KR100832584B1

KR100832584B1 - 라이코펜의 생합성에 관여하는 유전자, 그 유전자를포함하는 재조합 벡터, 및 그 재조합 벡터로 형질전환된미생물

Info

Publication number: KR100832584B1
Application number: KR1020070033680A
Authority: KR
Inventors: 조남륜; 박민수; 이동현; 정호승; 김종근
Original assignee: 에스케이에너지 주식회사; 아미코젠주식회사
Priority date: 2007-04-05
Filing date: 2007-04-05
Publication date: 2008-05-27
Also published as: US20110124090A1; WO2008123731A1; CN101675166A

Abstract

본 발명은 라이코펜 생합성에 관여하는 유전자에 관한 것으로서, 라이코펜 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자, 이들 유전자 중 적어도 하나의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터로 형질전환된 라이코펜 함량이 높은 미생물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 유전자를 이용한 재조합 대장균을 배양하면 15.3 mg/L의 수율과 4.2 mg/gDCW 함량이 획득되며, 본 발명의 유전자와 공지 유전자를 조합하여 미생물을 형질전환하는 경우 최대 5.4 mg/gDCW의 함량이 획득되어, 공지 유전자에 비해 건조세포 중량당 라이코펜의 함량이 증가된 라이코펜 생산 균주가 제공된다.

따라서 본 발명의 유전자들은 미생물에서 라이코펜의 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있으며, 더 나아가 카로티노이드의 대량 생산에도 사용될 수 있다.

카로티노이드(Carotenoid), 라이코펜(Lycopene), 해수의 메타게놈, crt 유전자, crtE, crtB, crtI

Description

라이코펜의 생합성에 관여하는 유전자, 그 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 그 재조합 벡터로 형질전환된 미생물{Gene involved in the biosynthesis of lycopene, recombinant vector comprising the gene, and transformed microorganism with the recombinant vector}

도 1은 라이코펜의 생합성 과정을 나타낸 것이다.

도 2는 재조합 벡터 pT5-LYC-idi의 개열 지도를 나타낸 것이다.

도 3은 재조합 벡터 pT5-ErEBI의 개열 지도를 나타낸 것이다.

도 4는 재조합 벡터 pT5-ErBI의 개열 지도를 나타낸 것이다.

도 5는 재조합 벡터 pT-EF5의 개열 지도를 나타낸 것이다.

도 6은 재조합 벡터 pT-SF5의 개열 지도를 나타낸 것이다.

도 7은 재조합 벡터 pBF5-crt의 개열 지도를 나타낸 것이다.

[서열목록의 간단한 설명]

서열번호 1은 해수의 메타 게놈에서 유래한 crtE 유전자의 염기서열(867 bp)이다.

서열번호 2는 crtE 유전자에 의해 코딩되는 제라닐제라닐 피로인산 합성효 소(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase)의 아미노산 서열(288개)이다.

서열번호 3은 해수의 메타 게놈에서 유래한 crtB 유전자의 염기서열(909 bp)이다.

서열번호 4는 crtB 유전자에 의해 코딩되는 피토엔 합성효소(Phytoene synthase)의 아미노산 서열(302개)이다.

서열번호 5는 해수의 메타 게놈에서 유래한 crtI 유전자의 염기서열(1,485 bp)이다.

서열번호 6은 crtI 유전자에 의해 코딩되는 피토엔 디세튜레이즈(Phytoene desaturase)의 아미노산 서열(494개)이다.

서열번호 7은 시네코시스티스(Synechocystis sp.) PCC 6803 crtE 유전자의 염기서열이다.

본 발명은 라이코펜 생합성에 관여하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 형질전환체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 라이코펜 생합성에 필요한 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 유전자, 상기 유전자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 형질전환체에 관 한 것이다.

라이코펜은 카로티노이드 색소 중 하나이다. 카로티노이드는 항산화 활성을 갖는 C40 이소프레노이드 화합물로 분자 구조에 따라 노란색, 적색, 주황색 등을 띄는 색소군으로, 그 예로는 베타카로틴(β-Carotene), 라이코펜(Lycopene), 루테인(Lutein), 아스타잔틴(Astaxanthin), 지아잔틴(Zeaxanthin) 등이 있으며, 주로 영양 보충제, 의약품, 식용착색제 및 동물 사료 첨가제로 사용되고 있다.

