KR101660805B1 - Glut-1 유전자로 형질전환된 형질전환체 및 그 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Glut-1 유전자로 형질전환된 형질전환체 및 그 배양방법에 관한 것으로, 특히, Glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이 및 상기 형질전환체의 바이오매스를 획기적으로 증가시켜, MAA 대량 생산에 활용할 수 있는 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 클라미도모나스 헤드레이이 형질전환체는 Glut-1 유전자로 형질전환된 미세조류로써, 이러한 형질전환체의 바이오매스를 증가시키는 배양 방법을 통하여, 시노린, 포르피라와 같은 MAA 대량 생산에도 유용하게 활용할 수 있다.

Description

Glut-1 유전자로 형질전환된 형질전환체 및 그 배양방법{Transformant transformed by Glut-1 gene and Methods for culturing the Same}

본 발명은 Glut-1 유전자로 형질전환된 형질전환체 및 그 배양방법에 관한 것으로, 특히, Glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이 및 상기 형질전환체의 바이오매스를 획기적으로 증가시켜, MAA 대량 생산에 활용할 수 있는 배양방법에 관한 것이다.

일반인들에게 잘 알려진 미역, 다시마, 김등의 해조류뿐만 아니라 클로렐라와 같은 단일 세포로 구성된 미세조류를 포괄적으로 연구하는 학문을 조류학(藻類學; Phycology)이라한다. 조류학은 미역, 다시마, 파래 등의 해조류(seaweed)를 포함하는 모든 조류(藻類, algae)에 관한 학문이나 미세조류는 선태식물, 양치식물이나 관속식물 이외의 광합성 식물을 대상으로 하는 생물 중에 해조류를 제외하고 현미경적 크기의 생물만을 의미한다.

미세조류는 미생물계에 속하나 분해자의 역할이 아니라 대기 중에 이산화탄소를 흡수하여 광에너지의 도움으로 식물처럼 광합성을 하여 유기물질을 합성하는 독립영양을 하는 생산자 역할을 한다. 반면에 약 35억년 전에 처음으로 지구상에 출현한 남세균은 광합성을 하면서 세균처럼 질소고정을 하는 원핵세포 생물로서 미생물 중에 세균에 포함된다.

미세조류는 진핵세포로 구성되어 식물의 생리적 기작과 유사하나 고등식물보다 생물주기가 짧고, 세포분열 능력이 띄어나 식물의 광합성 원리 연구를 위한 실험시료로 널리 이용되고 있다.

미세조류는 엽록소를 가지고 있는 광합성 생물로서 식물과 더불어 지구 생태계의 유기물 합성자로서의 역할을 담당하고 있으며, 다른 미생물들과 같이 식량과 대체에너지 및 고부가 가치의 의료용 물질 등 산업적으로 유용한 물질을 생산하고, 환경문제 해결에도 기여하는 등 긍정적인 면과 함께 부영양화현상처럼 수계 수질을 악화시키는 부정적인 측면에서 인류 사회 및 경제 발전에 많은 영향을 주고 있다.

오늘날은 생명공학기술의 급속한 발전으로 미세조류의 산업적 이용가치가 높아지고 있다. 각자 고유한 유전적 형질을 지니고 있으며, 인간에게 유용한 식량자원으로서 뿐만 아니라 다양한 기능성 생리활성물질 (항산화제, 항암제, 면역조절제, 항피부노화제 등), 기능성 식품 및 향장 소재, 친환경소재 등을 제공하고 있다.

미세조류의 생명공학적 연구는 대체에너지원, 건강기능성식품, 건강보조식품, 피부 화장료, 피부 외용제, 보습제, 방향성 식물 활성제, 수산양식용 사료, 의약품 개발을 위한 천연화합물 분석, 그외 고부가가치를 지니는 특정 색소, 탄수화물, 아미노산, 불포화지방 생산과 오폐수처리, 비료, 에너지를 생산하기 위한 미세조류의 대량생산을 위한 광생물반응기와 발효조 배양법에 의한 연구개발을 위한 생물공학적 연구가 광범위하게 진행되고 있다. 특히 미세조류의 세포밀도가 다른 미생물에 비해 상대적으로 낮아 배양 공정의 경제적 효율성의 확보를 위해 환경산업과 연계되어 폐자원(축산폐수, 산업폐기물 등)을 이용하여 대량 배양에 소요되는 경비 절감을 유도하여 생산성을 높이는 연구개발도 진행 중이다.

미세조류의 단백질, 비타민, 미네랄, 불포화지방산, 다당류 등 다양한 영양성분과 각종 유용물질인 생리활성물질을 이용한 면역증강(항균, 항암 예방효과), 세포부활, 혈압강화, 간의 지방질 감소 및 간기능 회복 등의 효과에 대한 연구와 뇌졸증과 백내장 개선, 예방 및 치료제, 리파아제 활성 촉진제 등의 연구와 광합성 색소를 이용한 항산화제, 여드름 예방 치료제, 항염효과, 항세균, 항진균, 항바이러스, 신경활성, 림프성 백혈병, 혈장 콜레스테롤 저하를 유도하여 고혈압과 심장병을 예방하는 기능성 탐색을 위한 활성 연구가 활발히 진행되고 있다.

