CN103468463A - 一种红曲霉液态发酵曲的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，该方法涉及一株高产色素和桔霉素的红曲霉菌株L，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC M2013039。在本发明技术条件下生产的液态发酵曲，其色价水平为110～120U/mL，发酵周期为5～7d，糖化酶活力为630～740U/mL，同时桔霉素含量仅为2～3mg/L，低于日本厚生省在1999年颁布、2003年修订的《日本食品添加剂标准》中对红曲色素的桔霉素含量限量指标0.2mg/kg（色价基准为5u/g，1%），该液态发酵曲不存在安全上的隐患，可应用于红曲黄酒酿造体系。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，尤其涉及一种红曲霉液态发酵曲的生产方法。
背景技术
红曲霉是一种腐生丝状真菌，属红曲科。将红曲霉应用于酿酒已有相当长的历史，主要是利用红曲霉代谢产生的红曲色素、各种酶以及多种生理活性物质，如麦角固醇、Monacolin K 和 γ-氨基丁酸等，不仅营养丰富，而且具有抗氧化、抗衰老、降血压、降胆固醇、参与机体代谢和免疫调节等生理功效。此外，红曲霉在代谢过程中还会产生一种真菌毒素——桔霉素，桔霉素主要作用的靶器官是肾脏,它不仅可以致畸、导致肿瘤的发生,而且可以诱发突变，使得红曲产品的食用安全性受到严重挑战，生产无桔霉素或低桔霉素含量的红曲产品具有重要的现实意义。
福建红曲黄酒作为我国黄酒产业的一朵奇葩，因添加了红曲进行发酵而有与众不同的功效。红曲是以大米为主要原料，经红曲霉固态发酵而成的一种紫红色米曲，在福建红曲黄酒酿造中有着举足轻重的作用，赋予红曲黄酒独特的风味和药用保健价值。固态发酵作为传统红曲的生产方式，具有培养基简单、成本低、对环境污染少、能耗低等优点，但是其抗微生物污染能力低、劳动强度大，操作繁琐，生长速度慢、生产周期长且产品质量稳定性不高而不适宜大规模机械化生产。
发明内容
为了克服现有红曲制备技术的缺点与不足，本发明提供了一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，该方法是一种高产糖化酶、低产桔霉素的红曲霉液态发酵曲的生产方法，以期应用于红曲黄酒酿造。液态发酵是工业化生产的前提，相比于固态发酵具有可操控强、能实现液态发酵生产红曲，对红曲黄酒工艺稳定性、机械化生产都有很大的促进作用。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，所述红曲霉名称为红曲霉菌株L（Monascus kaoliang Strains L），于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2013年1月22日，保藏编号为：CCTCC M 2013039。
所述生产方法包含以下的步骤：
①菌株活化：取权利要求1所述的红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑取少许菌种转接到PDA培养基上，活化培养；
②挑取活化好的菌种转接到种子培养基中，培养发酵种子，得到发酵种子液；
③在发酵培养基中接入上述发酵种子液，进行液态发酵；
④发酵完毕，测定发酵液的糖化酶活力、色价和桔霉素含量。
所述液态发酵的具体步骤如下：取发酵培养基30～50mL于250mL三角瓶装中，按3～8%接种量移取种子培养液于发酵培养基中，在32～36℃培养箱中，200-250 rpm/min 旋转振荡培养5～7天。
更优选的，所述生产方法包括以下具体步骤：
① 取权利要求1所述的红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种，转接于含PDA培养基的培养皿中，30℃活化培养8天；
② 用打孔器打取PDA平板上的红曲霉菌落转接到种子培养基中，摇床转速200rpm/min，温度30℃培养60h，制得种子培养液；
③ 250mL三角瓶装发酵培养基30mL，以体积比计，按5%的接种量移取种子培养液于发酵培养基中，在32℃恒温培养箱中，250rpm/min 旋转振荡培养6天；
④ 发酵液匀浆后，测定发酵液糖化酶活力、色价和桔霉素含量。
