DE69728481T2

DE69728481T2 - Verfahren zur Herstellung von omega-9 hochungesättigten Fettsäuren und diese enthaltendes Lipid

Info

Publication number: DE69728481T2
Application number: DE69728481T
Authority: DE
Inventors: Kengo Mishima-gun Akimoto; Hiroshi Takatsuki-shi Kawashima; Sakayu Kyoto-shi Shimizu
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 1996-08-23
Filing date: 1997-08-26
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2017-08-27
Also published as: JPH1057085A; JP3995290B2; ATE263840T1; EP0825263A3; US6812020B1; EP0825263A2; KR100524198B1; AU743992B2; CA2213374A1; AU3427397A; DK0825263T3; US6150144A; CA2213374C; EP0825263B1; PT825263E; ES2214593T3; KR19980018873A; DE69728481D1

Description

Hintergrund
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigter omega-9-Fettsäure und Lipid, das solche enthält, durch Fermentation unter Verwendung eines mutierten Mikroorganismus.
Es ist bekannt, daß mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäuren, wie z. B. 5,8,11-Eicosatriensäure (bezeichnet als „mead acid") und 8,11-Eicosadiensäure, einen der Fettsäurebestandteile von Tiergewebe darstellen, das einen Mangel an essentiellen Fettsäuren aufweist. Trotzdem war es extrem schwierig, sie zu isolieren und aufzureinigen, da sie in extrem kleinen Mengen vorliegen. Da es diesen hoch ungesättigten Fettsäuren möglich ist, Vorläufer für die Leucotrien-3-Gruppe im Körper zu werden, wurden erhebliche Erwartungen an ihre physiologische Aktivität gestellt. Ihre Verwendung für entzündungshemmende, antiallergische und antirheumatische Wirkungen wurde kürzlich berichtet (JP-A-7/41421).
Deshalb besteht ein starkes Interesse, eine Methode zu entwickeln für die Herstellung von hoch ungesättigten omega-9-Fettsäuren in großen Mengen. Ein Verfahren zur Herstellung von hoch ungesättigter omega-9-Fettsäure und Lipid, das diese enthält, wurde zuvor durch die Durchführung einer Mutation an Mikroorganismen erreicht, die die Fähigkeit zur Produktion von Arachidonsäure haben, und Isolation dieser Mikroorganismen, in denen die Δ12-Desaturierungsaktivität abgesenkt wurde oder verloren gegangen ist (EP-A-535939 und JP-A-5/91888). Die Mikroorganismen schlossen Mortierella ein, im besonderen Mortierella alpina. J. Gen. Microbiol. Bd. 138 (1992) S. 997–1002, S. Jareonkitmongkol et al., beschreibt Mutationen des M. alpina Stammes 1S-4, die zu Δ12-desaturasedefizienten, ebenso Δ5- und Δ6-desaturasedefizienten Mutanten führen, die kultiviert wurden, um verschiedene PUFAs in unterschiedlichen Mengen zu produzieren. Davor wurde in EP-A-252716 die Kultur einer Wildtyp-Mortierella-Spezies offenbart, um DGLA und EPA zu produzieren. Doch obwohl es revolutionär und bedeutend ist, daß ein Verfahren für die Herstellung von hoch ungesättigten omega-9-Fettsäuren und Lipid, das solche enthält, entwickelt wurde, da ein solcher Prozeß bis her in der Vergangenheit nicht existierte, besteht immer Bedarf an einer Verbesserung der Ausbeute. Folglich bestand ein starkes Bedürfnis, ein Verfahren für die effiziente Herstellung von größeren Mengen von hoch ungesättigten omega-9-Fettsäuren zu entwickeln, im besonderen ein Verfahren, das es möglich macht, hoch ungesättigte omega-9-Fettsäure oder Lipid, das diese enthält, in großen Mengen zu produzieren, z. B. unter Verwendung von üblichen, kostengünstigen Medien.
Als ein Ergebnis verschiedener Untersuchungen stellten wir die Existenz von Mutantenstämmen fest und schlugen deren Verwendung vor, in denen die Δ12-Desaturierungsaktivität abgesenkt wurde oder verloren gegangen ist, aber mindestens eine Aktivität aus der Δ5-Desaturierungsaktivität, der Δ6-Desaturierungsaktivität und der Kettenverlängerungsaktivität erhöht ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung für die Herstellung von Lipid, das mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäure enthält, welches die Schritte umfaßt:
Kultivieren einer Mutante in einem Medium, wobei die Mutante durch Mutation aus einem Mikroorganismus erhältlich ist, der die Fähigkeit hat, Arachidonsäure zu produzieren, und der zu einer Gattung gehört, die aus Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora, Echinosporangium und Saprolegnia ausgewählt ist, wobei in dieser Mutante, relativ zum entsprechenden Wildtyp, die Δ12-Desaturierungsaktivität durch eine erste Mutation abgesenkt wurde oder verloren gegangen ist, aber mindestens eine Aktivität aus Δ5-Desaturierungsaktivität, Δ6-Desaturierungsaktivität und Kettenverlängerungsaktivität durch eine zweite Mutation gesteigert wurde, und
Gewinnen des Lipids, das mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäure enthält, aus der Kultur.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit für die Herstellung von mehrfach ungesättigter omega-9-Fettsäure, das den Schritt der Gewinnung von hoch ungesättigter omega-9-Fettsäure aus der Kultur oder aus dem Lipid, das gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, umfaßt.
