DE3854080T2

DE3854080T2 - Verfahren zur Herstellung von Bis-homo-gamma-linolensäure.

Info

Publication number: DE3854080T2
Application number: DE3854080T
Authority: DE
Inventors: Kengo Akimoto; Sakayu Shimizu; Yoshifumi Shinmen; Hideaki Yamada
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1987-12-21
Filing date: 1988-12-21
Publication date: 1995-11-02
Anticipated expiration: 2008-12-22
Also published as: GR3017181T3; JPH01243992A; ES2074053T3; EP0322227B1; ATE124458T1; DE3854080D1; EP0322227A3; JP2746371B2; EP0322227A2; US4916066A; CA1316861C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Bishomo-γ-linolensäure und eines Bishomo-γ- linolensäure enthaltenden Lipids.
Bishomo-γ-linolensäure (cis-8,11,14-Eicosatrienonsäure) ist bekanntlich in Fischölen und Meerespflanzen als deren Fettsäurekomponente enthalten; da ihr Gehalt jedoch sehr gering ist, ist die daraus hergestellte gereinigte Bishomo-γ- linolensäure sehr teuer, und deshalb wird ein wirksames Verfahren zu deren Herstellung gefordert.
JP 61177990 (wovon Chemical Abstracts Bd. 105 Nr. 25, 1986, 224603y eine Zusammenfassung darstellt) beschreibt die Herstellung von Arachidonsäure und Bishomo-γ-linolensäure durch Euglena-Arten in Gegenwart von Linolen-, Olein- oder γ- Linolensäure.
EP-A-252716 (eine Zwischenliteratur (intermediate document) im Sinne von Art. 54(3) EPÜ) beschreibt ein Verfahren, bei dem Bishomo-γ-linolensäure durch Züchtung von Mortierella- Arten hergestellt wird, dies erfolgt gegebenenfalls in Gegenwart von Zusätzen, z.B. Kohlenwasserstoffen, Natriumsalzen von Fettsäuren, Olivenöl, Kokosnußöl, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl und Leinsamenöl.
Die vorliegende Erfindung hat deshalb das Ziel, ein Verfahren bereitzustellen, durch das Bishomo-γ-linolensäure unter Verwendung eines kostengünstigen Rulturmediums wirksam hergestellt werden kann.
Die hier genannten Erfinder haben festgestellt, daß bei der Züchtung eines Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Sesamöl oder Erdnußöl enthaltenden Medium die Produktion von Arachidonsäure unterdrückt wird und die erzeugte Menge an Bishomo-γ-linolensäure zunimmt.
Die hier genannten Erfinder haben auch festgestellt, daß die wirksamen Bestandteile im Sesamöl mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert werden können, das mit Sesamöl im wesentlichen nicht mischbar ist, z.B. Aceton, und daß diese Bestandteile zumindest Sesamin, Sesaminol, Episesamin, Episesaminol und Sesamolin umfassen. Die hier genannten Erfinder haben außerdem festgestellt, daß diese wirksamen Bestandteile mit einem organischen Lösungsmittel aus Sesamsamen extrahiert werden können, und daß diese Bestandteile zumindest 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4- hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 2,6-Bis-(3- methoxy-4-hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 2- (3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4-hydroxyphenoxy)- 3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan umfassen.
Nach einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Bishomo-γ-linolensäure oder eines Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids bereit, bei dem ein Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium mit einem Zusatz gezüchtet wird, der Sesamöl und/oder Erdnußöl ist.
Nach einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Bishomo-γ-linolensäure oder eines Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids bereit, wobei der Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium mit einem Zusatz gezüchtet wird, der ausgewählt ist aus:
(a) einem Extrakt von Sesamöl oder Sesamsamen&sub1; der mit einem Lösungsmittel extrahiert wurde, das mit Sesamöl im wesentlichen nicht mischbar ist;
(b) Sesamin, Sesaminol, Episesamin&sub1; Episesaminol, Sesamolin, 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4- hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 2,6-Bis- (3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan und 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4- hydroxyphenoxy)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan; und
(c) Estragonextrakt, Dillsamenextrakt, Petersilienextrakt, Kurkumaextrakt und Muskatnußextrakt.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung jedes der obengenannten Zusätze zur Verbesserung der Ausbeute von Bishomo-γ-linolensäure in diesem Verfahren.
Bei einem Verfahren nach jedem der Aspekte kann der Zusatz von Beginn an im Kulturmedium enthalten sein. Alternativ kann er zugesetzt werden, nachdem der Mikroorganismus bereits darin gewachsen ist, und danach wird der Mikroorganismus weiter gezüchtet.
Somit stellt die vorliegende Erfindung nach einer Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung von Bishomo-γ- linolensäure oder eines Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids bereit, welches die Schritte umfaßt:
Züchten eines Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium, das einen Zusatz enthält, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sesamöl, Erdnußöl und einer Mischung davon besteht, wodurch Bishomo-γ- linolensäure oder ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; oder Zugeben des Zusatzes zu einem Kulturmedium, in dem der Mikroorganismus gewachsen ist, und anschließendes weiteres Züchten des Mikroorganismus, wodurch Bishomo-γ-linolensäure oder ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; und Gewinnen von Bishomo-γ-linolensäure.
Nach einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Verfahren zur Herstellung eines Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids die Schritte:
Züchten eines Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium, das einen Zusatz enthält, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sesamöl, Erdnußöl und einer Mischung davon besteht, wodurch ein Bishomo-γ- linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; oder Zugeben des Zusatzes zu einem Kulturmedium, in dem der Mikroorganismus gewachsen ist, und anschließendes weiteres Züchten des Mikroorganismus, wodurch ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; und Gewinnen des Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids.
Nach einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Verfahren zur Herstellung von Bishomo-γ-linolensäure die Schritte:
Züchten eines Mikroorganismus, der Arachidonsaure produzieren kann, in einem Kulturmedium, das einen Zusatz enthält, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Extrakt von Sesamöl mit einem Lösungsmittel, das mit Sesamöl im wesentlichen nicht mischbar ist, und einem Extrakt von Sesamsamen mit einem Lösungsmittel besteht, das mit Sesamöl im wesentlichen nicht mischbar ist, wodurch Bishomo-γ-linolensäure oder ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; oder Zugeben des Zusatzes zu einem Kulturmedium, in dem Mikroorganismus gewachsen ist, und anschließendes weiteres Züchten des Mikroorganismus, wodurch Bishomo-γ-linolensäure oder ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; und Gewinnen von Bishomo-γ- linolensäure.
Nach einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Verfahren zur Herstellung eines Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids die Schritte:
Züchten eines Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium, das einen Zusatz enthält, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Extrakt, der aus Sesamöl mit einem Lösungsmittel extrahiert wurde, das mit Sesamöl nicht mischbar ist, und einem Extrakt aus Sesamsamen besteht, wodurch ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; oder Zugeben des Zusatzes zu einem Kulturmedium, in dem der Mikroorganismus gewachsen ist, und anschließendes weiteres Züchten des Mikroorganismus, wodurch ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; und Gewinnen des Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids.
Nach einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Verfahren zur Herstellung von Bishomo-γ-linolensäure die Schritte:
