ES2291312T3 - Conversion trofica de algas fototroficas estrictas mediante ingenieria metabolica. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para aumentar heterotróficamente el número de células de algas que comprende el cultivo de algas en un fermentador a la luz que es insuficiente para soportar a largo plazo el crecimiento de algas fototróficas estrictas y en presencia de una fuente de carbono catalizable por un monosacárido o un disacárido, siendo dichas algas de una cepa que es fototrófica estricta, en el que las algas expresan el ácido nucleico híbrido que codifica una proteína transportadora de hexosa a un mamífero que transporta la fuente de carbono catalizable a las células de las algas.

Description

Conversión trófica de algas fototróficas estrictas mediante ingeniería metabólica.

Antecedentes Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para la transformación genética de algas, y en particular a la conversión de organismos fototróficos estrictos en organismos recombinantes capaces de crecimiento heterotrófico.

Exposición de la técnica relacionada

Las algas fotosintéticas son los productores primarios en medios acuáticos, totalizando una proporción significativa de la producción de O_{2} en todo el mundo y de la fijación de CO_{2} en medios acuáticos. Tréquer, P., Nelson, D. M., Van Bennekom, A. J., DeMaster, D. J., Leynaert, A. y Quéniquer, B. 1995. "The silica balance in the world ocean: a reestimate", Science 269:375-79. Las algas son también necesarias para la acuicultura y se utilizan para producir muchos productos valiosos. Por ejemplo, las algas se utilizan para la producción de pigmentos (p. ej., \beta-caroteno, ficobiliproteínas), aceites de valor nutritivo (p. ej., ácido docosahexanoico) y productos bioquímicos marcados con isótopos estables (p. ej., ^{13}C-glucosa). Las algas se utilizan también como alimento para consumo humano y animal.

En general, las algas requieren la luz para realizar la fotosíntesis destinada a la producción de la energía química requerida por el metabolismo celular. Muchas son fotótrofas estrictas, lo que significa que tienen una necesidad absoluta de la luz para sobrevivir. Droop MR "Heterotrophy of Carbon" en Algal Physiology and Biochemistry, Botanical Monographs, 10: 530-559, ed. Stewart WDP, Universidad de California Press, Berkeley (1974). Dichas algas son incapaces de utilizar compuestos orgánicos exógenos (tales como glucosa, acetato, etc.) como fuente de energía o de carbono. Algunas algas son capaces de utilizar el carbono interno o externo fijado. Un pequeño número de algas son heterotróficas estrictas: son incapaces de fotosíntesis, basándose enteramente en los compuestos orgánicos exógenos como fuentes de energía y de carbono.

El cultivo a gran escala de las algas fotosintéticas requiere un medio relativamente controlado con una gran entrada de energía lumínica. Los requisitos de luz y el gran coeficiente de extinción de la clorofila en estos organismos ha necesitado el diseño y desarrollo de nuevos sistemas para el cultivo y crecimiento a gran escala. Chaumont, D. 1993. "Biotechnology of algal biomass production: a review of systems for outdoor mass culture". J. Appl. Phycol. 5:593-604. Una limitación frecuente de todos estos sistemas es la necesidad de suministrar luz al cultivo, haciéndolo ventajoso para maximizar la relación superficie a volumen del cultivo. A medida que las densidades celulares aumentan, el autosombreado se convierte en un factor limitante de la productividad, dando como resultado concentraciones de biomasa relativamente bajas.

Las técnicas de producción más comerciales utilizan grandes balsas abiertas, que presentan la ventaja de la luz solar natural, que es gratuita. Estos sistemas tienen una relación de superficie a volumen relativamente baja con las correspondientes densidades celulares bajas. Es muy difícil también excluir los organismos contaminantes en una balsa abierta. Esta dificultad restringe la utilidad de las balsas abiertas a un número limitado de algas que proliferan en condiciones no adecuadas para el desarrollo de la mayoría de los organismos. Por ejemplo, Dunaliella salina puede desarrollarse a muy altas salinidades. Apt KE et al., "Commercial Developments in Microalgal Biotechnology", J. Phycol. 35:215-226 (1999).

Los fotobiorreactores cerrados, tales como los fotobiorreactores tubulares, son una tecnología de cultivo cerrado alternativa a los abiertos que utilizan tubos transparentes que encierran el cultivo que minimiza la contaminación. Proporcionan una relación superficie a volumen muy grande, de modo que las densidades celulares son con frecuencia mucho mayores que las que pueden conseguirse en una balsa. Sin embargo, incluso en los fotobiorreactores tecnológicamente avanzados, las densidades celulares de algas máximas alcanzadas son relativamente bajas. Tanto en las balsas como en los biorreactores, las bajas densidades necesitan grandes volúmenes de cultivo, lo que puede producir un coste sustancial para cosechar las algas. Apt KE et al. (1999). Además, los sistemas de cultivo al exterior están sometidos a grandes variaciones de la intensidad de la luz y de la temperatura producidas por la periodicidad diurna y estacional que hace problemático el mantenimiento de la productividad y de la reproducibilidad máximas.

Se han construido numerosos diseños para el interior, cultivos cerrados de algas que utilizan luces eléctricas para iluminación. Ratchford y Fallowfield (1992) "Performance of a flan plate, air lift reactor for the growth of high biomass algal cultures", J. Appl. Phycol. 4:1-9; Wohlgeschaffen, GD et al. (1992) "Vat incubator with immersion core illumination - a new, inexpensive set up for mass phytoplankton culture", J. Appl. Phycol. 4:25-9; Iqbal, M. et al. (1993) "A flat sided photobioreactor for culturing microalgae", Aquacult. Eng. 12:183-90; Lee y Palsson (1994) "High-density algal photobioreactors; using light-emitting diodes", Biotechnol. Bioeng. 44:1161-7. Estos sistemas son costosos de construir y hacer funcionar y están sometidos a las mismas limitaciones de superficie a volumen y a los problemas asociados a rendimientos bajos de densidad como las balsas en el exterior. Apt KE et al. (1999).

Los costes de producción de las diatomeas de crecimiento fototrófico y de otras microalgas son muy costosos, lo que proviene de las bajas densidades y altos costes de cosecha. No obstante para un pequeño número de productos de algas específicos esta tecnología ha demostrado estar muy consolidada, produciendo muchos miles de toneladas al año. Lee, Y-K (1997) "Commercial production of microalgae in the Asia-Pacific Tim", J. Appl. Phycol. 9:403-11; Apt KE et al. (1999). Los principales productores de microalgas fotosintéticas incluyen la biomasa CK o los extractos celulares de Chlorella, Dunaliella y Spirulina. Éstas se producen principalmente en grandes balsas abiertas.

El crecimiento de las algas de manera heterotrófica en fermentadores convencionales es una alternativa potencial a las balsas o a los fotobiorreactores y un método potencial para reducir sustancialmente el coste del crecimiento de algas. Day et al. (1991) "Development of an industrial scale process for the heterotrophic production of a micro-algal mollusk feed", Bioresource Technol. 38:245-9; Orus et al. (1991) "Suitability of Chlorella vulgaris UAM 101 for heterotrophic biomass production", Bioresour. Technol. 38:179-184; Barclay et al. (1994) "Heterotrophic production of long-chain omega-3 fatty acids utilizing algae and algae-like microorganisms", J. Appl. Phycol. 6:123-9; Gladue y Maxey (1994) "Microalgal feeds for aquaculture", J. Appl. Phycol. 6:131-141; Chen F., "High cell density culture of microalgae in heterotrophic growth", Trends Biotechnol. 14:421-6 (1996); Apt, KE et al. (1999). El principio básico del crecimiento en el fermentador consiste en proporcionar condiciones de crecimiento óptimas muy controladas para maximizar la productividad.

Las condiciones del cultivo en el fermentador típicas pueden resumirse de la manera siguiente. El intervalo de recipientes de cultivo en volumen está comprendido entre 1 y 500.000 litros y se ponen en funcionamiento en condiciones estériles. Un eje motorizado con una serie de agitadores proporciona el mezclado. Se bombea aire esterilizado en el sistema a alta presión y caudales para asegurar el intercambio de gases apropiado, y se controlan continuamente las concentraciones de O_{2} y CO_{2} disueltos y se ajustan. Serpentines de calentamiento y/o enfriamiento regulan la temperatura y la adición automática de ácido y/o base mantiene el pH. El medio de cultivo para el crecimiento fermentativo de algas es similar al utilizado para el crecimiento fototrófico, con la excepción de que la glucosa o un carbohidrato similar proporciona tanto el carbono fijado como una fuente de energía en el crecimiento fermentativo. Otras concentraciones de nutriente (es decir, de nitrógeno y fósforo) se controlan y se añaden también continuamente. La densidad del cultivo puede aumentarse más utilizando técnicas tales como el cultivo quimioestático, el cultivo alimentado en discontinuo o el cultivo en biorreactor de membrana. La información más detallada con respecto al crecimiento de microalgas en fermentadores puede encontrarse en los artículos mencionados en la presente memoria, que se incorporan a ésta como referencia, y en Apt, KE et al. (1999). Véanse también la patente U.S. nº 5.244.921 concedida a Kyle et al.; patente U.S. nº 5.374.657 concedida a Kyle; la patente U.S. nº 5.550.156 concedida a Kyle; patente U.S. nº 5.567.732 concedida a Kyle; patente U.S. nº 5.492.938 concedida a Kyle et al.; patente U.S. nº 5.407.957 concedida a Kyle, et al.; patente U.S. nº 5.397.591 concedida a Kyle et al.; patente U.S. nº 5.130.242 concedida a Barclay; patente U.S. nº 5.658.767 concedida a Kyle; y patente U.S. nº 5.711.983 concedida a Kyle.

Como resultado del alto nivel del control del proceso posible con el crecimiento heterotrófico en los fermentadores, las condiciones de cultivo y los rendimientos de la biomasa son coherentes y reproducibles, con densidades celulares de algas heterotróficas descritas de 50 gramos de biomasa en seco por litro hasta como mucho 100 g de biomasa seca por litro. Gladue y Maxey (1994); Running et al. (1994) "Heterotrophic production of ascorbic acid by microalgae", J. Appl. Phycol. 6:99-104. Estas concentraciones de biomasa son por lo menos 10 veces mayores que los conseguidos por sistemas de cultivo basados en fotosíntesis. Radmer R. J. y Parker B. C. (1994) "Commercial application of algae: opportunities and constraints", J. Appl. Phycol. 6:93-98. Las concentraciones elevadas de biomasa también disminuyen en gran medida el volumen del agua que debe procesarse durante la recogida por gramo de rendimiento de biomasa. Debido a que los cultivos pueden desarrollarse de forma rutinaria en los fermentadores con volúmenes mayores de 100.000 l, varios miles de kilos de biomasa seca pueden producirse por serie. La eficacia de los cultivos a gran escala y la producción de concentraciones de biomasa elevada pueden hacer el coste del crecimiento fermentativa un orden de magnitud menos costoso que en los fotobiorreactores. (Radmer y Parker 1994; Apt KE et al. (1999).

La capacidad para proporcionar control completo sobre el cultivo es también crítica para mantener las Good Manufacturing Practices (GMP) estándar de la industria de alimentación, como es denominada por la Food and Drug Administration. El mantenimiento de las GMP se requiere para la producción de materiales de calidad alimentaria o farmacéutica elevada. Apt KE et al. (1999).

La capacidad para desarrollar microalgas de manera heterotrófica utilizando técnicas de fermentación microbiológica puede disminuir drásticamente los costes asociados a su producción y proporcionar el elevado grado de control de calidad necesario para un producto de calidad alimentaria. El coste estimado de producción de biomasa de algas heterotróficas puede ser inferior a 5\textdollar por kilogramo. Gladue y Maxey (1994). En comparación, el coste teórico de producir algas fototróficamente en biorreactores se estima que es del orden de magnitud mayor, y los costes de producción existentes para las algas fototróficas en acuicultura son con frecuencia dos órdenes de magnitud mayores. Wilkinson, L. (1998) "Criteria for the design and evaluation of photobioreactors; for the production of microalgae", World Aquaculture Society Annual Meeting, Febrero, Las Vegas, NV, pág. 584; Benemann, J. R. (1992) "Microalgae aquaculture feeds", J. Appl. Phycol. 4:232-45. Solamente un pequeño número de algas se producen actualmente utilizando tecnología de fermentación; éstas incluyen Chlorella, Nitzschia alba, Tetraselmis y Crypthecodinium. Estas algas con capaces de utilizar compuestos orgánicos externos como fuentes de energía y de carbono.

Dados los productos valiosos producidos por las algas (incluyendo la propia biomasa de las algas y las dificultadas de cultivar algas en sistemas basados en la fotosíntesis, es muy deseable cultivar microalgas en las condiciones heterotróficas en los fermentadores. Sin embargo, una limitación significativa en la utilización de la tecnología de fermentación para la producción de productos de algas es que la mayoría de las algas son fotótrofos estrictos y por lo tanto son incapaces de desarrollarse utilizando esta tecnología. Por consiguiente hay necesidad de desarrollar métodos de cultivo de una variedad mayor de algas en condiciones heterotróficas en los fermentadores.

Sumario de la invención

Según la presente invención se proporciona un procedimiento para aumentar de manera heterótrofa el número de células de las algas del cultivo en un fermentador en el que es insuficiente para soportar el crecimiento a largo plazo de las algas fototróficas estrictas y en presencia de un monosacárido o una fuente de carbono catabolizable de disacáridos, siendo dichas algas de una cepa que es fotótrofa estricta, en el que las algas expresan ácido nucleico híbrido que codifica una proteína transportadora con hexosa de mamífero que transporta la fuente de carbono catabolizable en las células de algas.

Los solicitantes describen células que se transforman con genes que codifican proteínas que potencian o permiten el crecimiento heterotrófico. En un modo de esto, la conversión heterotrófica se realiza transformando las células solamente con un gen. En otro modo, la conversión heterotrófica se realiza transformando las células con genes múltiples. Las células pueden transformarse con un gen o genes que codifican proteínas que afectan la absorción y el catabolismo de azúcares y/o otras fuentes exógenas de carbono fijado. Como alternativa, las células pueden transformarse con un gen o genes que codifican transportadores capaces de absorber una fuente de carbono fijo exógeno (es decir, un compuesto catabolizable). O las células pueden transformarse con un gen o genes que codifican transportadores mono o disacáridos, especialmente transportadores de hexosa.

