CN108866091B - 提高沼泽红假单胞菌角鲨烯含量用质粒及制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量的方法，其原理是通过敲除沼泽红假单胞菌的基因crtB来阻断类胡萝卜素的合成途径实现，所述沼泽红假单胞菌为敲除了shc基因后得到的重组菌R.palustris(Δshc)。本发明开公开了一种质粒pkCRLR以及该质粒pkCRLR的制备和使用方法，用于实现敲除重组菌R.palustris(Δshc)中的基因crtB，进而提高高沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量。

Description

提高沼泽红假单胞菌角鲨烯含量用质粒及制备和使用方法

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，特别是涉及一种提高沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量的方法，还涉及一种用于敲除基因crtB的质粒pkCRLR，还涉及一种该质粒pkCRLR的制备和使用方法。

背景技术

角鲨烯是一种天然存在于多种微生物及动植物细胞内的三萜烯类化合物，具有抗氧化，保护心脏，提高免疫力，降低血脂及抑制癌症发展等多种功效，被广泛应用于医药及保健品领域。当前，市面上的角鲨烯主要来源于植物种子及动物肝脏的提取，且价格昂贵。该方法具有周期长、成本高、破坏环境等缺点。因此，亟需新的更环保、更廉价的生产方式。

微生物发酵生产活性化合物具有廉价、快速、环保等优点。近年来，诸多研究致力于利用酵母、微藻及沼泽红假单胞菌等微生物进行角鲨烯的发酵生产，但均未实现突破，其产量与工业化生产要求尚有较大差距。因此，亟需新的生产菌株及提高角鲨烯含量的新方法。

近年来，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)基因组测序完成，使得采用代谢工程技术对其进行改造成为可能。由于Rhodopseudomonas palustris(R.palustris)富含多种生物活性物质，对其进行分子生物学改造相关研究越来越多。前期申请人通过敲除沼泽红假单胞中的shc基因，得到重组菌R.palustris(Δshc)，其原理是阻断角鲨烯下游合成途径使角鲨烯含量提高了27倍。然而，重组菌R.palustris(Δshc)中的角鲨烯产量尚未达到工业化生产水平。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种提高沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量的方法，用于实现提高其角鲨烯的合成。

本发明的第二个目的是提供一种质粒pkCRLR，用于敲除重组菌R.palustris(Δshc)中的基因crtB。

本发明的第三个目的是提供一种该质粒pkCRLR的制备方法，用以实现质粒pkCRLR的制备。

本发明的第四个目的是提供一种质粒pkCRLR的使用方法，用于如何使用质粒pkCRLR敲除重组菌R.palustris(Δshc)中的基因crtB。

为了达到上述第一个目的，本发明所采用的第一种技术方案是，一种提高沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量的方法，通过敲除沼泽红假单胞菌的基因crtB来阻断类胡萝卜素的合成途径实现，所述沼泽红假单胞菌为敲除了shc基因后得到的重组菌R.palustris(Δshc)。

为了达到上述第二个目的，本发明所采用的第二个技术方案是，一种质粒pkCRLR，用于敲除权利要求1所述基因crtB，包括载体pk18mobsacB，载体pk18mobsacB内插入有根据基因crtB上下游序列设计的上游同源臂CRL与下游同源臂CRR、大肠杆菌复制起始位点oriV、卡那霉素抗性筛选标记以及蔗糖敏感基因sacB；所述质粒pkCRLR的核苷酸序列如序列1所示，所述基因crtB的核苷酸序列如序列2所示，所述上游同源臂CRL的核苷酸序列如序列3所示，所述下游同源臂CRR的核苷酸序列如序列3所示。

为了达到上述第三个目的，本发明所采用的技术方案是，一种质粒pkCRLR的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1，根据重组菌R.palustris(Δshc)中基因crtB及其上下游序列，设计两对引物，以基因组为模板，通过菌落PCR获得基因crtB的扩增的上游同源臂CRL和下游同源臂CRR；

步骤2，扩增的上游同源臂CRL通过酶切与连接反应插入至载体pk18mobsacB中酶切位点EcoRI与BamHI之间，形成质粒pkCRL；

步骤3，扩增的下游同源臂CRR通过酶切与连接反应插入至质粒pkCRL中的酶切位点BamHI与HindIII之间，形成质粒pkCRLR。

本发明的第三种技术方案，还具有以下特点：

在所述步骤1中，上游同源臂CRL的一对引物为：

crtB_L_F：5’-GGAATTCCCGCGCTACAAGGAACTGATC-3’

crtB_L_R：5’-CGGGATCCGACTGTCGGCCTCGGGGACC-3’。

在所述步骤1中，下游同源臂CRR的一对引物为：

crtB_R_F：5’-CGGGATCCTGAGTCTGCAATCCGATATG-3’

crtB_R_R：5’-CCCAAGCTTATTGGTGAGTTGCATCGCGCA-3’。

为了达到上述第四个目的，本发明所采用的第四种技术方案是，一种质粒pkCRLR的使用方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，通过结合转移法将质粒pkCRLR转入重组菌R.palustris(Δshc)中；