Ausführliche Beschreibung
In der vorliegenden Erfindung sind die Mikroorganismen, die für die Mutation verwendet wurden (bezeichnet als "Ausgangsstamm"), Mikroorganismen, die die Fähigkeit haben, Arachidonsäure zu produzieren und die zur Gattung Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora, Echinosporangium oder Saprolegnia gehören.
Diese Mikroorganismen wandeln Stearinsäure durch Δ9-Desaturase zu Oleinsäure, Oleinsäure durch Δ12-Desaturase zu Linolsäure, Linolsäure durch Δ6-Desaturase zu γ-Linolensäure, γ-Linolensäure durch Kettenverlängerungsenzym zu Dihomo-γ-linolensäure und Dihomo-γ-linolensäure durch Δ5-Desaturase zu Arachidonsäure um. Darüber hinaus biosynthetisieren diese Mikroorganismen 6,9-Octadecadiensäure aus Oleinsäure durch Δ6-Desaturase, 8,11-Eicosadiensäure aus 6,9-Octadecadiensäure durch Kettenverlängerungsenzym und „mead acid" aus 8,11-Eicosadiensäure durch Δ5-Desaturase, wenn die Δ12-Desaturierungsaktivität gehemmt ist.
Mikroorganismen, die zu der Untergattung Mortierella in der Gattung Mortierella gehören, die eine ausgezeichnete Arachidonsäureproduktivität aufweisen, werden bevorzugt als Ausgangsstamm in der vorliegenden Erfindung verwendet, wobei Beispiele davon einschließen: die Stämme Mortierella elongata IFO 8570, Mortierella exiqua IFO 8571, Mortierella hygrophila IFO 5941 und Mortierella alpina IFO 8568, ATCC 16266, ATCC 32221, ATCC 42430, CBS 219.35, CBS 224.37, CBS 250.53, CBS 343.66, CBS 527.72, CBS 529.72, CBS 608.70 und CBS 754.68 ein.
All diese Stämme sind ohne Einschränkungen vom Institute of Fermentation Osaka (IFO), ansässig in Osaka, Japan, von der American Type Culture Collection (ATCC), ansässig in den USA, oder vom Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) erhältlich. Darüber hinaus kann der Stamm Mortierella elongata SAM0219 (FERM P-8703) (FERM BP-1239), der von den Erfindern der vorliegenden Erfindung aus dem Boden isoliert wurde, ebenfalls verwendet werden. Mortierella elongata SAM0219 wurde als FERM BP-1239 am 19. März 1986 als eine internationale Hinterlegung gemäß dem Budapester Abkommen beim Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba--shi, Ibaraki-ken, 305, Japan hinterlegt.
Darüber hinaus kann der Ausgangsstamm, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine Mutante oder ein rekombinanter Stamm sein, der sich von dem oben erwähnten Mikroorganismus (Wildtypen), der die Fähigkeit hat, Arachidonsäure zu produzieren, ableitet, insbesondere von Stämmen, die so verändert wurden, daß der Gehalt an hoch ungesättigter omega-9-Fettsäure, der Gesamtlipidgehalt oder beides größer ist als die Menge, die von dem ursprünglichen Wildtyp produziert wird, wenn sie unter Verwendung des gleichen Substrats kultiviert werden. Weiterhin schließt der Ausgangsstamm auch Mikroorganismen ein, die geschaffen sind, um eine mit dem korrespondierenden Wildtyp gleiche Menge an hoch ungesättigter omega-9-Fettsäure unter effizienter Nutzung eines Substrats produzieren, das einen ausgezeichneten Kostennutzen besitzt.
Um eine Mutante zu erhalten, die eine abgesenkte oder keine Δ12-Desaturierungsaktivität besitzt, aber zumindest eine erhöhte Δ5-Desaturierungsaktivität, Δ6-Desaturierungsaktivität oder Kettenverlängerungsaktivität aufweist, wird eine Mutation am oben erwähnten Mikroorganismus durchgeführt, der die Fähigkeit hat, Arachidonsäure zu produzieren, um zuerst eine Mutante zu erhalten, die verringerte oder verlorene Δ12-Desaturierungsaktivität besitzt. Durch weitere Mutation dieses mutierten Stammes kann eine Mutante erhalten werden, in der die Δ12-Desaturierungsaktivität abgesenkt ist oder verloren gegangen ist, aber zumindest eine Aktivität aus der Δ5-Desaturierungsaktivität, der Δ6-Desaturierungsaktivität und der Kettenverlängerungsaktivität erhöht worden ist. Ein Beispiel für eine Mutante, die verwendet werden kann, die eine verringerte oder verloren gegangene Δ12-Desaturierungsaktivität besitzt, ist Mortierella alpina SAM1861 (FERM BP-3590). Mortierella alpina SAM1861 wurde als FERM BP-3590 am 30. September 1991 als eine internationale Hinterlegung unter dem Budapester Abkommen beim Institute of Bioscience und Human-Technology Agency of Industrial Science und Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan hinterlegt.