Los solicitantes describen células de algas, preferentemente células de microalgas, que se desarrollan en ausencia sustancial de luz, aun cuando las células proceden de cepas de algas que son fotótrofas estrictas, debido a que las células comprenden ADN híbrido que codifica una proteína que transportará una fuente de carbono catabolizable en las células de las algas. Los solicitantes describen células de algas que comprenden el ADN híbrido que codifica una proteína que transportará una fuente de carbono catabolizable en la célula del alga, donde la proteína se expresa en una cantidad suficiente para transportar al interior de la célula la fuente de carbono catabolizable adecuada para soportar el crecimiento fototrófico de la célula. La fuente de carbono catabolizable puede ser un monosacárido o un oligosacárido; los autores también describen la proteína que es un transportador de disacáridos o un transportador de hexosa.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para la conversión heterotrófica de células de un organismo fototrófico estricto seleccionadas de entre el grupo constituido por organismos marinos, algas procarióticas y algas eucarióticas. El procedimiento comprende las etapas que consisten en (1) transformar las células con ADN que comprende un gen que codifica un transportador de fuente de carbono catabolizable a través de la membrana celular según la presente invención y (2) seleccionar las células capaces de desarrollarse en la fuente de carbono catabolizable en la oscuridad. En un modo de la presente forma de realización, el organismo fototrófico estricto es un alga marina. En un modo preferido, el gen que codifica un transportador de una fuente de carbono catabolizable se acopla con un gen seleccionable, y tras la transformación, las células transformadas se desarrollan en el medio selectivo para el gen seleccionable antes de seleccionar las células capaces de cultivarse en la fuente de carbono catabolizable en la oscuridad. En un modo particularmente preferido, el gen seleccionable proporciona resistencia al antibiótico en las células transformadas, y el medio selectivo contiene el antibiótico.

Los solicitantes describen un procedimiento para seleccionar células transformadas de una población celular expuesta a vectores de transformación que contienen un gen de interés. El método comprende transfectar las células de una población celular que es incapaz de crecer en la oscuridad en una fuente de carbono catabolizable, en la que el vector de transformación comprende un gen de interés junto con un gen cuya expresión permite el crecimiento de células en la fuente de carbono catabolizable en la oscuridad. Tras la transfección, se realiza la selección de las células capaces de desarrollarse en la oscuridad, y a continuación las células seleccionadas se continúan ensayando para determinar si contienen también el gen de interés.

En otra forma de realización según la presente invención, las células autótrofas se transforman con un gen de interés junto con un gen o genes que codifica la(s) proteína(s) que permite o aumenta el crecimiento heterotrófico y la transformación para establecer o aumentar el crecimiento heterotrófico se utiliza como marcador para la transformación con el gen de interés. Incluso en otra forma de realización de la presente invención, las células heterotróficas se mutagenizan para hacerlas incapaces de desarrollarse en una fuente de carbono dada, a continuación se transforman con un gen de interés junto con un gen o genes cuyo reestablecimiento de la capacidad de desarrollarse en esta fuente de carbono se utiliza como mecanismo para la selección, y el reestablecimiento del crecimiento en la fuente de carbono se utiliza como marcador para la transformación con el gen de interés.

Una limitación significativa de la utilización de la tecnología de fermentación para la producción de productos de algas es que la mayoría de las algas son fotótrofas estrictas y por consiguiente son incapaces de desarrollarse utilizando esta tecnología. Se ha descubierto que los organismos fototróficos estrictos no pueden utilizar una fuente de carbono fijo porque no poseen el sistema para importar el carbono fijado y/o no pueden convertirlo en una forma metabólicamente útil. La presente invención permite la evasión de esta limitación convirtiendo los fotótrofos en células que son capaces de desarrollarse en compuestos orgánicos externos. Con el fin de desarrollarse en la oscuridad en una sustancia orgánica como fuente de carbono y energía, una célula debe absorber eficazmente la(s) sustancia(s) requerida(s) del medio circundante y a continuación asimilarlo en todos los componentes esenciales para el crecimiento mediante reacciones metabólicas independientes de la luz.

Breve descripción de las Figuras

Figura 1. Cartografía del vector pPha-T1 de transformación de Phaeodactylum con las enzimas de restricción indicadas. La secuencia de este vector presenta el nº de registro AF219942 en el Genbank. El activador fcpA ha sido colocado enfrente del punto de clonación múltiple (MCS). El activador fcpB fue colocado enfrente del gen sh ble. El montaje contiene también el gen con resistencia a la ampicilina (Amp) y el origen de replicación de E. coli. La zona del terminador fcpA que sigue en las zonas tanto de MCS como de sh ble, no se muestra.

Figura 2. Análisis de transferencia Southern de P. tricornutum no transformado: las bandas presentan los resultados del tipo natural y de dos estirpes celulares transformadas con los genes que codifican los transformadores de glucosa. Se digirió ADN completo con endonucleasa de restricción. A) Hibridación de ADN de la estirpe celular Hup 2 con una sonda de ADN para la zona de codificación hup. B) Hibridación de ADN de la estirpe celular Glut 13 con la sonda de ADN para la zona de codificación glut.

Figura 3. Análisis de transferencia Northern de P. tricornutum no transformada: las bandas presentan los resultados para el tipo natural y dos estirpes celulares transformadas con los genes que codifican los transportadores de la glucosa. A) Hibridación del ARN completo de la estirpe celular Glut 13 con una sonda de ADN para la zona de codificación glut. B) Hibridación del ARN completo de la estirpe celular Hup 2 con una sonda de ADN para la zona de codificación hup.

Figura 4. Reactividad de anticuerpos específicos para GlutI o GFP para proteínas membranarias extraídas de las estirpes celulares no transformadas y transformadas. Las proteínas fueron resueltas por SDS-PAGE siguiendo la solubilización de las membranas completas de Wt, células no transformadas; GI-40, el transformante Glut1GFP-40; B, eritrocitos humanos; GlutI-17, el transformante Glut 1-17. Los anticuerpos utilizados eran específicos para GFP (panel izquierdo) o Glut1 (panel derecho).

Figura 5. Absorción de glucosa por las estirpes celulares transformadas y no transformadas. Se analizaron tanto Glut1GFP-40 y Glut1-17 para la absorción de glucosa utilizando el procedimiento descrito en la presente memoria.

Figura 6. Localización de GlutI en P. tricornutum transformada con el gen híbrido que codifica la proteína de fusión GlutI-GFP. El panel superior presenta una imagen a la luz transmitida de las células P. tricornutum no transformadas (A), fluorescencia de las células en el canal rojo (B), que representa la fluorescencia de la clorofila, y la fluorescencia de las células en el canal verde (C). El panel inferior presenta la fluorescencia en el canal verde de las células que han sido transformadas con el gen GFP dirigido por un activador Fep (D), y de las células que han sido transformadas con el gen híbrido Glut1-GFP (E, cepa denominada Glut1-40). Todas la imágenes de fluorescencia son secciones ópticas con focales individuales. Escala en bares = 10 micras.

Figura 7. Crecimiento de las células naturales y Glut1-17 en diferentes condiciones. El panel de la izquierda presenta el crecimiento de las células naturales (Wt) y el panel derecho presenta el crecimiento de Glut1-17 en varias condiciones. Se cultivaron las células a la luz sin enriquecimiento con glucosa (círculos negros), a la oscuridad con glucosa enriquecida (triángulos negros) o a la luz con enriquecimiento de glucosa (círculos blancos).

Descripción detallada de las formas de realización específicas

Existen numerosas utilizaciones comerciales valiosas para las microalgas. Sin embargo, la producción a escala comercial de algas fotosintéticas implica con mayor frecuencia la utilización de grandes balsas abiertas, lo que presenta numerosos inconvenientes. Los contaminantes invaden frecuentemente los cultivos de la balsa ya que permanecen desprotegidos del medio ambiente, y las variaciones estacionales y las fluctuaciones en la temperatura y las condiciones de la luz dificultan la predicción de la velocidad de crecimiento y de las densidades de cultivo finales. Además, el autosombreado entre las algas puede limitar gravemente los rendimientos de biomasa. Estos factores han limitado el cultivo a gran escala de las altas hasta un subconjunto pequeño de organismos que incluyen Spirulina y Dunaliella (Apt, et al. (1999) J. Phycol., 35:215).

Una estrategia que presenta potencial para reducir drásticamente el coste de producir biomasa de microalgas para utilizaciones comerciales consiste en modificar genéticamente los organismos para multiplicarse sin luz en fermentadores microbianos convencionales. Las consideraciones expuestas anteriormente sugieren que sería ventajoso modificar genéticamente el metabolismo de las microalgas para grandes velocidades de crecimiento heterotrófico. Los organismos más fotosintéticos (plantas, algas, cianobacterias) son capaces de la gluconeogénesis para el almacenamiento de carbono como azúcares. Cuando el suministro de carbono está limitado, estas reservas se metabolizan por la energía utilizando mecanismos glucolíticos conocidos. Los presentes inventores comprobaron la posibilidad de evitar la fotosíntesis si una célula importase directamente carbón fijado para la glucólisis, como con cualquier heterótrofo natural.

La mayoría de las diatomeas no tiene capacidad para crecer en ausencia de luz en glucosa exógena (Droop, 1974). Un "bloque metabólico" que impide el crecimiento heterotrófico de diatomeas se supuso que procedía de la incapacidad de las células para absorber o metabolizar más los azúcares. Los presentes inventores han demostrado en la presente memoria que la conversión trófica de la diatomea fotoautótrofa, P. tricornutum, puede conseguirse transformando las algas con un único gen que codifica un transportador de glucosa. Las cepas transformadas con el gen Hup1 de C. kessleri o el gen Glut1 de seres humanos son capaces de absorberglucosa y crecer en la oscuridad con glucosa como única fuente de carbono reducido. Estos resultados demuestran claramente una conversión trófica modificada genéticamente de un organismo fotoautótrofo estricto en un organismo heterótrofo. Aunque Hup1 también ha sido expresado en el alga verde Volvox (Hallman, et al., 1996) y la diatomea Cylindrotheca (Fischer, et al., 1999), ninguna de estas cepas transformadas fue capaz de multiplicarse de manera heterótrofa.

La conversión de un alga fototrófica en una capaz de crecer en, p. ej., glucosa como única fuente de carbono requiere la introducción de genes que codifican las funciones requeridas. Con objeto de que un fotótrofo estricto se convierta en heterótrofo, el fotótrofo debe adquirir competencia para crecer cuando se suministra con una fuente exógena de carbono fijado. Por lo tanto, la conversión de un alga fototrófica en una capaz de crecer en la oscuridad en una sustancia orgánica externa, tal como la glucosa, como única fuente de carbono y energía requiere la introducción de un gen o genes que codifican las funciones requeridas (p. ej., transportadores, hexocinasa, etc.).

Los intentos anteriores de convertir las algas fototróficas estrictas en algas heterotróficas han fracasado. Aunque las algas transformadas para expresar los transportadores de azúcar se ha demostrado que son capaces de absorber glucosa, ninguna de estas algas ha sido capaz de crecer en la oscuridad.

La presente invención proporciona un procedimiento para convertir células fototróficas estrictas en células heterotróficas, que son capaces de crecer en la oscuridad. No existe ningún precedente obvio de este tipo de conversión, por eso ha sido difícil predecir qué tipos de complicaciones se encontrarán. Según la presente invención, en el nivel más sencillo, solamente un transportador de hexosa de mamífero se requiere para la conversión. El descubrimiento por los presentes inventores de que la conversión heterotrófica puede realizarse mediante la inserción de un solo gen (p. ej., un gen que codifica un transportador capaz de absorber una fuente de carbono fijado exógeno, tal como un gen que codifica a un transportador de hexosa) es sorprendente, considerando la complejidad del metabolismo heterótrofo y de los fracasos anteriores en la técnica.

Desde luego, debido a que el crecimiento heterotrófico es un proceso complejo, el crecimiento heterotrófico puede aumentarse mediante la introducción de múltiples genes que codifican proteínas que aumentan o permiten la absorción y/o catabolismo de los azúcares y/o de otras fuentes exógenas de carbono fijado. En la presente invención, las algas fototróficas se transforman con uno o más genes que afectan a la absorción y al catabolismo de los azúcares y/o la fuente exógena del carbono fijado. Las células se transforman con estos genes utilizando un vector de transformación adecuado. Preferentemente, el/los gen(es) insertado(s) en el control de un activador producirán la expresión del o de los genes en las células transformadas.

Definiciones

Al describir la presente invención, se utiliza la siguiente terminología según las definiciones descritas a continuación.

"Conversión heterotrófica" es la conversión de un organismo fototrófico, autotrófico o auxotrófico que es incapaz de crecer, o que crece poco en una fuente de carbono orgánico y energía dada (p. ej., glucosa), en un organismo capaz de crecimiento heterotrófico, o crecimiento heterotrófico mejorado, en esta misma fuente de carbono. Para las células que se convierten de manera heterotrófica, es necesario que sean capaces de crecer en la oscuridad. No se requiere que las células permanezcan en oscuridad constante o completa.

"Catabolismo" es la descomposición o degradación metabólica de una molécula compleja (es decir, glucosa, u otra fuente de carbono) en productos más sencillos, principalmente para la producción de energía. Una "fuente de carbono catabolizable" es una molécula compleja, típicamente un mono u oligosacárido, un aminoácido u otra molécula bioquímica, que puede experimentar catabolismo en una célula biológica.

"Crecimiento mejorado" se pretende que comprenda cualquier mejora. Como ejemplos no limitativos, la mejora podría comprender el crecimiento más rápido, la producción más rápida de un producto deseado, o el crecimiento que puede estar mantenido durante periodos más prolongados de tiempo. Asimismo, "crecimiento escaso" pretende comprender cualquier característica relacionada con el crecimiento que se busque para ser mejorada. Tanto "crecimiento escaso" como "crecimiento mejorado" son expresiones relativas y niveles cuantitativos que significan poco o mejorado para una característica u organismo puede que no sea poco o mejorado para otra característica u organismo.

