CN104195049A - 一种γ-亚麻酸产生菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种γ-亚麻酸产生菌及其应用，其分类命名为雅致小克银汉霉（Cunningnamellaelegans）CLA-N2-V，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCM2014191，本发明以离子束诱变，摇瓶发酵筛选获γ-亚麻酸产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，最终筛选出目标菌株CLA-N2-V，该菌株可较大幅度提高发酵产物中γ-亚麻酸组分并减少其他组分，且遗传稳定性良好。该菌株利用玉米淀粉为发酵碳源，在5L发酵罐中发酵产γ-亚麻酸产量可达2273μg/mL，可应用于工业生产并大幅度提高发酵单位，具有重大的经济应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种γ-亚麻酸产生菌及其应用。
背景技术
γ-亚麻酸(γ-linolenic acid)是一系列多不饱和脂肪酸的一个重要分支。根据脂肪酸 碳链的长短不同,可分为长链脂肪酸,中链脂肪酸和短链脂肪酸,碳链长度为 18 的γ- 亚麻酸则属于长链脂肪酸的一种。根据饱和度来判断,又可将脂肪酸分为饱和脂肪酸 (Saturated fatty acid)、一价多不饱和脂肪酸(Monoursaturated fatty acid)、多不饱和脂 肪酸(Polysaturated fatty acid)三种。作为一种人体必不可少的脂肪酸,它是人体中多 个重要反应的中间产物,例如由亚油酸转化,可生成前列腺素和白细胞介素等的前体物质。由于对于中老年人,它可以起到增强其身体抵抗力的功效。
γ-亚麻酸(γ -linolenic acid)是一种人体必需的对其产生多种生理功能的多稀不饱 和脂肪酸。它是参与人体多种生化反应,并与人体代谢和生长发育息息相关的一种重要 中间物质。具有广泛的医用实用价值。目前国际上常用的方法是从植物种子油中提取γ -亚麻酸;另一种是通过丝状真菌发酵产生。而近些年,由于不受环境影响,成本 相对较低等特点,γ-亚麻酸的发展方向越来越侧重于工业化发酵的研究。本专利以 γ-亚麻酸(γ -linolenic acid)生产菌种小克银汉霉菌(Cunningnamel laelegans)为研究 对象,从菌种诱变到菌种筛选,以及发酵工艺优化等方面对小克银汉霉菌(Cunningnamel laelegans)进行多方面的研究。
目前，国内外已有利用霉菌进行γ-亚麻酸发酵的报道，如专利CN103484382A公开了一种高产γ-亚麻酸的突变株及制备方法和应用，利用深黄被孢霉进行发酵生产γ-亚麻酸。但这些方法大都产量不高，且发酵产物中杂酸偏多，不利于后道提取分离。因此研究一种适于工业生产的γ-亚麻酸生产途径具有很好的研究意义和很大的发展空间。
发明内容
为了解决目前的小克银汉霉菌γ-亚麻酸产量低，无法满足工业化生产的问题，本发明提供一种γ-亚麻酸产生菌及其应用。
本发明采用的技术方案如下：
一种γ-亚麻酸产生菌，其分类命名为雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans）CLA-N2-V已于2014年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO： M 2014191，地址：中国 武汉 武汉大学。
本发明所述的γ-亚麻酸产生菌雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans） CLA-N2-V的诱变筛选方法是：将γ-亚麻酸出发菌株雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans）CLA-N2，经离子束诱变后，通过摇瓶发酵筛选获得γ-亚麻酸产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出γ-亚麻酸产量高的目标菌株雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans）CLA-N2-V，形态学及生理生化学特征如下：
菌落颜色：灰白色。
需氧方式：好氧生长。
菌落大小：6~8 mm。
适宜生长温度：27℃。
适宜生长pH：6.5。
菌体形态：圆形菌落，无光泽。
本发明所提供的γ-亚麻酸产生菌的诱变方法，具体步骤如下：
(a)、单孢子悬浮液制备：将出发菌株雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans）CLA-N2孢子制成孢子悬液，镜检无细胞重叠。
(b)、低能氮离子注入诱变：取0.1mL的步骤(a)中单孢子悬液均匀涂布于无菌空平皿上，以无菌风吹干，在10~18KeV、注入剂量为40×1014~240×1014ions/cm2下，对雅致小克银汉霉CLA-N2进行氮离子注入，离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1mL无菌水洗脱，涂布到固体培养基上，在26~30℃下倒置培养24~48h。
(c)、诱变菌株的筛选：
筛选：将步骤(b)诱变得到的固体单菌落接入种子培养基，在培养温度26~30℃，200~220rpm摇床转速下扩大培养24~48h后，按5~15%(v/v)的接种量接入发酵培养基。在26~30℃、200~220rpm摇床转速下培养192h下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液测定发酵液中γ-亚麻酸含量。取发酵液γ-亚麻酸含量最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a) ~(c)，直至筛选出γ-亚麻酸产量高的目标菌株雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans）CLA-N2-V。
步骤(b)中所用的固体培养基为葡萄糖2.0%，马铃薯 2%，琼脂 1.5%，pH 6.5，其余为水。
步骤(b)中低能氮离子注入，优选诱变能量为16KeV，诱变剂量为160×1014ions/cm2。
