CN101675166A

CN101675166A - 参与番茄红素生物合成的基因、含有该基因的重组载体以及带有重组载体的转化的微生物

Info

Publication number: CN101675166A
Application number: CN200880011400A
Authority: CN
Inventors: 赵南仑; 朴民守; 李东炫; 郑皓丞; 金钟根
Original assignee: SK Corp; Amicogen Inc
Current assignee: SK Corp; Amicogen Inc; SK Energy Co Ltd
Priority date: 2007-04-05
Filing date: 2008-04-07
Publication date: 2010-03-17
Also published as: KR100832584B1; WO2008123731A1; US20110124090A1

Abstract

本发明提供了参与番茄红素的生物合成、并具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5显示的编码番茄红素生物合成所需的蛋白的DNA序列的基因，含有至少一个所述基因的重组载体，以及用所述重组载体转化的并具有高番茄红素含量的微生物。当培养具有crt基因的重组大肠杆菌时，获得的番茄红素的产量为15.3mg/L，含量为4.2mg/gDCW，当用本发明的基因与已知基因的组合转化微生物时，也获得了番茄红素的最大含量5.4mg/gDCW。因此，提供了与已知带有所述基因的番茄红素产生菌株相比，单位细胞干重的番茄红素含量更高的番茄红素产生菌株。因此，所述基因可用于在微生物中大量生产番茄红素，也可用于大量生产类胡萝卜素。

Description

参与番茄红素生物合成的基因、含有该基因的重组载体以及带有重组载体的转化的微生物

技术领域

本发明涉及参与番茄红素生物合成的基因、含有该基因的重组载体以及带有重组载体的转化的微生物，更具体来说，涉及番茄红素生物合成所需的、并具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的DNA序列的基因，含有选自所述基因的至少一个基因的重组载体，以及带有重组载体的转化的微生物。

背景技术

番茄红素是类胡萝卜素色素的一种。类胡萝卜素是具有抗氧化活性的C40类异戊二烯化合物，属于一组根据它们的分子结构而具有黄色、红色和橙色的色素。例如，类胡萝卜素包括β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、虾青素、玉米黄质等，并已经被用作营养补充剂、医学补给品、可食用着色剂和动物饲料添加剂。

其中，番茄红素具有式1所代表的分子结构，是脂溶性的物质，在番茄、西瓜、葡萄等中形成了红色色素的分子体，并且具有非常低的极性。与其它类胡萝卜素相似，番茄红素具有抗氧化和抗癌活性。

式1

根据到目前为止已经完成的研究，由底特律(美国)的Karmanos癌症研究中心(Karmanos Cancer Center)的Omer领导的小组在2000年报道了番茄红素抑制前列腺癌的转移(Omer Kucuk等，CancerEpidemiology，10，861-869，2001)。Hasharon医院(Hasharon Hospital，以色列，特拉维夫)的过敏科(Department of Allergy)和番茄红素的制造商LycoRed证实，番茄红素在患有运动引发的哮喘的患者中具有缓解哮喘症状的效应(L Neuman等，Allergy，55，1184-1189)。此外，Kuopio大学(University of Kuopio)的公共卫生系(Department of Public Health)报道了临床试验的结果，番茄红素对于心肌疾病和动脉粥样硬化具有出色的保护作用(Tiina Rissanen等，Exp Biol Med(Maywood).，227，900-907，2002)。

类胡萝卜素的体内生物合成途径显示在图1中。

在活的生物体中，被同化的甘油和葡萄糖，当进行2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(MEP途径)或甲羟戊酸途径(MVA途径)时，被代谢成异戊烯基焦磷酸(在本文后面称为“IPP”)或二甲基烯丙基焦磷酸(在本文后面被称为“DMAPP”)，而IPP或DMAPP被代谢成法呢基焦磷酸(在本文后面称为“FPP”)，它在通用类异戊二烯途径中是进入几种后续过程的重要中间体。FPP和IPP通过crtE基因编码的香叶基香叶基焦磷酸合酶被转化成香叶基香叶基焦磷酸(在本文后面称为“GGPP”)。然后，GGPP被crtB基因编码的八氢番茄红素合酶转化成八氢番茄红素，八氢番茄红素被crtI基因编码的八氢番茄红素去饱和酶代谢成番茄红素。然后，番茄红素被crtY基因转化成β-胡萝卜素，β-胡萝卜素被crtZ基因编码的β-胡萝卜素羟化酶转化成玉米黄质，玉米黄质被crtW基因编码的β-胡萝卜素酮酶转化成虾青素。此外，番茄红素也可以被crtL和crtR基因代谢成叶黄素。

如上所述，对于作为类胡萝卜素共同前体的异戊烯基二磷酸(IPP)的生物合成途径来说，已经知道有甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸途径。在这种情况下，已知甲羟戊酸途径存在于大多数真核生物(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、植物细胞的细胞质、一些细菌(例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和Paracoccuszeaxanthinifaciens)以及疟疾细胞中。非甲羟戊酸途径存在于大多数细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli))、以及植物细胞的载色体(质体)中。也就是说，革兰氏阴性(-)细菌大肠杆菌只使用非甲羟戊酸途径生物合成IPP。但是，野生型大肠杆菌可能不生产番茄红素，因为野生型大肠杆菌不具有参与类胡萝卜素、包括番茄红素的生物合成的基因。