미세조류 바이오소재 기술을 활용한 산업분야는 1. 미세조류를 이용해서 수질오염원이 되는 질소와 인(최근에는 물속의 방사선 물질까지 흡수하는 생물로서 확인됨)을 제거하여 수질을 정화하고, 수질 생태계를 복원하면서 이때 대량생산된 바이오매스를 바이오에너지, 비료 등으로 재활용하는 사업 분야, 2. 미세조류의 생리활성 물질을 고농도로 유도하여 수율이 높은 바이오소재로 개발하여 건강식품, 화장품, 약품소재를 활용하여 제품화 할 수 있는 사업분야, 3. 미세조류를 지표생물로 활용하여 수질의 오염 정도와 민물과 바다의 환경의 건강성을 분석하고 예측할 수 있는 환경영향평가 등에 활용되는 지표생물로 활용 된다(김과 김 1999).

특히, 클로렐라(Chlorella)를 비롯한 스피루리나(Spirulina), 두나리엘라 (Dunaliella), 헤마토코크스(Haematococcus)와 같은 미세조류를 이용한 건강 식품과 미세조류에서 유래되는 항산화제인 lutein, astaxanthin, cantaxanthin 등은 이미 선진 외국에서 개발 연구되어 항산화 효과가 기존의 vit E (토코페롤), beta-carotene 보다 월등하다는 임상보고가 잇따라 발표되고 있으며 astaxanthin의 경우는 2500 $/㎏의 고부가가치의 상품으로서 미국에서만도 매출 규모가 수십억 $ 이상을 기록하고 있다.

미세조류는 첫째) 산업화가 용이하고, 둘째) 기능성 생리활성물질의 체내 부존도가 상대적으로 풍부하고, 셋째) 상대적 부가가치가 높은 광합성 미생물이다. 또한 유전자 재조합 기술이 없이도 배양조건에 따라 부가가치 산물을 최적화하여 대량생산을 유도할 수 있는 특징을 가지고 있다

미세조류로부터 바이오디젤 생산의 주요 공정은 ①미세조류 탐색 및 기능강화(균주 개량), ② 미세조류의 고밀도 대량배양, ③ 미세조류의 효율적 수확, ④미세조류 바이오매스로부터 유용물질 및 바이오연료생산으로 구분해 볼 수 있다. 특히, 미세조류를 고밀도 대량배양하는 과정은 산업적으로 중요하며, 이러한 미세조류의 대량배양을 통하여 바이오매스로부터 의약용 물질, 기능성 식품, 수산양식용 사료, 동물사료 등의 고부가 유용물질을 생산하여 경제적 가치를 창출할 수 있다. 즉, 미세조류 생명공학은 생물산업의 활성화와 함께 이산화탄소의 저감 등 환경산업의 발전을 도모할 수 있는 유망한 미래 산업으로서 앞으로 큰 발전이 기대된다.

이러한 대부분의 미세조류는 스스로 광합성을 하며 그들의 성장은 광합성작용으로 유래된 에너지의 생성에 절대적으로 의존한다. 여기서 우리는 미세조류, Chlamydomonas hedleyi,에 Glucose transporter 1(Glut-1) 유전자를 유전학적으로 도입하여 형질전환체를 만들었다. 이렇게 만들어진 Glut-1형질전환체 미세조류는 빛이 없는 조건에서 외부에서 공급되는glucose만으로 자랄 수 있다. 이러한 사실은 생물체의 metabolism에서의 근본적인 변화가 하나의 유전자의 도입을 통해 이루어 질 수 있다는 것을 증명한다. 또한, 이러한 기술은 빛에 의존하는 생장에 대한 한계성을 극복하여 상업적으로 대량생산을 위한 근본적인 토대를 마련해준다.

이러한 미세조류를 이용한 종래의 기술로는 형질전환된 미세조류를 생산하는 방법(특허문헌 1) 에 관한 기술, 형질전환된 미세조류를 이용하여 외래 단백질을 생산하는 방법 (특허문헌 2) 에 관한 기술들이 존재하나, 본 발명에서와 같이 바이오매스 증가를 통한 MAA 대량 생산을 목적으로 특정 유전자가 삽입된 미세조류를 제작하는 경우는 거의 전무한 실정이다.