步骤(c) 中所用的种子培养基为：碳源4.0%~6.0%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.1%~0.6%，其余为水，pH 6.0~6.5；其中所述碳源为葡萄糖和玉米淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
步骤(c) 中所用的发酵培养基为：碳源8.0%~10.0%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.1%~0.6%，其余为水，pH 6.0~6.5；其中所述碳源为葡萄糖、玉米淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
上述筛选出的雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans） CLA-N2-V在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，
具体步骤如下：
1)、固体培养：将雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans）CLA-N2-V接种于固体培养基上，培养温度为27℃，培养时间为48h；
2)、种子培养：将步骤1)固体培养的雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans ）CLA-N2-V接种到种子培养基中，培养温度为27℃，200rpm转速下培养48h；
3)、发酵培养：将步骤2)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5~15%(v/v)，培养温度为27℃，200rpm转速下发酵192h。
步骤1）所述固体培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2.0%~4.0%、氮源0.5%~1.5%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水，pH 6.0~6.5；其中所述碳源为葡萄糖和玉米淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为麦芽浸粉和酵母膏中的一种或两种的混合。
步骤2）所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4.0%~6.0%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.3%~0.9%，其余为水，pH 6.0~6.5；其中所述碳源为葡萄糖和玉米淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
步骤3）所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源8.0%~15.0%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.3%~1.5%，其余为水，pH 6.0~6.5；其中所述碳源为葡萄糖、玉米淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
附图说明
图1：实施例2发酵液中γ-亚麻酸色谱图。
有益效果
本发明采用离子束诱变，最终筛选获得一株γ-亚麻酸产生菌雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans） CLA-N2-V，可较大幅度提高发酵产物中γ-亚麻酸组分且遗传稳定性好，菌株连续传代5次后效价并无明显变化。在5L发酵罐中，以廉价玉米淀粉为碳源，发酵产γ-亚麻酸产量达到2273μg/mL，相比原始出发菌株提高了21.9%，同时也超过国内外目前有报道的发酵产量最高的菌株（产量在1800μg/mL左右）。本技术发明完全符合工业化γ-亚麻酸生产菌株的诱变和筛选需要，并可应用于工业化发酵生产，具有重大的社会意义和经济价值。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 本实施例说明将雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans） CLA-N2进行诱变的方法。
以实验室保存的雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans） CLA-N2为出发菌株，进行诱变，具体步骤如下：
(a)、单孢子悬浮液制备：取26~30℃恒温固体培养24~48h的小克银汉霉菌加无菌水10mL，刮洗下孢子倾于带有玻璃珠的250mL三角瓶内震荡摇匀20min(250rpm)，打散孢子链，三层脱脂纱布过滤，滤液用血球计数板计数，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。
(b)、低能氮离子注入诱变：取0.1mL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌空平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为多功能注入机。分别在10KeV、14KeV、16KeV、18KeV的能量下对小克银汉霉菌进行离子注入。注入剂量分别为40×1014ions/cm2、80×1014ions/cm2、120×1014ions/cm2、160× 1014ions/cm2、200×1014ions /cm2、240×1014ions/cm2。靶室真空度为10-3Pa，以5S脉冲式注入，间隔15s，靶室内放置不接受注入的对照样。确定诱变能量16KeV，诱变剂量160×1014ions/cm2为最佳低能氮离子注入诱变条件。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1ml无菌水洗脱，涂布到固体培养基上，在24~30℃下倒置培养36~60h。
