KR20110090565A - 미세조류의 형질전환에 유용한 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 미세조류 - Google Patents

Abstract

미세조류에 도입된 외래 유전자가 보다 안정적으로 발현되고, 형질전환된 미세조류를 용이하게 선별할 수 있도록, 미세조류 유래의 프로모터와 미세조류에 적합하도록 코돈이 최적화된 리포터 유전자를 포함하는 미세조류의 형질전환에 유용한 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 미세조류에 관한 것이다.
본 발명에 따른형질전환된 미세조류를 효율적으로 선별할 수 있는 리포터 유전자 및 상기 리포터 유전자를 포함하는 바이너리 벡터를 이용할 경우, 미세조류에 도입된 외래 유전자가 안정적으로 발현될 뿐만 아니라, 형질전환된 미세조류를 용이하게 선별할 수 있다.

Description

미세조류의 형질전환에 유용한 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 미세조류{Useful Vector for Transformation of Microalgae and Microalgae Transformed With the Same}

본 발명은 미세조류의 형질전환에 유용한 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 미세조류에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세조류에 도입된 외래 유전자가 보다 안정적으로 발현되고, 형질전환된 미세조류를 용이하게 선별할 수 있도록, 미세조류 유래의 프로모터와 미세조류에 적합하도록 코돈이 최적화된 리포터 유전자를 포함하는 미세조류의 형질전환에 유용한 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 미세조류에 관한 것이다.

미세조류 (microalgae), 특히 녹조류 (Chlorophyta)는 광독립영양생물로 태양에너지와 이산화탄소를 이용해 유기물로 변환시키는 진핵생물의 일종이다. 최근 이산화탄소로 인한 지구온난화와 화석연료 에너지 고갈이 문제로 제기되고 있다. 이에 태양에너지를 사용하여 이산화탄소를 고정화하는 탄소동화기능을 이용하여 바이오매스 및 다양한 유용물질을 생산하므로 이산화탄소의 저감과 유용물질 생산이라는 장점으로 주목받고 있다. 또한 상기 언급한 미세조류의 바이오매스에 포함되어 있는 다량의 탄화수소는 대체에너지인 바이오디젤 등으로 전환이 가능하며 일부 미세조류는 균체 내에 다량의 전분을 축적하는데 이들을 분해하여 에탄올 생산이 가능하므로 대체 에너지 측면에서도 유용성이 높아 주목을 받고 있다. 그러나 현재까지 연구된 바로는 야생형의 미세조류에서는 경제성 있는 수율을 얻기가 어려워 유전공학적인 방법으로 균주를 개량하고자 많은 연구개발이 이루어지고 있다.

미세조류는 식물과 유사한 특성을 가지고 있으므로 미세조류에 외래 유전자를 도입하기 위한 방법으로 지금까지 유전자총(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 유리구슬(glassbead) 또는 실리콘 섬유(silicon fibers) 교반 (agitation)법, 아그로박테리움(Agrobacterium)에 의한 형질전환법 등이 사용되어져 왔다. 식물에서의 형질전환법과 마찬가지로 기존의 전기천공법 (electroporation)은 원형질체에서 재분화 식물체를 분화시키는 과정이 복잡하고 시간이 오래 걸리며 숙련된 기술이 요구된다는 단점이 있고, 유전자총 (bombardment)을 이용하는 방법은 원형질체 뿐 아니라 엽록체 등과 같이 다른 기관에도 무작위로 형질전환이 이루지지며, 복제 수를 조절하기 힘들고 분석과 선별에 많은 시간과 노력이 소요되는 단점이 있다. 또한 유리구슬 교반법 (agitation with glass bead)은 세포벽이 결손 또는 분해된 균주에서만 특이성이 높은 단점이 있고, 실리콘 섬유 교반법은 세포상해로 인해 효율이 낮은 것으로 지적되어 왔다. 상술한 이러한 문제점들로 인해 현재는 많은 식물에서 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하는 방법이 주로 사용되고 있다. 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 형질전환에서의 유전자 운반 수단으로 유전자 운반자, 즉 벡터(vector)가 고안되었으며, 대표적으로 아그로박테리움(Agrobacterium)의 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드 등이 알려져 있다. Agrobacterium tumafacience, Agrobacterium rhizogenes 등에서 발견된 Ti 플라스미드 및 Ri 플라스미드는 각각 토양미생물인 A. tumefaciens와 A. rhizogenes 내에서 염색체 DNA와는 별도로 존재하는 거대한 플라스미드로 원형 이중 나선구조를 가지고 있다. 이 미생물들은 토양 전염성을 일으키는 그람음성 세균으로서 A tumefaciens는 식물의 상처 난 부분에 감염하여 근두암종병을 일으키고, A. rhizogenes는 모근병을 유발한다. 많은 연구자들이 이러한 감염 및 발병기작에 근거하여 식물에 외래유전자를 도입하고, 도입 후 바람직한 유전자가 핵의 게놈에 삽입된 후 후대에서도 발현되어 유전적 안정한 형질전환체(transgenic)를 얻을 수 있음을 보였다.

미세조류에 최초로 적용된 예는 Chlamydomonas reinhardtii에서 이루어 졌다. 인도의 Kumar 등은 기존의 식물용 바이너리 벡터인 pCAMBIA1304에 베타글루쿠로니다제 유전자를 삽입하여 agrobacterium을 이용한 형질전환법을 적용하여 기존의 유리구슬 교반법에 비해 향상된 형질전환체를 얻었다고 보고하였다 (Kumar, S. V. et al., Genetic transformation of the green alga: Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacterium tumefaciens. Plant science., 166, 731-738, 2004). 그러나 상기 기술은 베타글루쿠로니다제 유전자의 삽입 유무를 확인하기 위하여 선별마커로써, 하이그로마이신을 이용하였지만, 하이그로마이신은 고가의 항생제로 사용되며, 클라미도모나스 형질전환체의 선별시 선별성이 낮은 문제점이 있어, 현재는 거의 사용하지 않고 있다.

또한 기존의 바이너리 벡터들은 고등식물 또는 식물 바이러스 유전자의 프로모터와 UTR을 포함하고 있어, 도입된 외래 유전자의 발현이 낮거가 발현되지 않는 등의 문제점들이 제기되고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 기존의 고등식물 및 작물에서 유래된 프로모터 대신에 미세조류 유래의 프로모터와 미세조류에 적합하도록 코돈이 최적화된 리포터 유전자를 포함하는 바이너리 벡터를 이용할 경우, 미세조류에 도입된 외래 유전자가 안정적으로 발현되고, 형질전환된 미세조류를 용이하게 선별할 수 있다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 형질전환된 미세조류를 효율적으로 선별할 수 있는 리포터 유전자 및 상기 리포터 유전자를 포함하는 바이너리 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이너리 벡터에 의해 형질전환된 미세조류를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리포터 유전자에서 3번째 코돈이 최적화되어 있는 것을 특징으로 하는 형질전환된 미세조류 선별용 리포터 유전자 및 상기 리포터 유전자를 포함하는 바이너리 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 바이너리 벡터에 의해 형질전환된 미세조류를 제공한다.