Una "proteína que puede permitir o aumentar el crecimiento heterotrófico" significa que interpretado ampliamente comprende cualquier proteína que (1) hace posible o ayuda a hacer posible que una célula que era incapaz de crecer en una fuente de carbono dada crezca en esta fuente de carbono, (2) hace posible o ayuda a hacer posible que una célula que crecía poco en una fuente de carbono dada presente crecimiento mejorado en esta fuente de carbono, o (3) hace posible o ayuda a hacer posible que una célula que inicialmente era capaz de crecer en una fuente de carbono dada presente un crecimiento mejorado en esta fuente de carbono. Dichas proteínas incluyen, pero no se limitan a, transportadores de compuestos de carbono a través de la membrana celular, proteínas que metabolizan compuestos de carbono y proteínas que aumentan y/o activan dichos transportadores o proteínas catabolizantes.

Un "fotótrofo" es un organismo capaz de convertir la energía de la luz en energía química.

Un "autótrofo" es un organismo celular que utiliza material inorgánico como fuente de nutrientes y CO_{2} como su fuente de carbono.

Un "fotótrofo estricto" es un organismo que requiere energía de la luz para la producción de energía química y es incapaz de utilizar de forma exógena las moléculas orgánicas suministradas preformadas como su única fuente de carbono o energía.

Un "heterótrofo" es un organismo que puede utilizar compuestos orgánicos preformados como fuente de carbono y energía en ausencia de luz. Los heterótrofos pueden, por consiguiente, crecer independientemente de la iluminación; por ejemplo, heterótrofos pueden crecer en la oscuridad, en la luz y en la luz parcial. Asimismo, "crecimiento heterotrófico" se refiere al crecimiento que no requiere la luz para que se produzca y puede ocurrir, por consiguiente, independientemente del nivel o falta de iluminación.

"Auxótrofo" son organismos que requieren una determinada sustancia para crecer. Por ejemplo, un auxótrofo dado puede ser incapaz de producir aminoácido específico y por consiguiente requerir el aminoácido para crecer. Muchos auxótrofos son fotótrofos. Según la presente invención, la conversión heterotrófica incluye la conversión de un organismo que es incapaz de crecer (o que crece poco) o una fuente de carbono externa tal como la glucosa para un organismo capaz de crecer (o que crece bien) en esta fuente de carbono externa.

"Fotótrofo", "autótrofo" y "auxótrofo" pueden utilizarse todos indistintamente para indicar un organismo que no crece, o que crece poco, en la fuente de carbono externa, p. ej., glucosa, en la que se busca que crezca. Debido a que este organismo crece poco o no crece en absoluto en las fuentes de carbono externas, pueden también referirse a un foto-, auto- o auxótrofos estrictos en el contexto de la presente invención.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "crecimiento (o cultivo) en la oscuridad sustancial (o en ausencia sustancial de luz)", "crecido (o cultivado) en la oscuridad sustancial (o en ausencia sustancial de luz)", y similares frases indican que el crecimiento o cultivo se realiza en condiciones luminosas bajo las que las células fototróficas serían incapaces de crecer o crecerían muy poco. Asimismo, "oscuridad sustancial" y "ausencia sustancial de luz" son sinónimos e indican un nivel de iluminación que puede oscilar entre la oscuridad total y el nivel al que las células fototróficas no pueden crecer o crecen muy poco. Expresado de una manera alternativa, el nivel de iluminación indicado por las frases "en la oscuridad", "ausencia sustancial de luz" y similares frases es un nivel de iluminación que sería limitativo del crecimiento (desde el punto de vista de, como ejemplos no limitativos, duplicación del tiempo, densidad del cultivo máxima o producción de producto) para las células fototróficas. Por consiguiente, el crecimiento o cultivo en la oscuridad comprende, como ejemplos no limitativos, el crecimiento en fermentadores que tienen ventanas o aperturas para observar las células, alimentación de las células y similares, con la condición de que la luz que entra al fermentador sea suficiente para soportar el crecimiento a largo plazo de fotótrofos estrictos en el cultivo.

Un "ADN híbrido" es un segmento identificable de ADN con una molécula de ADN mayor que no se encuentra asociada con la molécula mayor en la naturaleza. Por lo tanto, cuando el ADN híbrido codifica un segmento de proteína, la secuencia que codifica el segmento estará flanqueada por el ADN que no flanquea la secuencia de codificación en cualquier genoma natural. Las variaciones alélicas o los episodios de las mutaciones naturales no dan lugar a un ADN híbrido como se define en la presente memoria.

Una "secuencia de codificación" es una secuencia en el marco de codones que (a la vista del código genético) corresponde o codifica a una proteína o secuencia peptídica. Dos secuencias de codificación se corresponden entre sí si las secuencias de sus secuencias complementarias codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Una secuencia de codificación asociada a las secuencias reguladoras apropiadas puede transcribirse y traducirse en un polipéptido in vivo. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción normalmente estarán localizadas en 3' con respecto a la secuencia de codificación.

Una "secuencia activadora" es una zona reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo. Una secuencia de codificación está "bajo control" de la secuencia activadora cuando la ARN polimerasa que se une a la secuencia activadora transcriba la secuencia de codificación en el ARNm, y a continuación a su vez se traslada a la proteína codificada por la secuencia de codificación. Con objeto de definir la presente invención, la secuencia activadora se une en su terminal 3' mediante el codón de iniciación de la traducción de una secuencia de codificación y se extiende corriente arriba (dirección 5') para que incluya por lo menos el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. En la secuencia activadora se encontrará una secuencia de iniciación de la transcripción (convenientemente definida por la cartografía con la nucleasa S1), así como los dominios de la unión a la proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los activadores normalmente contienen secuencias de consenso adicionales (elementos activadores) para la iniciación más eficaz y la transcripción de los genes corriente abajo).

Una "fusión genética" según la presente invención es un ADN híbrido que contiene un activador y una secuencia de codificación que no están asociados en la naturaleza.

Un "replicón" es cualquier elemento genético (p. ej., plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación del ADN in vivo; es decir, capaz de replicación bajo su propio control.

Se utilizan vectores para introducir una sustancia extraña, tal como ADN, ARN o proteína, en un organismo. Un "vector de ADN" es un replicón, tal como plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN con el fin de que lleve a cabo la replicación del segmento unido.

Una célula ha sido "transformada" por el ADN exógeno cuando dicho ADN exógeno ha sido introducido dentro de la pared celular. El ADN exógeno puede o no estar integrado (unido por enlace covalente) al ADN cromosómico construyendo el genoma de la célula. Por ejemplo, el ADN exógeno puede mantenerse en un elemento extracromosómico (o replicón) tal como un plásmido. Una célula transformada de forma estable es en la que el ADN exógeno ha llegado a estar integrado en un cromosoma de modo que es heredado por las células hijas a través de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula a crear estirpes celulares o clones compuestos enteramente por una población de células hijas que contienen el ADN exógeno.

"Sal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un compuesto iónico inorgánico que se encuentra habitualmente en el agua del mar o una mezcla de dichos compuestos. La concentración de sal se expresa en la presente memoria como la cantidad de dichos compuestos que proporcionan el equivalente iónico hasta un peso dado de cloruro sódico. La concentración de sal del agua del mar es aproximadamente de 32 a 33 g/l.

Las algas que son fotótrofas estrictas (tanto las macroalgas como las microalgas) pueden convertirse en heterótrofas por el procedimiento de la presente invención. Muchas algas son fotótrofos estrictos, que son incapaces de desarrollarse en la glucosa, y cualquiera de estos organismos son dianas potenciales para la conversión trófica. La lista de fotótrofos puede encontrarse en un estudio de Droop (Droop M. R. "Heterotrophy of Carbon". En Algal Physiology and Biochemistry, Botanical Monographs, 10: 530-559, ed. Stewart WDP, Universidad de California Press, Berkeley (1974)); y una lista representativa, no exclusiva de los géneros de algas fototróficas con valor comercial potencial o conocido se proporciona a continuación (Tabla A), agrupados en el nivel phylum. El "nombre vulgar" está entre paréntesis.

TABLA A Lista a título de ejemplo de algas fototróficas

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Cianofitas (algas verde-azuladas) - Spirulina, Anabaena.

Clorofíceas (algas verdes) - Dunaliella, Chlamydomonas, Heamotococcus.

Rodofíceas (algas rojas) - Porphyridium, Porphyra, Euchema, Graciliaria.

Feofíceas (algas marrones) - Macrocystis, Laminaria, Undaria, Fucus.

Bacilariofíceas (diatomeas) - Nitzschia, Navicula, Thalassiosira, Phaeodactylum.

(Algunos miembros de estos géneros son capaces de crecimiento heterotrófico en glucosa, pero no otros).

Dinofíceas (dinoflagelados) - Gonyaulax.

Crisofíceas (algas doradas) - Irsochrysis, Nannochloropsis

Criptofila - Crypromonas.

Euglenofíceas - Euglena.

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Phaeodactylum tricornutum ha sido uno de los sistemas de modelo utilizados más ampliamente para estudiar las diatomeas, particularmente en las áreas de la ecología, fisiología y bioquímica. Véase, Ianora A., Poulet SA, Miralto (1995), "A comparative study on the inhibitory effect of diatoms on the reproductive biology of the copepod Temora stylifera", Mar. Biol. 121:533-539; Kuma K., Matsunga K. (1995); "Availability of colloidal ferric oxides to coastal marine phytoplankton", Marine Biol. 122:1-11; Alwyn T., Rees V. (1995), "On ammonia futile cycling in a marine unicellular alga", Biochem. Biophys. Acta. 1228:254-260; La Roche I et al. (1995), "Flavodoxin expression as an indicator of iron limitation in marine diatoms", J. Phycol. 31:520-530; Rees TAV et al. (1995), "In situ glutamine synthetase activity in a marine unicellular alga. Development of a sensitive colorimetric assay and the effects of nitrogen status on enzyme activity". Plant Physiol. 109:1405-1410; Khalyfa A. et al. (1995) "Purification and characterization of chlorophyllase from the alga Phaeodacrylum tricornitum by preparative native electrophoresis", Appl. Biochem. Biotech. 53:11-27; Zhukova NN, Alzdaischer NA (1995), "Fatty acid composition of 15 species of marine microalgae", Phytochemistry 39:351-356. Recientemente se ha empleado también un modelo molecular para estudiar alguno de los procesos biológicos exclusivos encontrados en las diatomeas, que implica particularmente el direccionamiento de proteínas plástido y la formación de la pared celular. Apt KE, Clendennen SK, Powers DA, Grossman AR (1995) "The gene family encoding the fucoxanthin chlorophyll proteins from the brown alga Macrocystis pyrifera", Mol. Gen. Genet. 246:455-64; Apt KE et al. (1994), "Characterization of genes encoding the light-harvesting proteins in diatoms: biogenesis of the fucoxanthin chlorophyll a/c protein complex", J. Appl. Phycol. 6:225-230, Bhaya D., Grossman AG (1993) "Characterization of gene clusters encoding the fucoxanthin chlorophyll protein of the diatom Phaeodactylum tricornutum", Nucleic Acids Research 21:4458-68).

La microalga Phaeodactylum tricornutum se ha descrito de forma repetida que es incapaz de utilizar glucosa externa, acetato, aminoácidos, etc., como única fuente de energía o de carbono. Cooksey KE "Acetate metabolism by whole cells of Phaeodactylum tricornutum", J. Phycol. 10:253-7 (1974); Droop 1974; Hellebust JA, Lewin J. "Heterotrophic Nutrition", en (Werner D. ed.) The Biology of Diatoms, Botanical Monographs 13:169-197, Universidad de California Press, (1977). Los presentes inventores han examinado de forma repetida esta microalga y no han observado ningún crecimiento detectable o absorción de nutrientes en la oscuridad en el medio que contiene glucosa. El reciente desarrollo de un sistema de transformación genética ha proporcionado nuevas oportunidades para estudiar los mecanismos moleculares para los procesos biológicos en los organismos tal como Phaeodactylum. (Documento WO 97/39106 y patente U.S. nº 6.027.900 de Allnutt et al., ambos titulados: "Methods and Tools for Transformation of Eukaryotic Algae". Como resultado, Phaeodactylum tricornutum se seleccionó como modelo para demostrar la capacidad para convertir un organismo fototrófico estricto mediante la utilización de la ingeniería genética.

Las células transformadas se producen introduciendo ADN exógeno en una población de células diana y seleccionando las células que han absorbido el ADN exógeno, normalmente midiendo la expresión de algún determinante presente en el ADN exógeno pero desapareciendo de las células no transformadas. Un marcador selectivo preferido para su utilización en algas es el sistema de selección de resistencia a la Zeocina (Invitrogen) descrito en el documento WO 97/39106. Véase también, la patente U.S. nº 6.027.900 de Allnutt et al. En resumen, la resistencia a la zeocina (y a los antibióticos relacionados) se ha descubierto que se mantiene en medio muy salino en una medida mucho mayor que la que se observa para otros genes con resistencia a antibióticos. Por lo tanto, los transformantes que contienen ADN exógeno con un determinante con resistencia a la zeocina crecerán en agua salada en presencia de concentraciones adecuadas de zeocina, mientras que las células no transformadas de los organismos marinos no.

Los procedimientos estándar para la construcción del ADN híbrido y su utilización en la transformación de las células y en la expresión de las proteínas en esta memoria son conocidos por el experto en la materia, y estos métodos han sido descritos en numerosos textos para la manipulación biológica molecular normal (Véase, p. ej., Packer y Glaser, 1988, "Cyanobacteria", Meth. Enzymol., Vol. 167; Weissbach y Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, Nueva York; Sambrook, J., Maniatis, T., y Fritsch, E. F. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.; y Clark MS, 1997, Plant Molecular Biology, Springer, Nueva York).

El ácido nucleico híbrido de la presente invención, p. ej., un montaje de ácido nucleico que comprende una secuencia de codificación que codifica una proteína que puede permitir o aumentar el crecimiento heterotrófico fusionado a un activador adecuado, puede estar introducido en las células de, p. ej., organismos marinos o algas eucarióticas solas o como parte de un vector de ADN. Los vectores adecuados para su utilización en organismos marinos o algas eucarióticas son conocidos en la técnica y algunos de dichos vectores pueden utilizarse. Incluso los vectores que no se replican en las algas pueden ser útiles, si se produce la recombinación entre el vector y el genoma.