이 중 라이코펜은 화학식 1의 구조를 가지고 있으며, 토마토나 수박, 포도 등에 붉은 색소의 본체를 이루고 있는 극성이 대단히 낮은 지용성 물질로 다른 카로티노이드와 같이 항산화, 항암 작용을 한다.

그 동안의 연구 결과를 살펴보면, 지난 2000년 미국 디트로이트 캘마노즈 암센터의 오머팀에서 라이코펜이 전립선 암의 전이를 억제한다는 연구 성과를 발표하였다(Omer Kucuk et al., Cancer Epidemiology, 10, 861-869, 2001). 이스라엘 텔아비브의 하샤론 병원 알러지 교실과 라이코펜 전문 메이커인 라이코레드 사(LycoRed)는 운동 유발성 천식 환자(Exercises-induced asthma)를 대상으로 천식 증상 완화 효과를 확인하였다(I. Neuman et al., Allergy, 55, 1184-1189). 또한 핀란드 쿠오피오 대학의 공중 보건학 교실에서는 심근 질환 및 죽상 동맥경화에 라이코펜이 탁월한 보호 효과를 갖는 것을 임상 실험 결과로 얻었다(Tiina Rissanen et al., Exp Biol Med (Maywood)., 227, 900-907, 2002).

카로티노이드의 생체 내에서의 생합성 경로는 도1과 같다.

생명체 내에 흡수된 글리세롤(Glycorol) 과 포도당(Glucose)이 2-C-메틸-D-에리트리톨-4-인산 경로(2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway, MEP 경로) 또는 메발론산 경로(Mevalonate pathway, MVA 경로)를 거치게 되면 이소펜테닐 피로인산(Isopentenyl pyrophosphate, 이하 IPP)나 이메틸아릴 피로인산(Dimethylallyl pyrophosphate, 이하 DMAPP)로 바뀌고, 다시 몇 단계를 거치면 일반적인 이소프레노이드 경로의 중요한 중간 생성물인 파네실 피로인산(Farnesyl pyrophosphate, 이하 FPP)가 된다. FPP와 IPP는 crtE에 의해 암호화되는 제라닐제라닐 피로인산 합성효소(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase)에 의해 제라닐제라닐 피로인산(Geranylgeranyl pyrophosphate, 이하 GGPP)로 된다. 이후, GGPP는 crtB에 의해 암호화되는 피토엔 합성효소(Phytoene synthase)에 의해 피토엔(Phytoene)이 되며, crtI에 의해 암호화되는 피토엔 디세투레이즈(Phytoene desaturase)에 의해 라이코펜으로 된다. 다시 라이코펜은 crtY에 의해 베타카로틴 으로 전환되고, 베타카로틴은 crtZ에 의해 암호화되는 베타카로틴 하이드록시레이즈(β-Carotene hydroxylase)에 의해 지아잔틴으로 전환되며, crtW에 의해 암호화되어 있는 베타카로틴 케토레이즈(β-Carotene ketolase)에 의해 지아잔틴이 아스타잔틴으로 전환된다. 또한 라이코펜은 crtL과 crtR에 의해 루테인으로 바뀔 수 있다.

상기와 같이 카로티노이드의 공통 전구체인 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)의 생합성 경로로서 메발론산 경로(Mevalonate pathway) 및 비메발론산 경로(Non-mevalonate pathway)가 알려져 있으며, 메발론산 경로는 대부분의 진핵 생물(예컨데, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)), 식물 세포의 세포질, 일부 박테리아(예컨데, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 및 파라코커스 제악산티니파시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens)) 및 말라리아 세포에 존재하는 것으로 알려져 있다. 비메발론산 경로는 대부분의 박테리아(예 대장균), 식물 세포의 색소체(plastid)에 존재한다. 즉 그람 음성 박테리아인 대장균(E. coli)의 경우 비메발론산 경로만을 이용하여 IPP를 생합성한다. 그러나, 야생형의 대장균은 라이코펜을 포함한 카로티노이드 생합성에 관련되는 유전자를 가지고 있지 않기 때문에, 라이코펜을 생산할 수 없다.