특허문헌 1: 제10-2000-41692호 특허문헌 2: 제10-2000-75076호

본 발명자들은 미세조류, 클라미도모나스 해들레이이(Chlamydomonas hedleyi)에 Glucose transporter 1(Glut-1) 유전자를 유전학적으로 도입하여 형질전환체를 만들었다. 이렇게 만들어진 Glut-1 형질전환체 미세조류는 빛이 없는 조건에서 외부에서 공급되는 글루코스만으로 자랄 수 있어, 생물체의 metabolism에서의 근본적인 변화가 하나의 유전자의 도입을 통해 이루어 질 수 있다는 것을 증명할 뿐만 아니라, 빛에 의존하는 생장에 대한 한계성을 극복하여 상업적으로 대량생산을 위한 근본적인 토대를 마련해준다.

따라서, 본 발명의 목적은 Glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 제공하는데 있다.

본 발명에 있어서, 상기 Glut-1 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 클라미도모나스 해들레이이일 수 있다.

본 발명의 목적은 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 함유하는 MAA 생산용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명에 있어서, 상기 클라미도모나스 해들레이이는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 Glut-1 유전자로 형질전환된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 MAA는 포르피라 또는 시노린인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 클라미도모나스 해들레이이를 암 조건에서 글루코스 함유 배지에 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 클라미도모나스 헤드레이이의 배양 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 Glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 Glut-1 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 클라미도모나스 해들레이일 수 있다.

본 발명은 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 함유하는 MAA 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 클라미도모나스 해들레이이는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 Glut-1 유전자로 형질전환된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 MAA는 포르피라 또는 시노린인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 클라미도모나스 헤드레이이를 암 조건에서 글루코스 함유 배지에 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 클라미도모나스 해들레이이의 배양 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 클라미도모나스 헤드레이이 형질전환체는 Glut-1 유전자로 형질전환된 미세조류로써, 이러한 형질전환체의 바이오매스를 증가시키는 배양 방법을 통하여, 시노린, 포르피라와 같은 MAA 대량 생산에도 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 이용된 pCAMBIA 1302의 개열지도(A), 본 발명에서 이용된 프라이머 서열들 (B), 실시예에 따른 Glut-1 클로닝 결과 (C), 헤그로마이신(hegromycin)을 이용한 형질전환체 선택적 발굴 결과(D)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 Glut-1 형질전환된 형질전환체의 형광 현미경 사진 (A 및 B)과 웨스턴 블랏 결과(C)이다.
도 3은 본 발명의 Glut-1 기능을 나타낸 그림(A)과 2-DG6P 스탠다드 커브(B), 형질전환체 내 2-DG uptake를 나타낸 커브(C)이다.
도 4는 본 발명에 따른 형질전환체의 배양시간에 따른 생장 곡선(A)과 글루코스 유/무 또는 빛 유/무에 따른 MAA 생산을 확인한 결과 그래프(B)이다.

본 발명은 일 관점에서 Glut-1 유전자(Glucose transporter member 1, source; Homo sapiens solute carrier family 2)로 형질전환된 미세조류인 클라미도모나스 해들레이이(Chlamydomonas hedleyi)에 관한 것이다.

클라미도모나스 해들레이이(Chlamydomonas hedleyi)는 단세포이며 지름이 약 10 um인 타원체이다. 체내에는 엽록체와 적색 안점이 있다. 편모를 가지고 있으며 이동시 사용하고, 어두운 환경조건에서는 생장이 왕성하지 못하고 편모의 기능을 상실한다. 담수종이 많으나 염분이 적은 기수역, 습토 속이나 고산의 빙설 속 등에서 서식이 가능하다.

본 발명에서 상기 Glut-1 유전자는 Glut-1 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하며, Glut-1 유전자는 서열번호 1의 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, Glut-1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

서열번호 1:

tggcatggcgggttgtgccatactcatgaccatcgcgctagcactgctggagcagctaccctggatgtcctatctgagcatcgtggccatctttggctttgtggccttctttgaagtgggtcctggccccatcccatggttcatcgtggctgaactcttcagccagggtccacgtccagctgccattgccgttgcaggcttctccaactggacctcaaatttcattgtgggcatgtgcttccagtatgtggagcaactgtgtggtccctacgtcttcatcatcttcactgtgctcctggttctgttcttcatcttcacctacttcaaagttcctgagactaaaggccggaccttcgatgagatcgcttccggcttccggcaggggggagccagccaaagtgacaagacacccgaggagctgttccatcccctgggggctgattcccaagtg

서열번호 2:

MEPSSKKLTGRLMLAVGGAVLGSLQFGYNTGVINAPQKVIEEFYNQTWVHRYGESILPTTLTTLWSLSVAIFSVGGMIGSFSVGLFVNRFGRRNSMLMMNLLAFVSAVLMGFSKLGKSFEMLILGRFIIGVYCGLTTGFVPMYVGEVSPTALRGALGTLHQLGIVVGILIAQVFGLDSIMGNKDLWPLLLSIIFIPALLQCIVLPFCPESPRFLLINRNEENRAKSVLKKLRGTADVTHDLQEMKEESRQMMREKKVTILELFRSPAYRQPILIAVVLQLSQQLSGINAVFYYSTSIFEKAGVQQPVYATIGSGIVNTAFTVVSLFVVERAGRRTLHLIGLAGMAGCAILMTIALALLEQLPWMSYLSIVAIFGFVAFFEVGPGPIPWFIVAELFSQGPRPAAIAVAGFSNWTSNFIVGMCFQYVEQLCGPYVFIIFTVLLVLFFIFTYFKVPETKGRTFDEIASGFRQGGASQSDKTPEELFHPLGADSQV