Züchten eines Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium, das einen Zusatz enthält, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sesamin, Sesaminol, Episesamin, Episesaminol, Sesamolin, 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 2,6-Bis-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-3,7- dioxabicyclo[3.3.0]octan, 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3- methoxy-4-hydroxyphenoxy)-3,7-dioxabicyclo3.3.0]octan und einer Mischung davon besteht, wodurch Bishomo-γ-linolensäure oder ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; oder Zugeben des Zusatzes zu einem Kulturmedium, in dem der Mikroorganismus gewachsen ist, und anschließendes weiteres Züchten des Mikroorganismus, wodurch Bishomo-γ-linolensäure oder ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; und Gewinnen von Bishomo-γ- linolensäure.
Nach einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Verfahren zur Herstellung eines Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids die Schritte:
Züchten eines Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium, das einen Zusatz enthält, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sesamin, Sesaminol, Episesamin, Episesaminol, Sesamolin, 2-(3,4- Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 2,6-Bis-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4-hydroxyphenoxy)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan und einer Mischung davon besteht, wodurch ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; oder Zugeben des Zusatzes zu einem Kulturmedium, in dem der Mikroorganismus gewachsen ist, und anschließendes Züchten des Mikroorganismus, wodurch ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; und Gewinnen des Bishomo-γ- linolensäure enthaltenden Lipids.
Nach einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Verfahren zur Herstellung von Bishomo-γ-linolensäure die Schritte:
Züchten eines Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium, das einen Zusatz enthält, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Estragonextrakt, Dillsamenextrakt, Petersilienextrakt, Kurkumaextrakt, Muskatnußextrakt und einer Mischung davon besteht, wodurch Bishomo-γ-linolensäure oder ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; oder Zugeben des Zusatzes zu einem Kulturmedium, in dem der Mikroorganismus gewachsen ist, und anschließendes weiteres Züchten des Mikroorganismus, wodurch Bishomo-γ-linolensäure oder ein Bishomo-γ- linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; und Gewinnen von Bishomo-γ-linolensäure.
Bei einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Verfahren zur Herstellung eines Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids die Schritte:
Züchten eines Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium, das einen Zusatz enthält, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Estragonextrakt, Dillsamenextrakt, Petersilienextrakt, Kurkumaextrakt, Muskatnußextrakt und einer Mischung davon besteht, wodurch ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; oder Zugeben des Zusatzes zu einem Kulturmedium, in dem der Mikroorganismus gewachsen ist, und anschließendes weiteres Züchten des Mikroorganismus, wodurch ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid produziert wird; und Gewinnen des Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1: ist eine graphische Darstellung, die das Verhältnis zwischen den Mengen von Arachidonsäure und Bishomo-γ-linolensäure und der Konzentration von Glucose oder Sesamöl zeigt, die dem Kulturmedium zugesetzt wurden;
Fig. 2: ist eine graphische Darstellung, die das Verhältnis zwischen den Mengen an Sesamöl und Produkten, die von einem Medium stammen, denen Sesamöl, mit Aceton behandeltes Öl oder die acetonlösliche Fraktion A zugesetzt wurde, und den Mengen der verschiedenen produzierten Fettsäuren zeigt; und
Fig. 3: zeigt graphische Darstellungen, die das Verhältnis zwischen der Menge des dem Medium zugesetzten Sesamins und den erzeugten Mengen an Arachidonsäure und Bishomo-γ-linolensäure zeigen.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Nach der vorliegenden Erfindung kann als erzeugender Mikroorganismus jeder Mikroorganismus verwendet werden, der Arachidonsäure produzieren kann. Diese Mikroorganismen umfassen jene, die zur Gattung Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula und Entomophthora gehören. Zur Gattung Mortierella gehörende Mikroorganismen umfassen z.B. Mortierella elongata IFO 8570, Mortierella exigua IFO 8571, Mortierella hygrophila IFO 5941, Mortierella alpina IFO 8568 und Mortierella parvispora IFO 8574. Andere Stämme, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Conidiobolus heterosporus CBS 138.57, Pythium irregulare CBS 494.86, Conidiobolus thromboides CBS 183.60, Penicillium cyaneum IFO 5337, Cladosporium cladosporioides (bisher C. herbarum) IFO 30314, Mucor ambiguus IFO 6742, Aspergillus candidus IFO 8816, Rhodotorula glutinis IFO 0695, Fusarium oxysporum IFO 5942, Cladosporium sphaerospermum IFO 6377 und Entomophthora ignobilis CBS 181.60.
Die obengenannten Stämme mit der IFO-Nummer sind im Osaka Institute for Fermentation; 17-85, Joso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan, hinterlegt und sind der Öffentlichkeit uneingeschränkt zugänglich. Die obengenannten Stämme mit CBS-Nummer sind im Central Bureau Voor Schimmelcultures, Boorn, Niederlande, hinterlegt und sind für die Öffentlichkeit uneingeschränkt zugänglich.
Außerdem kann der Stamm Mortierella elongata SAM 0219 verwendet werden. Dieser Stamm wurde kürzlich aus dem Boden abgetrennt und durch die hier genannten Erfinder identifiziert und wurde am 19. März 1986 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRL), Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan als FERM P-8703 hinterlegt und wurde am 22. Dezember 1986 in eine Internationale Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag als FERM BP-1239 überführt.
Als Inokulum für die Züchtung der erfindungsgemäßen Stämme werden Sporen, Myzele oder eine Vorkultur verwendet. Das verwendete Medium kann ein flüssiges oder festes Medium sein. Das flüssige Medium enthält eine Kohlenstoffguelle, z.B. Glucose, Fructose, Xylose, Saccharose, Maltose, lösliche Stärke, Molassen, Glycerol oder Manitol. Stickstoffquellen umfassen organische Substanzen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Casaminosäure, Einweichflüssigkeit von Mais, Harnstoff und anorganische Substanzen, wie Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen Bei Bedarf können im Medium anorganische Salze, wie Phosphatsalze, Magnesiumsulfat, Eisen(II)-sulfat und Kupfer(II)-sulfat, und Vitamine enthalten sein. Die Konzentration dieser Komponenten kann so ausgewählt sein, daß diese Komponenten das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus nicht nachteilig beeinflussen. In der Praxis beträgt die Konzentration der Kohlenstoffquelle 0,1 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 10 Gew.-%, bezüglich des Gesamtgewichtes des Mediums. Die Konzentration der Stickstoffquelle beträgt 0,01 bis 5 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 bis 2 Gew.-%, bezüglich des Gesamtgewichtes des Mediums.
Die Züchtungstemperatur beträgt 5 bis 40ºC, und der pH-Wert des Mediums 4 bis 10, vorzugsweise 6 bis 9.
Die Kultur erfolgt vorzugsweise mit Durchlüftung und/oder Rühren unter Schütteln in einem flüssigen Medium oder beim Stehenlassen und erfolgt gewöhnlich 2 bis 10 Tage lang.
Wenn die Züchtung in einem festen Medium erfolgt, besteht das feste Medium aus Weizenkleie, Spreu oder Reiskleie, die in einer Menge von 50 bis 100 Gew.-% bezüglich der Weizenkleie, des Spreus oder der Reiskleie mit Wasser ergänzt ist. Bei Bedarf wird das Medium mit einer geringen Menge einer Stickstoffquelle, anorganischer Salze und/oder etwas Nährstoffen ergänzt. Die Kultur erfolgt bei einer Temperatur von 5 bis 40ºC, vorzugsweise 20 bis 30ºC, 3 bis 14 Tage lang.
Nach der vorliegenden Erfindung wird der Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Medium gezüchtet, das einen Zusatz enthält, wodurch Bishomo-γ-linolensäure produziert wird. Diese Zusätze umfassen Sesamöl, Erdnußöl und eine Mischung dieser Öle. Die Öle können in roher oder gereinigter Form verwendet werden.