已经进行了许多尝试，通过将不同来源的基因导入不产生番茄红素的微生物例如野生型大肠杆菌中，以产生类胡萝卜素、包括番茄红素。Roche Vitamins，Inc.通过转化来自于黄杆菌(Flavobacterium sp.)R1534的crtE、crtB和crtI基因，制备了大肠杆菌转化体，其番茄红素的含量是0.5mg/gDCW(Luis Pasamontes等，US20040058410，2004)，Amoco Corporation通过使用来自于草生欧文氏杆菌(Erwinia herbicola)的crtI基因制备了产番茄红素的酵母菌株，其含量为0.1mg/g(毫克/克)DCW(Rodney L.Ausich等，US5,530,189,1996)。Misawa等使用源自于欧文氏杆菌物种和橙黄土壤杆菌(Agrobacterium aurantiacum)的crtE、crtB和crtI基因，制备了产番茄红素的、含量为1.03mg/g(毫克/克)DCW的大肠杆菌菌株，以及番茄红素的含量为0.11mg/g(毫克/克)DCW的酿酒酵母菌株(Norihiko Misawa，Journal of Biotechnology，59，169-181，1998)。Kirin Beer Kabushiki Kaisha使用了源自于噬夏孢欧文氏杆菌(Erwinia uredovora)的crtE、crtB、crtI基因，在微生物中生产了番茄红素，从而获得了番茄红素的含量为2.0mg/g(毫克/克)DCW的大肠杆菌菌株(Norihiko Misawa等，US 5,429,939,1995)。

但是，正如在上面的研究结果中描述的，番茄红素的含量太低，难以开发出有效的生产工艺。为了解决上述问题，本发明提供了与已知基因相比能够产生番茄红素含量更高的转化体的新基因，含有该新基因的载体，以及带有载体的转化的微生物。

因此，本发明人尝试了改进番茄红素的生产率，并发现，具有较高番茄红素含量的微生物可以通过从海水的宏基因组文库中分离参与番茄红素生物合成的crtE、crtB和crtI基因，克隆crtE、crtB和crtI基因，对基因进行测序，将基因导入载体，而从不产生番茄红素的微生物来制备，因此，在上述事实的基础上，本发明得以完成。

发明内容

技术难题

本发明的一个方面，提供了编码番茄红素生物合成所需的蛋白的基因。

本发明的另一个方面，提供了含有所述基因的重组载体。

本发明的另一个方面，通过使用所述重组载体提供了番茄红素含量增加的重组微生物。

技术方案

按照本发明的一个方面，提供了编码香叶基香叶基焦磷酸合酶、并具有SEQ ID NO：1显示的DNA序列的crtE基因。

按照本发明的另一个方面，提供了编码八氢番茄红素合酶、并具有SEQ ID NO：3显示的DNA序列的crtB基因。

按照本发明的另一个方面，提供了编码八氢番茄红素去饱和酶、并具有SEQ ID NO：5显示的DNA序列的crtI基因。

按照本发明的另一个方面，提供了含有选自SEQ ID NO：1显示的crtE基因、SEQ ID NO：3显示的crtB基因和SEQ ID NO：5显示的crtI基因中的至少一个基因的重组载体。

按照本发明的另一个方面，提供了带有重组载体的转化的微生物。

有益效果

如上所述，在本发明中，从海水的宏基因组文库中克隆了编码番茄红素生物合成所需的蛋白的三个新的crtE、crtB、crtI基因。此外，证实了通过运用crt基因，可以在不产生番茄红素的大肠杆菌中生产番茄红素，并且通过只使用新的crt基因或其与已知crt基因的组合，可以制备出与常规技术制备的菌株相比具有更高番茄红素含量的重组菌株。因此，本发明的crt基因可用于生产类胡萝卜素例如番茄红素，并且对于在微生物中大量生产类胡萝卜素(包括番茄红素)也是非常有用的。

附图简述

图1是番茄红素的生物合成过程的说明图。

图2是重组载体pT5-LYC-idi的酶切图的说明图。

图3是重组载体pT5-ErEBI的酶切图的说明图。

图4是重组载体pT5-ErBI的酶切图的说明图。

图5是重组载体pT-EF5的酶切图的说明图。

图6是重组载体pT-SF5的酶切图的说明图。

图7是重组载体pBF5-crt的酶切图的说明图。

本发明的最佳实施方案

后文将参考附图对本发明的示例性实施方案进行更详细的描述。

在本发明中，从海水的宏基因组文库中克隆了编码番茄红素生物合成所需的蛋白的crtE、crtB和crtI基因，构建了包含这些基因的重组载体，并用重组载体转化了不产番茄红素的大肠杆菌菌株。

此外，通过对转化的大肠杆菌菌株进行发酵，在与常规研究中制备的菌株相比时，证实番茄红素的含量增加，从而完成了本发明。

根据本发明，提供了编码番茄红素生物合成所需的蛋白、并具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5显示的DNA序列的基因，这些基因是从海水的宏基因组文库获得的。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的DNA序列分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6显示的氨基酸(香叶基香叶基焦磷酸合酶、八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素去饱和酶)。

本发明中提供的基因可以导入到各种不同的宿主细胞中，有效地用于生产番茄红素和其它类胡萝卜素。基因可以单独或以其组合使用。例如，通过将本发明的crtI基因导入只含有crtE和crtB基因的微生物，所述crtI基因可以用于生产番茄红素。此外，通过将本发明的crtE、crtB和crtI基因导入生物合成类胡萝卜素例如虾青素的微生物，所述crtE、crtB和crtI基因也可用于增加番茄红素的产量。

此外，本发明还提供了含有番茄红素生物合成基因的重组载体。

本发明的重组载体是通过将crtE、crtB和crtI基因导入到基础载体中构建的。所有可用于克隆和表达crt基因的载体一般来说都可以用作本发明的基础载体，并可以根据宿主细胞而变化。在本发明的实施例中使用了质粒pTrc99A作为基础载体，并通过将crtE、crtB和crtI基因导入到基础载体中、同时也导入编码大肠杆菌的IPP异构酶的idi基因，制备了重组载体，并命名为“pT5-LYC-idi(图2)”。此外，通过将本发明的crt基因与已知的crt基因进行组合，制备了重组载体，分别命名为“pT5-ErEBI(图3)”、“pT5-ErBI(图4)”、“pT-EF5(图5)”和“pT-SF5(图6)”。