Durch die Verwendung eines Mikroorganismus, der eine abgesenkte oder verlorene Δ12-Desaturierungsaktivität besitzt, und vorzugsweise eines Mikroorganismus, in dem die Δ12-Desaturierungsaktivität fehlt, als Ursprung für die Mutante, kann die Frage, ob ihre Δ5-Desaturierungsaktivität, Δ6-Desaturierungsaktivität oder Kettenverlängerungsaktivität erhöht ist, einfach beurteilt werden.
Genauer gesagt, da ungesättigte omega-6-Fettsäuren, wie z. B. Linolsäure, γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure und Arachidonsäure, inhärent entweder fehlen oder nur in sehr kleinen Mengen in mikrobiellen Zellen bei einem Mikroorganismus vorhanden sind, in dem die Δ12-Desaturierungsaktivität entweder abgesenkt wurde oder fehlt, wird γ-Linolensäure durch die Δ6-Desaturase gebildet, wenn die restlichen Zellen, die durch Kultivierung erhalten werden, mit Linolsäure umgesetzt werden, Arachidonsäure durch Δ5-Desaturase gebildet, wenn sie mit Dihomo-γ-linolensäure umgesetzt wird, oder Dihomo-γ-linolensäure durch Kettenverlängerungsenzym gebildet, wenn es mit γ-Linolensäure umgesetzt wird. Da die Aktivität von jedem der Enzyme leicht getestet werden kann, können die Δ5-Desaturierungsaktivität, die Δ6-Desaturierungsaktivität und die Kettenverlängerungsaktivität der Mikroorganismen, die durch Mutation erhalten wurden, durch ihren Vergleich mit dem Ausgangsstamm beurteilt werden.
Obwohl ein spezielles Beispiel für einen mutierten Stamm der vorliegenden Erfindung, der verwendet werden kann, Mortierella alpina SAM2086 (FERM P-15766) ist (der als FERM BP-6032 am 5. August 1996 als eine internationale Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag am besagten Institut hinterlegt wurde), ein Mikroorganismus, dem die Δ12-Desaturierungsaktivität fehlt und der eine erhöhte Δ6-Desaturierungsaktivität besitzt, die durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung in Mortierella alpina SAM1861 induziert wurde, sind solche Mutanten nicht auf diesen Stamm beschränkt, sondern es können vielmehr alle Mutanten verwendet werden, vorausgesetzt, dass dann, wenn die Δ5-Desaturierungsaktivität, Δ6-Desaturierungsaktivität oder Kettenverlängerungsaktivität des Ausgangsstammes, in dem die Δ12-Desaturierungsaktivität verringert oder verloren ist, als "1" ausgedrückt wird, zumindest eine dieser Aktivitäten einen Aktivitätsgrad aufweist, der 1 überschreitet.
Wirksame Mutanten können durch Mutationsverfahren identifiziert werden, gefolgt von entsprechend ausgewählten Testverfahren, beide wie vorliegend beschrieben.
Beispiele für mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäuren, die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden, schließen 6,9-Octadecadiensäure, 8,11-Eicosadiensäure und 5,8,11-Eicosatriensäure ein.
In der vorliegenden Erfindung kann „mead acid" in großen Mengen hergestellt werden, im besonderen durch die Verwendung einer Mutante, in welcher die Δ12-Desaturierungsaktivität fehlt und sowohl die Δ5-Desaturierungsaktivität als auch die Δ6-Desaturierungsaktivität erhöht ist.
Typische Mutationsverfahren können für die Einführung der Mutation durchgeführt werden, wie z. B. durch Bestrahlung mit Strahlen (Röntgenstrahlen, γ-Strahlen oder Neutronenstrahlen), ultravioletter Strahlung oder Hitzebehandlung, oder durch die Suspension des Mikroorganismus in einem geeigneten Puffer, Hinzufügen eines Mutagens und Inkubation für eine vorbestimmte Zeit, gefolgt von einer passenden Verdünnung und Kultivierung im Agarmedium, um Kolonien des mutierten Stammes zu erhalten. Beispiele für Mutagene schließen alkylierende Substanzen wie z. B. Stickstoff-Lost, Methylmethansulfonat (MMS) und N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) ein, Basenanaloga wie z. B. 5-Bromuracil, Antibiotika wie z. B. Mitomycin C, Syntheseinhibitoren von Basen wie z. B. 6-Mercaptopurin, Pigmente wie z. B. Proflavin (und andere Derivate), bestimmte Typen von Karzinogenen wie z. B. 4-Nitrochinolin-N-oxid, und andere Verbindungen wie z. B. Manganchlorid und Formaldehyd. Zusätzlich kann der Ausgangsstamm die Form von wachsenden Zellen (Mycelium) oder Sporen haben.