야생의 대장균과 같은 라이코펜 비생산 미생물에 유래가 다른 유전자를 도입함으로써 라이코펜을 비롯한 카로티노이드를 생산하는 연구는 이미 여러 곳에서 진 행되어 왔다. 로슈 비타민사(Roche Vitamins,Inc).에서는 플라보박테리움 R1534 (Flavobacterium sp. R1534) 종에서 유래한 crtE, crtB , crtI 를 전환하여 라이코펜 함량이 0.5 mg/gDCW인 대장균를 만들었으며(Luis Pasamontes et al., US20040058410, 2004), 아모코사(Amoco Corporation)에서는 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola)에서 유래한 crtI를 이용하여 효모에서 0.1 mg/gDCW의 함량을 갖도록 하였다(Rodney L. Ausich et al., US5,530,189, 1996). 미사와(Misawa) 등은 에르위니아 종(Erwinia species)과 아그로박테리움 아우란티아쿰(Agrobacterium aurantiacum)에서 유래된 crtE , crtB 및 crtI유전자를 이용하여 1.03 mg/gDCW의 함량을 갖는 대장균 균주 0.11 mg/gDCW의 라이코펜 함량을 갖는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 만들기도 하였다(Norihiko Misawa, Journal of Biotechnology, 59, 169-181, 1998). 기린맥주사(Kirin Beer Kabushiki Kaisha)에서는 에르위니아 우레도보라(Erwinia uredovora)에서 유래한 crtE , crtB , crtI 를 이용하여 미생물에서 라이코펜을 생산한 결과, 라이코펜 함량이 2.0 mg/gDCW인 대장균 균주를 확보하였다(Norihiko Misawa et al., US 5,429,939, 1995).

그러나 상기의 연구들에 언급된 함량은 매우 낮기 때문에 경제적인 생산공정의 개발이 쉽지 않다. 이를 해결하기 위해 본 발명에서는 공지된 유전자에 비해 높은 라이코펜 함량을 갖는 형질전환체를 만들 수 있는 새로운 유전자, 이를 포함하는 벡터, 이 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

즉, 본 발명은 라이코펜의 생산성 향상을 위한 연구를 수행한 결과, 해수의 메타게놈에서 라이코펜 생합성에 관련된 유전자 중 crtE , crtB 및 crtI 유전자를 분리하고, 그리고 상기 crtE , crtB 및 crtI 유전자를 클로닝하여 그의 염기서열을 규명하고, 이 유전자들을 벡터에 도입하여 라이코펜을 생산하지 않는 미생물을 보다 높은 라이코펜 함량을 갖도록 하였으며, 본 발명은 이를 기초로 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 라이코펜 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 이용하여 라이코펜의 함량이 향상된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 견지에 의하면, 제라닐제라닐 피로인산 합성효소(Geranylgetanyl pyrophosphate synthase) 를 코딩하며, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 crtE 유전자가 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 피토엔 합성효소(Phytoene synthase)를 코딩 하며, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 crtB유전자가 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 피토엔 디세튜레이즈(Phytoene desaturase)를 코딩하며, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 crtI유전자가 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 서열번호 1로 표시되는 crtE 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 crtB유전자 및 서열번호 5로 표시되는 crtI유전자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 재조합 벡터가 도입된 미생물 형질전환체가 제공된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 해수의 메타게놈으로부터 라이코펜 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 3개 유전자, crtE, crtB 및 crtI를 클로닝하고, 이들 유전자가 포함된 재조합 벡터를 확보하고, 이를 이용하여 라이코펜을 생산하지 않는 대장균을 형질전환하였다.

나아가, 상기 형질전환된 대장균을 발효하면 라이코펜의 함량이 기존 연구에 비해 향상되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 의하면, 라이코펜 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 서열번호1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 유전자가 제공되며, 상기 유전자는 해수의 메타게놈으로부터 확보된 유전자이다. 상기 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 염기서열은 각각 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 기재되는 아미노산(제라닐제라닐 피로인산 합성 효소, 피토엔 합성 효소, 피토엔 디세튜레이즈)을 암호화하는 서열이다.

본 발명에 따라 제공되는 유전자들은 다양한 숙주세포에 도입되어 라이코펜 뿐만 아니라 다른 카로티노이드를 생산하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 상기 유전자들은 단독으로 사용될 수도 있으며, 2개 이상이 함께 사용될 수도 있다. 예를 들면, crtE 및 crtB만을 가지고 있는 미생물에 본 발명의 crtI 유전자를 도입하여 라이코펜을 생산하는 데 사용할 수 있으며, 아스타잔틴과 같은 카로티노이드를 생합성하는 미생물에 본 발명의 crtE, crtB및 crtI 유전자를 도입하여 향상된 수율을 얻는 데 사용할 수도 있다.