Der Zusatz kann außerdem aus Sesamöl extrahiert werden. Um diesen Extrakt zu erhalten, wird Sesamöl mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, das mit Sesamöl im wesentlichen nicht mischbar ist und die wirksamen Bestandteile extrahieren und lösen kann. Die organischen Lösungsmittel sind z.B. Aceton, Methylethylketon, Diethylketon, Methanol, Ethanol und dergleichen. Für die Extraktion der wirksamen Bestandteile werden z.B. Sesamöl und das Lösungsmittel homogen gemischt, und die Mischung wird bei geringer Temperatur stehengelassen. Die Phasen werden durch ein herkömmliches Verfahren getrennt, z.B. durch Zentrifugieren, wodurch die organische Phase erhalten wird, die dann verdampft wird, wodurch der Extrakt erhalten wird. Alternativ kann aus Sesamsamen ein Extrakt gewonnen werden, der für die vorliegende Erfindung von Vorteil ist. In diesem Fall werden Sesamsamen, bei Bedarf nach dem Mahlen, mit einem Lösungsmittel extrahiert, das Sesamöl extrahieren kann, z.B. ein oben beschriebenes Lösungsmittel. Nach dem Abtrennen des Lösungsmittels vom Rückstand wird das Lösungsmittel verdampft, wodurch der Extrakt erhalten wird. Der von Sesamöl oder Sesamsamen erhaltene Extrakt enthält Lignane, wie Sesamin, Sesaminol, Episesamin, Episesaminol, Sesamolin, 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 2,6-Bis-(3-methoxy-4- hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo(3.3.0]octan, 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4-hydroxyphenoxy)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan. Deshalb können bei Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die obengenannte Verbindung allein oder eine Kombination von zumindest zwei der obengenannten Verbindungen als Zusatz verwendet werden. Alle obengenannten Verbindungen sind bekannt und handelsüblich. Alternativ können die Verbindungen vom obengenannten Extrakt aus Sesamöl oder Sesamsamen abgetrennt werden. Dazu kann der Extrakt durch ein herkömmliches Verfahren, z.B. Säulenchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie, Destillation, Kristallisation oder eine Kombination davon abgetrennt werden.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Zusätze umfassen außerdem Extrakte verschiedener Pflanzenarten, z.B. Gewürzpflanzen, wie Estragon, Dillsamen, Petersilie, Kurkuma, Muskatnuß und dergleichen. Außerdem können die Extrakte aus Gewürzen gefertigt werden, die aus diesen Pflanzen hergestellt wurden. Die Extrakte können hergestellt werden, indem die obengenannten Materialien mit einem herkömmlichen Lösungsmittel extrahiert werden, z.B. mit Dichlormethan, Ethanol, Methanol, Ethylether oder dergleichen.
Die dem Kulturmedium zuzugebende Menge des Zusatzes ist etwa wie folgt. Sesamöl, Erdnußöl oder die Gesamtmenge einer Mischung davon mit 0,001 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 10 Gew.-%, bezüglich der Menge des Mediums. Der Extrakt aus Sesamöl oder Sesamsamen wird in einer Menge von 3 x 10&supmin;³ bis 3 x 10&supmin;¹ Gew.-% bezüglich der Menge des Mediums verwendet. Die obengenannten Lignan-Verbindungen werden in einer Menge von 1 x 10&supmin;³ bis 10 x 10&supmin;¹ Gew.-% bezüglich der Menge des Mediums verwendet. Wenn eine Mischung aus zwei oder mehreren Lignanen verwendet wird, sollte diese Menge die Gesamtmenge der Mischung sein.
Der obengenannte Züsatz kann dem Kulturmedium vor der Inokulation oder unmittelbar nach der Inokulation oder vor Beginn der Kultur zugesetzt werden. Alternativ kann der Zusatz während der Kultur oder sowohl vor Beginn der Kultur als auch während der Kultur zum Medium gegeben werden. Wenn der Zusatz während der Kultur verwendet wird, wird er auf einmal, schrittweise oder kontinuierlich zugesetzt.
Um die Wirkung des Zusatzes zu verbessern, können dem Kulturmedium Olivenöl, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl, Kokosnußöl oder dergleichen zugesetzt werden, die die Produktion von Arachidonsäure verbessern.
Während der Züchtung wird intrazellulär ein Lipid angereichert, das eine große Menge Bishomo-γ-linolensäure enthält. Wenn die Kultur in einem flüssigen Medium erfolgt, wird Bishomo-γ-linolensäure zum Beispiel wie folgt gewonnen. Nach der Züchtung werden die Zellen durch herkömmliche Maßnahmen aus der Bouillonkultur aufgefangen, z.B. durch Filtration oder Zentrifugieren, die Zellen werden mit Wasser gewaschen, und die gewaschenen Zellen werden vorzugsweise getrocknet.
Das Trocknen erfolgt zum Beispiel durch Gefriertrocknung oder Lufttrocknung. Das getrocknete Produkt wird mit einem organischen Lösungsmittel oder einer Mischung davon, vorzugsweise unter einem Stickstoffstrom, behandelt, wodurch ein Bishomo-γ-linolensäure enthaltendes Lipid extrahiert wird. Das organische Lösungsmittel oder die Mischung davon ist z.B. Ether, z.B. Ethylether, Kohlenwasserstoffe, wie Hexan, Alkohole, z.B. Methanol oder Ethanol, Halogenkohlenwasserstoffe, wie Chloroform oder Dichlormethan, Petrolether, als auch eine Mischung von Chloroform, Methanol und Wasser, oder alternativ wird eine Kombination aus Methanol und Petrolether verwendet. Durch Abdestillieren des Lösungsmittels wird das Bishomo-γ-linolensäure enthaltende Lipid erhalten.
Die feuchten Zellen oder die Bouillonkultur können alternativ der direkten Extraktion unterzogen werden. In diesem Fall wird ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie Methanol oder Ethanol, oder eine mit Wasser mischbare Lösungsmittelmischung verwendet, die das mit Wasser mischbare Lösungsmittel und Wasser oder ein anderes organisches Lösungsmittel enthält. Das Extraktionsverfahren ist das gleiche, wie es für die getrockneten Zellen beschrieben wurde.
Das so erhaltene Lipid enthält Bishomo-γ-linolensäure in Form einer Lipidverbindung, z.B. Fett. Obwohl Bishomo-γ- linolensäure in Form der freien Bishomo-γ-linolensäure abgetrennt werden kann, wird sie vorzugsweise in Form eines Esters mit einem niederen Alkohol, z.B. Methylester, abgetrennt. Durch Überführen der Bishomo-γ-linolensäure in diesen Ester wird sie leicht von anderen Lipidkomponenten und von anderen unerwünschten Fettsäuren abgetrennt, die während der Züchtung gebildet wurden, z.B. Palmitinsäure, Oleinsäure, Linolensäure und dergleichen, die ebenfalls gleichzeitig mit der Veresterung von Bishomo-γ-linolensäure verestert werden. Um den Methylester von Bishomo-γ-linolensäure zu erhalten, wird zum Beispiel das wie oben beschrieben hergestellte Lipid mit einer 5 bis 10%igen Salzsäurelösung in absolutem Methanol oder einer 10 bis 50%igen BF&sub3;- Lösung in Methanol bei Raumtemperatur 1 bis 24 Stunden lang behandelt.
Die so erhaltene Mischung wird mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, z.B. mit Hexan, Ethylether oder Ethylacetat, wodurch der Methylester von Bishomo-γ-linolensäure gewonnen wird. Danach wird der Extrakt über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird bei reduziertem Druck abdestilliert, wodurch ein Rückstand erhalten wird, der hauptsächlich eine Fettsäuremischung umfaßt. Diese Mischung enthält zusätzlich zum Methylester von Bishomo-γ-linolensäure Methylpalmitat, Methylstearat, Methyloleat und dergleichen. Der Methylester von Bishomo-γ- linolensäure wird durch Säulenchromatographie, Kristallisation bei geringer Temperatur, ein Harnstoff-Additionsverfahren oder eine Kombination davon von der Mischung abgetrennt
Der abgetrennte Methylester von Bishomo-γ-linolensäure wird anschließend mit einem Alkali hydrolisiert und mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, z.B. mit Ethylether, Ethylacetat oder dergleichen, wodurch Bishomo-γ-linolensäure in der freien Form erhalten wird.
Alternativ kann Bishomo-γ-linolensäure ohne Umwandlung in den Methylester erhalten werden, indem eine Alkalolyse mit zum Beispiel 5 % Natriumhydroxid bei Raumtemperatur innerhalb von 2 bis 3 Stunden und eine anschließende Extraktion der Fettsäuren vom Produkt der Alkalolyse und eine Abtrennung von Bishomo-γ-linolensäure vorgenommen werden.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand der folgenden Beispiele ausführlicher erläutert, jedoch nicht durch diese eingeschränkt.