본 발명에 따른형질전환된 미세조류를 효율적으로 선별할 수 있는 리포터 유전자 및 상기 리포터 유전자를 포함하는 바이너리 벡터를 이용할 경우, 미세조류에 도입된 외래 유전자가 안정적으로 발현될 뿐만 아니라, 형질전환된 미세조류를 용이하게 선별할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이너리벡터 pCAMBIA3300-ble 및 p3300-ble를 구축하는 모식도와 T-DNA의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이너리벡터 pCAMBIA3300-par 및 p3300-par를 구축하는 모식도와 T-DNA의 구조를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 pCAMBIA3300-par 및 p3300-par의 T-DNA내의 파로모마이신 유전자 유무를 PCR로 확인한 전기영동 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 pCAMBIA3300-ble 및 p3300-ble의 T-DNA내의 블레오마이신 유전자 유무를 PCR로 확인한 전기영동 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 pCAMBIA3300-par 및 p3300-par가 형질전환된 클라미도모나스 레인하르티 cc-125 균주에서의 유전자 발현정도를 RT-PCR을 통해 확인한 전기영동 사진이다.
도 6은 대장균과 클라미도모나스의 코돈 선호도 차이를 나타낸 그래프이다(적색: 대장균, 흑색: 클라미도모나스, net difference: 23%).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이너리벡터 p3300-B-GUS 및 p3300-P-GUS의 모식도이다.

본 발명에서는 미세조류에 적합하도록 코돈이 최적화된 리포터 유전자를 포함하는 벡터를 이용할 경우, 외래 유전자가 도입된 형질전환 미세조류를 효율적으로 선별할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.

본 발명에서는, 대장균 유래의 리포터 유전자를 미세조류에 적합하도록 코돈을 최적화 시킨 후, 이를 포함하는 벡터를 제조하고, 상기 벡터로 형질전환된 미세조류를 제작하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 대장균 유래 uidA 유전자의 3번째 코돈의 GC %를 59%에서 72%로 증가시킨 crGUS 리포터 유전자를 합성하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 리포터 유전자에서 3번째 코돈이 최적화되어 있는 것을 특징으로 하는 형질전환된 미세조류 선별용 리포터 유전자에 관한 것이다.

통상적으로 미세조류는 3번째 코돈의 GC 함량이 높은 것으로 알려져 있으므로, 미세조류 이외의 종에서 유래된 리포터 유전자의 코돈을 미세조류에 적합하도록 최적화 시키면, 리포터 유전자와 함께 도입된 외래 유전자의 발현 여부를 보다 효율적으로 확인할 수 있다. 클라미도모나스 레인하르티의 경우 3번째 코돈의 GC%가 평균 86%로서 GC에 대한 선호도가 매우 높다.

상기 리포터 유전자는 미세조류의 종류에 따라 달라질 수 있지만, 3번째 코돈의 GC %가 70 이상%인 것이 바람직하다. 상기 3번째 코돈의 GC%가 70% 미만인 경우, 발현이 저해되거나 발현이 되지 않은 문제가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 리포터 유전자는 crGUS, crGFP 및 crlux로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 상기 crGUS는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 형질전환된 미세조류의 선별을 위하여, 코돈이 최적화된 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 crGUS 유전자를 포함하는 형질전환된 미세조류 선별용 리포터 유전자를 제공한다.

한편, 본 발명에서는 고등식물 또는 식물 바이러스 유전자의 프로모터와 UTR이 아닌 미세조류 유래의 프로모터를 포함하는 벡터를 이용할 경우, 형질전환된 미세조류를 제작시 안정적으로 외래 유전자의 발현을 유도시킬 것으로 예측하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 미세조류에 적합하도록 코돈이 최적화된 리포터 유전자, 미세조류 유래 프로모터 및 외래 유전자로써 항생제 내성 유전자를 포함하는 바이너리 벡터를 제작한 후, 이를 이용하여 형질전환 미세조류를 제조한 결과, 항생제 내성 유전자의 발현율이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 리포터 유전자를 포함하는 바이너리 벡터에 관한 것이다.

상기 리포터 유전자를 포함하는 바이너리 벡터는 프로모터, UTR, 인트론 및 목적 유전자를 더욱 포함할 수 있는데, 이때 상기 프로모터, UTR 및 인트론은 형질전환 시키고자 하는 미세조류 유래인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 프로모터는 클라미도모나스의 열충격단백질을 지정하는 pHsp70A 유전자, 리뷸로즈 포스페이트 신타제 (ribulose-5-phosphate synthase)의 small subunit 유전자 rbcS2, 베타튜뷸린 (beta-tubulin) 유전자 및 photosystem I complex를 구성하는 pSaD유전자의 프로모터들로 구성된 군에서 선택되는 프로모터를 1~2개 사용할 수 있으며, 상기 프로모터들의 하류에는 인트론이 하나 또는 그 이상 삽입되는 것이 바람직하다. 미세조류가 선호하는 유전자 구조 예를 들면 인트론이 하나 또는 다수 존재하는 구조를 가지도록 벡터를 구성할 경우, 보다 안정된 발현을 유도할 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명은 상기 프로모터의 하류에 미세조류 유래의 인트론(intron)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 프로모터의 유전자발현을 정지시킬 수 있는 UTR은 rbcS2, beta-tubulin, pSaD 중 어느 한 가지를 선택하여 사용하는 것이 바람직하며, 상기 UTR 상류에는 인트론이 하나 또는 그 이상 삽입될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이너리 벡터는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 pSaD 프로모터, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 rbcS2 프로모터 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 pHsp70A 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 목적 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 목적 유전자는 미세조류에서 발현이 가능한 모든 유전자를 제한없이 사용될 수 있으며, 유용물질 생산 유전자로써 지방산, 카로테노이드, 탄화수소, 단백질, 항생제 내성 유전자 등을 예시할 수 있으며, 항생제 내성 유전자로써 블레오마이신 내성유전자(ble), 파로모마이신 내성 유전자(par) 등을 예시할 수 있다.