또한 본 발명은 상기 라이코펜 생합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터는 crtE, crtB및 crtI 유전자를 기본 벡터에 도입하여 제조하였다. 본 발명에 사용할 수 있는 기본 벡터는 유전자를 클로닝하고 발현에 일반적으로 사용될 수 있는 벡터라면 모두 사용될 수 있으며, 숙주 세포에 따라 달라질 수도 있다. 본 발명의 실시예에서는 pTrc99A를 기본벡터로 사용하였으며 crtE, crtB및 crtI를 벡터에 도입하고, 대장균의 IPP 이성화효소 (IPP isomerase)를 코딩하는 idi 유전자도 도입하여 재조합 벡터를 제조하였으며, 이를 'pT5-LYC-idi(도 2)'라고 명명하였다. 뿐만 아니라, 공지된 crt 유전자들과 본 발명의 crt 유전자들을 조합하여 재조합 벡터를 제조하였으며, 이들을 'pT5-ErEBI(도 3)', 'pT5-ErBI(도 4)', 'pT-EF5(도 5)' 및 'pT-SF5(도 6)'라고 명명하였다.

본 발명의 범주에는 상기의 재조합 벡터뿐만 아니라, 본 발명의 crtE, crtB및 crtI 유전자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 포함하는 어떠한 재조합 벡터를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 라이코펜 생합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환한 균주를 제공한다.

상기 카로티노이드 생합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 되는 숙주는 대장균 또는 효모 등을 사용할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 재조합 벡터 pT5-LYC-idi, pT5-ErEBI, pT5-ErBI, pT-EF5 및 pT-SF로 형질전환된 대장균을 제조하였다.

본 발명에서 상기 유전자들을 도입한 재조합 벡터로 형질전환된 균주로부터 생산된 라이코펜의 양을 측정하면, 해수의 메타게놈에서 유래한 crtE , crtB 및 crtI 유전자의 조합을 포함하는 대장균에서의 수율은 15.3 mg/L이고 균체당 라이코펜 함량은 4.2 mg/gDCW 이었다. 또한, 공지된 crt유전자와 상기 유전자의 조합에서는 최대 수율 22.8 mg/L, 균체당 라이코펜의 최대 함량은 5.4 mg/gDCW를 획득할 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 목적을 달성하기 위해 해수의 메타게놈에서 신규의 crtE , crtB 및 crtI 유전자를 확보하였으며, 이들 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 그 벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 확보하였다. 상기 확보된 재조합 대장균의 발효 결과 이는 기존의 발명들과 비교하여 균체 당 높은 라이코펜의 함량을 확보함으로써 종래 발명에 비해 라이코펜의 경제적인 생산공정 개발을 가능하게 한다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

<실시 예 1> 해수 메타게놈으로부터 신규 라이코펜 생합성 유전자 (crtE , crtB , crtI)들의 클로닝

라이코펜 생합성에 필요한 유전자, crtE , crtB 및 crtI를 얻기 위하여 해수로부터 직접 게놈 DNA(메타게놈)를 확보하고 라이브러리를 구축한 다음 라이코펜이 붉은 색을 띠는 점을 이용하여 붉은 색을 띠는 클론을 선별하고 클론의 DNA를 분석하는 방법을 이용하였다.

먼저 해수로부터 메타게놈 DNA를 확보하기 위하여 막여과(Membrane filtration)를 통해 대량의 해수로부터 미생물을 농축하였다. 대부분의 미생물의 크기가 0.2μm에서 10μm 사이이므로 1차적으로, 대량의 해수를 연동 펌프를 통해 10μm의 포어 사이즈 필터로 통과시켜 10μm이상의 크기를 갖는 여러 부유물질을 제거하였고 2차적으로, 0.2μm의 포어 사이즈 필터를 통해 0.2μm 이상의 크기를 가지는 미생물만 선택적으로 회수하였다. 회수된 미생물의 염색체 DNA의 추출은 CTAB(Hexadecyltrimethyl ammonium bromide)를 이용한 방법(Zhou et al., Appl . Environm . Microbiol. 62:316-322,1996)을 사용하였다.