Beispiel 1

Jeweils 2 ml des Kulturmediums A, das 2,5 % Glucose und 1 % Hefeextrakt (pH = 6,0) enthielt, und des Kulturmediums B, das 0,5 % Glucose, 2 % Sesamöl und 1 % Hefeextrakt (pH = 6,0) enthielt, wurden in Versuchsröhrchen gegeben, die einen Schraubdeckel aufwiesen und das Ganze wurde 20 Minuten bei 120ºC in einem Autoklav behandelt. Mortierella isabellina IFO 7884, Mortierella vinacea IFO 7875, Mortierella humicola IFO 8289, Mortierella nana IFO 8796, Mortierella alpina IFO 8568, Mortierella elongata IFO 8570 und Mortierella parvispora IFO 8574 wurden in jedes der obengenannten beiden Medien getrennt eingeimpft und die Züchtung erfolgte sechs Tage bei 28ºC mit 110 U/min auf einem hin- und herschwingenden Schüttelapparat. Nach der Züchtung wurde jede Bouillonkultur zwei Stunden in einem Zentrifugalverdampfer bei 60ºC bis zur Trockenheit verdampft. Dem Rückstand wurden 2 ml Methylenchlorid und 2 ml 10%ige Salzsäure in absolutem Methanol zugegeben, und das Ganze wurde drei Stunden bei 50ºC inkubiert, wodurch die erzeugten Fettsäuren verestert wurden. Der Mischung wurden 4 ml n-Hexan und 1 ml Wasser zugegeben, wodurch die Methylester der Fettsäuren extrahiert wurden. Die Extraktion erfolgte zweimal, und die Extraktionsmittel wurden gemischt und eine Stunde bei 40ºC in einem Zentrifugalverdampfer verdampft, wodurch das Lösungsmittel beseitigt wurde. Die so erhaltenen Fettsäuremethylester wurden durch Gaschromatographie analysiert, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Produzierte Fettsäuren Erzeugerstämme γ-Linolensäure (mg/l) Bishomo-γ-linolensäure (mg/l) Arachidonsäure (mg/l) M. isabellina M. vinacea M. humicola M. nana M. alpina M. elongata parvispora Obere Angaben: Ergebnisse vom Medium A Untere Angaben: Ergebnisse vom Medium B
Wenn ein Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Medium gezüchtet wurde, das Sesamöl enthielt, wurde die Promotion von Arachidonsäure unterdrückt, und es wurde eine große Menge von Bishomo-γ-linolensäure produziert, wie es aus Tabelle 1 ersichtlich ist. Die produzierte Bishomo-γ-linolensäure wurde durch Massenspektral- und NMR-Analyse identifiziert.

Beispiel 2

Jeweils 4 ml eines Mediums, das 4 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 2 % Sesamöl enthielt (pH = 6,0) (Medium A), eines Mediums, das 4 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 2 % Erdnußöl enthielt (pH = 6,0) (Medium B), eines Mediums, das 4 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 2 % Olivenöl enthielt (pH = 6,0) (Medium C) und eines Mediums, das 4 % Glucose und 1 % Hefeextrakt enthielt (pH = 6,0) (Medium D), wurden in 20 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten einer Autoklavenbehandlung bei 120ºC unterzogen, jedem Medium wurden 200 ml einer Sporensuspension von Mortierella alpina IFO 8568 zugegeben, und die Züchtung erfolgte 8 Tage bei 20ºC mit 110 U/min auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttelapparat. Nach der Kultur wurde jede Bouillonkultur filtriert, wodurch die gezüchteten Zellen gewonnen wurden, die dann gründlich mit Wasser gewaschen wurden. Die gewaschenen Zellen wurden in einem Zentrifugalverdampfer getrocknet, und die getrockneten Zellen wurden wie im Beispiel 1 beschrieben der Hydrolyse, der Veresterung mit Methyl und der Extraktion unterzogen, und die so erhaltenen Fettsäuremethylester wurden durch Gaschromatographie analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Produkt Zusatz Trockene Zellen (g/l) Bishomo-γ-linolensäure (g/l) Arachidonsäure (g/l) Keiner Erdnußöl Sesamöl Olivenöl
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, unterdrückte der Zusatz von Sesamöl oder Erdnußöl zum Kulturmedium die Produktion von Arachidonsäure und stimulierte die Produktion von Bishomo-γ- linolensäure. Olivenöl, das ein von Sesamöl und Erdnußöl verschiedenes Öl darstellt, stimulierte die Produktion von Bishomo-γ-linolensäure nicht.