Um die Mutante in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung zu kultivieren, wird ein flüssiges oder festes Medium mit den durch vorherige Kultivierung erhaltenen Sporen, Mycelien oder flüssigen Vorkultur angeimpft. Falls ein flüssiges Medium verwendet wird, sind, obwohl alle üblicherweise als Kohlenstoffquelle verwendeten Substanzen benutzt werden können, für die Beispiele Glucose, Fructose, Xylose, Saccharose, Maltose, lösliche Stärke, Melasse, Glycerin, Mannit und Zitronensäure einschließen, Glucose, Maltose, Melasse und Glycerin besonders bevorzugt.
Weiterhin können als Stickstoffquelle organische Stickstoffquellen, wie z. B. Hefeextrakt, Weizenkeimextrakt, Fleischextrakt, Casaminosäuren, Maisquellwasser und Harnstoff, oder anorganische Stickstoffquellen, wie z. B. Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat, verwendet werden. Darüber hinaus können Phosphate, wie z. B. Kaliumphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat, anorganische Salze, wie z. B. Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Kupfersulfat, Magnesiumchlorid und Calciumchlorid, und auch Vitamine als notwendige Spurenelemente verwendet werden.
Es gibt keine spezifischen Grenzen für die Konzentrationen der Medienbestandteile, vorausgesetzt, daß sie das Wachstum des Mikroorganismus nicht hemmen. Was die Durchführbarkeit betrifft, sollte die Kohlenstoffquelle typischerweise mit 0,1 bis 30 Gew.-% und bevorzugt 1 bis 15 Gew.-%, verwendet werden, und die Stickstoffquelle mit 0,01 bis 10 Gew.-% und bevorzugt 0,1 bis 5 Gew.-%.
Die Temperatur der Kultur ist bevorzugt 5 bis 40°C, besonders bevorzugt 20 bis 30°C. Nachdem die Mikroorganismen bei einer Temperatur von 20 bis 30°C kultiviert wurden, können mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäuren auch durch nachfolgende Kultivierung bei 5 bis 20°C produziert werden. Die Menge der mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuren, die in den resultierenden Fettsäuren gebildet werden, kann durch eine solche Temperaturkontrolle erhöht werden. Der pH-Wert des Mediums sollte 4 bis 10 sein und bevorzugt 5 bis 8, und die Kultivierung wird in belüfteten Rührkulturen, Schüttelkulturen oder stationären Kulturen durchgeführt. Die Kultivierung wird normalerweise für 2 bis 20 Tage durchgeführt, bevorzugt für 5 bis 20 Tage und besonders bevorzugt für 5 bis 15 Tage.
In dem Fall, daß eine feste Kultur verwendet wird, wird die Kultivierung für 3 bis 14 Tage bei einer Temperatur von 5 bis 40°C durchgeführt, bevorzugt bei 20 bis 30°C, unter Verwendung von Weizenkleie, Reisspreu oder Reiskleie, die 50 bis 100 Gew.-% Wasser enthält, bezogen auf das Gewicht der festen Substanzen. In diesem Fall können Stickstoffquellen, anorganische Salze und Spurenelemente wie benötigt zugegeben werden. Darüber hinaus kann die Anreicherung von mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuren in der vorliegenden Erfindung durch die Zugabe eines Vorläufers der mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuren zum Medium während der Kultivierung unterstützt werden.
Beispiele für Vorläufer schließen Kohlenwasserstoffe ein, z. B. n-Alkane wie Tetradecan, Hexadecan und Octadecan, Fettsäuren, ihre Salze (z. B. Natriumsalze oder Kaliumsalze) oder ihre Ester, wie z. B. Tetradecansäure, Hexadecansäure und Octadecansäure, oder Öle, die Fettsäuren als ihre Grundbestandteile enthalten (z. B. Olivenöl, Kokosöl und Palmöl). Trotzdem sind die Vorläufer nicht auf diese Beispiele beschränkt. Die Gesamtmenge des zugegebenen Substrats ist 0,001 bis 10 Gew.-% und bevorzugt 0,5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf die Menge des Mediums. Darüber hinaus kann die Kultivierung auch durchgeführt werden, wenn der Vorläufer als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wird.