본 발명에 있어서, 상기 Glut-1 유전자로 형질전환된 미세조류인 클라미도모나스 해들레이이는, 공지의 알려진 유전공학적 방법에 따라서 제작될 수 있으며, 구체적으로는, 실시예 1의 공정에 따라 제작될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 Glut-1은 공지의 적절한 벡터에 삽입된 재조합 벡터의 형태로 클라미도모나스 해들레이이에 형질전환될 수 있다.

상기 Glut-1이 삽입될 적절한 벡터로는 예를 들어, pCAMBIA1200, pCAMBIA1300, pCAMBIA1380, pCAMBIA1390, pCAMBIA1201, pCAMBIA1301, pCAMBIA1302, pCAMBIA1303, pCAMBIA1304,pCAMBIA1381, pCAMBIA130191이 있다.

본 발명은 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.

용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명은 또한, Glut-1 유전자로 형질전환된, 예컨대, Glut-1이 삽입된 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체인 클라미도모나스 해들레이이에 관한 것이다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 Glut-1을 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포로써 클라미도모나스 해들레이이가 사용될 수 있으며, 형질전환방법 또한 종래의 알려진 방법들, 예를 들어 직접 아그로박테리움법(Direct agrobacterium), glass bead, electroporation, silicon carbide 등이 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 함유하는 MAA(Mycosporine-like amino acids) 생산용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 Glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 Glucose 함유 배지에 배양함으로써, 특히 암조건에서 배양함으로써, 바이오매스의 획기적 증가가 가능하며 이를 통해 MAA 대량 생산이 가능하다. 이러한 MAA에는 종래 알려져 있는 20 여종의 MAA들이 포함되어 있고, 특히 시노린, 포르피라를 함유하고 있는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 MAA는 포르피라 또는 시노린인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 클라미도모나스 해들레이이를 암 조건에서 글루코스 함유 배지에 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 클라미도모나스 헤드레이이의 배양 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 배양 방법은, 상기 Glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 글루코스 함유 배지에서 배양하되, 바람직하게는 빛이 없는 암조건에서 배양하고,

상기 배지 조성은 전체 배양 배지에 대하여, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O, CaCl₂·2H₂O, C₄H₁₁NO₃, C₁₀H₁₆N₂O₈, BO₃H₃, ZnSO₄·7H₂O, MnCl₂·4H₂O, FeSO₄·7H₂O, CoCl₂·6H₂O, CuSO₄·5H₂O, MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, Glucose, NH₄Cl 을 함유하는 배지 조성물, 일 양태로, 1L 총 배양배지에 대하여,

K₂HPO₄, 0.0972~0.1188; KH₂PO₄, 0.0504~0.0616; MgSO₄·7H₂O, 0.09~0.11; CaCl₂·2H₂O, 0.045~0.055; C₄H₁₁NO₃, 2.1798~2.6642; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.045~0.055; BO₃H₃, 0.01026~0.01254; ZnSO₄·7H₂O, 0.0198~0.0242; MnCl₂·4H₂O, 0.004554~0.005566; FeSO₄·7H₂O, 0.004491~0.005489; CoCl₂·6H₂O, 0.001449~0.001771; CuSO₄·5H₂O, 0.001503~0.001837; MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, 0.00099~0.00121; Glucose 2~25g, 바람직하게는, 5~15, 5~10, 2~10g, 바람직하게는, 5~15, NH₄Cl 50~600 μΜ 바람직하게는, 100~500 μΜ를 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

본 발명에 따른 클라미도모나스 해들레이이 형질전환체의 구축

1) pCAMBIA 1302내 Glut-1 유전자 클로닝

인간 유래 glucose transporter 1(Glut-1) 유전자(서열번호 1)를 프라이머들

서열번호 3: Bal = AGATCTGATGGAGCCCAGCAGCAAG

서열번호 4: BSTE = GGTNACCTCACACTTGGGAAT CAGCCCC

을 가지고 인간 cDNA를 이용하여 RT-PCR을 이용하여 분리했다. cDNA 및 RT-PCR 조건은 아래와 같은 조건하에서 시행되었다

- cDNA 합성 -

Primery Solution (100mMdNTP,Oligo dt or Random primer, RT buffer, Sample RNA)을 준비해준 다음 65℃에서 5min 동안 denaturation시켜주었다. 여기에 Secondary solution (100mM DTT)를 넣은 후 잘 혼합해준 후 25℃ 10 min 반응시켰다.42℃ 에서 1h 30min 동안 cDNA를 합성시킨 후 실온에서 cooling해주었다. 이후로는 만들어진 cDNA를 이용하여 real-time PCR을 진행하였다.

