CN107988129B - 改良螺旋藻关键酶基因提高生长固碳速率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物质能利用技术，旨在提供一种改良螺旋藻关键酶基因提高生长固碳速率的方法。包括：利用基因编辑技术对螺旋藻细胞中的四个关键酶的基因表达量进行调整以实现基因改良；取基因改良后的螺旋藻藻株，置于光生物反应器中进行多试管单个藻株纯化和扩大培养；每天采集各试管中的藻液，测试螺旋藻的固定二氧化碳速率，取固定二氧化碳速率的数值最大的样本作为改良后的螺旋藻藻株。本发明能增强螺旋藻的叶绿素合成通路及三羧酸循环通路，提高螺旋藻细胞光合利用效率及能量供给，进而提高螺旋藻的生长固碳速率，是一种高效可行的提高螺旋藻生长固碳速率方法。
Description
技术领域
本发明是关于生物质能利用和二氧化碳减排技术，特别涉及一种改良螺旋藻关键酶基因提高生长固碳速率的方法。
背景技术
随着大气CO2浓度提高，温室效应问题越来越引起全世界的关注。在众多尝试减排大气CO2的方法中，利用微藻来减排CO2的生物工程技术已经被广泛地研究了数十年(Sivakumar et al.2014)。微藻因其高固碳效率及高油脂含量，成为了可被持续利用的生物燃油制备的底物(Breuer et al.2012；Hu et al.2008)。此外，吸收利用燃煤电厂烟气中高浓度的CO2(15vol.％)可以协助降低CO2的排放，又可以节省微藻培养基中所需的碳源(Cheng et al.2015)。螺旋藻作为一种生长迅速的蓝藻，提高其生长固碳速率不仅对于吸收CO2减缓温室效应有很大作用，收获的生物质还可以用作食品或饲料(Panyakampol etal.,2015)。螺旋藻不但具有很高的生长固碳速率，富含蛋白质和色素，而且还可以在高pH及高盐度下生存来减少细菌的污染(Tan et al.2015)，为其户外大规模养殖提供了强大的竞争优势。利用螺旋藻细胞中关键酶基因改良增强代谢通路，可以从根本上改变藻株的固有生长特性，进一步提高其生长固碳速率。
目前已有许多方法试图通过改变外界条件来提高螺旋藻的生长固碳速率。(Ogbonda et al.2007)通过调节CO2浓度，发现4％-10％浓度的CO2可以提高螺旋藻的生长固碳速率。此外还有通过调整营养盐添加量，增加光照强度等方法来提高螺旋藻生长固碳速率。但是这些方法都只是通过改变外界条件来提高微藻的生长固碳速率，而对于微藻本身并没有任何改变。对螺旋藻基因层面的改良来提高其生长固碳速率的研究十分有限。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是克服现有技术的不足，提供一种改良螺旋藻关键酶基因提高生长固碳速率的方法。
为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种改良螺旋藻关键酶基因提高生长固碳速率的方法，包括下述步骤：
(1)利用基因编辑技术对螺旋藻细胞中的四个关键酶bchG、bchP以及DLD、ACO的基因表达量进行调整以实现基因改良：叶绿素合成酶bchG由120～140上调到310～350，双香叶基还原酶bchP由80～100上调到630～670，二氢硫辛酰胺脱氢酶DLD由100～120上调到320～360，乌头酸水合酶ACO由170～190上调到460～500；
(2)取基因改良后的螺旋藻藻株，置于光生物反应器中进行多试管单个藻株纯化和扩大培养；
(3)每天采集各试管中的藻液，测试螺旋藻的固定二氧化碳速率，取固定二氧化碳速率的数值最大的样本作为改良后的螺旋藻藻株。
本发明中，所述步骤(2)中，在光生物反应器中的培养条件为：采用螺旋藻标准培养基，藻液体积为300毫升，控制藻液接种密度为0.1克/升，温度为27℃，光照强度为7000Lux，持续通入空气流量为30毫升/分钟。
本发明中，所述步骤(3)中，螺旋藻固定二氧化碳速率的测试具体包括以下步骤：
a、每天取各藻液样品10毫升，用离心机7500转/分钟离心5分钟，倒掉上清液；然后在105℃下烘干24小时至恒重，称量并计算生物质密度DW；
b、螺旋藻生长速率的计算方法如下：u(g/L/day)＝(DW2-DW1)/(t2-t1)，其中DW2为t2＝第5天时的生物质密度(g/L)，DW1为t1＝第4天时的生物质密度(g/L)；
c、螺旋藻固定二氧化碳速率的计算方法如下：R(g/L/day)＝u×C×44/12，其中C为t2＝第5天时和t1＝第4天时测得螺旋藻生物质中碳元素重量百分比的平均值。