위에서 얻은 미생물 균체로부터 준비한 메타게놈 DNA를 사용하여 Copy Control fosmid library production kit(Epicenter 사)로 메타게놈 라이브러리를 제조하였으며 제조과정은 제조사의 매뉴얼을 따랐다. 라이브러리 제조는 포스미드(Fosmid) 벡터 Copy Control pCC1FOS(Epicenter 사)를 사용하였다. 삽입 DNA와 Copy Control pCC1FOS 벡터의 라이게이션 반응을 수행한 후 라이게이션 된 포스미드 클론을 MaxPlax lambda packaging extracts(Epicenter 사)로 패키징 시켰다. 이 와 같은 과정을 통하여 10,000개 이상의 클론을 얻을 수 있었다.

위에서 얻은 포스미드 클론들을 실온에서 48시간 정치 배양하여 콜로니의 색깔을 관찰하였으며 그 중 적색을 띄는 콜로니들을 선별하였다. 이들 콜로니들로부터 crt 유전자의 유무를 PCR로 확인하기 위하여 에르위니아 우레도브라(Erwinia uredovora), 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola), 플라보박테리움 STCC21588(Flavobacterium sp. Strain ATCC21588) 종, 로토박터 스파이로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 그리고 아그로박테리움 아우란티아쿰(Agrobacterium aurantiacum)으로부터 유래된 crtI C-말단 부분(crtIf)과 crtB중간 부분(crtBr)의 보존된 부위의 아미노산 서열로부터 프라이머를 합성하였다. 이들 프라이머들의 염기서열은 다음과 같다.

crtIf :

5'-GTNGGNGCRGGCACNCAYCC-3'

crtBr :

5'-TCGCGRGCRATRTTSGTSARRTG-3'

각각의 붉은색을 띄는 콜로니들로부터 추출한 포스미드 DNA를 주형으로 하여 상기에서 합성한 프라이머들을 통해 crt 유전자를 증폭하였다. 즉, 포스미드 DNA 100ng를 주형으로 하여 94 °C에서 5분 동안 변성(Denaturation) 후 94 °C에서 30 초, 50 °C ~ 60 °C에서 30초, 72 °C에서 1분의 사이클(Cycle)을 20회 수행 후, 94 °C에서 30초, 50 °C에서 30초, 72 °C에서 1분의 사이클을 15회 수행하였다. 그 결과 한 개의 클론으로부터 예상되는 620 bp 크기의 밴드(Band)를 얻을 수 있었으며, 이를 pST-Blue1벡터(Novagen 사) 에 삽입하여 염기서열을 분석한 결과, 보고된 crtB 유전자 염기서열과 상동성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

상기에서 얻어진 crtB 유전자의 조각을 탐침(Probe)으로 하여 서던 블러팅을 통해 crtB유전자를 포함하는 전체 라이코펜 생합성 유전자 클러스터를 획득하고자 하였다. 탐침으로 사용한 crtB유전자의 조각은 PCR을 통해 DIG 화합물을 부착하였으며, 주형 DNA를 각각 제한효소 BamHI, SalI, EcoRI으로 절단한 후 서던 블러팅하였다. 먼저 여러 가지 제한효소로 각각 처리한 DNA를 0.9% 아가로스 젤에서 전기영동하여 크기별로 분획한 후 나일로 멤브레인(Schleicher & Schuell, 독일)으로 모세관 이동(Capillary transfer)방법으로 옮겼다. 하이브리드화는 42°C에서 50% 포름아미드를 포함하는 표준용액 (5XSSC, 0.1% N-Lauroylsarcosine, 0.02% SDS, 5% Blocking regent, 50% Formamide)을 사용하여 탐침을 첨가한 후 6시간 이상 지속하였다. 제조사 (Boehringer-Mannheim, 독일)의 메뉴얼에 따라서 멤브레인을 알칼라인 포스파타제와 연결된 DIG에 대한 항체와 반응시킨 후 기질인 NBT와 X-포스페이트를 첨가하여 발색반응을 수행하였다.

서던 블러팅 결과, 시그널을 나타내는 EcoRI 절단 DNA 중 약 4kb 밴드를 pBluescript II KS(+) 벡터 (Stratagene 사)에 전환하여 DNA의 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석결과 총 3.2 kb의 crtE, crtB, crtI 유전자 부위를 확인 할 수 있었다. 상기와 같이 crtE, crtB 및 crtI 유전자는 해수의 메타게놈으로부터 클로닝하였으며, 이는 기존에 알려진 유전자들과는 그 서열이 다르다.