所述PDA培养基的配方如下：称取200g去皮切块的马铃薯，加入20g琼脂，20g葡萄糖，1000 mL去离子水，煮沸20～30 min，八层纱布过滤，混匀、分装、121℃灭菌30min。
所述种子培养基的配方如下(g.L-1)：籼米粉35，葡萄糖12，黄豆粉12，NaNO3 1，KH2PO4 1，MgSO4.7H2O 0.5， pH自然，121℃灭菌20min。
所述发酵培养基的配方如下(g.L-1)：米粉30～50，葡萄糖10～20，味精20～30，硫酸铵10～15，磷酸二氢钾2～3，七水合硫酸镁0.4～0.7，一水合硫酸锰0.05～0.07，pH 6.5，121℃灭菌20min。
所述液态发酵的具体步骤如下：取发酵培养基30～50mL于250mL三角瓶装中，按3～8%接种量移取种子培养液于发酵培养基中，在32～36℃培养箱中，200-250 rpm/min 旋转振荡培养5～7天。
所述的米粉为籼米粉、粳米粉、糯米粉、小米粉中的一种或几种。
本发明中红曲霉液态发酵物指标（糖化酶活力、色价和桔霉素）的测定方法如下：
1. 糖化酶活力的测定方法：
取两根25mL比色管，分别加入事先（40℃）下预热的2.5mL 2%可溶性淀粉溶液和0.5mL稀释15倍的发酵液，在40℃反应10min，立即加入2mL DNS试剂，在沸水浴中加热5min，用水冷却，最后定容至25mL，在540nm处测定吸光度。以加入事先40℃下预热的2.5mL 2%可溶性淀粉溶液和0.5mL适量稀释的酶液，立即加入2mL DNS试剂做空白。酶活力单位的定义：1mL酶液于40℃，pH4.6 的条件下，1h分解可溶性淀粉，产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以U/g表示。
2. 色价的测定方法：
将发酵液匀浆后，取0.2g发酵匀浆液到25ml离心管中，添加13%乙醇溶液10mL，60℃水浴浸提1h后用8000r/min离心，取离心上清液稀释10倍后测定410nm、465nm、505nm处吸光值，以水调零。色价=（OD410+ OD465+ OD505）×稀释倍数。
3. 桔霉素的测定方法：
采用国家标准（GB／T 5009.222-2008）方法测定。将带有菌丝体的液态发酵红曲样品匀浆后用吸管吸取10mL，置于50mL具塞试管中，加入20mL无水乙醇，60℃水浴加热1小时（期间不停地振荡），冷却至室温后转入塑料离心管中，3000r/min离心15分钟，上清液经0.22um滤膜过滤后进行HPLC分析。
本发明的显著优点：本发明成功建立了一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，该液态曲可用于红曲黄酒的酿造生产。红曲霉菌株L液态发酵生产的发酵曲色价水平为115.58～123.17U/mL，发酵周期为5～7d，糖化酶活力为632.32～738.84 U/mL，同时桔霉素含量仅为1.18～3.00mg/L，低于日本厚生省在1999年颁布、2003年修订的《日本食品添加剂标准》中对红曲色素的桔霉素含量限量指标0.2mg/kg（色价基准为5u/g，1%）。
附图说明
图1为红曲霉菌株L在实施例1、实施例2和实施例3的发酵结果。
具体实施方式
本发明的PDA培养基的配方如下：称取200g去皮切块的马铃薯，加入20g琼脂，20g葡萄糖，1000 mL去离子水，煮沸20-30 min，八层纱布过滤，混匀、分装、121℃灭菌30min。
本发明的种子培养基的配方如下：籼米粉35 g ，葡萄糖12 g ，黄豆粉12 g ，NaNO3 1 g ，KH2PO4 1 g ，MgSO4.7H2O 0.5 g，去离子水定容到1000 mL ，pH自然，121℃灭菌20min。
本发明的发酵培养基的配方如下：米粉30 ～50 g，葡萄糖10～20 g，味精20～30 g，硫酸铵10～15 g，磷酸二氢钾2～3 g ，七水合硫酸镁0.4～0.7 g ，一水合硫酸锰0.05～0.07 g ，去离子水定容到1000 mL ，pH 6.5，121℃灭菌20min。
本发明的液态发酵的具体步骤如下：取发酵培养基30～50mL于250mL三角瓶装中，按3～8%接种量移取种子培养液于发酵培养基中，在32～36℃培养箱中，200-250 rpm/min 旋转振荡培养5～7天。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于此。