상기 블레오마이신 내성유전자(ble) 및 파로모마이신 내성 유전자(par)는 미세조류에서 안정한 것으로 검증되었으나, 기존의 바이너리 벡터들에서는 이용되지 않았다. 상기 블레오마이신 내성유전자(ble)는 서열번호 5의 염기서열로 표시되고, 파로모마이신 내성 유전자(par)는 서열번호 6의 염기서열로 표시된다.

본 발명에 있어서, 상기 바이너리 벡터는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 p3300-B-GUS 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 p3300-P-GUS를 예시할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 바이너리 벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 숙주에 도입시켜 수득되는 형질전환 미생물을 제공한다. 상기 숙주로 이용되는 박테리아, 곰팡이 및 효모는 그 종류에 특별히 제한되지 않고, 사용할 수 있으며, 아그로박테리움 등을 예시할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 바이너리 벡터에 의해 형질전환된 미세조류를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 미세조류는 그 종류가 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면, 클로렐라 엘립소이데아, 클로렐라 소로키니아나, 클로렐라 불가리스 등의 클로렐라, 스피루리나(spirulina), 나노클로로프시스(Nannochloropsis), 테트라셀미스(Tetraselmis), 케오세로스(Cheaoceros) 이소크리오시스(Isochryosis), 팔브로바(Pavlova), 피오닥티룸(Phaeodactylum), 스켈리토네마(Skeletonama), 나비쿨라(Navicula), 칼로네이즈(Calonase), 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii) 등이 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시 예 1: 바이너리 벡터 구축

1-1: p3300-ble 구축

블레오마이신 (bleomycin) 내성유전자는 하기의 ble1과 ble2 프라이머를 이용하여 pGenD-ble (Fischer N. et al. (2001) The flanking region of pSaD drive efficient gene expression in the nucleus of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Genet. Genomics. 265, 888-894) 플라스미드를 주형으로 이용하여 총 반응액을 50㎕로 94 ℃에서 5분 동안 변성 후 94 ℃에서 20초 변성, 55℃~65 ℃에서 30초 결합, 72 ℃에서 30초의 신장 사이클(Cycle)을 30회 수행한 후 최종 신장반응을 72℃에서 5분간 PCR을 수행하여 목적한 190bp의 목적단편을 확보하였다. 다음으로 ble 유전자가 포함된 단편을 EcoRI과 XhoI으로 절단한 후, 상기 각 프로모터와 3'-UTR 이 포함된 벡터 내에 각각 클로닝 하였다.

[서열번호 9]: ble1 (EcoRI)-F ; 5'-GGAATTCATGGCCAAGCTGACCAGCGCC

[서열번호 10]: ble2 (XhoI)-F ; 5'-GCTCGAGCTGGTCCTGGACCGCGCTGAT

pGenD-ble 플라스미드로부터 bleomycin 내성 유전자 카세트를 분리하기 위하여 XbaI과 XhoI으로 절단하고, 1% 아가로즈 겔 전기영동 후 1.7kb 단편을 회수(elution)한 다음 미리 XbaI과 XhoI으로 절단하여 둔 pCAMBIA3300(Cambia, australia)에 리게이션(ligation)하여 대장균 (DH5α)에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 50㎍/㎖ 농도의 가나마이신이 포함된 LB 배지에서 배양시킨 후, 내성 콜로니를 선택하여 액체배지에서 하룻밤 배양켰다. 다음으로 플라스미드 미니프렙키트를 이용하여 내성 콜로니로부터 플라스미드를 분리한 후 XbaI과 XhoI으로 절단시키고, 1.7 kb의 단편이 포함된 것을 확인하여 확보된 클론을 p3300-ble로 명명하였다 (도 1).

도 1에 도시된 바와 같이, 블레오마이신 내성유전자 카세트는 pSAD 프로모터 하류에 인트론이 포함되지 않고, 블레오마이신 구조 유전자가 위치하여 발현되고 있다.

원래 pCAMBIA3300의 CaMV35S 프로모터와 비교하여 클라미도모나스에서의 발현정도 비교를 위해 CaMV35S 프로모터 하류에 블레오마이신 구조유전자를 삽입시킨 pCAMBIA3300-ble를 대조군으로 제작하였다.

1-2: p3300-par 구축

파로모마이신 내성유전자는 하기의 par1과 par2 프라이머를 이용하여 pSI103 (Sizova, I. et al. (2001) A Streptomyces rimosus aphVIII gene coding for a new type phosphotransferase provides stable antibiotic resistance to Chlamydomonas reinhardtii. Gene. 277. 221-229) 플라스미드를 주형으로 이용하여 총 반응액을 50㎕로 94 ℃에서 5분 동안 변성 후 94 ℃에서 20초 변성, 55℃~65 ℃에서 30초 결합, 72 ℃에서 1분의 신장 사이클(Cycle)을 30회 수행한 후 최종 신장반응을 72℃에서 5분간 PCR을 수행하여 목적한 820bp의 목적단편을 확보하였다. 목적 단편의 클로닝 및 시퀀스의 확인은 상기와 동일하다.

[서열번호 11]: par1 (EcoRI)-F ; 5'-GGAATTCAAGCATGGACGATGCGTTGCGTGC

[서열번호 12]: par2 (XhoI)-F ; 5'-GCTCGAGTCAGAAGAACTCGTCCAACAGCCG

파로모마이신 내성 유전자 카세트는 pSI103 플라스미드에서 XbaI과 KpnI으로 절단한 후 1-1과 동일한 방법으로 XbaI과 KpnI으로 절단 시키고 1.9kb의 단편을 회수하여 클로닝 한 후, 확보된 플라스미드를 절단하여 1.9kb 단편이 포함하는 클론을 확보하고 p3300-par로 명명하였다 (도 2).

도 2에 도시된 바와 같이, 파로모마이신 내성유전자 카세트는 pHSP70A/rbcS2프로모터/intron 구조 하류에 파로모마이신 구조 유전자가 위치하여 발현되고 있다.

원래 pCAMBIA3300의 CaMV35S 프로모터와 비교하여 클라미도모나스에서의 발현정도 비교를 위해 CaMV35S 프로모터하류에 파로모마이신 구조유전자를 삽입시킨 pCAMBIA3300-par를 대조군으로 제작하였다.

실시 예 2: 바이너리 벡터의 유전자 보유 및 발현 정도 확인

실시예 1에서 제작된 바이너리 벡터 p3300-ble, pCAMBIA3300-ble, p3300-par 및 pCAMBIA3300-par에 대한 유전자 보유여부를 각 클론의 total DNA를 이용하여 T-DNA 지역에 존재하는 파로모마이신과 블레오마이신의 내성유전자를 PCR을 통해 확인하였다. 사용된 프라이머 및 PCR 조건은 실시예 1과 동일하다.