步骤2，敲除R.palustris(Δshc)中的基因crtB。

本发明的第四种技术方案，还具有以下特点：

所述步骤1具体按照以下步骤实施：

步骤1.1，将质粒pkCRLR转入大肠杆菌E.coli S17-1形成重组菌E.coliS17-1/pkCRLR；

步骤1.2，重组菌R.palustris(Δshc)、大肠杆菌E.coli S17-1/pkCRLR及大肠杆菌E.coli HB101/pRK2013三株菌按照3:1:1的质量比例混合接入YP固体培养基使质粒pkCRLR转入重组菌R.palustris(Δshc)。

所述步骤2具体按照以下步骤实施：

步骤2.1，将1.2中所述的混合培养物影印至含卡那霉素素的YP固体平板筛选单交换重组菌；

步骤2.2，利用蔗糖培养基筛选双交换重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)；

步骤2.3，PCR及基因测序验证重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)。

本发明的有益效果是：

(1)通过本发明技术方案用于提高重组菌R.palustris(Δshc)中角鲨烯的含量，通过敲除基因crtB阻断类胡萝卜素合成途径，使更多的合成前体物用于角鲨烯的合成提高细胞中角鲨烯的积累量。

(2)通过本发明技术方案得到的质粒pkCRLR用于重组菌R.palustris(Δshc)中基因crtB的敲除，含有根据crtB基因上下游序列设计的上、下游同源重组臂CRL与CRR以及复制起始位点ori V，同时包含卡那霉素抗性筛选标记以及蔗糖敏感基因sacB。

(3)本发明技术方案得到的质粒pkCRLR为重组菌R.palustris(Δshc)发酵生产角鲨烯提供了有效的载体工具。

附图说明

图1是本发明所涉及的质粒pkCRLR的构建原理图；

图2是本发明所涉及的质粒pkCRLR验证示意图；

图3是本发明所涉及的质粒pkCRL质粒PCR及双酶切验证凝胶电泳图；

图4是本发明所涉及的pkCRLR质粒菌落PCR及双酶切验证图；

图5是本发明所涉及的重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)的验证示意图及菌落PCR验证凝胶电泳图；

图6是本发明所涉及的重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)中角鲨烯合成验证的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合附图说明和具体实施例对本发明的技术方案作进一步地详细说明。

实施例1

一种提高沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量的方法，通过敲除沼泽红假单胞菌的基因crtB来阻断类胡萝卜素的合成途径实现，所述沼泽红假单胞菌为敲除了shc基因后得到的重组菌R.palustris(Δshc)。

实施例2

一一种质粒pkCRLR，用于敲除权利要求1所述基因crtB，包括载体pk18mobsacB，载体pk18mobsacB内插入有根据基因crtB上下游序列设计的上游同源臂CRL与下游同源臂CRR、大肠杆菌复制起始位点ori V、卡那霉素抗性筛选标记以及蔗糖敏感基因sacB；所述质粒pkCRLR的核苷酸序列如序列1所示，所述基因crtB的核苷酸序列如序列2所示，所述上游同源臂CRL的核苷酸序列如序列3所示，所述下游同源臂CRR的核苷酸序列如序列3所示。

步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pTsqs进行验证。

实施例3

一种权利要求2所述质粒pkCRLR的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1，根据重组菌R.palustris(Δshc)中基因crtB及其上下游序列，设计两对引物，以基因组为模板，通过菌落PCR获得基因crtB的扩增的上游同源臂CRL和下游同源臂CRR；

上游同源臂CRL的一对引物为：

crtB_L_F：5’-GGAATTCCCGCGCTACAAGGAACTGATC-3’

crtB_L_R：5’-CGGGATCCGACTGTCGGCCTCGGGGACC-3’；

下游同源臂CRR的一对引物为：

crtB_R_F：5’-CGGGATCCTGAGTCTGCAATCCGATATG-3’

crtB_R_R：5’-CCCAAGCTTATTGGTGAGTTGCATCGCGCA-3’。

步骤2，扩增的上游同源臂CRL通过酶切与连接反应插入至载体pk18mobsacB中酶切位点EcoRI与BamHI之间，形成质粒pkCRL；

步骤3，扩增的下游同源臂CRR通过酶切与连接反应插入至质粒pkCRL中的酶切位点BamHI与HindIII之间，形成质粒pkCRLR。

实施例4

一种质粒pkCRLR的使用方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，通过结合转移法将质粒pkCRLR转入R.palustris(Δshc)中，具体为：

步骤1.1，将质粒pkCRLR转入大肠杆菌E.coli S17-1形成重组菌E.coliS17-1/pkCRLR；

步骤1.2，重组菌R.palustris(Δshc)、大肠杆菌E.coli S17-1/pkCRLR及大肠杆菌E.coli HB101/pRK2013三株菌按照3:1:1的质量比例混合接入YP固体培养基使质粒pkCRLR转入重组菌R.palustris(Δshc)；