除了重组载体之外，任何含有选自本发明的crtE、crtB和crtI基因中的至少一个基因的重组载体，都包含在本发明的范围内。

此外，本发明还提供了带有含有番茄红素生物合成基因的重组载体的转化菌株。

大肠杆菌或酵母可以用作宿主，用含有番茄红素生物合成基因的重组载体进行转化。在本发明的实施例中，使用重组载体pT5-LYC-idi、pT5-ErEBI、pT5-ErBI、pT-EF5和pT-SF5制备了转化的大肠杆菌。

当对带有导入了本发明基因的重组载体的转化菌株测量其所产生的番茄红素的量时，在含有源自于海水宏基因组文库的crtE、crtB和crtI基因组合的大肠杆菌中，番茄红素的产量是15.3mg/L(毫克/升)，每个细胞的番茄红素含量是4.2mg/g(毫克/克)DCW。此外，在含有已知crt基因和本发明基因的组合的大肠杆菌中，生产番茄红素的最大产量是22.8mg/L(毫克/升)，每个细胞的最大含量为5.4mg/g(毫克/克)DCW。

如上所述，为了实现本发明的目标，从海水的宏基因组中获得了新的crtE、crtB和crtI基因，也获得了含有基因的重组载体和用重组载体转化的重组大肠杆菌。当对获得的重组大肠杆菌菌株进行发酵时，重组大肠杆菌菌株与现有技术中的常规菌株相比，每个细胞具有更高的番茄红素含量，使得与现有技术发明相比，开发有效的番茄红素生产工艺成为可能。

后文将结合示例性实施方案对本发明进行更详细的描述。但是，应该理解，本文提出的描述只是优选的例子，仅仅是出于说明的目的，不打算对本发明的范围进行限制。

实施方案

实施例

实施例1：从海水的宏基因组文库克隆用于番茄红素生物合成的新基因(crtE、crtB和crtI)

为了获得番茄红素生物合成所需的crtE、crtB和crtI基因，从海水中直接获取基因组DNA(宏基因组)来构建宏基因组文库。在番茄红素带有红色的事实基础上，选择发红的克隆，并测序以证实其身份。

首先，通过膜过滤从大量海水收集微生物，从海水获得宏基因组DNA。因为大多数微生物的尺寸为0.2到10μm(微米)，因此首先使用蠕动泵将大量海水通过孔径为10μm(微米)的滤器，主要除去尺寸大于10μm(微米)的各种类型悬浮固体，然后通过孔径为0.2μm(微米)的滤器，只选择性回收尺寸为0.2μm(微米)以上的微生物。按照使用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)的方法(Zhou等，Appl.Environm.Microbiol.62：316-322，1996)，从回收的微生物中进行染色体DNA提取。

从得到的微生物细胞制备的宏基因组DNA，使用拷贝控制的Fosmid文库生产试剂盒(Epicenter)，制备了宏基因组文库。在这种情况下，制备过程按照制造商的手册进行。宏基因组文库的构建使用Fosmid载体拷贝控制pCClFOS(Epicenter)来进行。插入DNA被连接到拷贝控制pCClFOS载体中，然后使用MaxPlaxλ包装提取物(Epicenter)，对连接的Fosmid克隆进行包装。在该程序中，获得了超过10,000个克隆。

将获得的Fosmid克隆在室温静置培养48小时以观察菌落的颜色，从培养的菌落中筛选发红的菌落。为了通过PCR方法证实在这些菌落中是否存在crt基因，从源自于噬夏孢欧文氏杆菌(Erwinia uredovora)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、黄杆菌(Flavobacterium sp.)菌株ATCC21588、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)和橙黄土壤杆菌(Agrobacterium aurantiacum)的crtI的C-末端区域(crtIf)和crtB的中间区域(crtBr)合成了引物对。引物的DNA序列设计如下：

crtIf：5′-GTNGGNGCRGGCACNCAYCC-3′

crtBr：5′-TCGCGRGCRATRTTSGTSARRTG-3′

使用从每个发红的菌落提取的Fosmid DNA作为模板，然后使用合成的引物与模板一起扩增crt基因。也就是说，100ng(纳克)Fosmid DNA作为模板，在94℃变性5分钟，然后在下述PCR条件下将PCR扩增重复20个循环：94℃，30秒；50-60℃，30秒，和72℃，1分钟。然后在下述PCR条件下将PCR扩增重复15个循环：94℃，30秒；50℃，30秒，和72℃，1分钟。结果，从一个克隆获得了具有620bp预期大小的条带，将其插入到pST-Blue1载体(Novagen)中，并对其DNA序列进行分析。根据DNA序列分析，证实了克隆到的DNA序列与报道的crtB基因具有同源性。

将获得的crtB基因片段用作探针进行southern杂交，由此获得了包含crtB基因的番茄红素生物合成的完整基因簇。通过PCR将用作探针的crtB基因片段与DIG染料连接，将模板DNA用每种限制性酶BamHI、SalI和EcoRI进行消化，并进行southern杂交。首先，将分别用不同的限制性酶消化的DNAs在0.9％的琼脂糖凝胶上进行电泳，按照大小分离DNAs的条带。然后，将DNAs条带通过毛细转移转移到尼龙膜上(Schleicher&Schuell，德国)。在42℃下将探针加入到含有50％甲酰胺的储存溶液中(5XSSC，0.1％N-十二烷基肌氨酸，0.02％SDS，5％阻断试剂，50％甲酰胺)，然后进行6小时以上的杂交。按照制造商的手册(Boehringer-Mannheim，德国)，将尼龙膜与结合了碱性磷酸酶的抗DIG抗体进行反应，加入NBT和X-磷酸盐作为底物以执行颜色反应。

作为southern印迹的结果，将在EcoRI限制的DNAs中显示出信号的大约4kb条带导入到pBluescript II KS(+)载体(Stratagene)中，对DNA片段进行测序。根据测序结果，发现条带具有总共3.2kb的包含crtE、crtB和crtI基因的簇。如上所述，crtE、crtB和crtI基因是从海水的宏基因组文库中克隆的。在这种情况下，crtE、crtB和crtI基因具有与已知基因不同的DNA序列。