이 crt 유전자 클러스터의 염기서열을 바탕으로 아래의 프라이머들을 사용하여 PCR 반응을 수행한 후, 3개의 유전자가 함유된 약 3.2kb의 DNA 절편을 pBluescriptII KS(+) 벡터의 XhoI과 XbaI 제한효소 위치에 클로닝하여 이를 'pBF5-crt'라고 명명하였다.

F5crt-F:

5'-GTCTCGAGAGGAGGTAATAAATATGATAAGCCCTATATCCACTGCTGAT-3'

F5crt-R1 :

5'-GATTCTAGATCTAAACCCTCACTGCC-3'

<실시 예 2> 해수의 메타게놈 유래의 라이코펜 생합성 유전자를 도입한 재조합 벡터의 제조

상기 실시예1에서 클로닝한 crtE, crtB, crtI 유전자들을 발현벡터인 pTrc99A (Amannm E.et al.,(1998) Gene, 69:301-305) 벡터에 삽입하였다.

먼저 crtE 유전자를 pTrc99A 벡터에 삽입하기 위하여 다음의 2종류의 프라이 머들을 합성하였다.

f5E-f :

5'-TGGAATTCTACATCAGGAGGTAATAAATATGATAAGCCCTATATCCAC-3'

f5E-r :

5'-TAGGATCCCTCGAGATGCATTATCATGGGAGCTTCGCTCGGAGC-3'

이들 프라이머들을 이용하여 실시예 1에서 제조한 pBF5-crt를 주형으로 하여 약 0.85kb의 crtE 유전자를 함유하는 DNA 절편을 얻었다. 이를 Qiagen PCR purification kit(Qiagen사)로 정제한 후 EcoRI과 BamHI으로 절단하여 동일한 제한부위를 절단한 pTrc99A 벡터에 도입하고 이를 pT-f5crtE로 명명하였다. 다음으로 crtB와 crtI를 pT-f5crtE에 도입하기 위하여 다음의 4종류의 프라이머들을 합성하였다.

f5I-f :

5'-ATCTCGAGAGGAGGTAATAAATATGCAAACAGTTGTTATTGGTG-3'

f5I-r :

5'-CTCCTCTGCAGTTATCATGGCTGCTCCGCAGTCACCAC-3'

f5B-f :

5'-CCATGATAACTGCAGAGGAGGTAATAAATATGAAGATAGCGCTGGACCGG-3'

f5B-r :

5'-AGGTCGACGCGGCCGCGAGCTCTTATCGTAAACCCTCACTGCCAAC-3'

먼저 pBF5-crt 벡터를 주형으로 f5I-f와 f5I-r을 이용하여 약 1.5 kb의 crtI유전자를 함유하는 DNA 절편을 얻고 이를 Qiagen PCR purification kit로 정제하였다. 다음으로 pBF5-crt 벡터를 주형으로 f5B-f와 f5B-r을 이용하여 약 0.9 kb의 crtB유전자를 함유하는 DNA절편을 얻고 이를 Qiagen PCR purification kit로 정제하였다. 상기에서 확보한 두 종류의 DNA 절편들을 함께 섞고 f5I-f와 f5B-r 프라이머들을 이용하여 PCR반응을 통해 최종 crtB와 crtI유전자를 모두 함유하는 약 2.4 kb의 DNA 절편을 얻었다. 이를 Qiagen PCR purification kit으로 정제한 다음 XhoI과 SalI으로 절단하여 동일한 제한부위를 절단한 pT-f5crtE에 도입하고 이를 pT-f5EBI로 명명하였다. 여기에 대장균의 IPP 이성화효소(IPP isomerase)를 코딩하는 idi 유전자를 도입하기 위해 idi-f와 idi-r, 두 종류의 프라이머들을 합성하였다.

idi-f:

5'-TAAHAHCTCTAATAAATATHCAAACHHAACACHTCAT-3'

idi-r:

5'-CGACGCGGCCGCGCTTATTTAAGCTGGGTAAATGC-3'

이들 두 종류의 프라이머들을 이용하여 대장균 MG1655의 염색체 DNA로부터 PCR을 통해 약 0.6 kb의 idi유전자를 함유하는 DNA절편을 얻고 이를 Qiagen PCR purification kit으로 정제하였다. 이를 SacI과 NotI으로 절단한 후 동일한 제한부위를 절단한 pT-f5EBI에 도입하고 이를 pT5-LYC-idi [도 2]로 명명하였다.