步骤2，敲除R.palustris(Δshc)中的基因crtB，具体为：

步骤2.1，将1.2中所述的混合培养物影印至含卡那霉素素的YP固体平板筛选单交换重组菌；

步骤2.2，利用蔗糖培养基筛选双交换重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)；

步骤2.3，PCR及基因测序验证重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)。

其中，重组菌R.palustris(Δshc)为发明人前期在野生型R.palustrisTIE-1菌株基础上通过敲除基因组中shc基因所构建(Xu W,Chai C,Shao L,Yao J,Wang Y(2016)Metabolic engineering of Rhodopseudomonas palustris for squalene production.JInd Microbiol Biotechnol 43:719-725)。R.palustrisTIE-1的基因组DNA序列为GenBank号为CP002418.1的序列(BCT 11-DEC-2013)。以下实施例中的R.palustris(Δshc)、HB101/pRK2013以及、E.coli S17-1等菌株在西安医学院分子病毒与病毒免疫学实验室保藏，载体pk18mobsacB购自Nonagon公司；限制性内切酶(EcoRI、BamHI、HindIII)、T4连接酶、ExTaq聚合酶、DH5α感受态细胞以及250bp DNA Marker等均购自Takara公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒及琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生物科技有限公司；无水Na₂SO₄、色谱级甲醇、己烷及二氯甲烷等化学试剂均购自海默生物科技有限公司；角鲨烯标准品购自Sigma公司。

质粒pkCRLR质粒的构建及鉴定：通过菌落PCR法以提取的基因组为模板利用设计的两对引物分别扩增重组菌R.palustris(Δshc)基因组DNA序列的第1824253-1824752位(对应序列2的1-500位，命名为上游同源臂CRL)和第1825320-1825819位(对应序列3的1-500位，命名为下游同源臂CRR)，将上游同源臂CRL克隆至载体pk18mobsacB，得到含有基因crtB上游同源臂CRL的质粒pkCRL，进而将下游同源臂CRR克隆至质粒pkCRL得到同时含有crtB基因上、下游同源臂的敲除用质粒pkCRLR，然后通过菌落PCR、双酶切及人工测序等方法验证质粒pkCRLR，构建过程如图1所示。具体按照以下步骤实施

步骤1，引物的设计与合成

根据重组菌R.palustris(Δshc)基因组中的基因crtB上下游序列设计并合成如下两对引物：

扩增基因crtB上游同源臂CRL的引物对：

crtB_L_F：5’-GGAATTCCCGCGCTACAAGGAACTGATC-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为EcoRI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：CP002418.1的第1824253-1824273位,对应序列2的1-21位)。

crtB_L_R：5’-CGGGATCCGACTGTCGGCCTCGGGGACC-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为BamHI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：CP002418.1的第1824731-1824752位，对应序列2的480-500位反相互补序列)。

扩增基因crtB下游同源臂CRR的引物对：

crtB_R_F：5’-CGGGATCCTGAGTCTGCAATCCGATATG-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为BamHI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：CP002418.1的第1825320-1825340位，对应序列3的1-20位)。

crtB_R_R：5’-CCCAAGCTTATTGGTGAGTTGCATCGCGCA-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为HindIII酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：CP002418.1的第18257998-1825819位，对应序列3的479-500位)。

步骤2，质粒pkCRL的构建及鉴定

(1)依照基因组提取试剂盒对出发菌株基因组(重组菌R.palustris(Δshc))进行提取；

(2)以对应的基因组为模板，采用crtB_L_F与crtB_L_R引物扩增上游同源臂CRL；PCR反应体系：2×GC Buffer，25μl；dNTP，4μl；PrimerSTAR，1μl；crtB_L_F(10μM)，1μl；crtB_L_R(10μM)，1μl；基因组，1μl；ddH₂O，17μl；PCR反应条件为：先在98℃下进行3min保温；再依次循环32次以下过程：98℃下保温10s，68℃下保温50s；之后72℃下保温5min；最后保持4℃的反应条件。

PCR结果：PCR产物上样电泳，上游同源臂CRL片段为515bp，采用胶回收试剂盒切胶回收目的条带。

(3)上游同源臂CRL片段及载体pk18mobsacB的双酶切：采用限制性内切酶EcoRI与BamHI对上同源臂CRL片段及载体pk18mobsacB分别进行双酶切；

酶切反应体系为：10×QC Buffer，10μl；EcoRI，2μl；BamHI，2μl；CRL或pk18mobsacB，20μl；ddH₂O，66μl；总体积为100μl；

