KR20070082647A

KR20070082647A - 대장균에 의한 라이코펜의 대량 제조방법

Info

Publication number: KR20070082647A
Application number: KR1020060015489A
Authority: KR
Inventors: 정준기; 장형욱; 김성우; 김재범; 정우혁; 유지명; 허달
Original assignee: 주식회사 에이스바이오텍
Priority date: 2006-02-17
Filing date: 2006-02-17
Publication date: 2007-08-22
Also published as: KR100814941B1

Abstract

본 발명은 대장균에 의한 라이코펜의 대량 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터 및 이의 조절을 받는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제(geranylgeranyl pyrophosphate synthase; crtE), 파이토엔 탈포화효소(phytoene desaturase; crtI) 및 파이토엔 신타제(phytoene synthase; crtB)를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 배양하여 이의 배양물로부터 라이코펜을 분리하는 것을 특징으로 하는 라이코펜의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터 및 이의 조절을 받는 crtE 및 crtI를 포함하고, 또 다른 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터 및 이의 조절을 받는 crtB를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 배양하여 이의 배양물로부터 라이코펜을 분리하는 것을 특징으로 하는 라이코펜의 제조방법에 관한 것이다.

라이코펜, crtE, crtI, crtB, 대장균

Description

대장균에 의한 라이코펜의 대량 제조방법{Method for Mass-Production of Lycopene by E.coli}

도 1은 카로테노이드의 생합성 경로를 간략하게 나타낸 것이다.

도 2는 어위니아 유레도보라에서 유래된, 라이코펜 생합성에 관여하는 유전자 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제(geranylgeranyl pyrophosphate synthase; crtE), 파이토엔 탈푸화효소(phytoene desaturase; crtI) 및 파이토엔 신타제(phytoene synthase; crtB)로 이루어진 합성 오페론의 제조방법을 나타낸 것이다.

도 3은 crtE, crtI 및 crtB로 이루어진 합성 오페론을 이용하여 본 발명의 재조합 발현벡터(pTB-EIB)를 제조하는 방법을 나타낸 것이다[A: araBAD 프로모터-터미네이터 카세트와 pTB 벡터의 제조방법, B: pTB-EIB의 제조방법].

도 4는 본 발명에 따른 또 다른 재조합 발현벡터(pTB-EI4B)의 제조방법을 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 재조합 발현벡터(pTB-EIB 및 pTB-EI4B)를 저 복제수로 복제되는 발현벡터(pTB-EIBrop 및 pTB-EI4Brop)로 전환시키는 방법을 나타낸 것이다.

도 6은 라이코펜 생합성에 필요한 전구체의 증폭을 위한 공동 발현용 재조합 벡터 pATrc::idi의 제조방법을 나타낸 것이다.

도 7은 유전자의 재배열에 따른 라이코펜의 생산성 차이를 나타낸 것이다(회 색 막대: pTB-EIB 과 pATrc::idi로 공동 형질전환된 대장균, 흰색 막대: pTB-EI4B 와 pATrc::idi로 공동 형질전환된 대장균).

도 8a는 고 복제수를 갖는 재조합 발현벡터(pTB-EI4B)로 형질전환된 대장균의 아라비노스 농도에 따른 단백질의 발현 양상을, 8b는 라이코펜 생산성을 나타낸 것이다(M: 마커, 대장균 24시간 배양 후 각각 레인 1: 아라비노스 미처리, 레인 2: 아라비노스 0.01mM 처리, 레인 3: 아라비노스 0.1mM 처리, 레인 4: 아라비노스 1mM 처리, 레인 5: 아라비노스 2mM 처리, 레인 6: 아라비노스 10mM 처리한 경우의 전기영동 결과).

도 9a는 저 복제수를 갖는 재조합 발현벡터(pTB-EI4Brop)로 형질전환된 대장균의 아라비노스 농도에 따른 단백질의 발현 양상을, 9b는 라이코펜 생산성을 나타낸 것이다(M: 마커, 대장균 24시간 배양 후 각각 레인 1: 아라비노스 미처리, 레인 2: 아라비노스 0.1mM 처리, 레인 3: 아라비노스 0.5mM 처리, 레인 4: 아라비노스 1mM 처리, 레인 5: 아라비노스 5mM 처리, 레인 6: 아라비노스 10mM 처리한 경우의 전기영동 결과).