- RT-PCR -

아래의 반응액을 PCR tube에 넣고 모든 조작은 얼음 위에서 수행하였다.

시약 조성은 다음과 같다:

PCR 반응 조건은 다음과 같다:

PCR 반응이 끝나면 약 5~10㎕의 반응액을 100V에서 30~40분 전기영동(Buffer: 0.5 X TBE)하여 DNA의 band를 확인하였다.

제한효소 Bal II 와 BSTE II를 이용하여, 상기 얻어진 Glut-1 PCR product를 binary vector인 pCAMBIA 1302(성균관 대학교 세포공학 연구실, Tubu-bio Inc. Cat# M1593)에 클로닝한 다음, 서열 분석(sequencing analysis)를 통해 Glut-1 서열임을 도 1의 C에서와 같이 확인하였다. 구체적으로, Glut-1 유전자를 포함하는 plasmid DNA를 Bal , BSTE primer를 사용해 PCR를 수행하고, pCAMBIA vector에 형질전환 후, Bal II, BST II enzyme을 사용해 Glut-1유전자의 클로닝 여부를 도 1의 C에서와 같이 확인하였다.

2) Agrobacterium을 이용한 Glut-1 형질전환

클라미도모나스 해들레이이(Chlamydomonas hedleyi) KMMCC 118 종은 한국 해양 미세조류 배양센터에서 분주 받았으며 18S rRNA 유전자를 통해 종 구분이 되어 GenBank accession number, JQ315503을 부여 받았다. 아그로박테리움 형질전환체기법을 통한 클라미도모나스 해들레이이 Glut-1형질전환을 시도했다.

아그로박테리움에의한 형질질전환법의 원리는 20 세기 초반에 식물에 발생된 근두암종병 (crown gall disease)에 대한 연구를 통해 이루어졌다. 즉 질병의 원인은 세균자체가 아니라 아그로박테리움에 존재하는 플라스밋드가 원인이라는 것이 밝혀졌는데 이것이 Ti (tumor-inducing)플라스미드의 발견이다. 아그로박테리움에 의해 식물세로의 genomic DNA중에는 Ti플라스미드의 일부 DNA영역 (T-DNA, Transferred DNA)가 들어가는 있다는 놀라운 사실이 밝혀졌다 (Thomashow et al., 1980). 따라서 세균에 의한 자연계에 존재하는 유전자도입의 원리를 이용하여 식물, 미세조류 등을 포한함 여러 가지 생물체의 형질전환기술을 개발했다. 클라미도모나스 해들레이 형질전환체를 만들기 위해 사용된 pCAMBIA 1302의 Glut-1이 삽입된 부분이 T-DNA로 작용하여 클라미도모나스 해들레이 genomic DNA에 Glut-1 유전자가 들어가게 된다. 그 방식은 아래 그림과 같다.

다음으로 형질전환체 제작 과정을 살펴보면, acetosyringone(100uM)이 포함된 f/2 고체 배지에 클라미도모나스 해들레이이 (OD=1.24) 200ul을 도말한 후 3일 정도 20 incubator에서 키웠다. 3일 후 고체 배지에서 자란 클라미도모나스 해들레이이를 scrapper를 사용하여 15ml tube에 모은 후 1500rpm, 5분 동안 centrifugation한 후 상층액을 조심스럽게 제거하여 클라미도모나스 해들레이이를 얻었다. 멸균 증류수 (200ul)로 클라미도모나스 해들레이이 pellets을 resuspension한 후에 200ul agrobacterium (OD=0.5)와 잘 혼합하여 20℃, 48시간동안 배양시켰다. 그 후 1500 rpm, 5분 동안 centrifugation을 통해 agrobacterium 과 클라미도모나스 해들레이이를 얻은 후, cefotaxime이 포함된 액체 f/2 배지로 2회 씻겨주었다. 마지막으로 200 ul 액체 f/2배지로 pellets을 resuspension해준 후 10 mg/L hygromycin 과 500 mg/L cefotaxime이 포함된 고체 f/2배지에 도말한 다음, 일주일 동안 20℃ incubator에서 배양하였다. 배양배지조성(g/L): K₂HPO₄, 0.108; KH₂PO₄, 0.056; MgSO₄7H₂O, 0.1; CaCl₂2H₂O, 0.05; C₄H₁₁NO₃, 2.422; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.05; BO₃H₃, 0.0114; ZnSO₄7H₂O, 0.022; MnCl₂4H₂O, 0.00506; FeSO₄7H₂O, 0.00499; CoCl₂6H₂O, 0.00161; CuSO₄5H₂O, 0.00167; MO₇O₂₄(NH₄)₆4H₂O, 0.0011; Glucose 0~10g, 400 M NH₄Cl 이다.