도 3에 도시된 바와 같이, Control로 사용한 2번 lane과 파로모마이신 유전자가 포함되어 있지 않은 상태의 pCAMBIA3300 (4번 lane)에서는 DNA 밴드가 보이지 않으나, 파로모마이신 유전자가 삽입된 3번과 5번에서는 1kb DNA marker (Fermentas, USA)의 1,000bp와 750bp 사이에서 약 820bp의 밴드를 확인할 수 있었다.

도 4에 도시된 바와 같이, 블레오마이신의 경우에도 대조군으로 사용한 pCAMBIA3300 (4번 lane)에서는 DNA 밴드가 보이지 않으나 블레오마이신 유전자가 삽입된 2번과 3번에서는 약 200bp의 밴드를 확인할 수 있다. 이러한 결과로 바이너리벡터의 T-DNA부분에 원하는 내성유전자 카세트가 성공적으로 삽입 구축되었음을 확인하였다.

실시 예 3: 아그로박테리움 형질전환

실시예 1에서 제조된 바이너리 벡터(p3300-ble, pCAMBIA3300-ble, p3300-par 및 pCAMBIA3300-par)들을 freezing & thawing 방법(Weigel, D and Glazebrook, J. (2006) Transformation of Agrobacterium Using the Freeze-Thaw Method. Cold Spring Harb. Protoc. doi:10.1101)에 따라 Agrobacterium tumefacience LBA4404에 형질전환 시킨 후, YEP 배지(입수처)에 50㎍/㎖ 리팜피신, 스트렙토마이신 50㎍/㎖ 및 가나마이신 50㎍/㎖이 포함된 고체배지에서 배양시키고, 배양된 콜로니를 액체배지에 재 접종시켜 형질전환된 아그로박테리움을 선별하였다. 상기 Agrobacterium tumefacience LBA4404는 helper 플라스미드 pAL4404를 포함하고 있으며, Rifampicin과 Streptomycin (또는 spectinomycin) 내성 균주이다.

실시 예 4: 바이너리 벡터가 도입된 아그로박테리움을 이용한 미세조류 형질전환

미세조류 클라미도모나스 레인하르티 cc-125(Chlamydomonas center)및 cc-503(Chlamydomonas center) 균주를 1.5% agar가 포함된 TAP (Tris-Acetate-Phosphate) 고체배지에서 배양한 후, 배양된 콜로니를 동일 성분의 액체배지 50ml에 접종시키고, 23℃, 150rpm, 광량 80μmol/㎡/s에서 대수증식기에 해당하는 5일까지 배양시켰다. 배양된 균주를 블레오마이신 또는 파로모마이신을 각각 10㎍/㎖ 농도로 포함하고, 아세토시린곤 (acetosyringone)을 100μM 농도로 포함하는 TAP 고체배지상 (90㎜ 페트리디쉬)에 ml당 10⁷ 정도 되도록 도말후, 2일간 80μmol/㎡/s 광량에서 성장시키고, 밤새 항생제가 포함된 YEP 배지에서 배양된 실시예 2의 p3300-ble, pCAMBIA3300-ble, p3300-par 및 pCAMBIA3300-par 벡터가 각각 도입되어 있는 아그로박테리움 배양액을 흡광도 O.D=600nm에서 0.5 정도 되도록 조정하여 클라미도모나스를 키운 TAP 배지에 얇게 도말하였다.

클라미도모나스 레인하르티 cc-125 또는 cc-503와 실시예 2의 형질전환된 아그로박테리움을 48시간 동안 공동배양(co-cultivation)시킨 후, TAP 배지로 2-3회 수세(wash)하여 배지상에 자란 세포들을 회수하였다.

유전자 전달이 일어나지 않은 아그로박테리움 세포는 500㎍/㎖ 농도의 세포탁심(cefotaxime)을 이용하여 제거시킨 후, 1,000 rpm에서 2분간 원심분리하여 재회수하였다. 회수된 세포를 소량의 TAP 액체배지에 재 현탁하여 10㎍/㎖ 농도의 블레오마이신 또는 파로모마이신과 500㎍/㎖ 농도의 세포탁심이 포함된 TAP고체배지상에서 7일간 배양한 후 형성된 집락을 계산하고 형질전환율을 계산하여 하기 표 1에 나타내었다. 형성된 콜로니들을 상기와 동일 조건의 고체배지와 액체배지에 접종한 후 동일시간 배양하여 안정성을 평가하였으며 이후 유전자 포함여부 등을 확인하였다.

균주	플라스미드	형질전환율 (per 106 cell±SD)
cc-125	p3300-ble	381±25
	pCAMBIA3300-ble	359±21
	p3300-par	379±24
	pCAMBIA3300-par	352±19

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 기존의 바이너리 벡터인 pCAMBIA3300의 CAM35S 프로모터 하류에 블레오마이신과 파로모마이신을 발현하였을 때 보다 RBCS2 프로모터를 사용하였을 때 발현량이 약 1.5 배 증가하는 것을 알 수 있으며, RBCS2 프로모터를 개별적으로 하여 발현시킨 경우보다 pHSP70A와 rbcS2를 복합적으로 구성한 경우가 발현량이 2.8배 정도 향상된 것을 확인할 수 있었다.

실시 예 5: 유전자 발현 정도 확인

바이너리 벡터내의 프로모터 차이에 의한 유전자의 발현정도를 비교하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 공통적으로 파로모마이신 내성유전자가 삽입되어 있으나 CaMV35S 프로모터 하류에 장착된 pCAMBIA3300-par와 미세조류 클라미도모나스 유래의 프로모터 하류에서 발현되는 p3300-par 간의 파로모마이신 내성유전자의 발현율 차이를 각각의 바이너리 벡터가 형질전환된 클라미도모나스 cc-125 균주의 RNA를 TRIZOL 방법으로 분리한 후, 각기 2㎍/㎖ 농도의 RNA를 주형으로 하기의 프라이머를 사용하여 총량 20㎕로 역전사효소 반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다.

[서열번호 13]: Par-RT1 ; 5'-TCAGAAGAACTCGTCCAACAGCCG

이후 상기 서열번호 11(par1) 및 서열번호 12(par2) 프라이머를 이용하여 실시예 1에 기재된 내용과 동일한 조건과 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과 도6에나타난 바와 같이, pCAMBIA3300-par에 비하여 p3300-par의 유전자발현이 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 이미지분석을 통한 농도차이는 미세조류 프로모터하에서 발현되는 p3300-par에서 약 3배정도 더 높은 것으로 나타났다.

블레오마이신 내성유전자가 삽입되어 있는 pCAMBIA3300-ble과 p3300-ble 간의 블레오마이신 내성유전자의 발현율 차이는 real-time pcr을 통하여 분석하였다.