酶切反应条件为：于37℃水浴锅放置4h；

实验结果为：酶切反应液进行凝胶电泳后，上游同源臂CRL酶切后获得一条506bp条带，载体pk18mobsacB酶切后获得一条5698bp的条带。依照凝胶回收试剂盒操作说明对上游同源臂CRL片段与载体pk18mobsacB片段进行回收并通过酶标仪对浓度进行测定，并放入-20℃冰箱保存备用。

(4)采用T4连接酶将上游同源臂CRL与载体pk18mobsacB进行连接；

连接反应体系：10×T4Buffer，2μl；T4Ligase，1μl；CRL，5μl；pk18mobsacB，1μl；ddH₂O，11μl；

反应条件为：于16℃下保温12h；

反应完成后将连接产物通过热击法转入大肠杆菌DH5α，并涂布于含30mg/l卡那霉素的LB固体平板上筛选单克隆；

(5)质粒pkCRL验证：

同时采用菌落PCR(图2)与双酶切法对质粒pkCRL进行验证：

①于LB固体培养基上挑取阳性单克隆，利用引物crtB_L_F和crtB_L_R进行菌落PCR；

PCR反应体系：ExTaq Mix，25μl；crtB_L_F(10μM)，1μl；crtB_L_R(10μM)，1μl；ddH₂O，23μl；反应体系总体积为50μl，采用20μl枪头挑取单克隆混入反应液中。

PCR反应条件：先在98℃下进行3min保温；再依次循环32次以下过程：98℃下保温10s，62℃下保温30s，72℃下保温1min，72℃下保温5min；最后保持4℃的反应条件；

PCR结果：PCR反应液进行凝胶电泳后获得一条515bp的条带，结果如图3所示；

②将获得该条带的单克隆接种于含有30mg/l卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养16h，取上述培养菌液3ml并提取质粒pkCRL；

③双酶切验证重组质粒pkCRL：

酶切反应体系为：10×QC Buffer，10μl；EcoRI，2μl；BamHI，2μl；pkCRL，35μl；ddH₂O，51μl；

酶切反应条件为：于37℃水浴锅放置2h；

实验结果为：酶切反应液进行凝胶电泳后分别获得一条506bp(上游同源臂CRL)和一条5698bp(载体pkmobsacB)的条带，证明上游同源臂CRL片段被成功插入载体pkmobsacB，双酶切结果如图3所示。

步骤3，质粒pkCRLR的构建及鉴定

(1)以基因组为模板，采用引物crtB_R_F与crtB_R_R扩增下游同源臂CRR；

PCR反应体系：2×GC Buffer，25μl；dNTP，4μl；PrimerSTAR，1μl；crtB_R_F(10μM)，1μl；crtB_R_R(10μM)，1μl；基因组，1μl；ddH₂O，17μl；

PCR反应条件为：先在依次循环32次以下过程：98℃下保温10s，62℃下保温50s；然后72℃下保温5min；最后保持4℃的反应条件；

PCR结果：PCR产物上样电泳，下游同源臂CRR片段为517bp，采用胶回收试剂盒切胶回收目的条带。

(2)下游同源臂CRR片段及质粒pkCRL的双酶切；

采用限制性内切酶BamHI与HindIII对下游同源臂CRR及质粒pkCRL分别进行双酶切；

酶切反应体系为：10×QC Buffer，10μl；BamHI，2μl；HindIII，2μl；CRR或pkCRL，20μl；ddH₂O，66μl；

酶切反应条件为：于37℃水浴锅放置4h；

实验结果为：酶切反应液进行凝胶电泳后，下游同源臂CRR酶切后获得一条506bp条带，质粒pkCRL酶切后获得一条6170bp的条带。

依照凝胶回收试剂盒操作说明对下游同源臂CRR与载体pkCRL片段进行回收并通过酶标仪对浓度进行测定，并放入-20℃冰箱保存备用。

(4)采用T4连接酶将下游同源臂CRR片段与质粒pkCRL进行连接，反应体系同步骤2中连接体系一致，随后将连接产物通过热击法转入大肠杆菌DH5α，并涂布于含30mg/l卡那霉素的LB固体平板上筛选单克隆；

(5)质粒pkCRL验证：

同时采用菌落PCR(图2)与双酶切法对质粒pkCRL进行验证：

①于LB固体培养基上挑取阳性单克隆，利用引物crtB_R_F和crtB_RR进行菌落PCR；

PCR反应体系：ExTaq Mix，25μl；crtB_R_F(10μM)，1μl；crtB_R_R(10μM)，1μl；ddH₂O，23μl；反应体系总体积为50μl，采用20μl枪头挑取单克隆混入反应液中；

PCR反应条件为：先在98℃下进行3min保温；再依次循环32次以下过程：98℃下保温10s，62℃下保温30s，72℃下保温1min；之后在72℃下保温5min；最后保持4℃的反应条件；

PCR结果：PCR反应液进行凝胶电泳后获得一条517bp的条带，结果如图4所示；

②将获得目标条带的单克隆接种于含有30mg/l卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养16h，取上述培养菌液3ml并提取质粒；