在crt基因簇的DNA序列的基础上设计了下面的引物，并用于PCR反应。然后，将包含三个crt基因的大约3.2-kbDNA片段克隆到pBluescriptII KS(+)载体的XhoI和XbaI限制性位点之间，并命名为“pBF5-crt”。

F5crt-F：

5′-GTCTCGAGAGGAGGTAATAAATATGATAAGCCCTATATCCACTGCTGAT-3′

F5crt-R1：

5′-GATTCTAGATCTAAACCCTCACTGCC-3′

实施例2：制备包含源自海水宏基因组文库的番茄红素生物合成基因的重组载体

将在实施例1中克隆的crtE、crtB和crtI基因插入到表达载体pTrc99A(Amannm E.等，(1998)Gene，69：301-305)中。

首先，为了将crtE基因插入到pTrc99A载体中，合成了下面的引物对。

f5E-f：

5′-TGGAATTCTACATCAGGAGGTAATAAATATGATAAGCCCTATATCCAC-3′

f5E-r：

5′-TAGGATCCCTCGAGATGCATTATCATGGGAGCTTCGCTCGGAGC-3′

使用在实施例1中制备的载体pBF5-crt作为模板，使用引物进行扩增，获得包含crtE基因的大约0.85kb的DNA片段。使用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化获得的DNA片段，用限制性酶EcoRI和BamHI消化，并导入到用同样的限制性酶消化的pTrc99A载体中，命名为pT-f5crtE。接下来，为了将crtB和crtI基因导入到载体pT-f5crtE中，合成了下列两对引物。

f5I-f：

5′-ATCTCGAGAGGAGGTAATAAATATGCAAACAGTTGTTATTGGTG-3′

f5I-r：

5′-CTCCTCTGCAGTTATCATGGCTGCTCCGCAGTCACCAC-3′f5B-f：

5′-CCATGATAACTGCAGAGGAGGTAATAAATATGAAGATAGCGCTGGACCGG-3′

f5B-r：

5′-AGGTCGACGCGGCCGCGAGCTCTTATCGTAAACCCTCACTGCCAAC-3′

首先，使用载体pBF5-crt作为模板，使用引物f5I-f和f5I-r进行扩增，获得包含crtI基因的大约1.5kb的DNA片段，使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化获得的DNA片段。然后，使用载体pBF5-crt作为模板，使用引物f5B-f和f5B-r进行扩增，获得包含crtB基因的大约0.9kb的DNA片段，使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化获得的DNA片段。将这样获得的两个DNA片段彼此混合，在PCR反应中使用引物f5I-f和f5B-r进行扩增，获得含有crtB和crtI基因的大约2.4kb的最终DNA片段。使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化获得的DNA片段，用限制性酶XhoI和SalI消化，并导入到用同样的限制性酶消化的载体pT-f5crtE中，命名为pT-f5EBI。然后，为了将编码大肠杆菌IPP异构酶的idi基因导入载体pT-f5EBI中，合成了下面的引物对idi-f和idi-r。

idi-f：

5′-TAAHAHCTCTAATAAATATHCAAACHHAACACHTCAT-3′

idi-r：

5′-CGACGCGGCCGCGCTTATTTAAGCTGGGTAAATGC-3′

使用引物对，对大肠杆菌MG 1655的染色体DNA进行PCR，获得了含有idi基因的大约0.6kb的DNA片段，使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化获得的DNA片段。将纯化的DNA片段用限制性酶SacI和NotI进行消化，并导入到用同样的限制性酶消化的载体pT-f5EBI中，命名为pT5-LYC-idi(图2)。

实施例3：在重组大肠杆菌中生产番茄红素

证实了在用实施例2中制备的载体pT5-LYC-idi转化的大肠杆菌菌株中，番茄红素的生物合成是否进行。

首先，用载体pT5-LYC-idi转化大肠杆菌MG 1655。将转化的大肠杆菌的每个单菌落接种到5mL(毫升)添加有100μg/ml(微克/毫升)氨苄青霉素和50μg/ml(微克/毫升)氯霉素的2YT培养基中(16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物和5g/L NaCl)，在37℃振荡培养8小时。将600μl(微升)得到的培养液接种到30ml(毫升)添加有1％甘油和100μg/ml(微克/毫升)氨苄青霉素的2YT培养基中，在30℃培养48小时。

当细胞培养完成后，取适当量的培养液，通过计算细胞干重(gDCW/L)、番茄红素的产量(mg番茄红素/L，在后文中称为mg/L)和含量(mg番茄红素/gDCW，在后文中称为mg/gDCW)，来证实番茄红素的生产率。

首先，为了获得番茄红素的细胞干重，取5mL(毫升)菌株培养液，放入50mL(毫升)离心管中，离心(8,000rpm，10分钟)以除去上清液并回收细胞沉淀。将回收的细胞沉淀加入到20mL(毫升)无菌蒸馏水中，悬浮，离心以完全除去培养液成分并回收细胞沉淀。将回收的细胞沉淀加入到5mL(毫升)无菌蒸馏水中，完全悬浮，然后置于事先已经以mg(毫克)为单位称重过的铝称量盘中。在这种情况下，离心管用无菌蒸馏水清洗，清洗液也加入到称量盘中。将称量盘在干燥箱中在105℃干燥12小时以上，冷却，以mg(毫克)为单位测量称量盘的重量。细胞干重(gDCW/L)使用下面的方程1计算。

方程1

细胞干重(gDCW/L)＝{干燥后盘的重量(mg)-盘的重量(mg)}/5

为了确定番茄红素的产量，100μl(微升)量的培养液进行离心以获得细胞沉淀，将每个细胞沉淀悬浮在400μl(微升)丙酮中，保持在55℃15分钟。在得到的悬浮液中再加入600μl(微升)丙酮，通过将悬浮液在55℃保持15分钟来提取番茄红素。将得到的提取液以14,000rpm的转速离心10分钟以分离上清液。然后，使用分光光度计在474.5nm(纳米)波长处测量得到的分离上清液的吸光度。然后，将测量值代入通过校正曲线获得的方程，通过计算稀释率确定番茄红素的量。在这种情况下，为了对校正曲线进行作图，购买了标准的番茄红素(Sigma)，溶解在丙酮中，稀释成不同的浓度。然后，使用分光光度计在474.5nm(纳米)波长处测量稀释的标准番茄红素的吸光度，将获得的吸光度值用于标准校正曲线的作图。