먼저, 실시예 4에서 제작된 pCAMBIA3300-ble 및 p3300-ble 바이너리 벡터가 각각 형질전환된 클라미도모나스 cc-125 균주의 RNA를 TRIZOL 방법으로 분리하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 200ng/ml을 주형으로 SYBR Green PCR kit (QIAGEN)를 사용하여 총량 20ul로 Real-time pcr (iCycler, Biorad)을 수행하였다. pCAMBIA3300-ble와 p3300-ble의 ct(threshold cycle)값과 delta-ct값을 비교한 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 대조군으로 사용한 항시 발현되는 actin 유전자보다는 발현율이 낮지만 기존의 CaMV35S 프로모터 하에서 발현되는 pCAMBIA3300-ble보다 미세조류 유래의 프로모터하에서 발현되는 p3300-ble가 더 높은 ct값을 보여 발현률이 더 높은 것을 알 수 있었다.

구분	대상유전자	ct값	△ct
대조군	Actin	16	-
pCAMBIA3300-ble	bleomycin	22	4
p3300-ble		18

실시 예 6: 코돈 최적화된 리포터 유전자의 합성 및 발현 정도

도 6은 대장균과 클라미도모나스의 코돈 선호도 차이를 나타낸 그래프로서, 적색은 대장균 K-12, 흑색은 클라미도모나스(CC-503)를 나타낸다. 도 6에 나타난 바와 같이, 두 균주의 코돈 사용 비율을 비교하면 전체적으로 23% 정도의 차이를 보이며, 특히 라이신, 아르기닌, 프롤린, 발린, 페닐알라닌 등에서 큰 차이를 보이는 것을 알 수 있다.

서열번호 14의 염기서열로 표시되는 대장균 유래의 uidA 유전자의 3번째 codon의 3번째 코돈에 A 또는 T에 해당하는 것을 G와 C로 변경시켜, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 코돈이 최적화된 리포터 유전자(crGUS)를 합성하였다.

대장균 유래의 uidA 유전자의 3번째 GC%는 59%이었으나, 코돈 최적화 후 신규 합성된 crGUS 유전자의 3번째 GC%는 72%로 증가되었고 미국 NCBI 블라스트 N 검색결과 전체 1812bp 중 73개가 변경된 것으로 나타났다.

합성된 리포터 유전자(crGUS)의 전후방에 위치한 제한 효소 HindIII와 EcoRI부위를 pGEM-T easy vector(Promega, USA)로부터 절단 한 후, 용리(elution)하여 클라미도모나스 유래의 항시발현 프로모터인 베타튜불린 프로모터와 3'-UTR이 들어있는 litmus28 벡터(입수처)에 삽입한 후, 대장균 DH5a에 형질전환시킨 클론으로부터 1,824bp의 유전자가 삽입된 것을 확인하고, 이것을 다시 XbaI과 SpeI으로 절단한 후 미리 XbaI으로 절단시킨 실시예 1에서 구축된 p3300-Ble와 p3300-Par의 T-DNA 위치에 XbaI과 SpeI 으로 삽입하여 최종적으로 p3300-B-GUS 및 p3300-P-GUS를 완성하였다 (도 7).