Beispiel 3

10 ml eines Mediums, das 0, 0,5, 1, 2, 3 oder 4 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 2 % Sesamöl enthielt (pH = 6,0) und eines Mediums, das 4 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 0, 1, 2 oder 3 % Sesamöl enthielt (pH = 6,0) wurden in 50 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten einer Autoklavenbehandlung bei 120ºC unterzogen; 250 ul einer Sporensuspension von Mortierella alpina IFO 8568 wurden in das Medium geimpft, und die Kultur erfolgte 7 Tage bei 28ºC mit 110 U/min auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttelapparat. Nach der Kultur erfolgten die Filtration der Bouillonkultur, das Waschen der Zellen mit Wasser, das Trocknen der Zellen, die Hydrolyse des Lipids, die Veresterung der Fettsäuren mit Methyl und die Extraktion der Methylester nach den gleichen Verfahren, wie sie im Beispiel 1 beschrieben sind. Die so erhaltenen Fettsäuremethylester wurden durch Gaschromatographie analysiert, und die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.
Wie aus Fig. 1 ersichtlich, nahm die Produktion von Arachidonsäure und Bishomo-γ-linolensäure entsprechend dem gestiegenen Zusatz von Glucose zu, und die Zugabe von Sesamöl unterdrückt die Produktion von Arachidonsäure und stimuliert die Produktion von Bishomo-γ-linolensäure.

Beispiel 4

Jeweils 100 ml eines Mediums, das 5 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 2 % Sesamöl enthielt (pH = 6,0) wurden in einen 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten einer Autoklavenbehandlung bei 120ºC unterzogen; 2,5 ml einer Sporensuspension von Mortierella alpina IFO 8568 wurden in das Medium geimpft, und die Kultur erfolgte 7 Tage bei 20ºC mit 110 U/min auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttelapparat. Die Filtration der Bouillonkultur, das Waschen der Zellen mit Wasser, das Trocknen der Zellen, die Hydrolyse des Lipids, die Veresterung der Fettsäuren mit Methyl und die Extraktion der Methylester erfolgten nach den gleichen Verfahren, wie sie im Beispiel 1 beschrieben sind, wodurch 12,0 g einer Mischung von Fettsäuremethylestern erhalten wurden. Diese Mischung enthielt Methylbishomo-γ-linolenat in einer Menge von 9,3 Gew.-% bezüglich der Gesamtmenge der Mischung, dies entspricht 2,23 g/l des Mediums, und 55,8 mg/g trockene Zellen. Die Mischung enthielt Methylarachidonat in einer Menge von 6,6 Gew.-% bezüglich der Gesamtmenge der Mischung, dies entspricht 1,58 g/l des Mediums, und 39,4 mg/g trockene Zellen.

Beispiel 5

Jeweils 2 ml eines Mediums, das 4 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 1 % Sesamöl enthielt (pH = 6,0), und eines Mediums, das 4 % Glucose und 1 % Hefeextrakt enthielt (pH = 6,0) wurden in einen 10 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten einer Autoklavenbehandlung bei 120ºC unterzogen. Conidiobolus heterosporus CBS 138.57, Pythium irregulare CBS 494.86, Phytophthora infestans IFO 4872, Conidiobolus thromoboides CBS 183.60, Penicillium cyaneum IFO 5337, Cladosporium herbarum IFO 30314, Mucor ambiguus IFO 6742, Aspergillus candidus IFO 8816, Rhodotorula glutinis IFO 0695, Fusarium oxysporum IFO 5942, Cladosporium sphaerospermum IFO 6377 oder Entomophthora ignobilis CBS 181.60 wurden den obengenannten Medien getrennt eingeimpft, und es wurde 7 Tage bei 28ºC mit 110 U/min auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttelapparat gezüchtet. Die Filtration der Bouillonkultur, das Waschen der Zellen mit Wasser, das Trocknen der Zellen, die Hydrolyse der Fettsäuren, die Veresterung der Fettsäuren mit Methyl und die Extraktion der Methylester erfolgten nach den gleichen Verfahren, wie sie im Beispiel 1 beschrieben sind, wodurch eine Mischung von Fettsäuremethylestern erhalten wurde. Die Mischung wurde durch Gaschromatographie analysiert, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Menge der produzierten Bishomo-γ-linolensäure pro Medium (mg/l) Sesamöl Erzeugerstamm abwesend vorhanden Conidiobolus heterosporus CBS 138.57 Pythium irregulare CBS 494.86 Phytophthora infestans IFO 4872 Conidiobolus thromoboides CBS 183.60 Penicillium cyaneum IFO 5337 Cladosporium herbarum IFO 30314 Mucor ambiguus IFO 6742 Aspergillus candidas IFO 8816 Rhodotorula glutinis IFO 0695 Fusarium oxysporum IFO 5942 Cladosporium sphaerospermum IFO 6377 Entomophthora ignobilis CBS 181.60

Beispiel 6

Jeweils 4 ml eines Kulturmediums, das 4 % Glucose und 1 % Hefeextrakt enthielt, wurden in 20 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten einer Autoklavenbehandlung bei 120ºC unterzogen; 200 ul einer Sporensuspension von Mortierella alpina IFO 8568 wurden in das Medium geimpft, und die Züchtung erfolgte 2 Tage bei 28ºC mit 110 U/min auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttelapparat, und danach wurden der Kultur 80 mg (2 %) Sesamöl zugesetzt. Die Züchtung wurde 6 Tage fortgesetzt. Nach der Kultur wurden die gezüchteten Zellen durch Filtration gewonnen, gründlich mit Wasser gewaschen und 2 Stunden in einem Zentrifugalverdampfer bei 60ºC getrocknet. Die Hydrolyse der Fettsäuren, die Veresterungen der Fettsäuren mit Methyl und die Extraktion der Fettsäuremethylester erfolgten nach den gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 beschrieben, wodurch eine Fettsäuremethylestermischung erhalten wurde. Die Gaschromatographieanalyse der Mischung zeigte, daß die pro Medium produzierte Menge von Bishomo-γ-linolensäure 1,6 g/l betrug.

