpilze der Gattung Cunninghamelle, die erfindungsgemäß verwendet werden, keine toxischen Substanzen.

Schließlich kann die in der Fettsäuremischung enthaltene GLA weiter mittels des Harnstoffs-Addukt-Verfahrens gereinigt werden. Zum Beispiel wird ein Gemisch aus 1 Gew.-Teil der Fettsäuremischung, 2 Gew.-Teilen Harnstoff und 10 Gew.-Teilen Methanol hergestellt und auf etwa 60°C erhitzt. Die Lösung wird bei etwa 4°C über Nacht stehengelassen. Die so behandelte Lösung wird zur Entfernung von nicht gelöstem Material einschließlich gesättigter und einfach ungesättigter Fettsäuren, wie Palmitin, Stearin und Ölsäuren, filtriert. Das Filtrat enthält hoch ungesättigte Fettsäuren, wie Linolsäure und GLA. Die Verdampfung des Lösungsmittels aus dem Filtrat liefert eine Fettsäuremischung, die GLA in einer Menge von etwa 40 Gew.-% enthält.

Die nach dem Harnstoff-Addukt-Verfahren erhaltene Fettsäure-Mischung kann der Säulenchromatographie unterworfen werden, um eine weiter gereinigte GLA nach der Ethylveresterung zu erhalten. Die Ethylveresterung kann durch Erhitzen eines Gemischs der Fettsäuremischung (1 g), konzentrierter Schwefelsäure (0,2 g) und Ethanol (10 ml) auf 80°C für 2 Stunden bewirkt werden. Die Fettsäureethylester werden mit Petroleumether extrahiert. Für die Reinigung wird eine Silikagelsäule mit einem ersten Lösungsmittelgemisch aus Hexan und Ether in einem Verhältnis von 400/1 (Vol./Vol.) gesättigt. Die ethylveresterte Fettsäuremischung wird auf die Säule in einer Menge von etwa 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht an Silikagel, aufgebracht. Dann wird das erste Lösungsmittelgemisch durch die Säule gegeben. Wenn die GLA-Ethylester zu eluieren beginnen, wird das Lösungsmittel auf ein zweites Lösungsmittelgemisch aus Hexan und Ether in einem Verhältnis von 8/2 (Vol./Vol.) umgestellt. Die so erhaltene GLA-Ethylester-Fraktion enthält 80 bis 95 Gew.-% GLA-Ethylester.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Lipoid-Mischung mit einem hohen Gehalt an γ-Linolensäure, durch Züchten eines Schimmelpilzes bei Temperaturen von 15 bis 30°C in einem schwach sauren bis neutralen, wäßrigen Kulturmedium, das 3 bis 20% seines Gewichts an verwertbarem Kohlenstoff enthält, und Gewinnen der Lipoid-Mischung aus dem gezüchteten Schimmelpilz, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schimmelpilz Schimmelpilze der Gattung Cunninghamella züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle Natriumacetat einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schimmelpilz Cunninghamella elegans NRRL-1378, NRRL-1379, NRRL-1380, NRRL-1381, oder Cunninghamella blankesleegna NRRL-1373 oder Cunninghamella echinulate NRRL-1383 züchtet.