* pH의 범위: 7.0~7.4 (1 M의 초산 용액을 fed-batch 방식으로 주입

* 배양온도: 23/ * 교반속도: 130 rpm/ * 공기공급량: 1.0

3) Glut-1유전자를 지닌 클라미도모나스 해들레이이 형질전환체 선발

pCAMBIA 1302 벡터에 있는 selection marker인 hygromycin (10mg/ml)을 통해 Glut-1 유전자 형질전환체를 선택적으로 발굴했다. Glut-1 유전자 형질전환체는 hygromycin에 대한 저항성을 가지고 있으며 형질전환이 제대로 이루어지지 않은 세포는 사멸에 이른다. 따라서 고체배지에 hygromycin(10mg/ml) 농도로 제조하고 생존하는 세포를 선택해서 발굴했다. 또한 형질전환체를 만들기위해 사용된 pCAMBIA 1302 벡터에는 GFP 유전자가 들어있어 Glut-1유전자가 발현을 하게되면 Glut-1/ GFP fusion 단백질이 만들어진다. 따라서 Glut-1 유전자가 들어간 형질전환체는 형광현미경아래에서 GFP 단백질에 의한 green 형광을 관찰 할 수 있다. 도 2에서와 같이 현광현미경을 통해 형질전환체의 확인과정을 수행하였다.

그 다음으로 순수 Glut-1형질전환체를 얻기 위해 하나의 클라미도모나스 해들레이이 클론 12개를 분리해서 24wells plate의 각 well에 분주한 후 2주간 배양했다. 이들을 가지고 형질전환체 내에 도입된 Glut-1유전자의 발현이 성공적으로 이루어졌는지를 알아보기 위해 Glut-1 및 GFP 항체를 이용한 단백질 발현을 Western blot 분석을 통해 측정해 보았다. Western blot 분석은 10⁸ ~ 10⁹ cells의 형질전환된 클라미도모나스 헤들레이를 함유하는 배양액 3ml를 5분 동안 1,700 x g에서 원심분리하여 형질전환된 클라미도모나스 헤들레이를 분리하였다. 분리된 형질전환체를 sample loading buffer [ 1mM EDTA, 250 mM Tris-Cl (pH 6.8), 4% SDS, 2% - 머캄도에탄올, 0.2% 브모로페닐블루, 50% 글리세롤] 20ul에 현탁시키고 10분 동안 끓였다. 그 다음, 10분 동안 12,000 x g에서원심분리하여 상등액을 취하고, 15% SDS-PAGE겔에서 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스막으로 옮겼다. fGH에 대한 다클론 항체 (anti-GFP 혹은 anti-Glut-1)의 최종 농도는 1:5,000이고, 2차항체로 알카리성 인산화효소가 결합된 항체를 사용하였다. 형질전환되지 않은 클라미도모나스헤들레이 또한 동일한 방법으로 웨스턴 블럿 분석을 실행했다. 그 결과 Glut-1/GFP 합성 단백질이 형질전환체 내에서 정상적으로 발현되는 것을 클라미도모나스 해들레이 클론 G1-3에서 확인하였다 (도 2).

형질전환체 내에서의 Glut -1 기능 분석

다음으로 우리는 Glut-1 형질전환체 내에서 발현된 Glut-1단백질이 정상적으로 기능을 발휘해 Glucose를 세포내로 운반하는지 보기위해 glucose 유사체인 2-Deoxy-D-glucose (2-DG)를 이용하였다. 2-Deoxy-D-glucose는 glucose와 다르게 glycolysis를 겪지 않는다. 따라서 glucose transporter에 의해 2-DG가 세포내로 이동하여 glycolysis 기작에 의해 분해되지 않고 축적된다. 이는 glucose uptake 또는 hexokinase 활성 분석에 이용될 수 있다 (도 3A).

먼저 2-DG의 세포내 변형체인 2-DG6P에 대한 standard curve를 만들었다. 2-DG6P에 대한 standard curve를 얻기 위하여 먼저 Assay buffer 900 ul 에 10 mM 2-DG6P의 10ul를 넣어 0.1mM (100 pmol/ul)를 만들고 다시 Assay buffer 450 ul에 위에서 희석해 놓은 0.1mM 2-DG6P의 50ul를 넣어 최종적으로 0.01 mM (10 pmol/ul)의 2-DG6P standard 용액을 만든다. 그런 다음 96 well plate에 각각 0, 2, 4, 6, 8, 10 ul의 standard 용액을 넣은 후 Assay buffer를 이용하여 각각의 well안의 총 볼륨이 50 ul가 되게 맞춰준다. 여기서 각 well안에 포함되어 있는 2-DG6P 양은 각각 0, 20, 40, 60, 80, 100 pmol/well에 해당된다. 그런 다음 fluorescence meter 기기를 이용하여 412 nm 파장대의 OD값을 측정하여 standard curve를 작성하였다(도 3B). 그런 다음 이를 이용하여 Glut-1 형질전환체의 glucose 체내 축적량을 알아보았다. 그 과정을 자세히 살펴보면, Glut-1 형질전환체 (G1-3)와 비 형정질전환체 (Wt)를 24 well plate에 각각 2x10³에 해당하는 세포를 분주한 후 0, 100, 200, 300, 400, 500 pmol의 2-DG를 처리한 후 12시간 배양하였다. 그런 다름 각 well에 존재하는 미세조류 100ul를 96 well plate에 옮긴 후 fluorescence meter의 412 nm 파장아래 OD를 측정했다. 여기서 얻은 OD 값을 standard curve에 넣어 해당되는 2-DG6P 값을 얻었다.