使用细胞干重(gDCW/L)和番茄红素的产量(mg/L)，从下面的方程2计算番茄红素的含量(mg/gDCW)。

方程2

含量(mg/gDCW)＝产量(mg/L)/细胞干重(gDCW/L)

从方程确定的产生的番茄红素的水平列于下面的表1中。

表1

[表1]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产率(mg/L)	含量(mg/gDCW)
细胞干重(gDCW/L)	产率(mg/L)	含量(mg/gDCW)	3.56	15.3	4.2

实施例4：在带有包含源自于草生欧文氏菌的crtE、crtB和crtI基因的重组载体的转化大肠杆菌中，评估番茄红素的生产率

使用获得的源自于草生欧文氏菌的crtE、crtB和crtI基因，制备了载体pT5-ErEBI(图3)，并导入到大肠杆菌中，获得转化的大肠杆菌菌株。然后，按照与实施例3相同的方式评估转化的大肠杆菌菌株的番茄红素生产率。在培养48小时后，获得的番茄红素的生产率列于下面的表2中。

表2

[表2]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产率(mg/L)	含量(mg/gDCW)
细胞干重(gDCW/L)	产率(mg/L)	含量(mg/gDCW)	3.7	12.7	3.5

实施例5：在带有包含新crtE基因和源自于草生欧文氏菌crtB和crtI基因组合的重组载体的转化大肠杆菌中，评估番茄红素的生产率

通过将在实施例2中获得的载体pT5-LYC-idi中的crtB和crtI基因，用相应的已知源自于草生欧文氏菌的基因取代，制备了重组载体pT5-ErBI(图4)。

获得了带有重组载体pT5-ErBI的转化大肠杆菌，按照与实施例3中相同的方式评估新crtE基因的生产率。在培养48小时后，获得的番茄红素的生产率列于下面的表3中。

表3

[表3]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产率(mg/L)	含量(mg/gDCW)
细胞干重(gDCW/L)	产率(mg/L)	含量(mg/gDCW)	4.9	10.6	2.2

实施例6：在带有包含源自于草生欧文氏菌的crtE基因和新crtB和crtI基因组合的重组载体的转化大肠杆菌中，评估番茄红素的生产率

通过将在实施例2中获得的载体pT5-LYC-idi中的crtE基因，用相应的源自于草生欧文氏菌的基因取代，制备了重组载体pT-EF5(图5)。

获得了带有重组载体pT-EF5的转化大肠杆菌，按照与实施例3中相同的方式评估了新crtB基因和新crtI基因的生产率。在培养48小时后，获得的番茄红素的生产率列于下面的表4中。

表4

[表4]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产率(mg/L)	含量(mg/gDCW)
细胞干重(gDCW/L)	产率(mg/L)	含量(mg/gDCW)	4.2	22.8	5.4

实施例7：在带有包含源自于集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803的crtE基因和新crtB和crtI基因组合的重组载体的转化大肠杆菌中，评估番茄红素的生产率

通过将在实施例2中获得的载体pT5-LYC-idi中的crtE基因，用相应的源自于集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803的基因取代，制备了重组载体pT-SF5(图6)。

获得了，按照与实施例3中相同的方式评估带有重组载体pT-SF5的转化大肠杆菌的番茄红素生产率。然后，将获得的番茄红素的生产率列于下面的表5中。

表5

[表5]

[表]

细胞干重(gDCW/L)	产率(mg/L)	含量(mg/gDCW)
细胞干重(gDCW/L)	产率(mg/L)	含量(mg/gDCW)	4.1	19.5	4.8

序列名单

SEQ ID NO：1是源自于海水中宏基因组的crtE基因的DNA序列(867bp)。

SEQ ID NO：2是由crtE基因编码的香叶基香叶基焦磷酸合酶的氨基酸序列(288个氨基酸)。

SEQ ID NO：3是源自于海水中宏基因组的crtB基因的DNA序列(909bp)。

SEQ ID NO：4是由crtB基因编码的八氢番茄红素合酶的氨基酸序列(302个氨基酸)。

SEQ ID NO：5是源自于海水中宏基因组的crtI基因的DNA序列(1,485bp)。

SEQ ID NO：6由crtI基因编码的八氢番茄红素去饱和酶的氨基酸序列(494个氨基酸)。

SEQ ID NO：7是集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803中的crtE基因的DNA序列。

序列表

<110>SK能源株式会社(SK Energy Co.，LTD)

艾米可根株式会社(Amicogen Co.，LTD)

<120>参与番茄红素生物合成的基因、含有该基因的重组载体以及带有重组载体的转化的微

生物(Gene involved in the biosynthesis of lycopene，recombinant vector

comprising the gene，and transformed microorganism with the

recombinant vector)