<실시예3> 재조합 대장균에서의 라이코펜 생산

상기 실시예 2에서 얻은 벡터 pT5-LYC-idi로 형질전환된 대장균에서 라이코펜 생합성 유무를 판별하였다.

먼저 벡터 pT5-LYC-idi로 MG1655를 형질전환하였다. 형질전환된 각 대장균의 단일 콜로니를 100μg/mL의 암피실린과 50μg/mL의 클로람페니콜이 함유된 5 mL의 2YT배지(16 g/L 트립톤, 10 g/L 효모추출물 및 5g/L NaCl)에 접종하여 37°C에서 8시간 진탕배양 하였으며, 얻어진 배양액 600μL를 1% 글리세롤, 100μg/mL 암피실린이 함유된 2YT배지 30ml에 접종하여 30°C에서 48시간 동안 본 배양하였다.

배양이 완료되면, 적당량의 배양액을 취하여 건조세포 중량(Dry cell weight, gDCW/L), 수율(mgLycopene/L, 이하 mg/L로 표시), 함량(Content, mgLycopene/gDCW, 이하mg/gDCW로 표시)을 구하여 라이코펜의 생산성을 확인하였다.

먼저 건조 세포 중량을 얻기 위해서는 균주 배양액 5mL를 채취하여 50mL 원 심분리관에 첨가하고 원심분리(8,000rpm, 10분)하고 상등액을 제거하여 균체를 회수한다. 회수된 균체에 20mL의 멸균된 증류수 용액을 첨가하여 현탁한 뒤 원심분리하여 배양액 성분을 완전히 제거하고 균체를 회수한다. 회수된 균체에 5mL의 멸균 증류수를 첨가하여 완전히 현탁한 뒤 미리 mg 단위로 무게를 측정해둔 알루미늄 칭량접시(Weighing dish)에 첨가한다. 이때 멸균 증류수를 이용하여 원심분리관을 세척하고 세척액도 칭량 접시에 첨가한다. 칭량 접시를 105℃의 건조 오븐(Dry oven)에서 12시간 이상 건조한 뒤 냉각하여 칭량 접시의 무게를 mg 단위로 측정하였다. 건조세포중량(gDCW/L)은 [식 1]을 이용하여 계산하였다.

[식 1]

건조세포중량(gDCW/L) = {건조후 접시무게(mg) -접시무게(mg)}/5

라이코펜의 수율을 얻기 위하여 배양액을 100μL씩 원심분리하여 균체를 얻은 후 이를 아세톤 400μL으로 현탁시켜 55°C에서 15분간 방치하고, 여기에 다시 아세톤 600μL 를 가하여 55°C에서 15분간 방치하여 라이코펜을 추출하였다. 얻어진 추출액을 14,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 분리하고 분광광도계를 이용하여 474.5 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정값을 검량선을 통해 얻은 방정식에 대입하였고, 희석배수를 계산하여 라이코펜의 양을 계산하였다. 이때, 검량선 작성을 위해서 표준 라이코펜(Sigma 사)을 구입하여 아세톤에 용해시킨 후 각각 다른 농도로 아세톤에 희석하여 분광광도계의 474.5 nm 파장을 이용해 흡 광도를 측정하고 이를 이용하여 표준 검량선을 작성하였다.

라이코펜의 함량(mg/gDCW)은 상기의 건조세포 중량(gDCW/L)과 라이코펜의 수율(mg/L)를 이용하여 [식 2]를 이용하여 계산하였다.

[식 2]

함량 (mg/gDCW) =수율(mg/L) / 건조세포중량(gDCW/L)

상기 방법으로부터 확인된 라이코펜 생산 정도는 [표 1]과 같다.

[표 1]

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)
3.56	15.3	4.2

<실시예 4> 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola) 유래의 crtE , crtB 및 crtI 유전자로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생산성 평가

에르위니아 하이르비콜라 유래의 crtE , crtB 및 crtI 유전자를 확보하여 pT5-ErEBI(도 3)를 제조하고 이를 도입하여 형질전환 된 대장균를 확보하여 실시예3에서와 동일한 방법으로 라이코펜의 생산성 평가를 하였다. 48시간 배양 후 확인 된 형질전환 대장균의 라이코펜 생산성은 [표 2]와 같다.