（c）筛选：将步骤(b)诱变得到的固体单菌落接入种子培养基，在培养温度26~30℃，200~220rpm摇床转速下扩大培养24~48h后，按5~15%(v/v)的接种量接入发酵培养基。在26~30℃、200~220rpm摇床转速下培养192h下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液测定发酵液中γ-亚麻酸含量。取发酵液γ-亚麻酸含量最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a) ~(c)，直至筛选出番茄红素产量高的目标菌株雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans ）CLA-N2-V。
步骤(b)中所用的固体培养基为葡萄糖2.0%，马铃薯 2%，琼脂 1.5%，pH 6.5，其余为水。
步骤(c) 中所用的种子培养基为：葡萄糖6.0%，酵母粉 1.0%，NaNO3 0.5%, KH2PO4 0.3%, MgSO4·7H2O 0.03%，pH 6.5，其余为水。
步骤(c) 中所用的发酵培养基为：葡萄糖10.0%，酵母粉 1.5%，NaNO3 0.5%, KH2PO4 0.3%, MgSO4·7H2O 0.03%，pH 6.5，其余为水。
实施例2 本实施例说明高产菌株雅致小克银汉霉CLA-N2-V发酵生产γ-亚麻酸的工艺。
本实施例所用的培养基配方：
固体培养基为：葡萄糖2.0%，马铃薯 2%，琼脂 1.5%，pH 6.5，其余为水；
种子培养基为：葡萄糖6.0%，酵母粉 1.0%，NaNO3 0.5%, KH2PO4 0.3%, MgSO4·7H2O 0.03%，pH 6.5，其余为水；
发酵培养基为：葡萄糖10.0%，酵母粉 1.5%，NaNO3 0.5%, KH2PO4 0.3%, MgSO4·7H2O 0.03%，pH 6.5，其余为水；
将小克银汉霉菌CLA-N2-V接种于固体培养基上，培养温度为27℃，培养时间为48h；将固体培养的小克银汉霉菌CLA-N2-V培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为27℃，200rpm转速下培养48h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为6.5，接种量为10%(v/v)， 500mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为27℃，200rpm摇床转速下培养发酵168h。发酵产γ-亚麻酸产量为2097μg/mL，相对于原始出发菌株提高了18.6%。
实施例3 本实施例说明突变株的形态学及生理生化学特征和传代稳定性
雅致小克银汉霉CLA-N2-V，形态学及生理生化学特征如下：菌落颜色：灰白色；需氧方式：好氧生长；菌落大小：6~8mm；适宜生长温度：27℃；适宜生长pH：6.5；菌体形态：圆形菌落，无光泽。
在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中（发酵培养条件同实施例2），检测突变株小克银汉CLA-N2-V产量，观察期传代稳定性，菌株传代发酵试验结果如表1所示：
表1 高产突变菌株小克银汉CLA-N2-V稳定性试验
| CLA-N2γ-亚麻酸产量(μg/mL) | CLA-N2-Vγ-亚麻酸产量(μg/mL) | |
| F1 | 1768 | 2097 |
| F2 | 1765 | 2094 |
| F3 | 1759 | 2089 |
| F4 | 1767 | 2095 |
| F5 | 176 | 2096 |
从实验结果可以看出，经过5次传代，突变菌株小克银汉CLA-N2-V的γ-亚麻酸产量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例4本实施例说明高产菌株小克银汉CLA-N2-V发酵培养基优化工艺。
实验确定玉米淀粉、葡萄糖为发酵培养基所用碳源；花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉为发酵培养基所用有机氮源。为研究不同因数之间还存在的相互作用，采用正交实验方法确定发酵培养基的最佳组成，正交实验因数与水平设计如表2和3所示。
表2.表正交实验因数水平表（L1645）
| 因数 | 玉米淀粉/%A | 葡萄糖/%B | NaNO3/%C | 酵母粉/%E |
| 1 | 2 | 8 | 0.8 | 0.8 |
| 2 | 3 | 10 | 1.0 | 1.0 |
| 3 | 4 | 12 | 1.2 | 1.2 |
表3 正交实验及结果分析
| 实验序号 | A | B | C | D | 产量(μg/mL) |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 575.4 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2564.1 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 2605.4 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 2709.9 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 2937.9 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 2121 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 2828.7 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 2100.5 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 2494.8 |
| K1 | 1914.967 | 2038.000 | 1598.967 | 2326.411 | |
| K2 | 2589.600 | 2534.167 | 2589.600 | 2504.600 | |
| K3 | 2474.667 | 2407.067 | 2790.667 | 2471.933 | |
| 极差R | 674.633 | 496．167 | 1191.7 | 178.189 | |
| 优方案 | A2 | B2 | C3 | D2 |