Diese Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salze, Vitamine oder Substrate können vor oder direkt nach dem Animpfen mit einem Erzeugermikroorganismus zugegeben werden, oder sie können zugegeben werden, nachdem die Kultivierung schon gestartet wurde. Wahlweise können sie zu einem oder beiden Zeitpunkten zugegeben werden. Die Zugabe kann direkt nach dem Start der Kultivierung auf einmal oder nacheinander portionsweise erfolgen. Alternativ kann die Zugabe kontinuierlich erfolgen.
Lipide, die eine große Menge an mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuren enthalten, werden durch diese Art der Kultivierung gebildet und intrazellulär akkumuliert. Im Fall einer Flüssigkultur wird das Lipid, das mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäuren enthält, aus dem Kulturmedium oder aus dem sterilisierten Kulturmedium aus einem Zwischenschritt der Ölproduktion bei der Kultivierung von Mikroorganismen gewonnen, aus dem Kulturmedium oder dem sterilisierten Kulturmedium nach Beendigung der Kultivierung oder aus den kultivierten Zellen oder ihrem getrockneten Produkt, das aus einem der oben erwähnten Kulturmedien gewonnen wurde. Lipid, das mehr fach ungesättigte omega-9-Fettsäuren enthält, kann zum Beispiel aus kultivierten Zellen gewonnen werden, und das Lipid, das mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäuren enthält, kann wie unten beschrieben isoliert werden.
Nach Beendigung der Kultivierung werden die kultivierten Zellen aus dem Kulturmedium durch Zentrifugieren und/oder jede konventionelle Fest-Flüssig-Trenntechnik, wie z. B. Filtration, erhalten. Die Zellen werden bevorzugt gewaschen, zerkleinert und getrocknet. Das Trocknen kann durch Gefriertrocknen oder Lufttrocknen erfolgen. Die getrockneten Zellen werden bevorzugt mit organischen Lösungsmitteln in Gegenwart eines Stickstoffstroms extrahiert. Beispiele für organische Lösungsmittel, die verwendet werden können, schließen Ethylether, Hexan, Methanol, Ethanol, Chloroform, Dichlormethan und Petrolether ein, wobei abwechselnde Extraktion mit Methanol und Petrolether und Extraktion unter Verwendung einer einzelnen Lösungsmittelschicht aus Chloroform, Methanol und Wasser gute Resultate ergeben. Das organische Lösungsmittel wird dann unter Unterdruck vom Extrakt abdestilliert, um das Lipid zu erhalten, das mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäuren in hoher Konzentration enthält.
Außerdem kann die Extraktion auch unter Verwendung von nassen Zellen anstelle der oben beschriebenen Methode durchgeführt werden. In diesem Fall kann ein Lösungsmittel, wie z. B. Methanol oder Ethanol, das mit Wasser mischbar ist, oder Lösungsmittelmischungen, die diese Lösungsmittel, Wasser und/oder andere Lösungsmittel enthalten, die mit Wasser mischbar sind, verwendet werden. Die anderen Verfahrensschritte sind dieselben wie oben.
Die mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuren sind als Triglycerid in dem Lipid, das wie oben beschrieben isoliert wird, oder als Verbindung gebunden an Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylinositol vorhanden. Die Aufreinigung von Triglycerid, das mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäuren enthält, aus dem aus der Kultur gewonnenen Lipid, das mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäuren enthält, kann durch Routineverfahren, wie z. B. Hexanextraktion, gefolgt von der Abtrennung freier Säure, Entfärbung, Geruchsentfernung, Raffinieren oder Kältetrennung, erfolgen.
Zusätzlich sind mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäuren in Form einer Lipidverbindung, wie zum Beispiel als Bestandteil eines Fettes, in dem Lipid enthalten, das wie oben beschrieben erhalten wird. Obwohl diese direkt abgetrennt werden können, ist es vorteilhaft, sie in Form eines Esters eines kurzkettigen Alkohols abzutrennen, wobei Beispiele dafür Methyl-8,11-eicosadienoat, Methyl-6,9-octadecadienoat und Methylester von „mead acid" einschließen. Durch die Umwandlung zu Estern auf diese Weise können diese Komponenten leicht von anderen Lipidkomponenten abgetrennt werden. Zusätzlich können sie leicht von anderen Fettsäuren abgetrennt werden, die während der Kultivierung gebildet werden, wie z. B. Palmitinsäure und Oleinsäure (diese werden ebenfalls verestert während der Veresterung von mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuren). Um zum Beispiel den Methylester der mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuren zu erhalten, ist es vorteilhaft, das oben erwähnte extrahierte Lipid für 1 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur mit 5 bis 10% methanolischer Salzsäure oder 10 bis 50% BF3-Methanol zu behandeln.