[표 2]

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)
3.7	12.7	3.5

<실시예 5> 신규 crtE유전자와 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola) 유래의 crtB유전자와 crtI유전자의 조합으로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생산성 평가

상기 실시예 2에서 얻어진 벡터 pT5-LYC-idi에서 crtB유전자와 crtI유전자를 기존에 알려진 에르위니아 하이르비콜라 유래의 유전자로 대체하여 재조합 벡터 pT5-ErBI(도 4)를 제조하였다.

재조합 벡터 pT5-ErBI로 형질전환된 대장균을 확보하여 실시예 3에서와 동일한 방법으로 신규 crtE유전자의 생산성 평가를 하였다. 48시간 배양 후, 확인된 라이코펜 생산 정도는 [표 3]와 같다.

[표 3]

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)
4.9	10.6	2.2

<실시예 6> 에르위니아 하이르비콜라 유래의 crtE유전자와 신규 crtB유전자와 crtI유전자의 조합으로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생 산성 평가

상기 실시예 2에서 얻어진 벡터 pT5-LYC-idi에서 crtE유전자를 에르위니아 하이르비콜라 유래의 유전자로 대체하여 재조합 벡터 pT-EF5 (도 5)를 제조하였다.

재조합 벡터 pT-EF5로 형질전환된 대장균을 확보하여 실시예 3에서와 동일한 방법으로 신규 crtB유전자와 신규 crtI유전자의 생산성 평가를 하였다. 48시간 배양 후, 확인된 라이코펜 생산 정도는 [표4]과 같다.

[표4]

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)
4.2	22.8	5.4

<실시예 7> 시네코시스티스 PCC6803(Synechocystis sp. PCC6803) 종 유래의 crtE유전자와 신규 crtB유전자와 crtI유전자의 조합으로 이루어진 벡터로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생산성 평가

상기 실시예 2에서 얻어진 재조합 벡터 pT5-LYC-idi에서 crtE유전자를 시네코시스티스 PCC6803 종 유래의 유전자로 대체하여 재조합 벡터 pT-SF5(도 6)를 제조하였다.

재조합 벡터 pT-SF5로 형질전환된 대장균의 라이코펜 생산성 평가를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였으며, 이를 통하여 확인된 라이코펜 생산 정도 는 [표5]와 같다.

[표5]

건조세포중량(gDCW/L)	수율(mg/L)	함량(mg/gDCW)
4.1	19.5	4.8

전술한 바와 같이, 본 발명에서는 해수의 메타게놈으로부터 라이코펜 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 3개의 신규 유전자, crtE, crtB, crtI를 클로닝하였다. 또한, 상기 crt유전자를 이용하여 라이코펜을 생산하지 않는 대장균에서 라이코펜을 생산할 수 있으며, 상기 crt유전자들만을 사용하거나, 혹은 기존에 알려진 crt유전자들과의 조합을 통하여 종래의 기술에 비해 높은 라이코펜 함량을 보여주는 재조합 균주를 만들 수 있음을 확인할 수 있었다. 본 발명의 crt 유전자는 라이코펜과 같은 카로티노이드의 생산에 이용될 수 있으며, 더 나아가 미생물을 이용한 라이코펜을 비롯한 카로티노이드의 대량 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

제라닐제라닐 피로인산 합성효소(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase)를 코딩하며, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 crtE 유전자.
피토엔 합성효소(Phytoene synthase)를 코딩하며, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 crtB 유전자.
피토엔 디세튜레이즈(Phytoene desaturase)를 코딩하며, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 crtI 유전자.
서열번호 1로 표시되는 crtE 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 crtB유전자 및 서열번호 5로 표시되는 crtI유전자로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 4항에 있어서, 재조합 벡터는 서열번호 1로 표시되는 crtE 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 crtB 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 crtI 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 4항에 있어서, 재조합 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 crtB 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 crtI 유전자를 포함하며, 그리고 서열번호 7로 표시되는 crtE 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 4항에 있어서, 재조합 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 crtB 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 crtI 유전자를 포함하며, 그리고 에르위니아 하이르비콜라(Erwinia herbicola)에서 유래된 crtE 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
제 8항에 있어서, 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.