Para resumir el procedimiento de construcción de un vector, las secuencias de ADN aguas arriba de un gen expresado bajo el control de un activador adecuado puede ser la restricción cartografiada y las áreas importantes para la expresión de la proteína caracterizada. La posición exacta del codón de iniciación del gen está determinada y, haciendo uso de esta información y de la cartografía de restricción, puede diseñarse un vector para la expresión de una proteína heteróloga eliminado, la zona responsable de la codificación de la proteína del gen pero dejando la zona corriente arriba hallada que contiene el material genético responsable del control de la expresión del gen. Una secuencia de multiclonación de oligonucleótidos sintéticos se inserta preferentemente en la posición en la que la secuencia de codificación de proteínas una vez estaba, de modo que cualquier gen (p. ej., una secuencia de codificación de proteína) pudo clonarse utilizando secuencias de endonucleasa de restricción en el oligonucleótido sintético. Un gen no relacionado (o secuencia de codificación) insertado en esta secuencia estaría unido a continuación bajo el control de un codón de iniciación existente y la zona reguladora corriente arriba que dirigirá la expresión de la proteína extraña (es decir, no asociada normalmente a las secuencias reguladoras del vector) codificada por este gen. Una vez el gen para la proteína extraña se coloca en el vector de clonación, puede introducirse en el organismo hospedador utilizando cualquiera de los diversos métodos, alguno de los cuales debe ser peculiar para el organismo hospedador.

Los métodos de administración de ADN que están dentro de la experiencia en la materia incluyen agitación con barbas de carburo de sílice, agitación con lentejas de vidrio, electroporación y bombardeo con partículas. Preferentemente, se utiliza la agitación con lentejas de vidrio. Más preferentemente, se utiliza el bombardeo con partículas. Estos procedimientos pueden utilizarse para introducir la fusión genética de la presente invención en las células de, p. ej., organismos marinos o algas eucarióticas solos o como parte de un vector de ADN.

Las variaciones de estos procedimientos están descritas ampliamente en las referencias de la bibliografía general citadas en la presente memoria. La manipulación de las condiciones para optimizar la transformación para un hospedador determinado está dentro de la experiencia en la materia.

Los vectores de transformación adecuados incluyen los que tienen por lo menos una secuencia para insertar un gen que codifica una proteína que aumenta o permite el crecimiento heterotrófico. Preferentemente, los vectores de transformación utilizados en los procedimientos según la presente invención presentan por lo menos una secuencia de inserción para la inserción de un gen que codifica un transportador capaz de absorber una fuente de carbono exógena fija. Más preferentemente, los vectores de transformación utilizados en los procedimientos según la presente invención (tienen por lo menos una secuencia de inserción para la inserción de un gen que codifica un transportador de exosa). Típicamente, los vectores de transformación son capaces de replicarse en bacterias, de modo que las grandes cantidades del vector pueden prepararse fácilmente, utilizando procedimientos tales como los descritos en Sambrook, I., Maniatis, T., y Fritsch, E. F. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. Preferentemente, se seleccionarán vectores que son conocidos por transfectar las especies de algas hospedadoras.

Se han descrito sistemas de transformación para un número limitado de géneros de algas eucarióticas, incluyendo las diatomeas. Por ejemplo, se han transformado cuatro especies de diatomeas. En cada caso se desarrolló un vector especial para la diatomea de interés. Los presentes inventores transformaron Phaeodactylum, utilizando el vector denominado pPha-T1, que se describirá con mayor detalle a continuación. Se han transformado Cyctotella cryptica y Navicula saprophila utilizando vectores pACCNPT10 y pACCCNPT5.1, que poseen el gen nptII (neomicina fosfotransferasa) que comunica resistencia al antibiótico G418. El activador que dirige la expresión del gen introducido procede del gen acc endógeno (acil-CoA carboxilasa). Dunahay, T. G., Jarvis, E. E. y Roessler, P. G. (1995) "Genetic transformation of the diatoms Cyclotella cryptica and Navicula saprophila", J. Phycol. 31:1004-12. Cylindrotheca fusiformis fue transformada por Fisher et al. (Fischer H., Robl., I., Sumper, M., y Kroger, N., (1999), "Targeting and covalent modification of cell wall and membrana proteins heterologously expressed in the diatom Cylindrotheca fusiformis (Bacillariophyceae)", J. Phycol. 35:113-20). En este caso, se utilizó el gen sh ble, que proporciona resistencia al antibiótico zeocina. El activador que dirige la expresión procedía del gen endógeno fru, que codifica una proteína de la pared celular, y el vector se denominó pble/fruE. Un derivado de este vector, pble/HUPtag, que contiene el gen hupI que codifica el transportador de glucosa de Chlorella, se utilizó también para transformar Cylindrotheca fusiformis. El alga transformada fue capaz de absorber la glucosa. Sin embargo, el alga transformada fue incapaz de crecer de manera heterotrófica (Fischer, et al., 1999).

Un pequeño número de algas verdes se ha transformado (véase Stevens y Purton (1997) "Genetic engineering of eukaryotic algae: progress and prospects", J. Phycol. 33:713-22). La más destacada es Chamydomonas. Este alga ha sido un sistema de modelo molecular significativo durante muchos años en numerosos laboratorios involucrados en la investigación. Como resultado existe un gran número de vectores descritos que podría utilizarse para la conversión trófica de este alga. Volvox, un género que está íntimamente relacionado con Chlamydomonas, ha sido también transformado (Hallman A., Sumper M. (1996) "The Chlorella hexose/H" symporter is a useful selectable marker and biochemical reagent when expressed in Volvox'', Proc. Natl. Acad. Sci. 93:669-673). Llaman y Sumper introdujeron el gen hup de Chlorella en Volvox. El alga fue sensible a la desoxiglucosa, lo que indica que el transportador estaba funcionando. Sin embargo, los autores no proporcionaron las mediciones de absorción y las células no se desarrollaron de manera heterotrófica.

Los vectores preferidos para la presente invención son los vectores desarrollados para uno o más de los sistemas de algas. Además, los procedimientos descritos en la presente memoria y el sistema de selección de resistencia a la zeocina proporcionan a un experto en la materia orientaciones para la preparación y selección de los vectores apropiados para la transformación de las algas fototróficas en algas heterotróficas.

Los diferentes activadores pueden ser más o menos eficaces en diferentes sistemas de hospedadores. Por ejemplo, el activador de un gen asociado a la fotosíntesis en una especie fotosintética puede utilizarse para dirigir la expresión de una proteína en las células de algas transformadas o las células de otro organismo fotosintético marino. Los activadores adecuados para su utilización en la presente invención pueden aislarse o sintetizarse basándose en secuencias conocidas de otros organismos fotosintéticos. Los activadores preferidos incluyen aquellos para los genes de otras especies fotosintéticas, incluyendo otras algas y cianobacterias, que son homólogas para los genes fotosintéticos del huésped de algas que va a transformarse. Preferentemente, los activadores seleccionados para su utilización según la presente invención que proporcionan la producción de alto nivel, constitutiva de los genes híbridos controlan en los organismos en los que se utilizan. Preferentemente, esta producción de alto nivel constitutiva es independiente de la iluminación, de modo que tiene lugar tanto a la luz como en ausencia de luz. Los ejemplos de dichos activadores son los activadores para los genes expresados de manera constitutiva tal como los genes constitutivos. Dados los sistemas génicos indicadores actualmente disponibles, la selección de un activador con las características deseadas está comprendida dentro de la competencia de una de las técnicas de biología molecular, ficología, y similares. Véase, Zaslavskaia, et al.

Para un hospedador de algas determinado, puede resultar preferido identificar el gen de captación de luz homólogo del huésped y aislarlo del activador homólogo procedente del organismo hospedador para obtener la expresión óptima. Sin embargo, para algunos organismos se ha descubierto que los activadores extraños proporcionan expresión excelente o menos restringida en el hospedador en comparación con el activador homólogo del organismo hospedador (Mermet-Bovier, et al. (1993) Curr. Microbiol. 26:323-327).

En una forma de realización, el(los) gen(es) deseado(s) que va(n) a expresarse se regula(n) mediante un activador de una proteína de unión a la clorofila. Una serie de activadores de captación de luz de las proteínas de unión a la fucoxantina clorofila han sido identificados y clonado actualmente en Phaeodactylum tricornutum por los presentes inventores. Véase, Apt, et al. (1996). La utilización de los activadores de fcp para la transformación de algas, especialmente de diatomeas fotosintéticas, se describe en el documento WO 97/39106. Véase, también, la patente U.S. nº 6.027.900 concedida a Allnutt et al. Los activadores adecuados incluyen los activadores fcpA, fcpB, fcpC y fcpE, así como muchos otros activadores lhc (complejo captador de luz). Otros activadores adecuados que resultan evidentes para el experto en la materia pueden utilizarse para la conversión heterotrófica según la presente invención.

Se ha construido un vector de transformación con fines generales, pPha-T1 (Fig. 1) para facilitar la introducción eficaz de genes heterólogos en la diatomea P. tricornutum. Este vector contiene una secuencia de clonación múltiple con diez secuencias de restricción exclusiva para insertar los genes de interés. El activador y las zonas de terminador del gen fcpA flanquean la secuencia de clonación múltiple para activar la expresión eficaz de los genes insertados. La selección principal para las células de P. tricornutum que albergan el vector es la resistencia a la zeocina, que está codificada por el gen sh ble flanqueado por el activador P. tricornutum fcpB y el terminador fcpA.

El vector de transformación del plásmido pPha-T1 (Fig. 1) se construyó en varias etapas. La primera etapa implicó la subclonación de la zona del terminador fcpA de pfcpA/ble (Apt, et al., 1996) en las secuencias HinDIII-Xhol de pSP73 (Promega). El casete de resistencia a la zeocina de pfcpB/ble (Apt et al., 1996), que contiene el activador fcpB que dirige el gen sh ble, se subclonó en un fragmento XhoI en la secuencia XhoI de pSP73. La zona del activador fcpA de pfcpA/ble (Apt et al., 1996) se subclonó en un fragmento PstI-EcoRI y se insertó en Bluescript SK-. Este mismo fragmento se introdujo a continuación como fragmento BamHI-EcoRV y se ligó en las secuencias BgIII-EcoPV de PSP73 para formar el montaje básico final. La secuencia de multiclonación procedente de pSP73 entre las secuencias EcoRV y HinDIII se conservó intacta, excluyendo la secuencia Clai, que fue eliminada por mutagénesis dirigida al punto para eliminar un codón de iniciación ATG críptico (Deng, W. P. y Nickotoff, J. A., (1992) "Site-directed mutagenesis of virtually any plasmid by eliminating a unique site",

\hbox{ Anal. Biochem.  
1100:81-8; Zaslavskaia,  et al .,
2000).}

El vector de transformación del plásmido pPha-T1 puede utilizarse para transformar diatomeas tales como
Cyclotella, Cylindrotheca y Nitzshia alba mediante bombardeo con partículas. El experto en la materia puede también utilizar vectores de transformación alternativos, basados en activadores homólogos, que pueden prepararse por los procedimientos utilizados para preparar el vector pPha-T1. Documento WO 97/39106. Véase, también, la patente U.S. nº 6.027.900 concedida a Allnutt et al.

La capacidad de un activador dado para regular la expresión génica, así como la duración de dicha expresión y los factores que afectan a dicha expresión, en algunas especies específicas de algas puede evaluarse utilizando el sistema de selección de Zeocina descrita en el documento WO 97/39106. Véase, también, la patente US nº 6.027.900 concedida a Allnutt et al. Los sistemas de selección adicionales que pueden utilizarse para evaluar activadores y su actividad en un organismo dado se describen en Zaslavskaia, et al., 2000).

Con objeto de detectar fácilmente la transferencia del material genético a cualquier organismo, es decir, con objeto de detectar si una célula ha sido transformada, han de establecerse pruebas fenotípicas que indican que se necesita demostrar esta transferencia. El rasgo más conveniente, y por lo tanto tradicionalmente manipulado ha sido la sensibilidad antibiótica. Las concentraciones menores de zeocina y nurseotricina que eliminan completamente el crecimiento en varios organismos pueden determinarse utilizando los procedimientos elaborados para P. tricornutum en el documento WO 97/39106. Véase, también, la patente U.S. nº 6.027.900 concedida a Allnutt et al., y el Ejemplo 1, a continuación. Los sistemas de selección adicionales que pueden utilizarse para detectar la transferencia de material genético a un organismo se describen en Zaslavskaia, et al. (2000).

Las secuencias de codificación adecuadas para su utilización para su utilización en los montajes genéticos de la presente invención incluyen genes para proteínas que aumentan o permiten el crecimiento heterotrófico. Preferentemente, las secuencias de codificación son genes que codifican proteínas que afectan la absorción y el catabolismo de azúcares y/o otras fuentes exógenas de carbono fijas. Más preferentemente, las secuencias de codificación son genes que codifican transportadores capaces de absorber una fuente de carbono fija exógena. Ejemplos no limitativos de dichas fuentes de carbono incluyen azúcares, ácidos grasos, aminoácidos, piruvato, glicerol y citrato. Todavía más preferentemente, las secuencias de codificación son los genes que codifican transportadores de mono o disacáridos, tal como, pero no limitadas a, transportadores de sacarosa. Más preferentemente, las secuencias de codificación son los genes que codifican transportadores de hexosa, tales como, pero no limitadas a, transportadores de glucosa.

Otros ejemplos no limitativos de secuencias de codificación que son adecuadas para los montajes genéticos de la presente invención incluyen secuencias de codificación que codifican proteínas que aumentan los transportadores existentes de las fuentes de carbono reducidas a través de la membrana celular, las secuencias de codificación que codifican proteínas que activan los transportadores existentes de las fuentes de carbono a través de la membrana celular y las secuencias que codifican proteína que facilitan el

\hbox{catabolismo de las fuentes de carbono 
reducida por la célula.}

Los inventores han descubierto que la expresión de un solo gen exógeno que codifica un transportador para un compuesto que sirve como fuente de carbono catabolizable puede ser suficiente para convertir un fotótrofo estricto en una célula recombinante capaz de crecimiento heterotrófico. En las formas de realización preferidas de la presente invención, la transfección con un solo gen efectúa la conversión fotótrofo a heterótrofo. Desde luego, la introducción de una variedad de genes puede ser necesaria o deseable para conseguir más crecimiento heterotrófico amplio, y montajes que utilizan combinaciones de secuencias de codificación adecuadas pueden utilizarse según la presente invención. Por ejemplo, pueden utilizarse las secuencias que codifican transportadores para diferentes compuestos o transportadores junto con enzimas implicadas en el metabolismo de los compuestos.