③双酶切验证重组质粒pkCRLR。

酶切反应体系为：10×QC Buffer，10μl；BamHI，2μl；HindIII，2μl；pkCRLR，32μl；ddH₂O，54μl；总体积为100μl；

酶切反应条件为：于37℃水浴锅放置2h；

实验结果为：酶切反应液进行凝胶电泳后分别获得一条506bp(下游同源臂CRR)和一条6170bp(载体pkCRLR)的条带，证明下游同源臂CRR片段被成功插入质粒pkCRL，质粒pkCRLR被成功构建，双酶切结果如图4所示。

重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)的构建：首先将质粒pkCRLR转入大肠杆菌E.coli S17-1形成重组菌E.coli S17-1/pkCRLR；然后将重组菌R.palustris(Δshc)、重组菌E.coli S17-1/pkCRLR及大肠杆菌E.coli HB101/pRK2013三株菌按照3:1:1的质量比例混合接入YP固体培养基使质粒pkCRLR转入重组菌R.palustris(Δshc)中。质粒pkCRLR在细胞内发生第一次交换重组敲除基因crtB，挑取能够在400mg/l卡那霉素平板上生长的菌落接种至无抗培养基培养三天使第二次重组交换发生形成重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)，再将菌液涂布于含有10g/l蔗糖无抗培养基，使其长出单菌落，最后通过挑取单克隆进行菌落PCR及测序对重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)进行验证。具体实施步骤如下：

步骤1.crtB基因的敲除

(1)通过热击法将pkCRLR质粒转入大肠杆菌E.coli S17-1形成重组菌E.coliS17-1/pkCRLR；

(2)重组菌R.palustris(Δshc)、重组菌E.coli S17-1/pkCRLR及大肠杆菌E.coliHB101/pRK2013三株菌按照3:1:1的质量比混合接入YP固体培养基32℃培养三天使质粒pkCRLR转入重组菌R.palustris(Δshc)，并发生第一次重组交换；

(3)挑取在含400mg/l卡那霉素固体平板上能够生长的菌落，接种至无抗液体培养基，于32℃，200rmp培养三天，使第二次重组交换发生；

(4)将菌液涂布于含有10g/l蔗糖无抗培养基，使其长出单菌落；

步骤2.，重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)的验证：

(1)挑取若干单克隆接种培养，采用基因组提取试剂盒分别提取基因组；

(2)采用引物crtB_L_F与crtB_R_R分别以单克隆基因组和重组菌R.palustris(Δshc)的基因组为模板进行扩增，并对结果进行比较；

PCR反应体系：ExTaq Mix，25μl；crtB_L_F(10μM)，1μl；crtB_R_R(10μM)，1μl；基因组，1μl；ddH₂O，22μl；反应体系总体积为50μl；

PCR反应条件为：先在98℃下进行3min保温；再依次循环32次以下过程：98℃下保温10s，62℃下保温30s，72℃下保温2min 20s，72℃下保温5min；最后保持4℃的反应条件；

PCR结果：PCR反应液进行凝胶电泳后，基因crtB敲除前的重组菌R.palustris(Δshc)获得一条2084bp的条带，基因crtB敲除后即挑取的单克隆获得一条1022bp的条带，结果表明由于基因crtB被敲除使得上游同源臂CRL与下游同源臂CRR之间的序列消失，扩增片段减小(图5A)，表明重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)构建成功，PCR结果如图5B所示。

重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)中角鲨烯含量测定：

为了验证基因crtB敲除阻断类胡萝卜素合成途径对沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量的影响，同时对重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)以及作为出发菌株的重组菌R.palustris(Δshc)中角鲨烯含量进行了测定。采用皂化法分离提取了两株菌中的角鲨烯，通过高效液相色谱法进行含量分析与比较。具体按照以下步骤进行：

(1)将重组菌R.palustris(Δshc)与重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)接种至YP液体培养基，加入无菌液体石蜡封住培养基表面，于32℃光照培养36h；

(2)重组菌R.palustris(Δshc)与重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)中角鲨烯的提取；

对重组菌R.palustris(Δshc)及重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)做同样的提取处理，以出重组菌R.palustris(Δshc)为对照验证重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)角鲨烯含量的提高，方法如下：

①取20ml同浓度的菌液，之后进行5min的12000g离心，倒掉上清液，加入20mlddH₂O重悬菌体，再次离心并倒掉上清液，重复2次，得到菌泥；

②将收集的菌泥放入离心管中，冷冻干燥过夜；

③往离心管中加入5ml 60％氢氧化钾/水溶液(w/v)，7.5ml甲醇，7.5ml 0.5％焦性没食子酸/甲醇溶液(w/v)，放入45℃摇床150rpm温育10h；