Um die mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuren aus der oben beschriebenen Behandlungslösung zu gewinnen, ist es vorteilhaft, mit einem organischen Lösungsmittel wie Hexan, Ethylether oder Ethylacetat zu extrahieren. Danach, durch Trocknung dieses Extrakts über wasserfreiem Natriumsulfat usw. und Abdestillieren des organischen Lösungsmittels bevorzugt unter Unterdruck, wird eine Mischung erhalten, die hauptsächlich aus Fettsäureestern besteht. Diese Mischung enthält Methylpalmitat, Methylstearat, Methyloleat und andere Fettsäuremethylester zusätzlich zu den gewünschten mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuremethylestern. Um die mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuremethylester aus der Mischung von Fettsäuremethylestern zu isolieren, können Säulenchromatographie, Niedrigtemperaturkristallisation, Harnstoffeinschluss oder Flüssig-Flüssig-Gegenstrom-Verteilungschromatographie usw. allein oder in Kombination verwendet werden.
Um mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäuren aus den unterschiedlichen Typen von mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuremethylestern zu erhalten, die wie oben beschrieben isoliert wurden, wird die Mischung nach Hydrolyse in Gegenwart von Alkali mit einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Ethylether oder Ethylacetat, extrahiert.
Darüberhinaus, um die mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuren ohne den Umweg über ihre Methylester zu gewinnen, können die mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäuren nach Hydrolyse des oben erwähnten extrahierten Lipids mit Alkali (z. B. durch die Behandlung mit 5% Natriumhydroxidlösung für 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur) durch Verfahren extrahiert und aufgereinigt werden, die üblicherweise für die Extraktion und Aufreinigung von Fettsäuren verwendet werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele geben eine detaillierte Erklärung der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1
Czapek Agarmedium (0,2% NaNO₃, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄, 0,05% KCl, 0,001% FeSO₄, 3% Saccharose, 2% Agar, pH 6,0) wurde mit Mortierella alpina SAM1861 angeimpft, einer Mutante, der die Δ12-Desaturierungsaktivität fehlt, um Sporen für die Herstellung einer Sporenlösung zu bilden (50 mM Tris/Malatpuffer (pH 7,5), 1 × 10⁶ Sporen/ml).
0,5 ml 100 mM Tris/Malatpuffer (pH 7,5) wurden zu 1,0 ml der resultierenden Sporenlösung gegeben, gefolgt von der Zugabe von 500 μl einer NTG-Lösung (5 mg N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin/1 ml entionisiertes Wasser) und 15 Minuten Inkubation bei 28°C, um die Mutationsbehandlung durchzuführen.
Die NTG-behandelte Sporensuspension wurde auf etwa 10^–3 bis 10^–4 verdünnt und auf eine GY-Agarplatte aufgetragen (1% Glucose, 0,5% Hefeextrakt, 0,005% Triton X-100, 1,5% Agar, pH 6,0). Die Kolonien, die während der Kultivierung bei 28°C auftauchten, wurden zufällig gepickt und auf eine neue Platte transferiert.
Die gepickten Speicherkolonien wurden für 2 Tage bei 28°C und für 2 Tage bei 12°C auf einer GY-Agarplatte kultiviert und dann ausgeschnitten, wobei sie noch mit dem Agar zusammenhingen, und bei 100°C getrocknet.
Die resultierenden getrockneten Zellen wurden in ein Schraubdeckelreagenzglas gefüllt (16,5 mm Durchmesser), gefolgt von einer Methylveresterung durch Behandlung bei 50°C für 3 Stunden durch die Zugabe von 1 ml Methylenchlorid und 2 ml 10%iger methanolischer HCl. Nach der Zugabe von 4 ml n-Hexan und 1 ml Wasser, zweifacher Extraktion, Abdestillieren des Lösungsmittels von dem Extrakt unter Verwendung eines Zentrifugalverdampfers (40°C, 1 Stunde) wurden die resultierenden Fettsäuremethylester durch Kapillargaschromatographie analysiert. Als ein Resultat des Screenings wurde Mortierella alpina SAM2086 (FERM P-15766) erhalten, das eine höhere „mead acid"-Produktivität als der Ausgangsstamm, Mortierella alpina SAM1861, zeigte. Mortierella alpina 2086 wurde als FERM P-15766 am 5. August 1996 beim Institute of Bioscience und Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan hinterlegt. Weiterhin wurde Mortierella alpina SAM2104 durch die Durchführung einer ähnlichen Mutationsbehandlung wie oben beschrieben unter Verwendung des SAM2086 als Ausgangsstamm erhalten.
Beispiel 2
5 l eines Mediums (pH 6,0), das 4% Glucose und 1% Hefeextrakt enthält, wurden in einen 10 l Schüttelfermenter gefüllt und für 30 Minuten bei 120°C sterilisiert. Das Medium wurde dann mit 100 ml einer Vorkultur der Mutante SAM1861 oder SAM2086 von Mortierella alpina angeimpft, gefolgt von belüfteter Rührkultivierung für 8 Tage mit einer Belüftung von 1 Volumen/Volumen/min und einer Rührgeschwindigkeit von 300 U/min. Die Temperatur der Kultur zu Beginn der Kultivierung war 28°C und wurde dann am 2. Tag der Kultivierung auf 20°C gesenkt. Vom 1. bis zum 4. Tag der Kultivierung wurde täglich 1% Glucose zugegeben. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Filtration gewonnen, und nach angemessenem Waschen wurden die resultierenden nassen Zellen gefriergetrocknet, um 99,7 g bzw. 92,5 g der getrockneten Zellen der beiden entsprechenden Stämme zu erhalten.