Beispiel 7

In 150 ml Aceton wurden 20 g Sesamöl gelöst, die Lösung wurde über Nacht bei -80ºC stehengelassen, und als Ergebnis setzte sich die Ölfraktion ab. Das Ganze wurde anschließend filtriert, wodurch die Acetonfraktion erhalten wurde. Die Acetonfraktion wurde verdampft, wodurch die acetonlösliche Fraktion A erhalten wurde. Die abgesetzte Fraktion wurde im Rotationsverdampfer vom Aceton befreit, wodurch ein mit Aceton behandeltes Öl erhalten wurde. Die Volumenmenge der Fraktion A betrug 1/15 des Öls.
Jeweils 2 ml eines Mediums, das 4 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 0, 0,5, 1, 2 oder 3 % Sesamöl enthielt (pH = 6,0), eines Mediums, das 4 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 0, 0,5, 1, 2 oder 3 % des mit Aceton behandelten Öls enthielt (ph = 6,0), und eines Mediums, das 4 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 0, 0,1, 0,2 oder 0,5 mg der Fraktion A enthielt (pH = 6,0), wurden in 10 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten einer Autoklavenbehandlung bei 120ºC unterzogen; 100 ul einer Sporensuspension von Mortierella alpha IFO 8568 wurden in das Medium geimpft, und die Kultur erfolgte 8 Tage bei 28ºC mit 110 U/min auf einem sich hinund herbewegenden Schüttelapparat. Nach der Kultur wurde die gezüchtete Bouillon filtriert, wodurch die Zellen gewonnen wurden, die gründlich mit Wasser gewaschen und danach getrocknet wurden. Den getrockneten Zellen wurden 2 ml Methylenchlorid und 2 ml einer Mischung aus 10 % Salzsäure in absolutem Methanol zugegeben, und die Mischung wurde 3 Tage bei 50ºC inkubiert, um die Fettsäuren mit Methyl zu verestern. Der Mischung wurden 4 ml n-Hexan und 1 ml Wasser zugegeben, wodurch die Fettsäuremethylester extrahiert wurden. Die Extraktion wurde zweimal wiederholt. Die erhaltene organische Phase wurde 1 Stunde bei 40ºC in einem Zentrifugalverdampfer verdampft, wodurch ein Rückstand erhalten wurde, der Fettsäuremethylester umfaßte, dieser wurde dann durch Gaschromatographie analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.
Wie aus Fig. 2 ersichtlich, stieg die produzierte Menge von Bishomo-γ-linolensäure durch Zugabe von Sesamöl an sich oder der acetonlöslichen Fraktion A, nahm jedoch durch die Zugabe des mit Aceton behandelten Öls nicht zu. Andererseits nahm die produzierte Menge an Arachidonsäure ab, wenn Sesamöl oder die acetonlösliche Fraktion A zugesetzt wurde, sie wurde jedoch durch die Zugabe des mit Aceton behandelten Öls nicht wesentlich beeinflußt.
Dies bedeutet, daß die wirksamen Bestandteile mit Aceton aus Sesamöl extrahiert worden waren.
Das Verhältnis der produzierten Arachidonsäure bezüglich der gesamten produzierten Fettsäuren wurde durch die Zugabe von Sesamöl, der acetonlöslichen Fraktion A oder des mit Aceton behandelten Öls merklich verringert. Andererseits nahm das Verhältnis der produzierten Linolensäure bezüglich der gesamten produzierten Fettsäure durch die Zugabe von Sesamöl oder mit Aceton behandeltem Öl zu und wurde durch die Zugabe der acetonlöslichen Fraktion A nicht beeinflußt. Als Ergebnis nahm das Verhältnis der produzierten Bishomo-γ- linolensäure bezüglich der gesamten produzierten Fettsäuren durch die Zugabe der acetonlöslichen Fraktion A zu.

Beispiel 8

Die im Beispiel 7 erhaltene acetonlösliche Fraktion A wurde durch Hochdruckflüssigchromatographie mit einer Umkehrphasensäule (5C&sub1;&sub8;) und einer Mischung von Methanol und Wasser (Volumenverhältnis = 60:40) als Elutionsmittel getrennt, wodurch Fraktionen erhalten wurden, die die Produktion von Bishomo-γ-linolensäure stimulierten. Eine dieser erhaltenen Fraktionen wurde verdampft, wodurch ein Kristall erhalten wurde. Nach der Rekristallisation wurde diese Substanz durch Massenspektrometrie und NMR analysiert, und es wurde bestätigt, daß sie Sesamin, 2,6-Bis-(3,4-methylendioxyphenyl)-cis-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan war.
Jeweils 2 ml eines Mediums, das 4 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 0, 5, 10, 20, 35 oder 50 ul einer Lösung von 0,4 % des so erhaltenen Sesaminpräparats in Chloroform enthielt, wurden in einen 10 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten einer Autoklavenbehandlung bei 120ºC unterzogen; 100 ul einer Sporenlösung von Mortierella alpina IFO 8568 wurden in das Medium geimpft, und die Züchtung erfolgte 7 Tage bei 28ºC mit 110 U/min auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttelapparat. Die Filtration der Bouillonkultur, das Waschen der Zellen mit Wasser, das Trocknen der Zellen, die Hydrolyse der Fettsäuren, die Veresterung der Fettsäuren mit Methyl und die Extraktion der Methylester erfolgten nach den gleichen Verfahren, wie sie im Beispiel 1 beschrieben sind, wodurch eine Mischung von Fettsäuremethylestern erhalten wurde. Die Mischung wurde durch Gaschromatographie analysiert, und die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.
Wie aus Fig. 3 ersichtlich ist, nahm die produzierte Menge an Bishomo-γ-linolensäure zu, und die produzierte Menge von Arachidonsäure nahm ab, wenn Sesamin zugesetzt wurde.

Beispiel 9

2 ml eines Mediums, das 4 % Glucose und 1 % Hefeextrakt enthielt, wurden in einen 10 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten einer Autoklavenbehandlung bei 120ºC unterzogen; 100 ul einer Sporensuspension von Mortierella alpina IFO 8568 wurden in das Medium geimpft, und die Kultur erfolgte 2 Tage bei 28ºC mit 110 U/min auf einem sich hinund herbewegenden Schüttelapparat. Danach wurden 50 ul der im Beispiel 8 hergestellten Sesaminlösung zur Kultur gegeben, und die Züchtung erfolgte weitere 6 Tage. Nach der Züchtung erfolgten die Filtration der Bouillonkultur, das Waschen der Zellen mit Wasser, das Trocknen der Zellen, die Hydrolyse der Fettsäuren, die Veresterung der Fettsäuren mit Methyl und die Extraktion der Methylester nach den gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 beschrieben, wodurch eine Mischung von Fettsäuremethylestern erhalten wurde. Die Mischung wurde durch Gaschromatographie analysiert. Bishomo-γ-linolensäure wurde in einer Menge von 1,5 g/l der Bouillonkultur produziert.