구축된 벡터의 유용성을 확인하기 위해 클라미도모나스 레인하르티 cc-125에 agrobacterium을 이용하여 형질전환하고 각각 10㎍/㎖ 씩의 블레오마이신과 파로모마이신으로 선별하였다. 그 결과, 미세조류 유래의 프로모터 하에서 발현시킨 내성 유전자의 발현정도가 더 증가한 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> SUNGKYUNKWAN University Foundation for Collaboration <120> Useful Vector for Transformation of Microalgae and Microalgae Transformed with the Same <130> P10-B019 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1812 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crGUS <400> 1 atgttgcgtc ccgtggagac ccccacccgc gagatcaaga agctcgacgg cctgtgggca 60 ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatc gatcagcgct ggtgggagag cgcgctgcag 120 gagagccggg caatcgccgt gcccggcagt ttcaacgacc agttcgccga tgcagatatt 180 cgtaattatg tgggcaacgt ctggtaccag cgcgaggtct tcataccgaa gggttgggca 240 ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaggt gtgggtcaac 300 aaccaggaag tgatggagca tcagggcggc tacacgccat tcgaggccga cgtcacgccg 360 tacgtgatcg ccgggaagag tgtacgtatc accgtgtgcg tgaacaacga gctgaactgg 420 cagactatcc cgccgggaat ggtgatcacc gacgaaaacg gcaagaagaa gcagtcgtac 480 ttccatgatt tctttaacta cgccgggatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 540 aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagcctg taaccacgcg 600 tctgttgact ggcaggtggt ggccaacggt gatgtcagcg tggagctgcg cgacgcggac 660 cagcaggtgg ttgcaactgg acaaggcacc agcgggactt tgcaggtggt gaatccgcac 720 ctctggcaat cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa gagccagaca 780 gagtgtgata tctacccgct gcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgagcag 840 ttcctgatca accacaagcc gttctacttc actggcttcg gccgtcatga agatgcggat 900 ttgcgcggca agggattcga taacgtgctg atggtgcacg atcacgcatt aatggactgg 960 attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaggagat gctcgactgg 1020 gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgcag ctgtcggctt taacctctct 1080 ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaggaac tgtacagcga agaggcagtc 1140 aacggggaaa ctcagcaggc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa 1200 agccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt 1260 gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg 1320 atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt 1380 gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg 1440 gcagagaagg tactggaaaa ggaacttctg gcctggcagg agaagctgca tcagccgatt 1500 atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg 1560 tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt cgatcgcgtc 1620 agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt tcgcgacctc gcagggcata 1680 ttgcgcgttg gcggtaacaa gaagggcatc ttcacccgcg accgcaagcc gaagtcggcg 1740 gctttcctgc tgcagaagcg ctggactggc atgaacttcg gcgagaagcc gcagcagggc 1800 ggcaagcaat ga 1812 <210> 2 <211> 828 <212> DNA <213> pSad promoter <400> 2 ggatcccaca cacctgcccg tctgcctgac aggaagtgaa cgcatgtcga gggaggcctc 60 accaatcgtc acacgagccc tcgtcagaaa cacgtctccg ccacgctctc cctctcacgg 120 ccgaccccgc agcccttttg ccctttccta ggccaccgac aggacccagg cgctctcagc 180 atgcctcaac aacccgtact cgtgccagcg gtgcccttgt gctggtgatc gcttggaagc 240 gcatgcgaag acgaaggggc ggagcaggcg gcctggctgt tcgaagggct cgccgccagt 300 tcgggtgcct ttctccacgc gcgcctccac acctaccgat gcgtgaaggc aggcaaatgc 360 tcatgtttgc ccgaactcgg agtccttaaa aagccgcttc ttgtcgtcgt tccgagacat 420 gttagcagat cgcagtgcca cctttcctga cgcgctcggc cccatattcg gacgcaattg 480 tcatttgtag cacaattgga gcaaatctgg cgaggcagta ggcttttaag ttgcaaggcg 540 agagagcaaa gtgggacgcg gcgtgattat tggtatttac gcgacggccc ggcgcgttag 600 cggcccttcc cccaggccag ggacgattat gtatcaatat tgttgcgttc gggcactcgt 660 gcgagggctc ctgcgggctg gggaggggga tctgggaatt ggaggtagaa cgaaaaantg 720 gntngctngg gggggnagnt ttcntcnccn ancaagccag ggtttaggtg ttgcgctctt 780 gactcgttgt gcattctagg accccactgc tactcacaac aagcccat 828 <210> 3 <211> 212 <212> DNA <213> rbcS2 promoter <400> 3 ccgggcgcgc cagaaggagc gcagccaaac caggatgatg tttgatgggg tatttgagca 60 cttgcaaccc ttatccggaa gccccctggc ccacaaaggc taggcgccaa tgcaagcagt 120 tcgcatgcag cccctggagc ggtgccctcc tgataaaccg gccagggggc ctatgttctt 180 tactttttta caagagaagt cactcaacat ct 212 <210> 4 <211> 256 <212> DNA <213> pHsp70A promter <400> 4 gagctcgctg aggcttgaca tgattggtgc gtatgtttgt atgaagctac aggactgatt 60 tggcgggcta tgagggcgcg ggaagctctg gaagggccgc gatggggcgc gcggcgtcca 120 gaaggcgcca tacggcccgc tggcggcacc catccggtat aaaagcccgc gaccccgaac 180 ggtgacctcc actttcagcg acaaacgagc acttatacat acgcgactat tctgccgcta 240 tacataacca ctcagc 256 <210> 5 <211> 168 <212> DNA <213> bleomycin gene <400> 5 atggccaagc tgaccagcgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc 60 gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120 gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccag 168 <210> 6 <211> 804 <212> DNA <213> paromomycin gene <400> 6 tcagaagaac tcgtccaaca gccggtaaaa cgccagcttt tcctccgata ccgccccatc 60 ccacccgcgc ccgtactccc gcaggaacgc cgcggaacac tccggcccga accacgggtc 120 ctcctcgtgg gccagctcgc gcagcaccag cgcgagatcg gagtgccggt ccgcacggcc 180 gacccgcccc acgtcgatca gcccggtcac ctcgcaggta cgagggtcga gcagcacgtt 240 gtccgggcac aggtgaccgt ggcaaaccgc cagatcctcg tccgcaggcc gagtccgctc 300 cagctcggcg agaagccgct cccccgacca ccccttccgc tcctcgtcca gatcctccaa 360 gtcgacgctc ccttcagcga cagcacgggc cgcctgcggc accgtcaccg cgagactgcg 420 atcgaacgga caccgctccc agtccagcgc gtgcagcgaa cgagcgagcc ccgcgagcgc 480 caccgccacg tccagccgct gctcccgcgg ccaccgcgca ctggccggac gccccggaac 540 cgcttcggtg accaaccagg cgaccctctc gtccccacca ccctccacaa cacgaggtac 600 gggaatcccc acctccgcca accacaccag ccgctcagcc tcacccaaca agcccacccc 660 ggcccccaga gctgccacct tgacaaacaa ctcccgccca ccaccccgaa gccgataaac 720 accagccccc gaggccccat cctccacaac aacccactca caaccgggat accgaccccg 780 cagtgcacgc aacgcatcgt ccat 804 <210> 7 <211> 10724 <212> DNA <213> p3300-B-GUS binary vector <400> 7 ctagactttc ttgcgctatg acacttccag caaaaggtag ggcgggctgc gagacggctt 60 cccggcgctg catgcaacac cgatgatgct tcgacccccc gaagcccctt cggggctgca 120 tgggcgctcc gtgccgctcc agggcgagcg ctgtttaaat agccagcccc cgattgcaaa 180 gacattatag cgagctacca aagccatatt caaacaccta gatcactacc acttctacac 240 aggccactcg agcttgtgat cgcactccgc taagggggcg cctcttcctc ttcgtttcag 300 tcacaacccg caaacatgcg tgagatcgtc cacatccagg tgcgttgagc gcttagcgca 360 ttggctgagg ctagcgcagt caaggggcgc ggggtcgtgg ctacaccccc gcggctcaat 420 ttcaaacctg tttccgactt cgaggctcat cgtcgctccg cctgcttgcg cctttacatt 480 cacagaagct tatgttacgt cctgtagaaa ccccaacccg tgaaatcaaa aaactcgacg 540 gcctgtgggc attcagtctg gatcgcgaaa actgtggaat tgatcagcgt tggtgggaaa 600 gcgcgttaca agaaagccgg gcaattgctg tgccaggcag ttttaacgat cagttcgccg 660 atgcagatat tcgtaattat gtgggcaacg tctggtatca gcgcgaagtc tttataccga 720 aaggttgggc aggccagcgt atcgtgctgc gtttcgatgc ggtcactcat tacggcaaag 780 tgtgggtcaa taatcaggaa gtgatggagc atcagggcgg ctatacgcca tttgaagccg 840 atgtcacgcc gtatgttatt gccgggaaaa gtgtacgtat caccgtttgt gtgaacaacg 900 aactgaactg gcagactatc ccgccgggaa tggtgattac cgacgaaaac ggcaagaaaa 960 agcagtctta cttccatgat ttctttaact acgccgggat ccatcgcagc gtaatgctct 1020 acaccacgcc gaacacctgg gtggacgata tcaccgtggt gacgcatgtc gcgcaagcct 1080 gtaaccacgc gtctgttgac tggcaggtgg tggccaatgg tgatgtcagc gttgaactgc 1140 gtgatgcgga tcaacaggtg gttgcaactg gacaaggcac cagcgggact ttgcaagtgg 1200 tgaatccgca cctctggcaa tcgggtgaag gttatctcta tgaactgtgc gtcacagcca 1260 aaagccagac agagtgtgat atctacccgc tgcgcgtcgg catccggtca gtggcagtga 1320 agggcgaaca gttcctgatc aaccacaaac cgttctactt tactggcttt ggccgtcatg 1380 aagatgcgga tttgcgcggc aaaggattcg ataacgtgct gatggtgcac gatcacgcat 1440 taatggactg gattggggcc aactcctacc gtacctcgca ttacccttac gctgaagaga 1500 tgctcgactg ggcagatgaa catggcatcg tggtgattga tgaaactgca gctgtcggct 1560 ttaacctctc tttaggcatt ggtttcgaag cgggcaacaa gccgaaagaa ctgtacagcg 1620 aagaggcagt caacggggaa actcagcagg cgcacttaca ggcgattaaa gagctgatag 1680 cgcgtgacaa aaaccaccca agcgtggtga tgtggagtat tgccaacgaa ccggataccc 1740 gtccgcaagg tgcacgggaa tatttcgcgc cactggcgga agcaacgcgt aaactcgacc 1800 cgacgcgtcc gatcacctgc gtcaatgtaa tgttctgcga cgctcacacc gataccatca 1860 gcgatctctt tgatgtgctg tgcctgaacc gttattacgg atggtatgtc caaagcggcg 1920 atttggaaac ggcagagaag gtactggaaa aagaacttct ggcctggcag gagaaactgc 1980 atcagccgat tatcatcacc gaatacggcg tggatacgtt agccgggctg cactcaatgt 2040 acaccgacat gtggagtgaa gagtatcagt gtgcatggct