본 발명은 대장균을 이용한 라이코펜의 대량 제조방법에 관한 것으로 보다 자세하게는 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터와 이의 조절을 받는 라이코펜의 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 배양하여 이의 배양물로부터 라이코펜을 분리하는 것을 특징으로 하는 라이코펜의 제조방법에 관한 것이다.

카로테노이드(carotenoids)는 항산화 활성을 지니는 C₄₀ 이소프레노이드 화합물(isoprenoid compounds)로서, 자연계에 노란색, 오렌지색, 붉은색 계열의 색깔을 나타내는 널리 퍼져있는 색소 군(family)으로서, 녹황색 채소류의 식물이나 미생물에 의해 합성되는 것으로 알려져 있다(Goodwin et al. Plant Pigments, Academic Press, 1988, pp.61-132). 이들의 가장 중요한 기능은 항산화 작용으로 활성산소와의 상호작용을 통해서 유해 산소군에 의한 산화적 손상을 막아주는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Krinsky, Pure. Appl. Chem. 1994, vol.66, pp.1003-1010; Conn et al. Free Radic. Res. Commun. 1992, vol.16, pp.401-408), 많은 연구에서 암 예방효과(Bendich, Ann. N. Y. Acad. Sci. 1993, vol.691, pp.61-67; Gerster, Int. J. Vitam. Nutr. Res. 1993, vol.63, pp.93-121; Rice-Evans et al. Free Radic. Res. 1997, vol.26, pp.381-398), 면역반응 강화(Jyonouchi et al. Nutr. Cancer. 1991, vol.16, pp.93-105) 등에도 효과가 있는 것으로 보고가 되었다. 지금까지 700종 이상이 동정되었으며, 대부분은 생합성의 중간체로 소량 존재하며, 그러한 이유로 이들의 정제는 물론 산업적 응용을 위해 충분한 양을 추출해 내는데 많은 어려움이 있어 왔다. 카로테노이드 화합물들 중 산업적으로 관심을 끄는 것에는 베타카로텐(β-carotene: 당근의 주황색 색소), 라이코펜(Lycopene: 토마토의 붉은색 계열의 색소), 아스타잔틴(Astaxanthin: 주홍색 또는 밝은 오렌지색의 색 소) 등이 있으며, 현재 이들 카로테노이드는 식품 착색제, 영양 강화제, 사료 첨가제, 화장품 소재 등으로 사용되고 있고 최근에는 의약용으로 용도개발이 진행 중에 있다.

라이코펜은 카로테노이드 중에서도 가장 강력한 항산화 능력을 보유한 것으로 보고 되면서 비교적 최근에 각광받기 시작하였는데, 그 일례로 2002년 핀란드 쿠오피오대학의 공중보건학 교실에서 발표한 연구내용을 보면 725명의 중년층을 대상으로 실시된 임상 실험 결과 심근 질환 및 죽상 동맥경화에 탁월한 보호효과를 갖는 것으로 나타났다(Rissanen et al. Exp. Biol. Med. 2002, vol.227, pp.900-907). 또한, 독일의 루드비히 샤펜대학의 독성학교실과 다국적 화학 회사인 바스프사는 공동연구를 통해 바스프사에서 합성 기법으로 제조한'바스프 라이코펜 1-CWD 와 Lyco VitR' 제품이 천연물 유래 못지않게 안전하다는 연구결과를 발표하여 주목 받은 바 있다(Food and Chemical Toxicology, 2002, vol.40, pp.1581-1588). 다만 합성 라이코펜에 대한 사용에 있어 규제는 국가마다 달라서 2003년 11월을 기준으로 BASF사에서 제조한 라이코펜이 미국 FDA의 일반 안전물질 승인을 받은 반면, 국내와 유럽의 경우 식품 첨가물 공전 상에 오로지 천연물 유래의 라이코펜만 법적으로 허용하고 있어 아직까지는 천연물 유래의 라이코펜에 대한 수요가 지속적으로 증가되는 추세에 있다.