实施例1：
本发明的PDA培养基的配方如下：称取200g去皮切块的马铃薯，加入20g琼脂，20g葡萄糖，1000 mL去离子水，煮沸30 min，八层纱布过滤，混匀、分装、121℃灭菌30min。
本发明的种子培养基的配方如下：籼米粉35 g ，葡萄糖12 g ，黄豆粉12 g ，NaNO3 1 g ，KH2PO4 1 g ，MgSO4.7H2O 0.5 g，去离子水定容到1000 mL ，pH自然，121℃灭菌20min。
本发明的发酵培养基的配方如下：米粉50 g，葡萄糖20 g，味精30 g，硫酸铵15 g，磷酸二氢钾3 g ，七水合硫酸镁0.7 g ，一水合硫酸锰0.07 g ，去离子水定容到1000 mL ，pH 6.5，121℃灭菌20min。
一种红曲霉液态发酵曲的生产方法具体如下：取红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种，转接于含PDA的培养皿中，30℃活化培养。取活化后的红曲霉菌株L以同样的方式接种到种子培养基中，30℃ 200rpm/min培养60h。制备种子液。按5%接种量分别移取种子培养液于发酵培养基中，培养条件为250mL三角瓶装发酵培养基30mL，在32℃培养箱中，250 r/min 旋转振荡培养6天。所得发酵液分别测定发酵产物的色价、糖化酶活力和桔霉素含量。
本发明中所涉及的红曲霉菌株L在上述方法下生产的液态发酵曲色价可达115.58U/mL，糖化酶活力达到738.84 U/mL，桔霉素含量仅为2.87 mg/L。
实施例2：
本发明的PDA培养基的配方如下：称取200g去皮切块的马铃薯，加入20g琼脂，20g葡萄糖，1000 mL去离子水，煮沸20 min，八层纱布过滤，混匀、分装、121℃灭菌30min。
本发明的种子培养基的配方如下：籼米粉35 g ，葡萄糖12 g ，黄豆粉12 g ，NaNO3 1 g ，KH2PO4 1 g ，MgSO4.7H2O 0.5 g，去离子水定容到1000 mL ，pH自然，121℃灭菌20min。
本发明的发酵培养基的配方如下：米粉30g，葡萄糖10 g，味精20 g，硫酸铵10g，磷酸二氢钾2 g ，七水合硫酸镁0.4 g ，一水合硫酸锰0.05 g ，去离子水定容到1000 mL ，pH 6.5，121℃灭菌20min。
一种红曲霉液态发酵曲的生产方法具体如下：取红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种，转接于含PDA的培养皿中，30℃活化培养。取活化后的红曲霉菌株L以同样的方式接种到种子培养基中，30℃ 200rpm/min培养60h。制备种子液。按3%接种量分别移取种子培养液于发酵培养基中，培养条件为250mL三角瓶装发酵培养基40mL，在32℃培养箱中，200 r/min 旋转振荡培养7天。所得发酵液分别测定发酵产物的色价、糖化酶活力和桔霉素含量。
本发明中所涉及的红曲霉菌株L在上述方法下生产的液态发酵曲色价可达123.17U/mL，糖化酶活力达到691.14 U/mL，桔霉素含量仅为3.00 mg/L。
实施例3：
本发明的PDA培养基的配方如下：称取200g去皮切块的马铃薯，加入20g琼脂，20g葡萄糖，1000 mL去离子水，煮沸25 min，八层纱布过滤，混匀、分装、121℃灭菌30min。
本发明的种子培养基的配方如下：籼米粉35 g ，葡萄糖12 g ，黄豆粉12 g ，NaNO3 1 g ，KH2PO4 1 g ，MgSO4.7H2O 0.5 g，去离子水定容到1000 mL ，pH自然，121℃灭菌20min。
本发明的发酵培养基的配方如下：米粉35 g，葡萄糖15 g，味精25 g，硫酸铵12 g，磷酸二氢钾2.5 g ，七水合硫酸镁0.5 g ，一水合硫酸锰0.06 g ，去离子水定容到1000 mL ，pH 6.5，121℃灭菌20min。
一种红曲霉液态发酵曲的生产方法具体如下：取红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种，转接于含PDA的培养皿中，30℃活化培养。取活化后的红曲霉菌株L以同样的方式接种到种子培养基中，30℃ 200rpm/min培养60h。制备种子液。按8%接种量分别移取种子培养液于发酵培养基中，培养条件为250mL三角瓶装发酵培养基50mL，在36℃培养箱中，240 r/min 旋转振荡培养5天。所得发酵液分别测定发酵产物的色价、糖化酶活力和桔霉素含量。