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Los transportadores de hexosa comprenden una superfamilia de transportadores de azúcar relacionados que consisten todos en una estructura que posee 12 dominios que comprenden la membrana. Véase, p. ej., Walmsley AR et al. (1998) "Sugar transporters from bacteria, parasites and mammals: structure-activity relationships", Trends. Biochem. Sci. 23(12):476-81 (a broad general review); Henderson PJ, (1990) "The homologous glucose transport proteins of prokaryotes and eukaryotes", Res. Microbiol. 141(3):316-28; Bisson LF et al., (1993) "Yeast sugar transporters", Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28(4):259-308; Kruckeberg (1996); Mueckler M. et al., (1997); Barret MP et al., (1998) "Trypanosome glucose transporters", Mol. Biochem. Parasitol. 91(1):195-205; Caspari T. et al. (1994) "Hexose/H+ symporters in lower and higher plants", J. Exp. Biol. 196;483-491. En la Tabla B se da una lista a título de ejemplo de transportadores de hexosa caracterizada, junto con ejemplos de transportadores caracterizados de sacarosa, citrato y ácido graso. Véase, Hirsch D. et al., (1998) "A family of fatty acid transporters conserved from mycobacterium to man", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(15):8625-8629; Heisterkamp N. et al., (1995) "Localization of the human mitochondrial citirate transporter protein gene to chromosome 22Q11 in the DiGeorge syndrome critical region", Genomics 29(2):451-456; Rentsch D. et al., (1998) "Structure and function of plasma membrane amino acid, oligopeptide and sucrose transporters from higher plants", J. Membr. Biol. 162(3):177-90. La Tabla B incluye también una lista a título de ejemplo de transportadores de aminoácidos. Véase, Saier MH, (2000) "Familias of transmembrane transporters selective for amino acids and their derivatives". Microbiology 146:1775-95; Meredith D. y Boyd CA. (2000) Structure and function of eukaryotic peptide transporters. Cell Mol. Life Sci. 57(5):754-78; Ortiz-López A., Chang H. y Bush DR. (2000) "Amino acid transporters in plants". Biochim. Biophys. Acta 1465(1-2):275-80; y McGivan JD. (1996) "Mammalian amino acid transporters and their regulation: introduction". Biochem. Soc. Trans. 24(3):837-8.

TABLA B Ejemplos de transportadores caracterizados de fuentes de carbono reducido (es decir, compuestos catabolizables)

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Ejemplos de transportadores de hexosa caracterizada

Levadura - hxt 1-7, gh rl

Mamíferos - glutI, glut4

Tripanosomas - tht

Plantas - stpI-4

Algas - hupI, hup2

Cianobacterias - glcP

Bacterias - xylE, galP

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Ejemplos de transportadores caracterizados de sacarosa (disacárido)

Plantas - sut1, sut2, sucI

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Ejemplos de transportadores caracterizados de citrato

Mamíferos - ctp

Bacterias - cit

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Ejemplos de transportadores caracterizados de ácidos grasos

Mamíferos - fatp

Levadura - pxalp, fatlp

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Ejemplos de transportadores de aminoácidos

Plantas - aap1-5

Mamíferos - ngt1

Levadura - ort1

Bacterias - gap1

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Los presentes inventores han logrado converter algas fototróficas en heterótrofas insertando glut1 (symporter de hexoxa de mamífero). Los presentes inventores han descubierto que la inserción de glut1 se logra en particular convirtiendo las algas fototróficas en heterótrofas.

Se ha demostrado que muchas algas son utilizaciones de codón no habituales (Bhaya, D., Grossman AG (1993) "Characterization of gene clusters encoding the fucoxanthin chlorophyll protein of the diatom Phaeductiylum tricornutum", Nucleic Acids Research 21:4458-159; Apt KE, Hoffman N., Grossman AR (1993) "The Y subunit of R-phycoerythrin and its posible mode of transport into the plastid of red algae", J. Biol. Chem. 268:16208-15; Apt KE, Clendennen SK, Powers DA, Grossman AR (1995) "The gene family encoding the fucoxanthin chlorophyll proteins from the brown alga Macrocystis pyrifera", Mol. Gen. Genet. 246:455-64). La utilización del codón en P. tricornutum es muy similar a la del hombre porque los codones AGA y AGG de arginina se utilizan raramente (Bhaya et al., 1993; Apt, et al., 1995). Todos los intentos previos para expresar en genes heterólogos de P. tricornutum que contenían una preponderancia del codón AGA fracasaron. Los presentes inventores han determinado que la utilización infrecuente de codones AGA y, especialmente, AGG, son importantes para la expresión génica apropiada. Hasta la fecha, no se ha clonado ningún gen, o, expresado con éxito en P. tricornutum, que contiene una predominancia del codón AGG. Según la presente invención, todas las transformaciones de P. tricornutum se realizan por consiguiente preferentemente con los genes que no contienen estos codones (o por lo menos que los contienen raramente).

En resumen, se determina la secuencia de ADN de una proteína de interés. Se identifican los codones no deseables. Utilizando mutagénesis puntual, estos codones no deseables se sustituyen por codones deseables que codifican el mismo aminoácido. Los genes recién reconstruidos se insertan a continuación en vectores y se utilizan para transformar especies de interés. De esta manera, pueden adaptarse proteínas heterogéneas que se expresan de manera eficaz en el organismo de interés. Por consiguiente, algunos genes relacionados con la absorción y utilización del azúcar y/o de otras fuentes exógenas de carbono fijado pueden reconstruirse por dichas técnicas y utilizarse para convertir fotótrofos en heterótrofos utilizando los procedimientos de la presente invención. Por ejemplo los transportadores de levadura hexosa (los productos proteicos de los genes hxt) pueden utilizarse con más éxito para convertir Phaeodactylum reconstruyendo los genes hxt para reducir o eliminar la utilización de codones AGA y
AGG.

Alternativamente, la utilización del codón puede cambiarse reconstruyendo la sustitución del aminoácido conservador que utiliza el gen (Zolotukhin S., Potter H., Hauswirth WM, Guy J., Muzyczka N. (1996) "A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expresión in mammalian cells", J. Virology, 70:4646-4654; Haas J., Park EC, Seed B. (1 de marzo de 1996) "Codon usage limitation in the expression of HIV-1 envelope glycoprotein", Curr. Biol. 6(3):315-24). "Las sustituciones de aminoácidos conservadoras" son la sustitución de un resto de aminoácido en una secuencia por otro resto de propiedades similares, de modo que la estructura secundaria y terciaria de los péptidos resultantes son sustancialmente las mismas. Las sustituciones de aminoácidos conservadores se producen cuando un aminoácido tiene sustancialmente la misma carga que el aminoácido por el que se sustituye y la sustitución no tiene ningún efecto significativo sobre la configuración local de la proteína. Los pares de aminoácidos que pueden ser sustituidos de forma conservadora por otros son bien conocidos por los expertos en la
materia.

Si un gen dado se ha expresado con éxito en una célula transformada (determinada utilizando el sistema de selección de resistencia a la Zeomicina) puede determinarse utilizando los métodos de la presente invención. La expresión consolidada de un gen o genes útiles para convertir las células fototróficas en células heterotróficas pueden medirse mediante la capacidad de las células transformadas para producir una fuente externa de carbono fijo (p. ej., glucosa, acetato) o para desarrollarse en la oscuridad. Preferentemente, la expresión con éxito de un gen o genes útiles para convertir células fototróficas en células heterotróficas se mide tanto por la capacidad de las células transfomadas para producir una fuente externa de carbón fijo y para crecer en la oscuridad. Las células de referencia para su utilización en la determinación del éxito de la expresión en este contexto pueden ser referencias negativas (p. ej., células de las especies transformantes que no han sido transformadas u otros fotótrofos) y/o referencias negativas (p. ej., heterótrofos naturales o células fototróficas que se han convertido previamente en heterótrofas).

Una secuencia de ADN que codifica un gen que codifica una proteína útil para la absorción y/o utilización de una fuente exógena de carbono puede insertarse en el vector seleccionado por técnicas de ADN recombinante corrientes para crear un vector que produzca la expresión de la proteína de interés. Por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica una proteína transportadora de hexosa puede utilizarse para crear un vector transportador de hexosa (HX). Una población del vector, p. ej. el vector HX, puede obtenerse por expansión del vector en el cultivo bacteriano, para los vectores capaces de replicación en bacterias, o por PCR u otras técnicas de ampliación. La población expandida de vectores, p. ej. vectores HX, se utiliza a continuación para transformar una población de las células huésped seleccionadas.

La transformación puede realizarse por cualquier técnica adecuada, incluyendo la electroporación, el bombardeo de micropartículas recubiertas de ADN, la agitación intensa con cerdas de carburo de silicio y la agitación intensa con lentejas de vidrio. Preferentemente, se utiliza la agitación intensa con lentejas de vidrio o el bombardeo con micropartículas. Más preferentemente, se utiliza el bombardeo con partículas. Dichas técnicas son bien conocidas en la materia y se describen con mayor detalle en la presente memoria y en el documento WO 97/39106. Véase, también, la patente U.S. nº 6.027.900 concedida a Allnutt et al.

Cuando se utiliza el bombardeo con micropartículas se emplea el sistema de administración de partículas Biosilite PDS-100/HE^{TM} de Bio-Rad (según las instrucciones del fabricante), preferentemente se utilizan discos de ruptura de 1100, 1350 o 1500 psi, aunque puede utilizarse cualquier disco de rupturas en psi. Más preferentemente se utilizan discos de rupturas de 1500 psi. Asimismo, cualquier micropartícula utilizada normalmente en la técnica puede utilizarse para el bombardeo. Preferentemente, se utilizan partículas de tungsteno M5 (diámetro medio de 0,4 \mum) o M17 (diámetro medio de 1,1 \mum) o partículas de oro de un diámetro medio de 1 micra. Más preferentemente, se utilizan partículas M17 de tungsteno. Las células que deben ser bombardeadas pueden colocarse en cualquier nivel dentro de la cámara. Preferentemente, las células se colocan en el nivel dos o tres. Aún más preferentemente, las células se colocan en el nivel dos. Preferentemente, el ADN recubierto sobre las partículas está superenrollado.

En un modo preferido de la invención, se seleccionan transformantes con éxito en una primera etapa de selección, basándose en una característica del vector tal como una resistencia a un antibiótico, y únicamente se prueba la capacidad para crecer de manera autótrofa de los transformantes consolidados en una segunda etapa utilizando el sustrato de interés (es decir, fuente(s) externa(s) de carbono fijado en el que el/los gen(es) transformante(s) debería(n) permitir que crezcan las células transformadas). En otro modo preferido, tras la etapa de transformación, las células se desarrollan en luz reducida en presencia de bajas concentraciones de la fuente de carbono reducida cuya utilización se permite mediante la transcripción, p. ej., azúcar y las células huésped transformadas se subcultivan en el medio con concentraciones de substrato sucesivamente crecientes para que permitan al huésped transformado adaptar el crecimiento heterotrófico. Cuando el sustrato de interés es la glucosa, la etapa de selección puede ser el análisis de las células por la capacidad para absorber ^{14}C-glucosa o por la sensibilidad del análogo tóxico de glucosa, 2-desoxiglucosa. Preferentemente, la luz se retira y se analiza la capacidad de las células transformadas para crecer en la oscuridad en el sustrato de interés.

Por ejemplo, el ADN que codifica una proteína transportadora de glucosa puede insertarse en un vector que contiene un gen con resistencia al antibiótico, tal como resistencia a la fleomicina. Se utiliza el vector HX resultante para transformar las células de algas, y después de la etapa de transformación, las células se colocan en el medio que contiene la fleomicina antibiótica y crecimiento a la luz. Las colonias que parecen representar células que han adquirido resistencia al antibiótico como resultado de la transformación consolidada con el vector HX. Éstas células transformadas se colocan a continuación en placas en medio que contiene baja concentración de azúcar (p. ej., 0,1% de glucosa). Las colonias que crecen con baja luz o en la oscuridad en el medio bajo en azúcar se vuelven a colocar en placas en el medio que contiene una concentración más alta de glucosa (p. ej., glucosa al 1%). Las células que son capaces de crecer en la oscuridad en estas placas con mucho azúcar son algas recombinantes heterotróficas.

El procedimiento de conversión trófica de la presente invención produce algas recombinantes capaces de crecimiento heterotrófico. Estas algas recombinantes pueden desarrollarse en fermentadores hasta cifras altas de células sin el problema de inanición debido al autosombreado que se produce en las algas fototróficas. Por lo tanto, los productos celulares de algas pueden obtenerse con alto rendimiento del cultivo del fermentador de las algas recombinantes de la presente invención que se compara con el rendimiento del cultivo de las algas fototróficas precursoras. La modificación genética adicional de las algas recombinantes puede proseguirse por procedimientos de mutación tradicionales o procedimientos recombinantes o ambos. Cultivando las células modificadas en la penumbra o en oscuridad considerable en el medio que contiene el sustrato (p. ej., azúcar) se mantendrá la naturaleza heterotrófica de las células, porque la ausencia de luz o la ausencia considerable de luz proporciona células supresoras de la presión selectiva que pierden el ADN que codifica el transportador de hexosa u otro(s) gen(es) de conversión.

La presente invención también contempla los procedimientos de utilización de las algas heterotróficas recombinantes para cultivar en fermentadores con el fin de producir productos de algas deseados. Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para obtener biomasa de algas o productos de células de algas que comprende cultivar en un fermentador células de algas recombinantes que expresan una proteína transportadora de hexosa de mamífero heteróloga y recoger la biomasa y/o el/los producto(s) de célula(s) de algas deseado(s). Las condiciones del medio y del cultivo tanto para la colocación en placas de las algas recombinantes como para el cultivo del fermentador pueden ser determinados fácilmente por cualquier especialista por optimización rutinaria. Véase, también, la patente U.S. nº 5.244.921 concedida a Kyle et al.; patente U.S. nº 5.374.657 concedida a Kyle; patente U.S. nº 5.550.156 concedida a Kyle; patente U.S. nº 5.567.732 concedida a Kyle; patente U.S. nº 5.492.938 concedida a Kyle et al.; patente U.S. nº 5.407.957 concedida a Kyle, et al.; patente U.S. nº 5.397.591 concedida a Kyle et al.; patente U.S. nº 5.130.242 concedida a Barclay, patente U.S. nº 5.658.767 concedida a Kyle; y patente U.S. nº 5.711.933 concedida a Kyle.