<130>SCT093610-70

<160>7

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>867

<212>DNA

<213>crtE

<400>1

atgataagcc ctatatccac tgctgatgtg gcctttgagc gcctcgttga cagctgtgaa 60

cgatcgttga aagagtgtat agccgcgagc tgtccagccc ttcatcaagc ttggcagcat 120

cagttcgcag cgcgaggcaa gcgtttacgt atgcacctag ccttagaaag tagtctggcg 180

ctagggttga ccgaccatca atgccacacc attgcggtgg catgcgaatt agtccaccag 240

gcctcattga ttcacgatga tgtgcttgat gcggataccc accgaaatgg caaagcaacg 300

gtttggcacc agtatggagc tgccacagca atttgtctgg gtgacagttt attagttgag 360

gcaatgctgc aaatagcgtt gttggaaaat ttaccgagcg ccgttcggca gcagcttgtg 420

caattattta aagatgccat acaagccgcc gctgagggcc aaattgacga ttgtaatagc 480

gacaaaatag ccaactatag ceatgccgat tattgcactg cagtgcgcaa aaaatcaggc 540

gcgctgttcg gcttaccggt gttggcggct atgttaatga gtcaacagca tgcaattact 600

atcggggtag ccaaccgagc ctatgctgaa tttggtattg cctatcagtt actcgatgac 660

ctgcatgacc gtgacgttga tcagcagggt cggatgaacg gttattgggt attaagtcgg 720

gattatccga ccggggtaga agcagcactc tttgctgcgg ttgagcagca tctcggcgag 780

gccgagcgac tgatcgcatc attgccatcg agcttgcacc ccagctttta tgtggtgcat 840

gactcgctcc gagcgaagct cccatga 867

<210>2

<211>288

<212>PRT

<213>Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase

<400>2

Met Ile Ser Pro Ile Ser Thr Ala Asp Val Ala Phe Glu Arg Leu Val

1 5 10 15

Asp Ser Cys Glu Arg Ser Leu Lys Glu Cys Ile Ala Ala Ser Cys Pro

20 25 30

Ala Leu His Gln Ala Trp Gln His Gln Phe Ala Ala Arg Gly Lys Arg

35 40 45

Leu Arg Met His Leu Ala Leu Glu Ser Ser Leu Ala Leu Gly Leu Thr

50 55 60

Asp His Gln Cys His Thr Ile Ala Val Ala Cys Glu Leu Val His Gln

65 70 75 80

Ala Ser Leu Ile His Asp Asp Val Leu Asp Ala Asp Thr His Arg Asn

85 90 95

Gly Lys Ala Thr Val Trp His Gln Tyr Gly Ala Ala Thr Ala Ile Cys

100 105 110

Leu Gly Asp Ser Leu Leu Val Glu Ala Met Leu Gln Ile Ala Leu Leu

115 120 125

Glu Asn Leu Pro Ser Ala Val Arg Gln Gln Leu Val Gln Leu Phe Lys

130 135 140

Asp Ala Ile Gln Ala Ala Ala Glu Gly Gln Ile Asp Asp Cys Asn Ser

145 150 155 160

Asp Lys Ile Ala Asn Tyr Ser Tyr Ala Asp Tyr Cys Thr Ala Val Arg

165 170 175

Lys Lys Ser Gly Ala Leu Phe Gly Leu Pro Val Leu Ala Ala Met Leu

180 185 190

Met Ser Gln Gln His Ala Ile Thr Ile Gly Val Ala Asn Arg Ala Tyr

195 200 205

Ala Glu Phe Gly Ile Ala Tyr Gln Leu Leu Asp Asp Leu His Asp Arg

210 215 220

Asp Val Asp Gln Gln Gly Arg Met Asn Gly Tyr Trp Val Leu Ser Arg

225 230 235 240

Asp Tyr Pro Thr Gly Val Glu Ala Ala Leu Phe Ala Ala Val Glu Gln

245 250 255

His Leu Gly Glu Ala Glu Arg Leu Ile Ala Ser Leu Pro Ser Ser Leu

260 265 270

His Pro Ser Phe Tyr Val Val His Asp Ser Leu Arg Ala Lys Leu Pro

275 280 285

<210>3

<211>909

<212>DNA

<213crtB

<400>3

atgaagatag cgctggaccg gcctgagcat gctgccatta tgcagcagca tggcaagtca 60

ttttatttgg ctggtagctt tctcggtcgt gatgcctggc agcgtgcgtc agcgctttat 120

gcttttttac gccatatcga cgaccaaatt gatgaagctg aaacatctgc cgtagcagcg 180

caacgactgg cacagattcg tcagcagctg ttctcaagcg caatcatgac cgacgcagat 240

gagcagagct taagcattga gcaaagcacc ctggagcaat ttttgcgtgg catggcttat 300

gacattggtc acgttgctat tgctgatcag gctgagttag aagactactg ctattgtgtc 360

gccggcaccg tcggtgaaat gatgtgtcag gccttgcgct gtgatgaccc gcgcgcaatt 420

ggtcatgcta ttgatttggg tgtcgctatg caaatgacca atattgcccg cgatgttcat 480

gccgatagcg ccttagggcg ccgttattta cccgccacct gggttggtga tctcagtgct 540

gagagcatta ccacggcaac accagctatc tcggcacaga tagccgcggc aattatgcgg 600

ctgattgcgt tatctgagca gcgttatcaa tcagcgtatg cgggtatcgc actgttgccg 660

ttgcgctcgc gcttggcaat tttggcggca agtcaccttt atgccggtat tggtcgcgcc 720

attgcggcgg agcatgcgca atcatggcag caacggaagg tgttgtcagg gtcgcgtaag 780

gcggcaatta ctgccgccgc agtggcggaa tttgcgactc gaccgcgact atggcgttat 840

tacgcgcagc ctagcttcgg taagccggcc gagcggatcg ctgcgtctgt tggcagtgag 900

ggtttatga 909

<210>4

<211>302

<212>PRT

<213>Phytoene Synthase

<400>4

Met Lys Ile Ala Leu Asp Arg Pro Glu His Ala Ala Ile Met Gln Gln

1 5 10 15

His Gly Lys Ser Phe Tyr Leu Ala Gly Ser Phe Leu Gly Arg Asp Ala

20 25 30

Trp Gln Arg Ala Ser Ala Leu Tyr Ala Phe Leu Arg His Ile Asp Asp

35 40 45

Gln Ile Asp Glu Ala Glu Thr Ser Ala Val Ala Ala Gln Arg Leu Ala

50 55 60

Gln Ile Arg Gln Gln Leu Phe Ser Ser Ala Ile Met Thr Asp Ala Asp

65 70 75 80

Glu Gln Ser Leu Ser Ile Glu Gln Ser Thr Leu Glu Gln Phe Leu Arg

85 90 95

Gly Met Ala Tyr Asp Ile Gly His Val Ala Ile Ala Asp Gln Ala Glu

100 105 110

Leu Glu Asp Tyr Cys Tyr Cys Val Ala Gly Thr Val Gly Glu Met Met

115 120 125

Cys Gln Ala Leu Arg Cys Asp Asp Pro Arg Ala Ile Gly His Ala Ile

130 135 140

Asp Leu Gly Val Ala Met Gln Met Thr Asn Ile Ala Arg Asp Val His

145 150 155 160

Ala Asp Ser Ala Leu Gly Arg Arg Tyr Leu Pro Ala Thr Trp Val Gly

165 170 175

Asp Leu Ser Ala Glu Ser Ile Thr Thr Ala Thr Pro Ala Ile Ser Ala

180 185 190

Gln Ile Ala Ala Ala Ile Met Arg Leu Ile Ala Leu Ser Glu Gln Arg

195 200 205

Tyr Gln Ser Ala Tyr Ala Gly Ile Ala Leu Leu Pro Leu Arg Ser Arg

210 215 220

Leu Ala Ile Leu Ala Ala Ser His Leu Tyr Ala Gly Ile Gly Arg Ala

225 230 235 240

Ile Ala Ala Glu His Ala Gln Ser Trp Gln Gln Arg Lys Val Leu Ser

245 250 255

Gly Ser Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ala Ala Ala Val Ala Glu Phe Ala