④往离心管中加入10ml己烷并震荡5min，用分液漏斗分离收集上层己烷，重复三次，将所有己烷收集到同一个新的离心管中；

⑤往己烷中加入5g无水Na₂SO₄，在通风橱中于40℃下蒸干己烷，得到固体粗提物；

(3)HPLC法分析角鲨烯合成：

①将上述固体粗提物溶解于1ml甲醇/二氯己烷(9:1，v/v)中；

②采0.22μm孔径的有机系无菌滤膜过滤甲醇/二氯己烷溶液；

③通过HPLC法对标准品、重组菌R.palustris(Δshc)提取物及及重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)提取物分别进行检测分析，检测条件：柱体为C₁₈，柱温为40℃，样品注入体积为10μl，流动相为甲醇/水溶液(9:1，v/v)，流速为1.0ml/min；

④将标准品、重组菌R.palustris(Δshc)提取物及及重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)提取物的检测结果进行对比分析，结果如图6所示。

结果显示，由标准品的分析证明了角鲨烯的出峰时间约为27.2min(图6A)。同样干重的细胞条件下，重组菌R.palustris(Δshc)与重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)的提取物在27.2min附近均出现一个吸收峰，但是重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)的吸收峰(图6B)明显高于重组菌R.palustris(Δshc)的吸收峰(图6C)。换算后结果表明，重组菌R.palustris(Δshc)中角鲨烯含量为3.82mg/g(细胞干重，DCW)而重组菌R.palustris(ΔshcΔcrtB)中角鲨烯的含量为6.76mg/g DCW。可见，通过敲除crtB基因阻断类胡萝卜素合成途径的方法使沼泽红假单胞菌中角鲨烯的含量提高了77％。

序列表

<110> 西安医学院

<120> 提高沼泽红假单胞菌角鲨烯含量用质粒及制备和使用方法

<130> 2018

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6680

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

tgccgcaagc actcagggcg caagggctgc taaaggaagc ggaacacgta gaaagccagt 60

ccgcagaaac ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa 120

aacgcaagcg caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac 180

tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag 240

gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc 300

aggggatcaa gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat 360

ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 420

caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 480

gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactccaaga cgaggcagcg 540

cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact 600

gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct 660

caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 720

cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 780

actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 840

gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcggatgc ccgacggcga ggatctcgtc 900

gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 960

ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc 1020

cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt 1080

atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 1140

gcgggactct ggggttcgct agaggatcga tcctttttaa cccatcacat atacctgccg 1200

ttcactatta tttagtgaaa tgagatatta tgatattttc tgaattgtga ttaaaaaggc 1260

aactttatgc ccatgcaaca gaaactataa aaaatacaga gaatgaaaag aaacagatag 1320

attttttagt tctttaggcc cgtagtctgc aaatcctttt atgattttct atcaaacaaa 1380

agaggaaaat agaccagttg caatccaaac gagagtctaa tagaatgagg tcgaaaagta 1440

aatcgcgcgg gtttgttact gataaagcag gcaagaccta aaatgtgtaa agggcaaagt 1500

gtatactttg gcgtcacccc ttacatattt taggtctttt tttattgtgc gtaactaact 1560

tgccatcttc aaacaggagg gctggaagaa gcagaccgct aacacagtac ataaaaaagg 1620

agacatgaac gatgaacatc aaaaagtttg caaaacaagc aacagtatta acctttacta 1680

ccgcactgct ggcaggaggc gcaactcaag cgtttgcgaa agaaacgaac caaaagccat 1740

ataaggaaac atacggcatt tcccatatta cacgccatga tatgctgcaa atccctgaac 1800

agcaaaaaaa tgaaaaatat caagtttctg aatttgattc gtccacaatt aaaaatatct 1860

cttctgcaaa aggcctggac gtttgggaca gctggccatt acaaaacgct gacggcactg 1920

tcgcaaacta tcacggctac cacatcgtct ttgcattagc cggagatcct aaaaatgcgg 1980

atgacacatc gatttacatg ttctatcaaa aagtcggcga aacttctatt gacagctgga 2040

aaaacgctgg ccgcgtcttt aaagacagcg acaaattcga tgcaaatgat tctatcctaa 2100

aagaccaaac acaagaatgg tcaggttcag ccacatttac atctgacgga aaaatccgtt 2160

tattctacac tgatttctcc ggtaaacatt acggcaaaca aacactgaca actgcacaag 2220

ttaacgtatc agcatcagac agctctttga acatcaacgg tgtagaggat tataaatcaa 2280

tctttgacgg tgacggaaaa acgtatcaaa atgtacagca gttcatcgat gaaggcaact 2340

acagctcagg cgacaaccat acgctgagag atcctcacta cgtagaagat aaaggccaca 2400

aatacttagt atttgaagca aacactggaa ctgaagatgg ctaccaaggc gaagaatctt 2460

tatttaacaa agcatactat ggcaaaagca catcattctt ccgtcaagaa agtcaaaaac 2520

ttctgcaaag cgataaaaaa cgcacggctg agttagcaaa cggcgctctc ggtatgattg 2580

agctaaacga tgattacaca ctgaaaaaag tgatgaaacc gctgattgca tctaacacag 2640

taacagatga aattgaacgc gcgaacgtct ttaaaatgaa cggcaaatgg tacctgttca 2700

ctgactcccg cggatcaaaa atgacgattg acggcattac gtctaacgat atttacatgc 2760

ttggttatgt ttctaattct ttaactggcc catacaagcc gctgaacaaa actggccttg 2820

tgttaaaaat ggatcttgat cctaacgatg taacctttac ttactcacac ttcgctgtac 2880

ctcaagcgaa aggaaacaat gtcgtgatta caagctatat gacaaacaga ggattctacg 2940

cagacaaaca atcaacgttt gcgccgagct tcctgctgaa catcaaaggc aagaaaacat 3000

ctgttgtcaa agacagcatc cttgaacaag gacaattaac agttaacaaa taaaaacgca 3060

aaagaaaatg ccgatgggta ccgagcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat 3120

cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc 3180

gggacgccct cgcggacgtg ctcatagtcc acgacgcccg tgattttgta gccctggccg 3240

acggccagca ggtaggccga caggctcatg ccggccgccg ccgccttttc ctcaatcgct 3300

cttcgttcgt ctggaaggca gtacaccttg ataggtgggc tgcccttcct ggttggcttg 3360

gtttcatcag ccatccgctt gccctcatct gttacgccgg cggtagccgg ccagcctcgc 3420

agagcaggat tcccgttgag caccgccagg tgcgaataag ggacagtgaa gaaggaacac 3480

ccgctcgcgg gtgggcctac ttcacctatc ctgcccggct gacgccgttg gatacaccaa 3540

ggaaagtcta cacgaaccct ttggcaaaat cctgtatatc gtgcgaaaaa ggatggatat 3600

accgaaaaaa tcgctataat gaccccgaag cagggttatg cagcggaaaa gcgctgcttc 3660

cctgctgttt tgtggaatat ctaccgactg gaaacaggca aatgcaggaa attactgaac 3720

tgaggggaca ggcgagagac gatgccaaag agctcctgaa aatctcgata actcaaaaaa 3780

tacgcccggt agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc 3840

aacgtctcat tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg 3900

atttatttat tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtatt tattcggcgc aaagtgcgtc 3960