Los productos que pueden producirse por las algas incluyen, pero no se limitan a, pigmentos (p. ej., \beta-caroteno, ficobiliproteínas, carotenoides, xantofilas), aceites con valor nutritivo (p. ej., ácido docosahexanoico) y productos bioquímicos marcados con isótopos (p. ej., ^{13}C- o ^{14}C-glucosa).

La presente invención comprende también la utilización de biomasa de algas, ya sea antes o después de la extracción o de la extracción parcial de los productos deseados, como alimentación animal. Un ejemplo no limitativo consiste en la utilización de la biomasa como pienso para acuicultivo para, p. ej., larvas, ratíferos, artemia, gambas, peces, moluscos, vertebrados o invertebrados. Otros ejemplos no limitativos son la utilización de la biomasa para alimentar, p. ej., aves de corral, vacas o cerdos. La biomasa puede utilizarse como un alimento o composición nutritiva para seres humanos.

Los solicitantes describen un sistema de selección para detectar y/o seleccionar las algas transformadas. Estos procedimientos son particularmente útiles en la transformación de un organismo que es capaz (bien en su estado natural o mediante la conversión heterotrófica de la presente invención) de desarrollarse en una fuente de carbono dada en la oscuridad. La mutagénesis se utiliza para descomponer un gen o genes necesarios y/o útiles en la absorción y/o catabolismo de esta fuente de carbono. Los medios para producir la mutagénesis de las células son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitativos, no exclusivos de los procedimientos para mutagenizar las células incluyen la mutagénesis química, la mutagénesis inducida por radiación, el reemplazamiento génico y la mutagénesis dirigida al punto.

Cuando se utiliza el reemplazamiento génico para inactivar el gen buscado que debe inactivarse, se produce un montaje génico que contiene el gen buscado que debe inactivarse con un marcador seleccionable por antibiótico insertado en el medio de la zona de codificación, produciendo una zona de codificación no funcional del gen buscado que debe inactivarse. El montaje génico se inserta a continuación en las células por procedimientos descritos en la presente memoria. Cuando la copia no funcional del gen buscado debe inactivarse se integra y se sustituye el gen funcional endógeno, la célula se produce, p. ej., incapaz o menos capaz de desarrollarse en la fuente de carbono cuyo catabolismo facilitó el gen descompuesto.

Las células que son incapaces o menos capaces de desarrollarse en la fuente de carbono pueden detectarse por varios procedimientos, tales como ensayar la capacidad de las células para absorber esta fuente de carbono o para desarrollarse en esta fuente de carbono en la oscuridad. Cuando el gen que ha sido inactivado es un gen implicado en la absorción de glucosa, las células pueden ensayarse fácilmente por inactivación del gen de interés desarrollándolas sobre el análogo de glucosa tóxica desoxiglucosa. Las células que poseen un transportador funcional de glucosa importarán este compuesto. La desoxiglucosa se introducirá en las células y no se metabolizará. Como resultado se acumulará dentro de las células hasta concentraciones tóxicas, destruyendo las células. Las células que pueden desarrollarse en presencia de desoxiglucosa probablemente no serán capaces de absorber este compuesto, y, de este modo, se han transformado como se deseaba. Que las células no pueden absorber desoxiglucosa o glucosa puede confirmarse por los ensayos de absorción de glucosa y la incapacidad de las células para desarrollarse en la oscuridad en glucosa como única fuente de carbono.

Cuando un gen ha sido inactivado por sustitución génica y un marcador seleccionable por antibiótico se ha insertado, las células con los genes disgragados pueden seleccionarse fácilmente por el crecimiento de las células en el antibiótico, seleccionando de este modo las células resistentes. La confirmación de que las células no pueden llevar y/o catabolizar una fuente de carbono dada puede determinarse por ensayos de absorción y/o ensayos para determinar la capacidad de las células para desarrollarse en una fuente de carbono en la oscuridad.

Una cepa que se ha hecho inestable o menos capaz de crecer en una fuente de carbono dada puede transformarse a continuación con otros genes de interés junto con la transformación de un gen que reestablecerá la capacidad de las células para crecer en la oscuridad en una fuente de carbono específica. De esta manera, la capacidad para crecer en una fuente de carbono específica puede utilizarse como marcador seleccionable para la transformación, de manera similar a aquella en la que la resistencia al antibiótico se utiliza como dicho marcador. Las células que han sido transformadas con éxito pueden seleccionarse cultivando las células en la oscuridad en una fuente de carbono específica.

De manera similar, la introducción de un gen o genes que codifican proteína(s) que permite o aumenta el cultivo de las células en una fuente de carbono específica en la que fueron incapaces anteriormente o menos capaces de crecer (como se describe en la presente memoria) puede también utilizarse como marcador seleccionable. En dicho sistema, las células se transformarían con un gen de interés junto con su transformación con un gen o genes que codifica(n) proteína(s), que permite o aumenta el crecimiento de las células en una fuente de carbono específica sobre la que eran incapaces anteriormente o menos capaces de desarrollarse.

De esta manera, la capacidad para crecer en una fuente de carbono específica puede utilizarse como marcador seleccionable para la transformación, de manera similar a aquella en la que la resistencia antibiótica se utiliza como marcador. Las células que se han transformado con éxito pueden seleccionarse cultivando las células en la oscuridad en la fuente de carbono específica.

La introducción o reintroducción de un gen que codifica una proteína que permite o aumenta la absorción o el crecimiento en una fuente de carbono específica se realizaría por los procedimientos descritos en la presente memoria. El diseño del vector sería similar al descrito en la presente memoria, excepto que el gen que codifica una proteína que permite o que aumenta la absorción o el crecimiento en una fuente de carbono específica reemplazaría el marcador seleccionable por el antibiótico. En la presente memoria se proporcionan las directrices para llevar a cabo las transformaciones de la realización y selección.

Dado que las células de la presente invención son capaces de desarrollarse de manera heterótrofa y pueden utilizarse como un sistema de selección de la transformación, la presente invención contempla la utilización de estas células para producir la proteína recombinante. En dicha aplicación, las células autótrofas o las células de cuya capacidad para crecer en la oscuridad en una fuente de carbono externa, ha sido destruida por mutagénesis se transforman con un gen que codifica la proteína recombinante buscada que debe prepararse y un gen o genes que codifica(n) la(s) proteína(s)
que permite(n) o aumenta(n) el crecimiento heterotrófico. Si se desea, puede utilizarse un sistema de selección del antibiótico, como el descrito en la presente memoria, para ayudar a la identificación inicial de las células para su transformación. Las células que han experimentado transformación heterótrofa se seleccionan a continuación utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria. En las células seleccionadas se determinada su capacidad para producir la proteína recombinante de interés. Estas células que producen la proteína pueden cultivarse a continuación en fermentaciones en condiciones heterotróficas, y aislarse la proteína de ellas utilizando técnicas que son bien conocidas por los expertos en la materia.

La conversión trófica de las microalgas tales como las diatomeas es una primera etapa crítica en la ingeniería de las algas para el cultivo con éxito a gran escala utilizando tecnología de fermentación microbiana. Además de proporcionar un medio para mantener rigurosamente las condiciones de cultivo específicas con el objetivo de maximizar la productividad, la utilización de tecnología de fermentación eliminará la contaminación de los cultivos por microbios, lo que es un criterio importante para mantener los patrones de la industria alimentaria como estipula la U.S. Food and Drug Administration. Además, los azúcares tales como la glucosa, así como otros nutrientes limitadores de crecimiento, pueden ser proporcionados continuamente por los cultivos de modo que las velocidades de crecimiento queden saturadas. La fermentación eficaz ha permitido el cultivo de las microalgas Crypthecodinium para la producción del ácido graso poliinsaturado para su utilización en la nutrición humana (Kyle, D. J., (1996) Lipid Technology, 2:106). Las condiciones de optimización para el crecimiento fermentativo de las algas heterotróficas naturales ha dado como resultado la acumulación de biomasa seca hasta 100 g/litro (Gladue, et al., 1999; Running, et al., 1994) que es 10 a 50 veces mayor que los rendimientos obtenidos utilizando sistemas de cultivo dependientes de la luz. El aumento de acumulación de biomasa en los sistemas con fermentador da como resultado costes de producción que son por lo menos un orden de magnitud inferior a los que se incurre utilizando métodos de producción de cultivo en balsa (Radmer, et al., 1994). Este coste reducido aumenta la fiabilidad para desarrollar una gama grande de productos de algas, incluyendo los ácidos grasos poliinsaturados (p. ej. EPA), carotenoides y xantofilas (p. ej. (caroteno, luteína, filcoxantina, astanxantina), alimentos para acuicultura y una variedad de productos farmacéuticos y nutracéuticos para la producción comercial. Pero los resultados también presentan implicaciones importantes con respecto a los aspectos biológicos fundamentales de los ecosistemas marinos. Aproximadamente el 50% de la fijación de carbono se produce en los océanos, y los océanos sirven como un sumidero principal para el carbono fijado (Raven, et al. (1999) Plant Cell and Environm., 22:741). Las diatomeas contribuyen esencialmente a la reducción del carbono inorgánico en los hábitats marinos, y su contribución puede aumentar sustancialmente ya que la ecología de los medios oceánicos se altera (M. R. Landry, et al., (2000) Marine Ecology Progress Series, 201:57); B. Boyle, (1998) Nature 393:733; Takeda, (1998) Nature 393:777). La explotación de las diatomeas que puede manipularse genéticamente y que puede crecer de manera heterótrofa facilitará la utilización de mutantes para aumentar la utilización por los autores tanto de la fotosíntesis como de otra serie de reacciones metabólicas en las algas que son esenciales para el mantenimiento de los ecosistemas marinos.

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Ejemplos

Con objeto de facilitar una comprensión más completa de la invención, se proporcionan a continuación numerosos Ejemplos. Sin embargo, el alcance de la invención no está limitado a las formas de realización específicas dadas a conocer en estos ejemplos proporcionados únicamente a título ilustrativo.

Ejemplo 1

Sensibilidad a antibióticos en diatomeas

En las diatomeas Phaeodactylum tricornutum, Cylindrotheca fusiformis, Cyclotella cryptica y Nitzschia alba se determinó extensamente su sensibilidad a una serie de antibióticos para los cuales están disponibles genes con resistencia, y se determinaron las concentraciones más bajas que suprimen completamente el crecimiento para cada antibiótico (Tabla C). La mayoría de los antibióticos no presentó ningún efecto significativo sobre el crecimiento o fueron eficaces solamente a concentraciones muy altas en comparación con su eficacia para suprimir el crecimiento de otros organismos eucarióticos. Estos incluyen los antibióticos tales como G418, higromicina, kanamicina y espectinomicina, que se utilizan de forma rutinaria para la selección de otros organismos eucarióticos.

Para las diatomeas ensayadas, solamente los antibióticos zeocina y fleomicina dieron como resultado la muerte celular en una media de I.O. del 100% (véase el Ejemplo 4 para la descripción de las condiciones del medio y de crecimiento).

Se descubrió que reduciendo la concentración del medio al 50% de I.O. o menor sensibilidad de las diatomeas a los antibióticos aumentó grandemente. El intervalo de concentración eficaz del antibiótico en la mayoría de los casos se redujo por un factor de 10. Las diatomeas representativas se continuaron ensayaron frente a tres de los antibióticos más eficaces a concentraciones inferiores de medio.

Las células de cada especie de diatomeas se colocaron en placas en medio sólido a equivalentes de salinidad del 25 al 100% de medio I.O., con un gradiente de concentraciones de antibiótico. Después de 2 semanas de iluminación se evaluó el crecimiento de las células y se determinó la concentración de antibiótico requerida para la muerte celular (Tabla D).

TABLA C Efecto de los antibióticos sobre el crecimiento de las diatomeas seleccionadas. Los valores representan la concentración menor de antibiótico por ml requerido para la muerte celular o la concentración más alta determinada

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TABLA D Efecto de los antibióticos sobre el crecimiento de las diatomeas seleccionadas en el medio con salinidad reducida. El porcentaje relativo de salinidad frente al agua de mar normal se da entre paréntesis. Las concentraciones de antibióticos se dan como la concentración inferior de antibiótico por ml requerida para la muerte celular o la concentración inferior determinada

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Ejemplo 2

P. tricornutum es incapaz de crecimiento heterotrófico

Para confirmar que P. tricornutum era incapaz de crecimiento heterotrófico en glucosa, se colocaron repetidamente las células en placas sobre medio sólido que contiene glucosa y se colocaron en la oscuridad. Las células se dividieron típicamente hasta 1 a 2 veces durante 24 h, a continuación se interrumpió el crecimiento. Ninguna división adicional resultó evidente durante 1 a 2 meses. Se comprobó también la actividad del transportador de glucosa en los cultivos. Ninguna absorción detectable resultó evidente aún después de 4 horas de incubación. Se colocaron también en placas en 16 hexosas diferentes o azúcares relacionados (arabiosa, celobiosa, fructosa, fucosa, galactosa, gluconato, lactosa, maltosa, maltobiosa, manosa, meliblosa, nibosa, sorbitol, sucrosa, trehalosa, xilosa), sin crecimiento
detectable.

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Ejemplo 3

La mutación genérica no permite el crecimiento heterotrófico de P. tricornutum

Para confirmar que P. tricornutum no es capaz de mutaciones espontáneas que dan como resultado la capacidad para desarrollarse en la oscuridad en glucosa, se colocaron en placas 10^{10} células de referencia en medio sólido que contiene glucosa. No se formaron colonias espontáneas en glucosa. Para confirmar que el procedimiento de transformación y/o la inserción del ADN extraño no pudo producirse en la conversión trófica, se transformaron aproximadamente 100 estirpes celulares con pPha-T1 que contenían una variedad de genes heterólogos (uidA gpf, nat, y nptII), pero no glutI o hupI y estas estirpes celulares transformadas se determinó el crecimiento en glucosa en la oscuridad. Ninguna se desarrolló en glucosa.