Als das Lipid aus diesen getrockneten Zellen gemäß der Extraktionsmethode von Bligh & Dyer unter Verwendung einer einzelnen Lösungsmittelschicht aus Chloroform, Methanol und Wasser extrahiert wurde, wurden die Lipide jeweils in den Mengen von 48,92 g bzw. 44,17 g gewonnen. Um die Fettsäurezusammensetzung dieser Lipide zu bestimmen, wurden 10 mg des Lipids in Schraubdeckelreagenzgläser gefüllt und durch Behandlung für 3 Stunden bei 50°C durch Zugabe von 1 ml Methylenchlorid und 2 ml 10%iger methanolischer HCl methylverestert. Nach Zugabe von 4 ml n-Hexan und 1 ml Wasser, zweifacher Extraktion und Abdestillieren des Lösungsmittels von dem Extrakt unter Verwendung eines Zentrifugalverdampfers (40°C, 1 Stunde) wurden die resultierenden Fettsäuremethylester durch Gaschromatographie analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Es konnte klar gezeigt werden, daß SAM2086, der durch Mutation aus SAM1861 erhalten wurde, sowohl hervorragende „mead acid"-Produktivität als auch Mengenanteil zeigt.
Tabelle 1
Beispiel 3
1 ml 0,1 M Phospatpuffer (pH 7,4), 30 mg aus Beispiel 2 erhaltener nasser Zellen der Mutante SAM1861 oder SAM2086 von Mortierella alpina und 100 μl einer in BSA suspendierten Substratlösung (hergestellt durch Mischen von 20 mg Linolsäure, γ-Linolensäure oder Dihomo-γ-linolensäure in 2 ml 5%igem Rinderserumalbumin (fettsäurefreies BSA, Sigma) und Suspendieren durch Ultraschall für ungefähr 20 Minuten) wurden in Schraubdeckelreagenzgläser gegeben (16,5 mm im Durchmesser), wonach die Reagenzgläser mit einem Siliconstopfen verschlossen wurden und bei 120 U/min bei 28°C geschüttelt wurden. Die Reaktion wurde nach 0, 2, 6 oder 20 Stunden durch Zugabe von 4 ml Ethanol gestoppt.
Nach Trocknung in einem Zentrifugalverdampfer (40°C, 1 Stunde) wurde die Methylveresterung auf dieselbe weise wie in Beispiel 2 durchgeführt, und die resultierenden Fettsäuremethylester (Substrate und Reaktionsprodukte) wurden durch Kapillargaschromatographie analysiert. In dieser Analyse wurde dieselbe Menge 5%iger BSA-Lösung als Kontrolle verwendet. Wenn Dihomo-γ-linolensäure als Substrat verwendet wird, wird also die Δ5-Desaturierungsaktivität aus der Menge des Reaktionsprodukts bestimmt, d. h. Arachidonsäure; wenn γ-Linolensäure als Substrat verwendet wird, wird die Kettenverlängerungsaktivität aus der Menge des Reaktionsprodukts, d. h. Dihomo-γ-linolensäure, und die Δ5-Desaturierungsaktivität wird aus der Menge der Arachidonsäure bestimmt; und wenn Linolsäure als Substrat verwendet wird, wird die Δ6-Desaturierungsaktivität aus der Menge des Reaktionsprodukts, d. h. γ-Linolensäure, bestimmt, die Kettenverlängerungsaktivität aus der Menge des Dihomo-γ-linolensäure bestimmt und die Δ5-Desaturierungsaktivität aus der Menge der Arachidonsäure bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Für den Fall, daß die Aktivität des SAM1861 für die Δ5-Desaturierungsaktivität unter Verwendung von Dihomo-γ-linolensäure als Substrat auf 1 festgelegt wurde, war die Aktivität des SAM2086 1,74. In dem Fall, daß die Aktivität des SAM1861 für die Δ6-Desaturierungsaktivität unter Verwendung von Linolsäure als Substrat auf 1 festgelegt wurde, war die Aktivität des SAM2086 1,42. Der Anstieg der „mead acid"-Produktivität und das Verhältnis von SAM2086, induziert durch Mutation aus SAM1861 aus Beispiel 2, waren eindeutig das Ergebnis einer erhöhten Δ5-Desaturierungsaktivität und Δ6-Desaturierungsaktivität.