도 3C에 나타난 바와 같이, Glut-1 유전자의 발현이 없는 Wild type은 2-DG 처리에 대한 세포내 2-DG6P 농도변화가 보이지 않은 반면, Glut-1 형질전환체인 G1-3은 2-DG 처리농도에 비례해서 2-DG6P의 세포내 축적량이 증가함을 보였다.

또한, glucose 유입에 대한 저해제인 Phloretin의 처리는 Glut-1을 통한 2-DG의 세포내 유입을 방해하는 것으로 나타났다 (도 3C). 따라서 2-DG를 이용한 Glut-1 형질전환체의 glucose uptake실험을 실시해 본 결과 Glut-1의 기능이 정상적으로 이루어짐을 알 수 있었다 (도 3).

빛 조건 및 Glucose 에 따른 Glut-1(-), Glut-1(+)의 생장곡선 및 Biomass

5L Jar Fermentation 시스템을 활용하여 빛 조건 및 Glucose에 따른 Glut-1(-) 와 Glut-1(+)의 생장곡선을 확인하고, 5L에서 Biomass를 측정하였다 (도 4).

구체적으로, Glut-1(-)과 Glut-1(+) 클라미도모나스 해들레이가 5L Jar Fermentation 시스템에 10% 농도로 계대배양이 이루어졌다. 실험에 사용한 배지 조성은 다음과 같다.

배양배지조성(g/L): K₂HPO₄, 0.108; KH₂PO₄, 0.056; MgSO₄7H₂O, 0.1; CaCl₂2H₂O, 0.05; C₄H₁₁NO₃, 2.422; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.05; BO₃H₃, 0.0114; ZnSO₄7H₂O, 0.022; MnCl₂4H₂O, 0.00506; FeSO₄7H₂O, 0.00499; CoCl₂6H₂O, 0.00161; CuSO₄5H₂O, 0.00167; MO₇O₂₄(NH₄)₆4H₂O, 0.0011; Glucose 0~10g, 400 M NH₄Cl 이다.

최종적으로 배지의 pH는 6.3~6.4로 맞추었다. 바이오메스 측정은 UV fluorescence (520 nm)과 소수점 3자리 전자저울을 사용해 측정했다.

빛이 없는 암조건이며 동시에 Glucose 존재 하에서 Glut-1(+)형질전환체의 바이오매스 증가량은 어느 것보다 많이 증가함을 보였다. 하지만 같은 조건하에서 Glut-1(-)의 형질전환체의 바이오매스는 배양 기간 동안 거의 변하지 않았다.

반면에 빛 조건하에서 배양되었을 경우에는 Glut-1(+) 와 Glut-1(-)의 바이오매스 증가량이 배양기간 동안 거의 같게 나타났다 (도 4A). 다음으로 이에 따른 세포내 MAAs 합성을 비교해본 결과 단위 (mg/g)당 MAAs의 합성도 비슷한 수준으로 생산되는 것으로 나타났다 (도 4B). 따라서 이러한 결과는 암조건 임에도 불구하고 glucose가 있는 상태에서 MAAs의 세포내 함량 변화 없이 충분히 클라미도모나스 해들레이이의 바이오매스를 늘릴 수 있다는 것을 말한다.