发明原理描述：
叶绿素合成通路是藻细胞合成叶绿素利用光能的代谢通路，该通路的增强可以提高藻细胞对光能的利用效率；三羧酸循环通路是藻细胞获得能量最有效的方式，该通路的增强可以提高藻细胞的能量供应，供给细胞增殖需要能量的代谢过程。该两个代谢通路对于螺旋藻的生长固碳过程是至关重要的。
对螺旋藻细胞中叶绿素合成酶bchG和双香叶基还原酶bchP的基因表达量进行调整，能促进类叶绿素与植基二磷酸生成叶绿素和二磷酸的化学反应，从而增强螺旋藻细胞的叶绿素合成代谢通路，提高叶绿素含量以及光能向生物质能的转化效率。对螺旋藻细胞中二氢硫辛酰胺脱氢酶DLD和乌头酸水合酶ACO的基因表达量进行调整，能促进丙酮酸向乙酰辅酶A转化反应以及柠檬酸盐向异柠檬酸盐转化反应，从而增强螺旋藻细胞的三羧酸循环代谢通路，为提高螺旋藻生长固碳速率提供能量物质基础。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过上调叶绿素合成通路中叶绿素合成酶bchG和双香叶基还原酶bchP，以及三羧酸循环通路中二氢硫辛酰胺脱氢酶DLD和乌头酸水合酶ACO的基因表达量，来增强螺旋藻的叶绿素合成通路及三羧酸循环通路，提高螺旋藻细胞光合利用效率及能量供给，进而提高螺旋藻的生长固碳速率。使螺旋藻的生长速率由关键酶基因改良前的0.4g/L/day提高到0.6～0.9g/L/day，固碳速率由关键酶基因改良前的0.73g/L/day提高到1.1～1.65g/L/day，是一种高效可行的提高螺旋藻生长固碳速率方法。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
首先需要说明的是，利用基因编辑技术对酶的基因表达量进行调整以实现基因改良，属于本领域技术人员熟练掌握的技能。因其不属于本发明创新内容，故不再赘述。
实施例1
(1)利用基因编辑技术对螺旋藻细胞中的四个关键酶bchG、bchP以及DLD、ACO的基因表达量进行调整以实现基因改良：叶绿素合成酶bchG的基因表达量由120上调到310，双香叶基还原酶bchP的基因表达量由80上调到630，二氢硫辛酰胺脱氢酶DLD的基因表达量由100上调到320，乌头酸水合酶ACO的基因表达量由170上调到460。
(2)取基因改良后的螺旋藻藻株，置于光生物反应器中进行多试管单个藻株纯化和扩大培养。培养条件为：采用螺旋藻标准培养基，藻液体积为300毫升，控制藻液接种密度为0.1克/升，温度为27℃，光照强度为7000Lux，持续通入空气流量为30毫升/分钟。
(3)每天采集各试管中的藻液，按下述方法分别测试其生长固碳速率：离心去上清液，烘干至恒重，称量并计算生物质密度DW；计算各样本的螺旋藻固定二氧化碳速率，取固定二氧化碳速率的数值最大的样本作为改良后的螺旋藻藻株。测试藻株生长固碳速率的具体方法是：每天各藻液样品10毫升，用离心机7500转/分钟离心5分钟，倒掉上清液，然后在105℃下烘干24小时至恒重，称量并计算生物质密度DW；螺旋藻生长速率的计算方法如下：u(g/L/day)＝(DW2-DW1)/(t2-t1)，其中DW2为t2＝第5天时的生物质密度(g/L)，DW1为t1＝第4天时的生物质密度(g/L)；螺旋藻固定二氧化碳速率的计算方法如下：R(g/L/day)＝u×C×44/12，其中C为t2＝第5天时和t1＝第4天时测得螺旋藻生物质中碳元素重量百分比的平均值。螺旋藻经过关键酶基因改良后，生长速率达到0.6g/L/day，固碳速率达到1.1g/L/day。
实施例2
(1)利用基因编辑技术对螺旋藻细胞中的四个关键酶bchG、bchP以及DLD、ACO的基因表达量进行调整以实现基因改良：叶绿素合成酶bchG的基因表达量由130上调到330，双香叶基还原酶bchP的基因表达量由90上调到650，二氢硫辛酰胺脱氢酶DLD的基因表达量由110上调到340，乌头酸水合酶ACO的基因表达量由180上调到480。
(2)取基因改良后的螺旋藻藻株，置于光生物反应器中进行多试管单个藻株纯化和扩大培养。培养条件为：采用螺旋藻标准培养基，藻液体积为300毫升，控制藻液接种密度为0.1克/升，温度为27℃，光照强度为7000Lux，持续通入空气流量为30毫升/分钟。