ggatatgtat caccgcgtct 2100 ttgatcgcgt cagcgccgtc gtcggtgaac aggtatggaa tttcgccgat tttgcgacct 2160 cgcaaggcat attgcgcgtt ggcggtaaca agaagggcat cttcacccgc gaccgcaaac 2220 cgaagtcggc ggcttttctg ctgcaaaaac gctggactgg catgaacttc ggtgaaaaac 2280 cgcagcaggg aggcaaacaa tgagaattcc tcgagacgta cggtgcgcgc gatgcattcg 2340 aagatctgcc cactagaact agtggatccc acacacctgc ccgtctgcct gacaggaagt 2400 gaacgcatgt cgagggaggc ctcaccaatc gtcacacgag ccctcgtcag aaacacgtct 2460 ccgccacgct ctccctctca cggccgaccc cgcagccctt ttgccctttc ctaggccacc 2520 gacaggaccc aggcgctctc agcatgcctc aacaacccgt actcgtgcca gcggtgccct 2580 tgtgctggtg atcgcttgga agcgcatgcg aagacgaagg ggcggagcag gcggcctggc 2640 tgttcgaagg gctcgccgcc agttcgggtg cctttctcca cgcgcgcctc cacacctacc 2700 gatgcgtgaa ggcaggcaaa tgctcatgtt tgcccgaact cggagtcctt aaaaagccgc 2760 ttcttgtcgt cgttccgaga catgttagca gatcgcagtg ccacctttcc tgacgcgctc 2820 ggccccatat tcggacgcaa ttgtcatttg tagcacaatt ggagcaaatc tggcgaggca 2880 gtaggctttt aagttgcaag gcgagagagc aaagtgggac gcggcgtgat tattggtatt 2940 tacgcgacgg cccggcgcgt tagcggccct tcccccaggc cagggacgat tatgtatcaa 3000 tattgttgcg ttcgggcact cgtgcgaggg ctcctgcggg ctggggaggg ggatctggga 3060 attggaggta gaacgaaaaa ntggntngct ngggggggna gntttcntcn ccnancaagc 3120 cagggtttag gtgttgcgct cttgactcgt tgtgcattct aggaccccac tgctactcac 3180 aacaagccca tatggccaag ctgaccagcg ccgttccggt gctcaccgcg cgcgacgtcg 3240 ccggagcggt cgagttctgg accgaccggc tcgggttctc ccgggacttc gtggaggacg 3300 acttcgccgg tgtggtccgg gacgacgtga ccctgttcat cagcgcggtc caggaccagt 3360 tctggcagca gctggaccgc ctgtaccatg gagaagagct ttacttgccg ggatggccga 3420 tttcgctgat tgatacggga tcggagctcg gaggctttcg cgctaggggc taggcgaagg 3480 gcagtggtga ccagggtcgg tgtggggtcg gcccacggtc aattagccac aggaggatca 3540 gggggaggta ggcacgtcga cttggtttgc gaccccgcag ttttggcgga cgtgctgttg 3600 tagatgttag cgtgtgcgtg agccagtggc caacgtgcca cacccattga gaagaccaac 3660 caacttactg gcaatatctg ccaatgccat actgcatgta atggccaggc catgtgagag 3720 tttgccgtgc ctgcgcgcgc cccgggggcg cagtttagct gaccagccgt gggatgatgc 3780 acgcatttgc aaggacaggg taatcacagc agcaacatgg tgggcttagg acagctgtgg 3840 gtcagtggac ggacggcagg 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cggcggttgc 8220 cgggattctt tgcggattcg atcagcggcc gcttgccacg attcaccggg gcgtgcttct 8280 gcctcgatgc gttgccgctg ggcggcctgc gcggccttca acttctccac caggtcatca 8340 cccagcgccg cgccgatttg taccgggccg gatggtttgc gaccgtcacg ccgattcctc 8400 gggcttgggg gttccagtgc cattgcaggg ccggcagaca acccagccgc ttacgcctgg 8460 ccaaccgccc gttcctccac acatggggca ttccacggcg tcggtgcctg gttgttcttg 8520 attttccatg ccgcctcctt tagccgctaa aattcatcta ctcatttatt catttgctca 8580 tttactctgg tagctgcgcg atgtattcag atagcagctc ggtaatggtc ttgccttggc 8640 gtaccgcgta catcttcagc ttggtgtgat cctccgccgg caactgaaag ttgacccgct 8700 tcatggctgg cgtgtctgcc aggctggcca acgttgcagc cttgctgctg cgtgcgctcg 8760 gacggccggc acttagcgtg tttgtgcttt tgctcatttt ctctttacct cattaactca 8820 aatgagtttt gatttaattt cagcggccag cgcctggacc tcgcgggcag cgtcgccctc 8880 gggttctgat tcaagaacgg ttgtgccggc ggcggcagtg cctgggtagc tcacgcgctg 8940 cgtgatacgg gactcaagaa tgggcagctc gtacccggcc agcgcctcgg caacctcacc 9000 gccgatgcgc gtgcctttga tcgcccgcga cacgacaaag gccgcttgta gccttccatc 9060 cgtgacctca atgcgctgct taaccagctc caccaggtcg gcggtggccc atatgtcgta 9120 agggcttggc tgcaccggaa tcagcacgaa gtcggctgcc ttgatcgcgg acacagccaa 9180 gtccgccgcc tggggcgctc cgtcgatcac tacgaagtcg cgccggccga tggccttcac 9240 gtcgcggtca atcgtcgggc ggtcgatgcc gacaacggtt agcggttgat cttcccgcac 9300 ggccgcccaa tcgcgggcac tgccctgggg atcggaatcg actaacagaa catcggcccc 9360 ggcgagttgc agggcgcggg ctagatgggt tgcgatggtc gtcttgcctg acccgccttt 9420 ctggttaagt acagcgataa ccttcatgcg ttccccttgc gtatttgttt atttactcat 9480 cgcatcatat acgcagcgac cgcatgacgc aagctgtttt actcaaatac acatcacctt 9540 tttagacggc ggcgctcggt ttcttcagcg gccaagctgg ccggccaggc cgccagcttg 9600 gcatcagaca aaccggccag gatttcatgc agccgcacgg ttgagacgtg cgcgggcggc 9660 tcgaacacgt acccggccgc gatcatctcc gcctcgatct cttcggtaat gaaaaacggt 9720 tcgtcctggc cgtcctggtg cggtttcatg cttgttcctc ttggcgttca ttctcggcgg 9780 ccgccagggc gtcggcctcg gtcaatgcgt cctcacggaa ggcaccgcgc cgcctggcct 9840 cggtgggcgt cacttcctcg ctgcgctcaa gtgcgcggta cagggtcgag cgatgcacgc 9900 caagcagtgc agccgcctct ttcacggtgc ggccttcctg gtcgatcagc tcgcgggcgt 9960 gcgcgatctg tgccggggtg agggtagggc gggggccaaa cttcacgcct cgggccttgg 10020 cggcctcgcg cccgctccgg gtgcggtcga tgattaggga acgctcgaac tcggcaatgc 10080 cggcgaacac ggtcaacacc atgcggccgg ccggcgtggt ggtgtcggcc cacggctctg 10140 ccaggctacg caggcccgcg ccggcctcct ggatgcgctc ggcaatgtcc agtaggtcgc 10200 gggtgctgcg ggccaggcgg tctagcctgg tcactgtcac aacgtcgcca gggcgtaggt 10260 ggtcaagcat cctggccagc tccgggcggt cgcgcctggt gccggtgatc ttctcggaaa 10320 acagcttggt gcagccggcc gcgtgcagtt cggcccgttg gttggtcaag tcctggtcgt 10380 cggtgctgac gcgggcatag cccagcaggc cagcggcggc gctcttgttc atggcgtaat 10440 gtctccggtt ctagtcgcaa gtattctact ttatgcgact aaaacacgcg acaagaaaac 10500 gccaggaaaa gggcagggcg gcagcctgtc gcgtaactta ggacttgtgc gacatgtcgt 10560 tttcagaaga cggctgcact gaacgtcaga agccgactgc actatagcag cggaggggtt 10620 ggatcaaagt actttgatcc cgaggggaac cctgtggttg gcatgcacat acaaatggac 10680 gaacggataa accttttcac gcccttttaa atatccgtta ttctaataaa cgctcttttc 10740 tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact gaaggcggga 10800 aacgacaatc tgatccaagc tcaagctgct ctagcattcg ccattcaggc tgcgcaactg 10860 ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg 10920 tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac 10980 gacggccagt gccaagcttg catgcctgca ggtcgact 11018 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ble1 primer <400> 9 ggaattcatg gccaagctga ccagcgcc 28 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ble2 primer <400> 10 gctcgagctg gtcctggacc gcgctgat 28 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> par1 primer <400> 11 ggaattcaag catggacgat gcgttgcgtg c 31 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> par2 primer <400> 12 gctcgagtca gaagaactcg tccaacagcc g 31 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> par-RT1 primer <400> 13 tcagaagaac tcgtccaaca gccg 24 <210> 14 <211> 1812 <212> DNA <213> uidA <400> 14 atgttacgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60 ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120 gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180 cgtaattatg tgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240 ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300 aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360 tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 420 cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 480 ttccatgatt tctttaacta cgccgggatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 540 aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagcctg taaccacgcg 600 tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat 660 caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcacc agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac 720 ctctggcaat cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca 780 gagtgtgata tctacccgct gcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag 840 ttcctgatca accacaaacc gttctacttt actggctttg gccgtcatga agatgcggat 900 ttgcgcggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg atcacgcatt aatggactgg 960 attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg 1020 gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgcag ctgtcggctt taacctctct 1080 ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc 1140 aacggggaaa ctcagcaggc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa 1200 aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt 1260 gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg 1320 atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt 1380 gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg 1440 gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt 1500 atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg 1560 tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc 1620 agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata 1680 ttgcgcgttg gcggtaacaa gaagggcatc ttcacccgcg accgcaaacc gaagtcggcg 1740 gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga 1800 ggcaaacaat ga 1812