由实验结果可以确定，影响γ-亚麻酸发酵培养的因数由大到小的顺序为：NaNO3 >玉米淀粉> 葡萄糖> 酵母粉。由实验结果可以确定这4个因素的最优水平为：A2 B2 C3 D2；即最佳发酵培养基组成为：玉米淀粉3.0%，葡萄糖10.0%，NaNO3 1.2%，酵母粉1.0%，MgSO4 0.03%
实施例5 本实施例说明高产菌株小克银汉CLA-N2-V发酵生产γ-亚麻酸的工艺
本实施例所用的培养基配方：
固体培养基为：葡萄糖2.0%，马铃薯 2%，琼脂 1.5%，pH 6.5，其余为水。
种子培养基为：葡萄糖6%,酵母膏1%,NaNO3 0.5%,KH2PO4 1.0%, MgSO4 0.03%，pH 6.5其余为水。
发酵培养基为：玉米淀粉3.0%,葡萄糖10.0%,NaNO3 1.2%,酵母粉1.0%,MgSO4， 0.03%，pH 6.5，其余为水。
将小克银汉CLA-N2-V接种于固体培养基上，培养温度为27℃，培养时间为48h；将固体培养的小克银汉CLA-N2-V培养物接种至种子培养基中，500mL培养瓶中装液量为150mL，培养温度为27℃，200rpm转速下培养48h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为6.5，接种量为10%(v/v)， 5000ml培养瓶中装液量为3000mL，培养温度为27℃，200rpm摇床转速下培养发酵168h。发酵液中γ-亚麻酸产量为2273μg/mL，相对于原始出发菌株提高了21.9%。
实施例6 本实例说明发酵液中γ-亚麻酸产量的检测方法。
仪器设备：气相色谱仪、色谱工作站、离心机、超声清洗器、漩涡混合器、微量进样器、微孔滤膜，PEG20M 色谱柱等。
检测条件：检测器为 FID;载气为 N2(80ml/min);分流比为:120:1;进样口温度为 260°C;检测口温度:280°C;柱前压:0.02MPa; 柱温:190°C;进样量:0.5ul。
操作步骤
样品制备
取油脂 0.1g(或干菌体 0.2g)于 10mL 容量瓶中, 加入 5%KOH-CH3OH 溶液(质量体积比)1mL,60°C水浴 10min。取出容量瓶, 室温冷却 5min,加入甲醇 2mL,三氟化硼-乙醚溶液 1.5mL,充分震荡混匀,60°C 水浴 10min。取出容量瓶,室温冷却 5min,加入正己烷 2mL,充分震荡混匀, 静置 10min。取上层清液 0.1mL 于 1.5mL 离心管中加入 0.5mL 正己烷,再加入 少许无水 Na2SO4(用于吸水),取 1μL 进样。
在上述条件下，待仪器稳定后注入标样溶液连续两针标样γ-亚麻酸峰面积相对变化小于1.5%后，再将制备好的样品进样检测。γ-亚麻酸峰的出峰时间为10.53min左右。 计算方法
γ-亚麻酸产量（g/L）=(样品峰面积 / 标准品峰面积) ×标准品浓度×稀释倍数。
Claims (6)
1.一种γ-亚麻酸产生菌，其分类命名为雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans）CLA-N2-V，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO： M 2014191。
2.权利要求1所述的γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用。
3.根据权利要求2所述γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，其特征在于包含如下步骤：
1)、固体培养：将雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans）CLA-N2-V接种于固体培养基上，培养温度为27℃，培养时间为48h；
2)、种子培养：将步骤1)固体培养的雅致小克银汉霉（Cunningnamel laelegans）CLA-N2-V接种到种子培养基中，培养温度为27℃，200rpm转速下培养48h；
3)、发酵培养：将步骤2)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5~15%(v/v)，培养温度为27℃，200rpm转速下发酵168~192h。
4.根据权利要求3所述γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，其特征在于：步骤1）所述固体培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2.0%~4.0%、氮源0.5%~1.5%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水，pH 6.0~6.5；其中所述碳源为葡萄糖和马铃薯中的一种或两种的混合；所述氮源为马铃薯、麦芽浸粉和酵母膏中的至少一种。
5.根据权利要求3所述γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，其特征在于：步骤2）所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4.0%~6.0%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.3%~0.9%，其余为水，pH 6.0~6.5；其中所述碳源为葡萄糖和玉米淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
6.根据权利要求3所述γ-亚麻酸产生菌在发酵生产γ-亚麻酸中的应用，其特征在于：步骤3）所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源8.0%~15.0%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.3%~1.5%，其余为水，pH 6.0~6.5；其中所述碳源为葡萄糖、玉米淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为酵母粉、大豆粉中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
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