<110> BIOFDNC KIOST <120> Transformant transformed by Glut-1 gene and Methods for culturing the Same <130> P-140528-1 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1476 <212> DNA <213> Glut-1 gene <400> 1 atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60 cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120 gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180 ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240 ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300 ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360 atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgaccac aggcttcgtg 420 cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480 cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540 ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600 tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660 gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720 ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780 gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840 tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900 gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc attggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960 actgtcgtgt cgctgtttgt ggtggagcga gcaggccggc ggaccctgca cctcataggc 1020 ctcgctggca tggcgggttg tgccatactc atgaccatcg cgctagcact gctggagcag 1080 ctaccctgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140 gtgggtcctg gccccatccc atggttcatc gtggctgaac tcttcagcca gggtccacgt 1200 ccagctgcca ttgccgttgc aggcttctcc aactggacct caaatttcat tgtgggcatg 1260 tgcttccagt atgtggagca actgtgtggt ccctacgtct tcatcatctt cactgtgctc 1320 ctggttctgt tcttcatctt cacctacttc aaagttcctg agactaaagg ccggaccttc 1380 gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggagccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440 gagctgttcc atcccctggg ggctgattcc caagtg 1476 <210> 2 <211> 492 <212> PRT <213> Glut-1 protein <400> 2 Met Glu Pro Ser Ser Lys Lys Leu Thr Gly Arg Leu Met Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Ala Val Leu Gly Ser Leu Gln Phe Gly Tyr Asn Thr Gly Val 20 25 30 Ile Asn Ala Pro Gln Lys Val Ile Glu Glu Phe Tyr Asn Gln Thr Trp 35 40 45 Val His Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Leu Pro Thr Thr Leu Thr Thr Leu 50 55 60 Trp Ser Leu Ser Val Ala Ile Phe Ser Val Gly Gly Met Ile Gly Ser 65 70 75 80 Phe Ser Val Gly Leu Phe Val Asn Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser Met 85 90 95 Leu Met Met Asn Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala Val Leu Met Gly Phe 100 105 110 Ser Lys Leu Gly Lys Ser Phe Glu Met Leu Ile Leu Gly Arg Phe Ile 115 120 125 Ile Gly Val Tyr Cys Gly Leu Thr Thr Gly Phe Val Pro Met Tyr Val 130 135 140 Gly Glu Val Ser Pro Thr Ala Leu Arg Gly Ala Leu Gly Thr Leu His 145 150 155 160 Gln Leu Gly Ile Val Val Gly Ile Leu Ile Ala Gln Val Phe Gly Leu 165 170 175 Asp Ser Ile Met Gly Asn Lys Asp Leu Trp Pro Leu Leu Leu Ser Ile 180 185 190 Ile Phe Ile Pro Ala Leu Leu Gln Cys Ile Val Leu Pro Phe Cys Pro 195 200 205 Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu Ile Asn Arg Asn Glu Glu Asn Arg Ala 210 215 220 Lys Ser Val Leu Lys Lys Leu Arg Gly Thr Ala Asp Val Thr His Asp 225 230 235 240 Leu Gln Glu Met Lys Glu Glu Ser Arg Gln Met Met Arg Glu Lys Lys 245 250 255 Val Thr Ile Leu Glu Leu Phe Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Gln Pro Ile 260 265 270 Leu Ile Ala Val Val Leu Gln Leu Ser Gln Gln Leu Ser Gly Ile Asn 275 280 285 Ala Val Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser Ile Phe Glu Lys Ala Gly Val Gln 290 295 300 Gln Pro Val Tyr Ala Thr Ile Gly Ser Gly Ile Val Asn Thr Ala Phe 305 310 315 320 Thr Val Val Ser Leu Phe Val Val Glu Arg Ala Gly Arg Arg Thr Leu 325 330 335 His Leu Ile Gly Leu Ala Gly Met Ala Gly Cys Ala Ile Leu Met Thr 340 345 350 Ile Ala Leu Ala Leu Leu Glu Gln Leu Pro Trp Met Ser Tyr Leu Ser 355 360 365 Ile Val Ala Ile Phe Gly Phe Val Ala Phe Phe Glu Val Gly Pro Gly 370 375 380 Pro Ile Pro Trp Phe Ile Val Ala Glu Leu Phe Ser Gln Gly Pro Arg 385 390 395 400 Pro Ala Ala Ile Ala Val Ala Gly Phe Ser Asn Trp Thr Ser Asn Phe 405 410 415 Ile Val Gly Met Cys Phe Gln Tyr Val Glu Gln Leu Cys Gly Pro Tyr 420 425 430 Val Phe Ile Ile Phe Thr Val Leu Leu Val Leu Phe Phe Ile Phe Thr 435 440 445 Tyr Phe Lys Val Pro Glu Thr Lys Gly Arg Thr Phe Asp Glu Ile Ala 450 455 460 Ser Gly Phe Arg Gln Gly Gly Ala Ser Gln Ser Asp Lys Thr Pro Glu 465 470 475 480 Glu Leu Phe His Pro Leu Gly Ala Asp Ser Gln Val 485 490 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> primer (Bal) <400> 3 agatctgatg gagcccagca gcaag 25 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> primer (BSTE) <400> 4 ggtnacctca cacttgggaa tcagcccc 28

Claims (6)

1. Glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이(Chlamydonomas hedleyi).
2. 제1항에 있어서, 상기 Glut-1 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 클라미도모나스 해들레이이.
   
3. 제1항에 따른 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 함유하는 MAA(Mycosporine-like amino acid) 생산용 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 클라미도모나스 해들레이이는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 Glut-1 유전자로 형질전환된 것을 특징으로 하는 MAA 생산용 조성물.
   
5. 삭제
6. 제1항에 따른 클라미도모나스 헤드레이이를 암 조건에서 글루코스 함유 배지에 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 클라미도모나스 해들레이이의 배양 방법.
   

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