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Ejemplo 4

Transformación de P. tricornutum para el crecimiento heterotrófico

Phaeodactylum tricornutum es una microalga que puede modificarse genéticamente por transformación (Zaslavskaia, et al. (2000), Apt, et al. (1996)), pero que es incapaz de crecer de manera heterótrofa (Cooksey, 1974; Droop, 1974; Hellebust, et al., 1977). Una conversión trófica de este alga se intentó transformándola con los genes que codifican los transportadores de glucosa. Los genes transportadores de glucosa utilizados para la transformación incluían Glut1, de eritrocitos humanos (Mueckler, et al., 1997), Hup1 de Chlorella kessleri (Sauer, et al., (1989), y Hxt1, Hxt2, Hxt4 de Saccharomyces cerevisiae (Kruckeberg, 1996). Las zonas de codificación de estos genes se insertaron en el vector pPha-T1 de transformación de P. tricornutum, que utiliza el activador de un gen que codifica las proteínas de unión a fucoxantina clorofila (Fcp) para conducir la expresión de genes extraños en diatomeas (Barclay, et al., 1994; Zaslavskaia, et al., 2000). Se generó también un montaje en el que el gen GFP se fusionó al extremo 3' del gen Glut. Se introdujeron plásmidos en P. tricornutum utilizando procedimientos biolísticos y transformantes se seleccionaron por resistencia a la zeocina a la luz (Zaslavskaia, et al, 2000). Los transformantes se transfierieron a continuación a un medio sólido o líquido que contenía 0,1 a 1,0% de glucosa, colocados en la oscuridad completa y controlando su crecimiento.

Condiciones de cultivo: Bohlin de Phaeodactylum tricornutum (cepa 646 de la Colección de cultivos de la University of Texas) se cultivó a 20ºC con iluminación continua a 75 \mumoles fotones M^{-2}s^{-1} en medio de agua marina enriquecido con Provasoli preparado con Instant Ocean^{TM} (I.O.) agua de mar artificial, en lugar de agua de mar natural, a una concentración de 0,5 X. Véase, Stair, R. C. y Zeikus, J. A. (1993) "UTEX-The culture collection of algae at the University of Texas at Austin", J. Phycol. 29 (supl.):93. El medio sólido contenía agar-agar al 1,2% y los cultivos líquidos se barbotearon con aire que contenía CO_{2} al 1% en botellas Roux.

Montajes: La secuencia del vector pPha-TI de transformación de Phaeodanylum (véase Fig. 1) presenta el número de registro AF219942 del Genbank. El activador fcpA ha sido colocado enfrente de la secuencia de clonación múltiple (MCS). El activador fcpB se colocó enfrente del gen sh ble. El montaje contiene también el gen con resistencia a la ampicilina (Amp) y el origen de replicación de E. coli.

Se construyó pPha-T1 (Fig. 1) en varias etapas. La primera etapa implicaba la subclonación de la zona del terminador fcpA del pfcpA/ble (Apt et al. 1996) en las secuencias HindIII-XhoI de pSP73 (Promega). El casete de resistencia a la neomicina de pfcpB/ble (Apt et al. 1996), que contiene el activador fcpB que dirige el gen sh ble, se subclonó como fragmento de XhoI en el punto XhoI de pSP73. La zona del activador fcpA del pfcpA/ble (Apt et al. 1996) se subclonó como un fragmento de PstI-EcoRI y se insertó en Bluescript SK-. Este mismo fragmento se eliminó a continuación como un fragmento de BamHI-EcoRV y se ligó en las secuencias BgIII-EcoRV de pSP73 para formar el montaje básico final. La secuencia de multiclonación de pSP73 entre las secuencias EcoRV y HindIII se preparó intacta, excluyendo la secuencia ClaI, que se eliminó por mutagénesis dirigida al sitio (Deng y Nickoloff 1992) para eliminar un codón de iniciación ATG críptico. El vector pPha-T1 contiene diez únicas secuencias de restricción utilizadas normalmente en las que pueden insertarse los genes de interés.

Se determinó la expresión en una serie de transportadores de glucosa en P. tricornutum. Éstas incluyen los genes hxt1, hxt2, hxt4 de Saccaromyces cerevisiae, el gen hup1 de Chlorella kessleri, y glut1 hallado en eritrocitos. Kruckeberg AL (1996) "The hexose transporter family of Saccharomyces cerevisiae", Arch. Microbiol. 166:283-92; Sauer N., Tanner W. (1989) "The hexose carrier from Chlorella cDNA cloning of a eucrytoic H+-cotransporter", FEBS Lett. 259:43-46; Mueckler M, Hresko RC, Sato M. (1997) "Structure, function and biosyntesis of GLUT1", Biochemical Society Transactiions 25:951-4. Las zonas de codificación de estos genes se insertaron en el vector de transformación pPha-T1.

Los plásmidos utilizados para la construcción de vectores de transformación para introducir transportadores de glucosa en las células de Phaeodactylum se construyeron añadiendo secuencias de restricción apropiadas por PCR e insertando la zona de codificación para el transportador de interés en pPha-T1. El plásmido pGlut-Phat utilizó los cebadores GLUTPHAT5' (GACTGGATCCATGGAGCCCAGCAGCAAG) y GLUTPATT3' (GACTAAGCTT-TCA
CACTTGGGAATCAGC). El plásmido pHup-Phat utilizó los cebadores HUPPHAT5' (GATGAATTCA-TGGCCGGC
GGTGGTGTAG) y HUPPHAT3' (GACTAAGCTTTTACTTCATCGCCTTTGAC). El plásmido pHxt2-Phat utilizó los cebadores HXT2PHAT5' (GGGAATTCATTCAAGATGTCTGAGTTCGCTAGAAG) y HXT2PHAT3' (CCCCG
CATGCTTATTCCTCGGAAACTCTT). El plásmido pHxt4-Phat utilizó los cebadores HXT4PHAT5' (GGGAAT
CATTCAGGATGTCTGAAGAAGCT) y HXT4PHAT3' (CCTCTAGATTACTTTTTTCCGAACATC).

Bombardeo con micropartículas: Se bombearon las células con el vector de transformación que contiene el gen de interés utilizando el sistema de administración de partículas PDS-1000/He biolístico de Bio-Rad con discos de ruptura de 1.500 psi. Las partículas M17 de tungsteno (diámetro medio de 1,1 \mum) se recubrieron con 0,8 mg de ADN plásmido en presencia de CaCl_{2} y espermidina, como describe el fabricante. Aproximadamente 5 \times 10^{7} células se extendieron en el centro de un tercio de una placa de medio sólido 0,5 \times I.O. 1 h. antes del bombardeo. La placa se colocó en el segundo nivel en la cámara biolística para bombardeo. Las células bombardeadas se iluminaron durante 24 h. (las células se dividieron una vez durante este periodo) antes de la suspensión en 0,5 ml de medio 0,5 \times I.O.; 100 \mul de esta suspensión (\sim1\times10^{7} células) se colocaron en un medio sólido que contenía 100 \mug/ml de Zeocina. Se colocaron las placas bajo iluminación constante (75 \mul de fotones m^{-2}s^{-1}) durante 2 a 3 semanas y las colonias resistentes se sembraron en rayas en medio sólido reciente que contenía por lo menos 100 \mug/ml de
Zeocina.

Las colonias de los transformantes primarios se volvieron a sembrar en rayas en 250 \mug/ml de Zeocina. Después de dos semanas las células se volvieron a sembrar en rayas en un medio que contenía 0,1% y 1,0% de glucosa, y se mantuvieron en la oscuridad envolviéndolas con varias hojas de papel de aluminio. Después de 4 semanas los transformantes que presentaban crecimiento detectable se volvieron a sembrar en rayas y se mantuvieron en 1,0% de glucosa. Los cultivos líquidos se cultivaron en medio I.O. con glucosa al 1,0% a 20ºC en un agitador orbital. En cada estirpe celular resistente a la zeocina se comprobó también la absorción de la glucosa. Todos estos transformantes procedían de bombardeos con partículas independientes.

Absorción de glucosa y crecimiento sobre glucosa: Se recogieron 250 a 500 ml de células de Phaeodacrylum en cultivo en fase logarítmica a 200 rpm durante 10 min., se lavaron 2 veces con I.O. al 50%, se volvieron a suspender en I.O. y se contaron. Se tomaron alícuotas de las células en tubos de 50 ml (7 ml/tubo). Se añadió glucosa no marcada de una solución madre de 0,1 m en I.O. al 50% hasta la concentración apropiada. Se añadió D-^{14}C-glucosa (ICN) hasta una concentración de 0,05 \muCi por ml. Se tomaron muestras (1 ml) a intervalos de 1 min., se filtraron las células sobre nitrocelulosa y se lavaron 3 veces con I.O. al 50% que contenía glucosa no marcada al 5%. Se transfirieron los filtros a viales de centelleo con 10 ml de Scintisafe (Fisher), se incubaron durante 1 h y se hizo el recuento. Se utilizaron células destruidas térmicamente o fijadas en aldehído como referencias.

Para los transformantes que contienen glut1, 22 de las 32 estirpes celulares resistentes a zeocina fueron capaces de absorción de glucosa detectable. Las velocidades de absorción oscilaron entre una superior de 8,8 a 2,0 nmoles \cdot (10^{8} células \cdot min.)^{-1} (Tabla E). Las estirpes celulares con velocidades de absorción de 1,6 nmoles de glucosa (10^{8} células \cdot min.)^{-1} o mayores (11 de 28) fueron capaces de crecer en glucosa en la oscuridad. Para los transformantes que contienen hup1 14 de cada 25 estirpes celulares resistentes a antibióticos fueron capaces de absorción de glucosa. Las velocidades de absorción oscilaron entre 1,72 hasta 0,06 nmoles \cdot (10^{8} células \cdot min.)^{-1} (Tabla F). Las estirpes celulares con velocidades de absorción de 0,29 nmoles \cdot (10^{8} células \cdot min.)^{-1} o mayores (11 de 25) fueron capaces de crecer en la oscuridad. Ninguno de los transformantes de P. tricornutum transformado con vectores que contienen los transportadores de levadura fueron capaces de detectar la absorción de glucosa. La presencia de los genes hxt 1, 2 ó 4 o los productos génicos en las células no se confirmó. La incapacidad de los transformantes para expresar la proteína funcional Hxt puede reflejar diferencias sorprendentes en la utilización del codón entre la levadura y P. tricornutum (Zaslavskaia, et al., 2000).

Once de los glu1 y 11 de los hupI que contienen transformantes presentaban crecimiento detectable en placas de agar-agar o en medio líquido que contiene glucosa al 0,1% después de 2 a 4 semanas en completa oscuridad. Los transformantes que contienen glut1 con velocidades de absorción mayores de 2,0 nmoles \cdot (10^{8} células \cdot min.)^{-1} fueron capaces de crecimiento en la oscuridad en glucosa. Todos los Hup1 que contienen transformantes con velocidades de absorción de glucosa superiores a 0,29 nmoles \cdot (10^{8} células \cdot min.)^{-1} las células fueron capaces de crecimiento heterotrófico.

Para confirmar que el procedimiento de transformación y/o inserción del ADN extraño no producía conversión trófica, aproximadamente 100 estirpes celulares transformadas con pPha-T1 que contenían una variedad de genes heterólogos (uidA gfp, nat y nptII), pero no transportadores de glucosa, se colocaron sobre glucosa (0,1%) que contenía el medio sólido. Ninguna de estas estirpes celulares presentaba crecimiento detectable después de 4 semanas en la oscuridad.

Se determinaron las velocidades de crecimiento heterotrófico para los transformantes Glut-13, Glt-17 y Hup-2. Las tres estirpes celulares presentaban velocidades de división de aproximadamente 0,7 divisiones al día.

TABLA E Velocidades de absorción de glucosa de glut1 que contienen transformantes de P. tricornutum. Las velocidades de absorción se expresan en nmoles \cdot (10^{8} células \cdot min.)^{-1}. Las estirpes celulares capaces de crecimiento heterotrófico se designan con un "+" las células que no presentan crecimiento se designan como "-"

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TABLA F Velocidades de absorción de glucosa de hup1 que contienen transformantes de P. tricornutum. Las velocidades de absorción se expresan en nmoles \cdot (10^{8} células \cdot min.)^{-1}. Las estirpes celulares capaces de crecimiento heterotrófico se designan con un "+" las células que no presentan crecimiento se designan como "-"

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Ejemplo 5

Incorporaciones de inserciones genéticas deseadas

Se utilizaron las estirpes celulares Glut-17 y Hup-2 para examinar la integración y expresión de los transportadores de glucosa respectivos. Basándose en las transferencias Southern (véase la Fig. 2), Glut-17 parece presentar una copia de glut1 y Hup-2 probablemente presenta múltiples copias de hup1. Las transferencias de ARN (véase, la Fig. 3) indican que cada estirpe celular produce un transcrito del tamaño esperado.

Preparación de ácidos nucleicos: Para la preparación del ADN completo, se sedimentaron las células por centrifugación (5.000 \times g durante 10 min.), se lisaron con Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS al 1,0%, DTT 10 mM, 10 \mug/ml de proteasa K, 20 \mug/ml de ARNasa A y se incubaron a 37ºC durante 15 min. El lisado se extrajo con un volumen de fenol:cloroformo (1:1) y de nuevo con un volumen de cloroformo. Se recogió la fase acuosa y se prepararon 1,2 g/ml de CsCl y 0,2 mg/ml de bromuro de etidio antes de la centrifugación en un agitador Beckman V665.2 durante 6 h. a 55.000 rpm. Se recogió la banda de ADN, se extrajo con butanol, se precipitó con 2 volúmenes de etanol y se volvió a poner en suspensión en TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) hasta una concentración final de 1 mg/ml. Se extrajo el ARN utilizando el procedimiento de Chomczynski, (1994, "Single-step method of total RNA isolation by acid guanidine-phenol extraction". En: Celis J. E. (ed.) Cell Biology: a laboratory handbook, Vol. I. Academic Press, San Diego, págs. 680-683).