260 265 270

Thr Arg Pro Arg Leu Trp Arg Tyr Tyr Ala Gln Pro Ser Phe Gly Lys

275 280 285

Pro Ala Glu Arg Ile Ala Ala Ser Val Gly Ser Glu Gly Leu

290 295 300

<210>5

<211>1485

<212>DNA

<213>crtI

<400>5

atgcaaacag ttgttattgg tggaggctta ggtggtatcg cagcggcgtt gcgagcccgt 60

gcaaaaggcc atcaagtcac cctaatagaa aaaaatcagc agttaggtgg ccgtgcgcaa 120

gtatttgaac gtgagggttt tcgttttgat gccggcccca ccgtgattac tgcaccattc 180

ttgtttgatg agctatttga attatttggc aaaaaacgcc aagactatgt cgagtttatt 240

ccgctcaatc cgtggtacca attttactac agtgacgaca agtcgcgctt caactatggt 300

ggaagtgtcg atgacacctt gcaagaaatt gctaaaattg agccaagtga ccaggccaat 360

tatctgcgtt taatcgagca tagcaaaaag atctacaaaa tcggctttga gcaactcgcc 420

gatcagccgt ttcacaagct ttccaccatg ttaaagcaaa ttccccattt gggccggctg 480

cgcgctgacc gcacggtttg gaatatggtt agtcgctatc ttaaaaatga caaactacgc 540

caagcttttt ctattcagtc attgctagta ggtggtaacc catttgatac caccagtatt 600

tatggactga ttcattattt agagcgggaa tatggcattc atttcgccat gggcggcacc 660

ggtgccatta ttgatgcatt acacaagctg atgctcgaag agggtatcga ggtgcgcacg 720

aactgctgtg tcaccgactt tcatagcagc ccgagccgca ttgagagcgc agtgattaat 780

cagcacgagg tgctatctgc tgactacttt atttttaatg gcgacccact gtatttgtat 840

aaacacctgt tacctgaaag ttctgctaat ttgcaattac ggttgaaggt tgatcacagt 900

aaacgctcaa tgggtctata tgtgctgttt tttggcacca ccaaacaata tccagaggtt 960

gagcatcaca ctatttggct gggcaagcgt tatcagcaat tattagcaga aatttttgcc 1020

gaaaaatcat tacccgatga tttttcactt tatgtacata gaccaactgc ttcggatcca 1080

tcctttgcgc cggctggttg cgacagcttt tatgtgttag ctccggtgcc caatctgcgg 1140

gcagatatag attggcaggt tgaggaaccc aagttgcgac aacggatcat cgacgcgcta 1200

gcagatacct tattgccggg cttacatgac tgtattaccg ctgagtttgc gatgacccca 1260

gaacagttta aaagcgatta tttgagtgtc gatggcgctg gcttttccat tgcacccaaa 1320

tttactcagt cggcgtggtt ccgttttcat aatctgtcgg aaaaatatag caacttatta 1380

ctcgctggtg ccggaacgca cccaggtgct ggcatgccgg gcgtactctg ttcggcaaaa 1440

gtcattgaaa aactgctccc tgtggtgact gcggagcagc catga 1485

<210>6

<211>494

<212>PRT

<213>Phytoene Desaturase

<400>6

Met Gln Thr Val Val Ile Gly Gly Gly Leu Gly Gly Ile Ala Ala Ala

1 5 10 15

Leu Arg Ala Arg Ala Lys Gly His Gln Val Thr Leu Ile Glu Lys Asn

20 25 30

Gln Gln Leu Gly Gly Arg Ala Gln Val Phe Glu Arg Glu Gly Phe Arg

35 40 45

Phe Asp Ala Gly Pro Thr Val Ile Thr Ala Pro Phe Leu Phe Asp Glu

50 55 60

Leu Phe Glu Leu Phe Gly Lys Lys Arg Gln Asp Tyr Val Glu Phe Ile

65 70 75 80

Pro Leu Asn Pro Trp Tyr Gln Phe Tyr Tyr Ser Asp Asp Lys Ser Arg

85 90 95

Phe Asn Tyr Gly Gly Ser Val Asp Asp Thr Leu Gln Glu Ile Ala Lys

100 105 110

Ile Glu Pro Ser Asp Gln Ala Asn Tyr Leu Arg Leu Ile Glu His Ser

115 120 125

Lys Lys Ile Tyr Lys Ile Gly Phe Glu Gln Leu Ala Asp Gln Pro Phe

130 135 140

His Lys Leu Ser Thr Met Leu Lys Gln Ile Pro His Leu Gly Arg Leu

145 150 155 160

Arg Ala Asp Arg Thr Val Trp Asn Met Val Ser Arg Tyr Leu Lys Asn

165 170 175

Asp Lys Leu Arg Gln Ala Phe Ser Ile Gln Ser Leu Leu Val Gly Gly

180 185 190

Asn Pro Phe Asp Thr Thr Ser Ile Tyr Gly Leu Ile His Tyr Leu Glu

195 200 205

Arg Glu Tyr Gly Ile His Phe Ala Met Gly Gly Thr Gly Ala Ile Ile