(3)每天采集各试管中的藻液，按下述方法分别测试其生长固碳速率：离心去上清液，烘干至恒重，称量并计算生物质密度DW；计算各样本的螺旋藻固定二氧化碳速率，取固定二氧化碳速率的数值最大的样本作为改良后的螺旋藻藻株。测试藻株生长固碳速率的具体方法是：每天各藻液样品10毫升，用离心机7500转/分钟离心5分钟，倒掉上清液，然后在105℃下烘干24小时至恒重，称量并计算生物质密度DW；螺旋藻生长速率的计算方法如下：u(g/L/day)＝(DW2-DW1)/(t2-t1)，其中DW2为t2＝第5天时的生物质密度(g/L)，DW1为t1＝第4天时的生物质密度(g/L)；螺旋藻固定二氧化碳速率的计算方法如下：R(g/L/day)＝u×C×44/12，其中C为t2＝第5天时和t1＝第4天时测得螺旋藻生物质中碳元素重量百分比的平均值。螺旋藻经过关键酶基因改良后，生长速率达到0.8g/L/day，固碳速率达到1.5g/L/day。
实施例3
(1)利用基因编辑技术对螺旋藻细胞中的四个关键酶bchG、bchP以及DLD、ACO的基因表达量进行调整以实现基因改良：叶绿素合成酶bchG的基因表达量由140上调到350，双香叶基还原酶bchP的基因表达量由100上调到670，二氢硫辛酰胺脱氢酶DLD的基因表达量由120上调到360，乌头酸水合酶ACO的基因表达量由190上调到500。
(2)取基因改良后的螺旋藻藻株，置于光生物反应器中进行多试管单个藻株纯化和扩大培养。培养条件为：采用螺旋藻标准培养基，藻液体积为300毫升，控制藻液接种密度为0.1克/升，温度为27℃，光照强度为7000Lux，持续通入空气流量为30毫升/分钟。
(3)每天采集各试管中的藻液，按下述方法分别测试其生长固碳速率：离心去上清液，烘干至恒重，称量并计算生物质密度DW；计算各样本的螺旋藻固定二氧化碳速率，取固定二氧化碳速率的数值最大的样本作为改良后的螺旋藻藻株。测试藻株生长固碳速率的具体方法是：每天各藻液样品10毫升，用离心机7500转/分钟离心5分钟，倒掉上清液，然后在105℃下烘干24小时至恒重，称量并计算生物质密度DW；螺旋藻生长速率的计算方法如下：u(g/L/day)＝(DW2-DW1)/(t2-t1)，其中DW2为t2＝第5天时的生物质密度(g/L)，DW1为t1＝第4天时的生物质密度(g/L)；螺旋藻固定二氧化碳速率的计算方法如下：R(g/L/day)＝u×C×44/12，其中C为t2＝第5天时和t1＝第4天时测得螺旋藻生物质中碳元素重量百分比的平均值。螺旋藻经过关键酶基因改良后，生长速率达到0.9g/L/day，固碳速率达到1.65g/L/day。
最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种改良螺旋藻关键酶基因提高生长固碳速率的方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）利用基因编辑技术对螺旋藻细胞中的四个关键酶叶绿素合成酶bchG、双香叶基还原酶bchP以及二氢硫辛酰胺脱氢酶DLD、乌头酸水合酶ACO的基因表达量进行上调，以实现基因改良；
（2）取基因改良后的螺旋藻藻株，置于光生物反应器中进行多试管单个藻株纯化和扩大培养；
（3）每天采集各试管中的藻液，测试螺旋藻的固定二氧化碳速率，取固定二氧化碳速率的数值最大的样本作为改良后的螺旋藻藻株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，在光生物反应器中的培养条件为：采用螺旋藻标准培养基，藻液体积为300毫升，控制藻液接种密度为0.1克/升，温度为27℃，光照强度为7000Lux，持续通入空气流量为30毫升/分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，螺旋藻固定二氧化碳速率的测试具体包括以下步骤：
a、每天取各藻液样品10毫升，用离心机7500转/分钟离心5分钟，倒掉上清液；然后在105°C下烘干24小时至恒重，称量并计算生物质密度DW；
b、螺旋藻生长速率的计算方法如下：u(g/L/day)=（DW2-DW1）/（t2-t1），其中DW2为t2=第5天时的生物质密度(g/L)，DW1为t1=第4天时的生物质密度(g/L)；
c、螺旋藻固定二氧化碳速率的计算方法如下：R(g/L/day)=u×C×44/12，其中C为t2=第5天时和t1=第4天时测得螺旋藻生物质中碳元素重量百分比的平均值。
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