Claims (16)

1. 리포터 유전자에서 3번째 코돈이 최적화되어 있는 것을 특징으로 하는 형질전환된 미세조류 선별용 리포터 유전자.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 3번째 코돈의 GC %가 70~90%인 것을 특징으로 하는 미세조류 선별용 리포터 유전자.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 crGUS, crGFP 및 crlux로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미세조류 선별용 리포터 유전자.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 crGUS는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 미세조류 선별용 리포터 유전자.
   
5. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 crGUS 유전자를 포함하는 미세조류 선별용 리포터 유전자.
   
6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항의 리포터 유전자를 포함하는 바이너리 벡터.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 바이너리 벡터는 pSaD 프로모터, rbcS2 프로모터, pHsp70A 프로모터 및 beta-tublin 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 목적 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이너리 벡터.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 프로모터는 미세조류 유래인 것을 특징으로 하는 바이너리 벡터.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 프로모터의 하류에는 미세조류 유래의 인트론(intron)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이너리 벡터.
   
10. 제7항에 있어서, 상기 목적 유전자는 블레오마이신 내성 유전자(ble) 또는 파로모마이신 내성 유전자(par)인 것을 특징으로 하는 바이너리 벡터.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 블레오마이신 내성유전자(ble)는 서열번호 5의 염기서열로 표시되고, 파로모마이신 내성 유전자(par)는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 바이너리 벡터.
    
12. 제7항에 있어서, 상기 바이너리 벡터는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 p3300-B-GUS인 것을 특징으로 하는 바이너리 벡터.
    
13. 제7항에 있어서, 상기 바이너리 벡터는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 p3300-P-GUS인 것을 특징으로 하는 바이너리 벡터.
    
14. 제6항의 바이너리 벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 숙주에 도입시켜 수득되는 형질전환 미생물.
    
15. 제14항의 형질전환 미생물이 도입되어 형질전환된 미세조류.
    
16. 제6항의 바이너리 벡터에 의해 형질전환된 미세조류.

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