Condiciones de la electroforesis en gel y de hibridación: Se redisolvió el ADN en geles de agarosa en tampón TAE (Maniatis et al.. 1982). Los ácidos nucleicos se transfirieron a filtros Nutran (Schleicher y Schuell) y se reticularon con luz UV utilizando un Stratalinker (Stratagene). Se realizaron hibridaciones en una estufa rotativa Bachofer a 65ºC durante la noche en 5 \times SSFE, 1% de SDS, 5 \times Denhardt y 100 \mug/ml de ADN, según los protocolos normalizados (Sambrook et al. 1989). Siguiendo las hibridaciones, se lavaron los filtros tres veces durante 30 min. a la temperatura de hibridación en tampón fosfato 50 mM que contenía SDS al 0,1%. Los filtros se secaron a continuación y se expusieron a película de rayos X durante 1 a 4 d (Kodak XAR5). El ADN total se redisolvió en un gel de agarosa que contenía formaldehído según el procedimiento de Rosen, et al. (1990, "Optimizing the Northern blot procedure", Biotechniques 8:398-403).

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Ejemplo 6

Localización de la proteína expresada a partir del gen insertado

Se llevó a cabo una caracterización más detallada para numerosos transformantes de Glut, incluyendo Glut-17 y Glut GFP-40. Esta última cepa se transformó con pPha-T 1 que alberga el gen glut1 fusionado a GFP. Las células transformadas se descompusieron utilizando MinibeadBeater mediante dos ciclos de rotura a toda velocidad (30 s. para cada ciclo con 3 a 5 min. de enfriamiento en hielo entre ciclos) y se sedimentaron las membranas por centrifugación a 100.000 \times g durante 30 y a continuación se disolvieron en SDS al 2%. Las proteínas disueltas se redisolvieron en un gel de poliacrilamida al 7,5%, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Towbin, et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350) y las proteínas Glut1 o GFP se detectaron inmunológicamente (Liscum, et al., (1995) Plant Cell, 7:473). Los anticuerpos monoespecíficos contra el polipéptido Glut1 y GFP se utilizaron para demostrar la acumulación de Glut1 o la proteína de fusión Glut1GFP en las estirpes celulares transformadas.

Las membranas del transformante Glut-17 contenían dos polipéptidos principales que reaccionaron con anticuerpos específicos para Glut1 (Fig. 4). Estos polipéptidos poseían masas moleculares de 44 y 39 kDa, que es inferior a la de la proteína natural (aproximadamente 55 kDa) sintetizada en eritrocitos humanos (Fig. 4, compara las bandas B y G1-17), pero que está comprendida en el tamaño de Glut1 no glucosilada (38 kDa) (Asano, et al. (1991) J. Biol. Chem., 266:24632). Esto implica que el Glut1 que se acumula en P. tricornutum está glucosilado de forma diferente que en los eritrocitos humanos. La proteína de fusión Glut1GFP presente en el transformante Glut1 GFP-40 presentó una masa molecular de aproximadamente 75 kDa, que es también ligeramente más pequeña que el tamaño esperado de Glut1GFP (82 kDa).

Para determinar la posición subcelular de la proteína Glut 1 en las estirpes transformadas, se examinó la cepa Glut1GFP-40 para la fluorescencia de GFP por microscopia confocal. Las células se untaron ligeramente en cubreobjetos (nº1 1/2) y se montaron en una capa fina de agua de mar artificial. Se llevó a cabo la microscopía confocal utilizando objetivo de inmersión en agua Nikon 60\times N.a.=1.2 en un microscopio invertido Nikon TMD 200 fijado con un cabezal confocal BioRad MRC 1024 montado en una configuración Koehler. EGFP se excitó a 488 nm y se observó con un filtro de paso de banda 522/25 nm. La autofluorescencia del plástido se excitó a 456 nm y se observó con un filtro de paso de 585 nm de longitud. Se ajustaron las imágenes en Adobe Photoshop tal como referencia y las imágenes experimentales se trataron idénticamente. Se realizaron únicamente ajustes lineales de contraste y brillo en las imágenes originales.

Mientras que las células no transformadas presentaban fluorescencia de clorofila intensa en el canal rojo de fluorescencia, solamente una pequeña cantidad de fluorescencia se observó en el canal verde (Fig. 6, panel superior). Las células transformadas para expresar GFP a partir del vector pPha-T1 excitaron fluorescencia GFP intensa en un modelo coherente con la localización en el citosol y el lumen de los núcleos celulares (Fig. 6, parte inferior izquierda). Una distribución similar de GFP soluble en las células vegetales se ha observado (Chiu, et al. (1996) Curr. Biol., 6:325; Haseloff, et al. 1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:2122). En cambio, cuando el montaje híbrido Glut1GFP se introduce en las células de diatomeas la mayoría de la fluorescencia está asociada a la periferia extrema de las células (Fig. 6, parte inferior derecha). Estos resultados demuestran que la proteína Glut 1 dirige GFP a la corteza de la célula, modelo coherente con la localización de la proteína híbrida para la membrana citoplásmica y la función de Gluti como transportador asociado a la membrana citoplásmica.

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Ejemplo 7

Cinética de la absorción de glucosa por las células transformadas

La cinética de la absorción de la glucosa detallada se realizó en varios transformantes que contienen glut, que crecieron bien en el medio que contenía glucosa. Se recogieron a 4.500 rpm (agitador SA600) 200 a 500 ml de células P. tricornutum transformadas en crecimiento en fase logarítmica durante 10 min., se lavaron 2 veces, se volvieron a poner en suspensión y se hizo el recuento completo con medio I.O. al 50%. Se iniciaron los análisis añadiendo glucosa no marcada (a la concentración apropiada) de una solución madre de 0,1 M en I.O. al 50% y D-^{14}C-glucosa (ICN) a 0,05 \muCi por ml; se mantuvieron las células a la luz durante el ensayo. Se retiraron las muestras (800 \mul) de la mezcla del ensayo a intervalos de tiempo específicos (0, 2, 5, 10 y 15 min.) siguiendo la adición de la glucosa marcada. Se filtraron las células sobre membranas Supor (polietersulfona) (Gelman Scientific) y se lavaron con medio I.O. al 50% que contenía glucosa no marcada al 1%. Se transfirieron las membranas a viales de centelleo con 5 ml de Scintisafe (Fisher), incubado durante 1 h, a 20ºC y a continuación se hizo el recuento.

Los transformantes Glut-13, Glut-17 y Glut GFP-40 presentaban velocidades elevadas de absorción de glucosa (Fig. 5). El transformante Glut-13 presentó una Km de 1,2 mM y una V_{máx} de 1,4 a 3 nmoles de glucosa (10^{8} células \cdot min.)^{-1}. Glut-17 presentó una Km de 0,9 mM y una V_{máx} de 1 a 5 nmoles de glucosa (10^{8} células \cdot min.)^{-1} El transformante Glut-17 presentó una Km para glucosa de 1,2 mM y una V_{máx} de 7,6 nmoles de glucosa (10^{8} células \cdot min.)^{-1} mientras que el transformante Glut]GFP-40 presentó una Km de aproximadamente 1,0 mM y una Vmax de 13 nmoles de glucosa (10^{8} células \cdot min.)^{-1}. Los valores de K_{m} para la glucosa en los transformantes son similares a los medidos (1 a 2 mM) para eritrocitos humanos (Chisholm, S. W., (2000) Nature, 407:685; Mueckler, et al., 1997). Las diferencias en la V_{máx} reflejan probablemente diferentes niveles de expresión del gen Glut1, que dependerían del punto de integración en el genoma de la diatomea. Para confirmar más que el transportador glut1 está funcionando normalmente se incubó el inhibidor específico Cytochalasin B con la estirpe celular Glut-13. El Cytochalasin B es bien conocido por ser un inhibidor específico del tipo de transportadores de glucosa (Lu, et al., (1997) J. Chromatog., 776:81). En presencia de 5\times10^{-4} de Cytochalasin B glucosa se redujo la absorción a un nivel indetectable. Los datos del inhibidor apoyan además que el transportador heteróglogo Glut1 está funcionando de manera
correcta.

La cinética de la absorción de la glucosa para el transformante Hup-2 se midió también con detalle con una K_{m} de 40 \muM y una V_{máx} de 3 nmoles de glucosa (10^{8} células \cdot min)^{-1}. Los valores de K_{m} son ligeramente superiores a las medidas de los valores publicados para las células de Chlorella intactas y el Hup1 producido en levadura o Xenopus, que fueron de 10 a 20 \muM (Sauer N., Caspari T., Klebl F., Tanner W. (1990) "Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schzosaccharomyces pombe", Proc. Natl. Acad. Sci. 87:7949-52; Aoshima H., Yamada M., Sauer N., Kornor E., Schobert C. (1993) "Heterologous expression of the H+/hexose cotransporter from Chlorella in Xenopus oocytes and its characterization with respect to sugar specificity, pH and membrane potencial", J. Plant Physiol. 141:293-297).

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Ejemplo 8

Comparación del crecimiento a la luz y a la oscuridad de un transformante

Se midió el crecimiento del transformante Glut-17 a la luz y a la oscuridad en medio enriquecido con glucosa. Las concentraciones de glucosa se mantuvieron típicamente entre 5 y 10 g/l. Las velocidades de crecimiento se controlaron en los cultivos mantenidos en 50 ml de medio en matraces de 250 ml con cierres de espuma de silicio. Se tomaron muestras a diario para medir el número de células y las concentraciones de nutriente. Se agitaron los matraces en una plataforma rotativa a 100 rpm. Se cultivaron los cultivos a alta densidad en un fermentador Applikont de 2 l utilizando una velocidad de agitación de 100 rpm, el oxígeno disuelto se mantuvo a > 20% de saturación y el pH fue de 7,5.

Como se muestra en la Fig. 7, tanto las células no transformadas como el transformante Glut-17 se desarrolló a la luz enriquecido aproximadamente las mismas densidades celulares (2\times10^{7} células \cdot ml^{-1}). La adición de glucosa al medio no cambió las características de crecimiento de la cepa no transformada. En cambio, la cepa transformada alcanzó una densidad celular que fue aproximadamente 5 veces superior a la de las células no transformadas (durante un periodo de crecimiento de cinco días). Además, aunque las células no transformadas eran incapaces de crecer en la oscuridad en presencia de glucosa, el transformante Glut-17 creció a la misma velocidad y a la misma densidad celular que cuando se desarrolla en presencia de glucosa a la luz. Sorprendentemente, a medida que los cultivos se volvieron más densos y la absorción de la luz se atenúa por autosombreado, la velocidad de crecimiento del transformante en presencia de glucosa excede de la de las células no transformadas. Si el crecimiento heterotrófico se realiza en un fermentador microbiano con adición continua de glucosa y otros nutrientes al medio, la densidad alcanzada por los cultivos del transformante puede exceder la de las células naturales en 10 a 20 veces, alcanzando densidades de 5\times10^{8} células \cdot ml^{-1}.

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Ejemplo 9

Se producen células mutadas exponiendo las células a la luz U.V. (210 a 260 nm) a concentraciones suficientes para producir >90% de muerte celular.

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Ejemplo 10

Las células mezcladas células mutadas producen por las en líquido con Nitrosoguanidina (mutágeno químico) durante 5 min. a una concentración suficiente para producir >90% de muerte celular. El mutágeno químico se lava en las células y las células se colocan en placas en el medio sólido.

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Ejemplo 11

El gen que codifica el transportador de glucosa en un grupo de células se inactiva mediante una sustitución génica. Se produce un montaje génico que contiene el transportador de glucosa endógeno para las células, con un casete de resistencia a la zeocina (descrito en la presente memoria) insertado en el centro de las zonas de codificación del transportador, produciendo una zona de codificación no funcional del transportador de glucosa. El montaje génico se introduce en las células utilizando bombardeo de micropartículas. Este gen integra y sustituye el transportador de glucosa endógeno funcional. Las células se desarrollan en zeocina. Las células capaces de desarrollarse en zeocina se seleccionan para ambos ensayos para determinar si el transportador de glucosa endógeno ha sido inactivado.

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Ejemplo 12

Las células que se han mutado, como por ejemplo, en los Ejemplos 9, 10 u 11, se cultivan en presencia de desoxiglucosa. Las células que pueden crecer son incapaces de llevar la desoxiglucosa tóxica, lo que indica que no poseen transportadores funcionales de glucosa. Las células sin un transportador funcional de glucosa se seleccionan para los experimentos adicionales.

Un gen que codifica un transportador de glucosa se inserta en las células seleccionadas por los métodos descritos en la presente memoria. Junto con esta transformación, las células se transforman también con un segundo gen ("gen de interés").

Se determina la capacidad de las células para cultivarse en glucosa en la oscuridad, como se describe en la presente memoria. Las células que pueden cultivarse en glucosa en la oscuridad, lo que indica la expresión de un transportador funcional de glucosa, se seleccionan para experimentación adicional con objeto de determinar si han sido también transformadas por el gen de interés.

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otro modo, técnicas de biología molecular convencional, microbiología y de ADN recombinante dentro de la experiencia en la materia. Dichas técnicas son bien conocidas por los expertos en la materia y se explican completamente en la bibliografía. Véase, p. ej., Sambrook, J., Maniatis, T. y Fritsch, E. F. (1939), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; "DNA Cloning: A Practical Approach", volúmenes I y II (D. N. Glover, ed., 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B. D. Hames y S. J. Higgins, eds., 1985); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); "Animal Cell Culture".

Claims (8)

1. Procedimiento para aumentar heterotróficamente el número de células de algas que comprende el cultivo de algas en un fermentador a la luz que es insuficiente para soportar a largo plazo el crecimiento de algas fototróficas estrictas y en presencia de una fuente de carbono catalizable por un monosacárido o un disacárido, siendo dichas algas de una cepa que es fototrófica estricta, en el que las algas expresan el ácido nucleico híbrido que codifica una proteína transportadora de hexosa a un mamífero que transporta la fuente de carbono catalizable a las células de las algas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la célula del alga es una célula de microalgas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteína es un transportador de disacáridos.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el transportador de hexosa es Glut 1.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que antes de cultivar las algas se transforman con ADN que comprende un gen que codifica la proteína transportadora y las células transformadas que pueden crecer en la fuente de carbono catalizable en la oscuridad se seleccionan para el cultivo.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el gen que codifica una proteína transportadora se acopla con un gen seleccionable, y después de la transformación, las algas transformadas se hacen crecer en un medio selectivo para el gen seleccionable antes de seleccionar las algas que pueden crecer en la fuente de carbono catalizable en ausencia sustancial de luz.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el gen seleccionable proporciona resistencia a un antibiótico en las células transformadas y el medio selectivo contiene el antibiótico.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el alga es un alga marina.