210 215 220

Asp Ala Leu His Lys Leu Met Leu Glu Glu Gly Ile Glu Val Arg Thr

225 230 235 240

Asn Cys Cys Val Thr Asp Phe His Ser Ser Pro Ser Arg Ile Glu Ser

245 250 255

Ala Val Ile Asn Gln His Glu Val Leu Ser Ala Asp Tyr Phe Ile Phe

260 265 270

Asn Gly Asp Pro Leu Tyr Leu Tyr Lys His Leu Leu Pro Glu Ser Ser

275 280 285

Ala Asn Leu Gln Leu Arg Leu Lys Val Asp His Ser Lys Arg Ser Met

290 295 300

Gly Leu Tyr Val Leu Phe Phe Gly Thr Thr Lys Gln Tyr Pro Glu Val

305 310 315 320

Glu His His Thr Ile Trp Leu Gly Lys Arg Tyr Gln Gln Leu Leu Ala

325 330 335

Glu Ile Phe Ala Glu Lys Ser Leu Pro Asp Asp Phe Ser Leu Tyr Val

340 345 350

His Arg Pro Thr Ala Ser Asp Pro Ser Phe Ala Pro Ala Gly Cys Asp

355 360 365

Ser Phe Tyr Val Leu Ala Pro Val Pro Asn Leu Arg Ala Asp Ile Asp

370 375 380

Trp Gln Val Glu Glu Pro Lys Leu Arg Gln Arg Ile Ile Asp Ala Leu

385 390 395 400

Ala Asp Thr Leu Leu Pro Gly Leu His Asp Cys Ile Thr Ala Glu Phe

405 410 415

Ala Met Thr Pro Glu Gln Phe Lys Ser Asp Tyr Leu Ser Val Asp Gly

420 425 430

Ala Gly Phe Ser Ile Ala Pro Lys Phe Thr Gln Ser Ala Trp Phe Arg

435 440 445

Phe His Asn Leu Ser Glu Lys Tyr Ser Asn Leu Leu Leu Ala Gly Ala

450 455 460

Gly Thr His Pro Gly Ala Gly Met Pro Gly Val Leu Cys Ser Ala Lys

465 470 475 480

Val Ile Glu Lys Leu Leu Pro Val Val Thr Ala Glu Gln Pro

485 490

<210>7

<211>909

<212>DNA

<213>crtE of Synechocystis sp.PCC 6803

<400>7

atggttgccc aacaaacacg aaccgacttt gatttagccc aatacttaca agttaaaaaa 60

ggtgtggtcg aggcagccct ggatagttcc ctggcgatcg cccggccgga aaagatttac 120

gaagccatgc gttattctct gttggcgggg ggcaaacgat tgcgaccgat tttatgcatt 180

acggcctgcg aactgtgtgg cggtgatgaa gccctggcct tgcccacggc ctgtgccctg 240

gaaatgatcc acaccatgtc cctcatccat gatgatttgc cctccatgga taatgacgat 300

ttccgccggg gtaaacccac taaccacaaa gtgtacgggg aagacattgc cattttggcc 360

ggggatggac tgctagccta tgcgtttgag tatgtagtta cccacacccc ccaggctgat 420

ccccaagctt tactccaagt tattgcccgt ttgggtcgca cggtgggggc cgccggttta 480

gtggggggac aagttctaga cctggaatcg gaggggcgca ctgacatcac cccggaaacc 540

ctaactttta tccataccca taaaaccggg gcattgctgg aagcttccgt gctcacaggc 600

gcaattttgg ccggggccac tggggaacaa caacagagac tggcccgcta tgcccagaat 660

attggcttag cttttcaagt ggtggatgac atcctcgaca tcaccgccac ccaggaagag 720

ttgggtaaaa ccgctggtaa agatgtcaaa gcccaaaaag ccacctatcc cagtctcctc 780

ggtttggaag cttcccgggc ccaggcccaa agtttgattg accaggccat tgtcgccctg 840

gaaccctttg gcccctccgc cgagcccctc caggcgatcg ccgaatatat tgttgccaga 900

aaatattga 909

Claims

1.crtE基因，其编码香叶基香叶基焦磷酸合酶，并具有SEQ ID NO：1显示的DNA序列。

2.crtB基因，其编码八氢番茄红素合酶，并具有SEQ ID NO：3显示的DNA序列。

3.crtI基因，其编码八氢番茄红素去饱和酶，并具有SEQ ID NO：5显示的DNA序列。

4.重组载体，其含有选自SEQ ID NO：1显示的crtE基因、SEQ IDNO：3显示的crtB基因和SEQ ID NO：5显示的crtI基因中的至少一个基因。

5.权利要求4的重组载体，含有SEQ ID NO：1显示的crtE基因、SEQID NO：3显示的crtB基因和SEQ ID NO：5显示的crtI基因。

6.权利要求4的重组载体，含有SEQ ID NO：3显示的crtB基因和SEQ ID NO：5显示的crtI基因，还含有SEQ ID NO：7显示的crtE基因。

7.权利要求4的重组载体，含有SEQ ID NO：3显示的crtB基因和SEQ ID NO：5显示的crtI基因，还含有源自于草生欧文氏杆菌(Erwiniaherbicola)的crtE基因。

8.转化的微生物，其带有权利要求4到7任一项中的重组载体。

9.权利要求8的转化的微生物，包括大肠杆菌。