gggtgatgct gccaacttac tgatttagtg tatgatggtg tttttgaggt gctccagtgg 4020

cttctgtttc tatcagctcc tgaaaatctc gataactcaa aaaatacgcc cggtagtgat 4080

cttatttcat tatggtgaaa gttggaacct cttacgtgcc gatcaacgtc tcattttcgc 4140

caaaagttgg cccagggctt cccggtatca acagggacac caggatttat ttattctgcg 4200

aagtgatctt ccgtcacagg tatttattcg gcgcaaagtg cgtcgggtga tgctgccaac 4260

ttactgattt agtgtatgat ggtgtttttg aggtgctcca gtggcttctg tttctatcag 4320

ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaaaagg 4380

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 4440

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 4500

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 4560

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 4620

ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 4680

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 4740

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 4800

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 4860

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 4920

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 4980

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 5040

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 5100

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 5160

gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 5220

gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc 5280

cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 5340

ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 5400

cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 5460

ggaaacagct atgacatgat tacgaattcc cgcgctacaa ggaactgatc agcgacatct 5520

tcagccggaa ggtggtcgcc gaggatttca gcctgtatct gcatcgcccg actgcgaccg 5580

acccgtcgct cgcgccgcag ggctgcgaca ctttctacgt cctgtcgccg gtgccgaatc 5640

tgctcggtga tactgattgg cacaccaagg ccgagactta tcgcgcctcg atcgccaaga 5700

tgctcggtgc gaccgttctg cccgatctgg aaaaccagat cgctacctcc aagatcacca 5760

cgccgatcga tttccaggac cggctgtcgt cgttccgcgg cgcggcgttc ggtctggagc 5820

cggtgttgtg gcagagcgcc tggttcaggc cgcacaatca gagcgaagac gtcaaacgcc 5880

tttatctcgt cggcgccgga acgcatcccg gcgctggcct gcccggggta ctgtcctcgg 5940

cgcgggtact cgatgcgctg gtccccgagg ccgacagtct ggtgacatcg gatcctgagt 6000

ctgcaatccg atatgttggc ccaatccgac atgctggcct gccgtgagat gatcaaggaa 6060

ggctcgcaca cctttcacgc ggcctccaag gtgctgccgc ggcggatcag tgatccggcg 6120

atcgcgctgt acgcgttctg ccgcgtcgcc gacgacgccg tggatctcgg tctcgaccgc 6180

gccgccgcgg tcgaagtgct gaaggaccgg ctcgatcgcg cctgccgcgg cgtgccgcgt 6240

gcctatccgt ccgaccgcgc cttcgctgat gtggtggcgc ggttttcgat tccgccggca 6300

attcccgagg cgctgatcga gggcctggaa tgggatgcgc agggccgtcg cttcgagacg 6360

ctgtcggatc tgtattcgta ttgcgcccgc gtcgccggca ccgttggcgt gatgatgacg 6420

ctggtgatgg gccagcgcaa acccgacatc gtggcgcgtg cctgcgatct cggctgcgcg 6480

atgcaactca ccaataagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 6540

ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 6600

tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 6660

gcgataagct agcttcacgc 6680

<210> 2

<211> 1068

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

atgagtctgc aatccgatat gttggcccaa tccgacatgc tggcctgccg tgagatgatc 60

aaggaaggct cgcacacctt tcacgcggcc tccaaggtgc tgccgcggcg gatcagtgat 120

ccggcgatcg cgctgtacgc gttctgccgc gtcgccgacg acgccgtgga tctcggtctc 180

gaccgcgccg ccgcggtcga agtgctgaag gaccggctcg atcgcgcctg ccgcggcgtg 240

ccgcgtgcct atccgtccga ccgcgccttc gctgatgtgg tggcgcggtt ttcgattccg 300

ccggcaattc ccgaggcgct gatcgagggc ctggaatggg atgcgcaggg ccgtcgcttc 360

gagacgctgt cggatctgta ttcgtattgc gcccgcgtcg ccggcaccgt tggcgtgatg 420

atgacgctgg tgatgggcca gcgcaaaccc gacatcgtgg cgcgtgcctg cgatctcggc 480

tgcgcgatgc aactcaccaa tatcgcccgc gacatcggcg aggatgcccg taacgggcgc 540

atctatatgc cgctgtcgtg gatgcgcgaa gctggcctcg atccggagac ctggctcgcc 600

aatccgaagt tcacgccgga gatcgccagc atcgtcaagc ggctgatcga cactgcggat 660

gcgctgtacg atcgcgcgac gctcggcatc gccaacctgc cgcgctcctg ccgtcccggc 720

attttcgcag cgcgcgcgct gtacgccgag atcggccgcg aggtcgagcg ctccggcctc 780

gactcggtgt cgagccgtgc agtggtctca accggccgca agctcgccgt gctggcgcgg 840

ctgctggcgt tccaggaaac cgaatgggcg ccggcgaagt atctgccggc caagttcggc 900

gacatggaag agaccaagtt tctggtcgac gcggtgatcg cgcatccggt gcgcgaactg 960

ccggcgcgcc agaaggtcaa gccgattgag cagaaggtcg cctggctggt cgacctgttc 1020

acccgcctcg aacgccgcga ccagatgctg caacgcagcc gggtgtag 1068

<210> 3

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ccgcgctaca aggaactgat cagcgacatc ttcagccgga aggtggtcgc cgaggatttc 60

agcctgtatc tgcatcgccc gactgcgacc gacccgtcgc tcgcgccgca gggctgcgac 120

actttctacg tcctgtcgcc ggtgccgaat ctgctcggtg atactgattg gcacaccaag 180

gccgagactt atcgcgcctc gatcgccaag atgctcggtg cgaccgttct gcccgatctg 240

gaaaaccaga tcgctacctc caagatcacc acgccgatcg atttccagga ccggctgtcg 300

tcgttccgcg gcgcggcgtt cggtctggag ccggtgttgt ggcagagcgc ctggttcagg 360

ccgcacaatc agagcgaaga cgtcaaacgc ctttatctcg tcggcgccgg aacgcatccc 420

ggcgctggcc tgcccggggt actgtcctcg gcgcgggtac tcgatgcgct ggtccccgag 480

gccgacagtc tggtgacatc 500

<210> 4

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

tgagtctgca atccgatatg ttggcccaat ccgacatgct ggcctgccgt gagatgatca 60

aggaaggctc gcacaccttt cacgcggcct ccaaggtgct gccgcggcgg atcagtgatc 120

cggcgatcgc gctgtacgcg ttctgccgcg tcgccgacga cgccgtggat ctcggtctcg 180

accgcgccgc cgcggtcgaa gtgctgaagg accggctcga tcgcgcctgc cgcggcgtgc 240

cgcgtgccta tccgtccgac cgcgccttcg ctgatgtggt ggcgcggttt tcgattccgc 300

cggcaattcc cgaggcgctg atcgagggcc tggaatggga tgcgcagggc cgtcgcttcg 360

agacgctgtc ggatctgtat tcgtattgcg cccgcgtcgc cggcaccgtt ggcgtgatga 420

tgacgctggt gatgggccag cgcaaacccg acatcgtggc gcgtgcctgc gatctcggct 480

gcgcgatgca actcaccaat 500

Claims (1)

1.一种提高沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，通过敲除沼泽红假单胞菌中的crtB基因来阻断类胡萝卜素的合成途径实现，所述沼泽红假单胞菌为敲除了shc基因后得到的重组菌R.palustris(Δshc)。

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