Beispiel 10

Jeweils 2 ml eines Mediums, das 4 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 50 ul der Sesaminlösung enthielt, die im Beispiel 8 hergestellt worden war (pH = 6,0), und eines Mediums, das 4 % Glucose und 1 % Hefeextrakt enthielt (pH = 6,0), wurden in 10 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten einer Autoklavenbehandlung bei 120ºC unterzogen.
Conidiobolus heterosporus CBS 138.57, Pythium irregulare CBS 494.86, Phytophthora infestans IFO 4872, Penicillium cyaneum IFO 5337, Cladosporium herbarum IFO 30314, Mucor ambiguus IFO 6742, Aspergillus candidus IFO 8816, Rnodotorula glutinis IFO 0695, Fusarium oxysporum IFO 5942, Entomophthora ignobilis CBS 181.60 wurden getrennt in die obengenannten Medien geimpft, und die Kultur erfolgte 7 Tage bei 28ºC mit 110 U/min auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttelapparat. Die Filtration der Bouillonkultur, das Waschen der Zellen mit Wasser, das Trocknen der Zellen, die Hydrolyse der Fettsäuren, die Veresterung der Fettsäure mit Methyl und die Extraktion der Methylester erfolgten nach den gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 beschrieben, wodurch eine Mischung von Fettsäuremethylestern erhalten wurde. Die Mischung wurde durch Gaschromatographie analysiert, und die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Menge der produzierten Bishomo-γ-linolensäure pro Medium (mg/l) Sesamin Erzeugerstamm abwesend vorhanden Conidiobolus heterosporus CBS 138.57 Pythium irregulare CBS 494.86 Phytophthora infestans IFO 4872 Penicillium cyaneum IFO 5337 Cladosporium herbarum IFO 30314 Mucor ambiguus IFO 6742 Aspergillus candidas IFO 8816 Rhodotorula glutinis IFO 0695 Fusarium oxysporum IFO 5942 Entomophthora ignobilis CBS 181.60

Beispiel 11

Die von den Sesamin enthaltenden verschiedenen Fraktionen, wie sie im Beispiel 8 hergestellt worden waren, wurden verdampft, wodurch Kristalle erhalten wurden, die anschließend in Ethanol rekristallisiert wurden. Die Kristalle wurden durch Massenspektroskopie und NMR analysiert und es wurde bestätigt, daß sie Sesaminol, d.h. 2-(3,4-Methylendioxy-6- hydroxyphenyl)-6-(3,4-methylendioxyphenyl)-cis-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, Episesaminol und Episesamin waren. Die Fraktionen von Sesaminol, Episesaminol und Episesamin wurden in einem Zentrifugalverdampfer verdampft, und die Rückstände wurden in 200 ml Chloroform gelöst, wodurch Lösungen von Sesaminol, Episesaminol und Episesamin hergestellt wurden.
Jeweils 2 ml eines Mediums, das 4 % Glucose, 1% Hefeextrakt und 50 ul einer Lösung von 0,4 % Sesaminol, Episesaminol oder Episesamin enthielt (pH = 6,0), wurden in 10 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten einer Autoklavenbehandlung bei 120ºC unterzogen; 100 ul einer Sporensuspension von Mortierella alpina IFO 8568 wurden in das Medium geimpft, und die Züchtung erfolgte 8 Tage bei 28ºC mit 110 U/min auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttelapparat. Nach der Züchtung erfolgten die Filtrationen der Bouillonkultur, das Waschen der Zellen mit Wasser, das Trocknen der Zellen, die Hydrolyse der Fettsäuren, die Veresterung der Fettsäuren mit Methyl und die Extraktion der Methylester nach den gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 beschrieben, wodurch eine Mischung von Fettsäuremethylestern erhalten wurde. Die Mischung wurde durch Gaschromatographie analysiert. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die Menge der produzierten Bishomo-γ-linolensäure durch die Zugabe von Sesaminol, Episesaminol oder Episesamin deutlich zunahm, und die Menge an Bishomo-γ-linolensäure betrug 0,86, 0,71 bzw. 0,81 g/l der Bouillon.

Beispiel 12

Jeweils 0,5 g Gewürze, d.h. Estragon, Dillsamen, Petersilie, Kurkuma und Muskatnuß wurden getrennt zu 5 ml Dichlormethan gegeben, jede Mischung wurde in einem Mörser mit einem Stößel zerstoßen, um die Bestandteile zu extrahieren, und das Ganze wurde zentrifugiert, wodurch ein Überstand erhalten wurde, der danach verdampft wurde, wodurch der Extrakt erhalten wurde. Jeder Extrakt, der von den obengenannten Gewürzen erhalten wurde, wurde in 4 ml Ethanol gelöst, wodurch eine Lösung erhalten wurde.
Zum Vergleich wurden wäßrige Lösungen von 4 mg/ml Uracil, Cytokin (cytocine), Adenin, Guanin und Hypoxanthin hergestellt.
Jeweils 10 ml eines Mediums, das 4 % Glucose und 1 % Hefeextrakt enthielt (pH = 6,0), wurden in Versuchsröhrchen gegeben und einer Autoklavenbehandlung unterzogen, und diesen Versuchsröhrchen wurden 50 ul der oben hergestellten Lösungen zugegeben, und jeweils 100 ul der Sporensuspension von Mortierella alpina IFO 8568 wurden in das Medium geimpft. Die Züchtung erfolgte 6 Tage bei 28ºC unter Schütteln mit 300 U/min, die Zellen wurden aus jeder Bouillonkultur gewonnen, und die Zellen wurden nach den gleichen Verfahren behandelt, wie sie im Beispiel 1 beschrieben sind, wodurch die Menge an Bishomo-γ-linolensäure bestimmt wurde, die von jeder Kultur gewonnen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Produzierte Menge von Bishomo-γ-linolensäure (g/l Bouillon) Zusatz Menge des Produktes Estragonextrakt Dill samenextrakt Petersilienextrakt Kurkumaextrakt Muskatnußextrakt Uracil * Cytokin * Adenin * Guanin * Hypoxanthin * * nur als vergleichende Darstellung
Als Vergleich betrug die Menge von Bishomo-γ-linolensäure, die aus einer Kultur ohne Zusatz produziert worden war, 0,18 g/l.

Beispiel 13

Das gleiche Verfahren, wie es im Beispiel 12 beschrieben ist, wurde wiederholt, außer daß Kurkumaextrakt als Zusatz verwendet wurde, und es wurden verschiedene Erzeugerstamme gezüchtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Produzierte Menge an Bishomo-γ-linolensäure pro Medium (mg/l) Kurkumaextrakt Erzeugerstamm abwesend vorhanden Conidiobolus heterosporus CBS 138.57 Pythium irregulare CBS 494.86 Phytophthora infestans IFO 4872 Penicillium cyaneum IFO 5337 Cladosporium herbarum IFO 30314 Mucor ambiguus IFO 6742 Aspergillus candidas IFO 8816 Rhodotorula glutinis IFO 0695 Fusarium oxysporum IFO 5942
Wie aus Tabelle 6 ersichtlich, verbesserte der Kurkumaextrakt die Produktion von Bishomo-γ-linolensäure bei allen geprüften Stämmen.