Tabelle 2 Reaktionsgeschwindigkeiten von SAM1861 und SAM2086 (nmol/30 mg nasse Zellen/Stunde)

LA: Linolsäure
GLA: γ-Linolensäure
DGLA: Dihomo-γ-linolensäure
Ara: Arachidonsäure
Δ5 DS: Δ5-Desaturierungsaktivität
Δ6 DS: Δ6-Desaturierungsaktivität
EL: Kettenverlängerungsaktivität

Beispiel 4
2 ml eines Mediums (pH 6,0), das 2% Glucose, 1% Hefeextrakt und jeweils 0,5% eines Vorläufers für die hoch ungesättigten omega-9-Fettsäuren, die in Tabelle 3 angegeben sind, oder Öle, die dieselben enthalten, enthält, wurden in 10 ml Erlenmeyer-Kolben gefüllt und für 20 Minuten bei 120°C sterilisiert. Die Kolben wurden jeweils mit Zellen der Mutante SAM2086 von Mortierella alpina angeimpft, gefolgt von einer Kultivierung bei 28°C für 8 Tage unter Verwendung eines Kolbenschüttelapparats (110 U/min). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3

18 : 2: 6,9-Octadecadiensäure
20 : 2: 8,11-Eicosadiensäure
20 : 3: 5,8,11-Eicosatriensäure („mead acid")

Beispiel 5
5 l eines Mediums (pH 6,0), das 2% Glucose, 1% Hefeextrakt, 0,1% Olivenöl und 0,01% Adecanol (Entschäumungsmittel; Markenname) enthält, wurden in einen 10 l Schüttelfermenter gefüllt, gefolgt von einer Sterilisation bei 120°C für 30 Minuten. 100 ml einer Vorkultur von Mortierella alpina SAM2104 wurden angeimpft. Die Kultivierung wurde für 8 Tage durchgeführt mit einer Belüftung von 1 Volumen/Volumen/min und Schütteln mit 300 U/min.
Die Temperatur der Kultur war zu Beginn der Kultivierung 28°C und wurde dann am 2. Tag der Kultivierung auf 20°C gesenkt. 1,5% Glucose wurden am 2. und 3. Tag der Kultivierung zugegeben. Nach Beendigung der Kultivierung wurden 15,80 g getrocknete Zellen pro 1 l Medium gemäß dem selben Verfahren wie in Beispiel 2 beschrieben erhalten. Das Lipid wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 extrahiert, die Lipide wurden methylverestert, die resultierenden Fettsäuremethylester wurden durch Gaschromatographie analysiert. Die produzierte Menge und Prozente der „mead acid", 8,11-Eicosadiensäure und 6,9-Octadecadiensäure, bezogen auf die gesamte Menge der Fettsäuren, war 1,76 g/l und 23,76% für „mead acid", 0,35 g/l und 4,75% für 8,11-Eicosadiensäure und 0,84 g/l und 11,35% für 6,9-Octadecadiensäure.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Lipid, das mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäure enthält, welches die Schritte umfaßt: Kultivieren einer Mutante in einem Medium, wobei die Mutante durch Mutation aus einem Mikroorganismus erhältlich ist, der die Fähigkeit besitzt, Arachidonsäure zu produzieren, und der zu einer Gattung gehört, die aus Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora, Echinosporangium und Saprolegnia ausgewählt ist, wobei in dieser Mutante, relativ zum entsprechenden Wildtyp-Stamm, die Δ12-Desaturierungsaktivität durch eine erste Mutation abgesenkt wurde oder verloren gegangen ist, aber mindestens eine Aktivität aus Δ5-Desaturierungsaktivität, Δ6-Desaturierungsaktivität und Kettenverlängerungsaktivität durch eine zweite Mutation gesteigert wurde, und Gewinnen des Lipids, das mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäure enthält, aus der Kultur.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, Arachidonsäure zu produzieren, ausgewählt ist aus Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila und Mortierella alpina.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin Mortierella elongata Mortierella elongata SAM 0219 (FERM BP-1239) ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in welchem die verwendete Mutante eine ist, die sich von Mortierella alpina SAM 1861 (FERM BP-3590) durch Mutation ableitet, um die Δ5-Desaturierungsaktivität, die Δ6-Desaturierungsaktivität oder die Kettenverlängerungsaktivität zu erhöhen.
Verfahren gemäß Anspruch 4, worin die Mutante Mortierella alpina SAM 2086 (FERM BP-6032) ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Mikroorganismus-Mutante bei einer Temperatur zwischen 20 und 30°C für das Wachstum und anschließend bei einer niedrigeren Temperatur zwischen 5 und 20°C für die Produktion der mehrfach ungesättigten omega-9-Fettsäure kultiviert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die mehrfach ungesättigte omega-9-Fettsäure mindestens eine aus 6,9-Octadecadiensäure, 8,11-Eicosadiensäure und 5,8,11-Eicosatriensäure ist.
Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigter omega-9-Fettsäure, das den Schritt der Gewinnung von mehrfach ungesättigter omega-9-Fettsäure aus einer Kultur oder einem Lipid umfaßt, die/das gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellt wurde.