本发明中所涉及的红曲霉菌株L在上述方法下生产的液态发酵曲色价可达118.32U/mL，糖化酶活力达到632.32 U/mL，桔霉素含量仅为1.18mg/L。
Claims (8)
1.一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于：所述红曲霉名称为红曲霉菌株L（Monascus kaoliang Strains L），于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC M 2013039。
2.根据权利要求1所述的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于：所述生产方法包含以下的步骤：
①取权利要求1所述的红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑取少许菌种转接到PDA培养基上，活化培养；
②挑取活化好的菌种转接到种子培养基中，培养发酵种子，得到发酵种子液；
③在发酵培养基中接入上述发酵种子液，进行液态发酵；
④发酵完毕，测定发酵液的糖化酶活力、色价和桔霉素含量。
3.根据权利要求2所述的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于：所述液态发酵的具体步骤如下：取发酵培养基30～50mL于250mL三角瓶装中，按3～8%接种量移取种子培养液于发酵培养基中，在32～36℃培养箱中，200-250 rpm/min 旋转振荡培养5～7天。
4.根据权利要求2所述一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于：所述生产方法包括以下具体步骤：
① 取权利要求1所述的红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种，转接于含PDA培养基的培养皿中，30℃活化培养8天；
② 用打孔器打取PDA平板上的红曲霉菌落转接到种子培养基中，摇床转速200rpm/min，温度30℃培养60h，制得种子培养液；
③ 250mL三角瓶装发酵培养基30mL，以体积比计，按5%的接种量移取种子培养液于发酵培养基中，在32℃恒温培养箱中，250rpm/min 旋转振荡培养6天；
④ 发酵液匀浆后，测定发酵液糖化酶活力、色价和桔霉素含量。
5.根据权利要求3或4所述的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于：所述PDA培养基的配方如下：称取200g去皮切块的马铃薯，加入20g琼脂，20g葡萄糖，1000 mL去离子水，煮沸20-30 min，八层纱布过滤，混匀、分装、121℃灭菌30min。
6.根据权利要求3或4所述的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于：所述种子培养基的配方如下：籼米粉35 g ，葡萄糖12 g ，黄豆粉12 g ，NaNO3 1 g ，KH2PO4 1 g ，MgSO4.7H2O 0.5 g，去离子水定容到1000 mL ，pH自然，121℃灭菌20min。
7.根据权利要求3或4所述的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方如下：米粉30 ～50 g，葡萄糖10～20 g，味精20～30 g，硫酸铵10～15 g，磷酸二氢钾2～3 g ，七水合硫酸镁0.4～0.7 g ，一水合硫酸锰0.05～0.07 g ，去离子水定容到1000 mL ，pH 6.5，121℃灭菌20min。
8.根据权利要求6所述的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于：所述的米粉为籼米粉、粳米粉、糯米粉、小米粉中的一种或几种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20131225 |