Beispiel 14

Als Lignan-Verbindungen sind außer den oben beschriebenen bekannt: Sesamolin (Verbindung A) aus rohem Sesamöl; und aus Sesamsamen 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4- hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan (Verbindung B), 2,6-Bis-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan (Verbindung C) und 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4-hydroxyphenoxy)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan (Verbindung D). Unter Anwendung der gleichen Verfahren wie in den Beispielen 8 und 11 beschrieben wurden die obengenannten Verbindungen durch Hochdruckflüssigchromatographie abgetrennt und gewonnen.
Jeweils 2 ml eines Mediums, das 4 % Glucose, l % Hefeextrakt und 0,01 % der Verbindung A, B, C oder D enthielt, wurden in einen 10 ml Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten einer Autoklavenbehandlung bei 120ºC unterzogen; 100 ul einer Sporensuspension von Mortierella alpina IFO 8568 wurden in das Medium geimpft, und die Züchtung erfolgte 8 Tage bei 28ºC mit 110 U/min auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttelapparat. Nach der Züchtung erfolgten die Filtration der Bouillonkultur, das Waschen der Zellen mit Wasser, das Trocknen der Zellen, die Hydrolyse der Fettsäuren, die Veresterung der Fettsäuren mit Methyl und die Extraktion der Methylester nach den gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 beschrieben, wodurch eine Mischung aus Fettsäuremethylestern erhalten wurde. Die Mischung wurde durch Gaschromatographie analysiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 Produzierte Menge an Bishomo-γ-linolensäure pro Medium (g/l) Zusatz Menge des Produktes Verbindung
Wie aus Tabelle 7 ersichtlich, wurde durch den Zusatz der Verbindung A, B, C oder D eine große Menge an Bishomo-γ-linolensäure produziert.
Aus den obengenannten Ergebnissen wird deutlich, daß mit Haedoxan verwandte Verbindungen, die eine Grundstruktur aufweisen, die der obengenannten Verbindung ähnlich ist, als Zusätze für die vorliegende Erfindung wirksam sind.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Bishomo-γ-linolensäure oder eines Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids, bei dem ein Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium mit einem Zusatz gezüchtet wird, der Sesamöl und/oder Erdnußöl ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Sesamöl und/oder Erdnußöl dem Kulturmedium zugesetzt wird, indem der Mikroorganismus bereits wächst.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Sesamöl und/oder Erdnußöl vom Beginn des Wachstums des Mikroorganismus im Kulturmedium vorliegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Zusatz 0,5 bis 10 Gew.-% des Kulturmediums darstellt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Mikroorganismus aus der Gattung Mortierella, Conidiobolus, Pytnium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula und Entomophthora ausgewählt ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus Mortierella elongata IFO 8570, Mortierella exigua IFO 8571, Mortierella hygrophila IFO 5941, Mortierella alpina IFO 8568, Mortierella elongata SAM 0219, Mortierella parvispora IFO 8574, Conidiobolus heterosporus CBS 138.57, Pythium irregulare CBS 494.86, Conidiobolus thromboides CBS 183.60, Penicillium cyaneum IFO 5337, Cladosporium cladosporioides IFO 30314, Mucor ambiguus IFO 6742, Aspergillus candidus IFO 8816, Rhodotorula glutinis IFO 0695, Fusarium oxysporum IFO 5942, Cladosporium sphaerospermum IFO 6377 und Entomophthora ignobilis CBS 181.60.

7. Verfahren zur Herstellung von Bishomo-γ-linolensäure oder eines Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids, bei dem ein Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium mit einem Zusatz gezüchtet wird, der ausgewählt ist aus:

(a) einem Extrakt von Sesamöl oder Sesamsamen, der mit einem mit Sesamöl im wesentlichen nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert wurde;

(b) Sesamin, Sesaminol, Episesamin, Episesaminol, Sesamolin, 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3- methoxy-4-hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 2,6-Bis-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-3,7- dioxabicyclo(3.3.0]octan, und 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4-hydroxyphenoxy)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan; und

(c) Estragonextrakt, Dillsamenextrakt, Petersilienextrakt, Kurkumaextrakt und Muskatnußextrakt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Zusatz dem Kulturmedium zugesetzt wird, in dem der Mikroorganismus bereits wächst.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Zusatz vom Beginn des Wachstums des Mikroorganismus im Kulturmedium vorhanden ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei

der Zusatz 0,003 bis 0,3 Gew.-% des Kulturmediums bildet, wenn er aus der Gruppe (a) ausgewählt ist, und

der Zusatz 0,001 bis 0,1 Gew.-% des Kulturmediums darstellt, wenn er aus der Gruppe (b) ausgewählt ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei der Mikroorganismus aus der Gattung Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula und Entomophthora ausgewählt ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus Mortierella elongata IFO 8570, Mortierella exigua IFO 8571, Mortierella hygrophila IFO 5941, Mortierella alpina IFO 8568, Mortierella elongata SAM 0219, Mortierella parvispora IFO 8574, Conidiobolus heterosporus CBS 138.57, Pythium irregulare CBS 494.86, Conidiobolus thromboides CBS 183.60, Penicillium cyaneum IFO 5337, Cladosporium cladosporioides IFO 30314, Mucor ambiguus IFO 6742, Aspergillus candidus IFO 8816, Rhodotorula glutinis IFO 0695, Fusarium oxysporum IFO 5942, Cladosporium sphaerospermum IFO 6377 und Entomophthora ignobilis CBS 181.60.

13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Bishomo-γ-linolensäure als Methylester von einem Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipid oder durch Alkalolyse gewonnen wird.

14. Verwendung eines Kulturmediumzusatzes, der ausgewählt ist aus:

(b) Sesamin, Sesaminol, Episesamin, Episesaminol, Sesamolin, 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3- methoxy-4-hydroxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 2,6-Bis-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-3,7- dioxabicyclo[3.3.0]octan, und 2-(3,4-Methylendioxyphenyl)-6-(3-methoxy-4-hydroxyphenoxy)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan; und

(c) Estragonextrakt, Dillsamenextrakt, Petersilienextrakt, Kurkumaextrakt und Muskatnußextrakt;

zur Verbesserung der Ausbeute an Bishomo-γ-linolensäure oder eines Bishomo-γ-linolensäure enthaltenden Lipids bei einem Verfahren, bei dem ein Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium gezüchtet wird.

15. Verwendung von Sesamöl oder Erdnußöl als Kulturzusatz zur Verbesserung der Ausbeute von Bishomo-γ-linolensäure oder eines diese enthaltendenen Lipids bei einem Verfahren, bei dem ein Mikroorganismus, der Arachidonsäure produzieren kann, in einem Kulturmedium gezüchtet wird.