천연 라이코펜은 자연계에서 매우 소량으로 존재하며, 현재 상업적으로 개발된 천연 라이코펜 생산 공정은 주로 토마토를 가공하여 토마토내의 다양한 성분과 함께 출시되었다. 이와 같은 산업계의 선두 주자는 이스라엘계 미국회사인 라이코 레드(LycoRed)사로서 90년대 말부터 'Lyc-O-MatoR' 이라는 브랜드 명으로 다양한 제형의 관련 제품을 생산해내고 있다. 또한 미생물을 이용한 카로테노이드의 생산도 이루어지고 있으나 아직은 미미한 수준이며, 러시아의 JSC "Uralbiopharm" 이라는 회사가 진균류 곰팡이인 블라케슬리아 트리스포라(Blakeslea trispora)를 사용하여 발효배양을 통해서 카로테노이드를 생산하는 것으로 알려져 있으나 그 진위 여부는 확인되지 않고 있다. 하지만, 최근에 스페인의 페니실린 생산업체 안티바이오틱(Antibiotics)사의 자회사인 비타텐(Vitatene)사가 동일한 균주인 블라케슬리아 트리스포라로부터 추출한 라이코펜이 영국 식품위원회로부터 그 안정성면에서 만족스런 결과를 얻음에 따라 식품첨가물에 대한 시장유통 승인에 한 걸음 다가 설 수 있게 되었다. 그 외에도 염분호수가 많고, 건조한 사막기후 지형을 갖는 이스라엘, 호주, 미국, 칠레 등지에서 호염성 미세녹조류인 듀나리엘라 살리나(Dunaliella salina), 듀나리엘라 바르다위(D. bardawii)를 사용하여 옥외배양 시스템을 통해 생산한다고 알려져 있다.

천연 유래의 라이코펜에 대한 수요가 지속적으로 증가하므로, 카로테노이드의 생산을 늘리기 위한 방법으로서 재조합 DNA 기술을 통해 다양한 종류의 카로테노이드를 비 카로테노이드 생산성 박테리아나 효모로부터 성공적으로 생합성하는 것이 보고되었다(Missawa et al. Appl. Environ. Microbiol. 1991, vol.57, pp.1847-1849). 즉, 대장균과 같이 자연 상태에서는 카로테노이드를 생산하지 않는 박테리아에 카로테노이드 생산에 관련된 유전자들을 도입함으로써 카로테노이드의 생합성이 가능하게 되었으며(Missawa et al. J. Bacteriol. 1990, vol.172, pp.6704-6712), 또한 사카로마이세스 세르비지에(Saccharomyces cerevisiae)나 캔디다 유틸리스(Candida utilis)와 같이 식용이 가능한 효모 군에서도 어위니아(Erwinia) 유래의 유전자들을 클로닝함으로써 카로테노이드를 생산하게 되었다(Ausich et al. Patent Application PCT/US91/01458, 1991; Miura et al. Biotechnol. Bioeng. 1998, vol.58, pp.306-308; Yamano et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994, vol.58. pp.1112-1114). 형질 전환된 균주들은 대사공학적인 방법을 통하여 대량생산을 위한 균주 개량작업이 이루어졌으며, 일례로 도 1에서 카로테노이드의 생합성에 공통적으로 요구되는 대사전구체(metabolic precursor)인 이소펜티닐 파이로포스페이트(Isopentenyl pyrophosphate, IPP)의 합성을 증가시키는 대장균 균주를 개발함으로써 증가된 전구체를 통하여 보다 많은 카로테노이드를 생산하는 균주를 확보할 수 있었다(Kim et al. Biotechnol. Bioeng. 2001, vol.72, pp,408-415; Matthews et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000, vol.53, pp.396-400). 그러나 이러한 연구들이 단위 세포당 카로테노이드를 많이 생산하도록 하는 균주개발에 초점이 맞추어진 바, 실제 산업화를 위한 균주로 사용하기에는 개선해야 될 문제들이 있는 것으로 확인되었다. 일례로 이들 연구에서 사용된 벡터시스템은 유도 발현(inducible expression) 프로모터를 통한 카로테노이드의 생산이 아닌 어위니아 균주로부터 관련 유전자 클러스터를 그대로 대장균 발현벡터에 삽입한 형태로서, 카로테노이드가 항시 발현(constitutive expression)의 양상을 띠며 생산되기 때문에 카로테노이드의 대량생산을 위한 시스템으로서는 부적합하다.

이에, 본 발명자들은 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균에서 라이코펜의 대량생산에 적합하도록 유도 발현성 합성 오페론의 제조와 유전자의 재배열을 통하여 라이코펜 생산에 보다 효율적인 벡터 시스템을 제조하였으며, 이렇게 제조된 벡터 시스템은 기존에 보고된 라이코펜 생산 대장균 균주들보다 더 효율적으로 라이코펜을 생산하였음을 확인하였고 또한, 본 발명에 따라 개발된 벡터가 유도 인자에 의해서 안정적으로 라이코펜을 생산하였음을 확인함으로써, 고농도 배양을 위한 근간을 마련하였음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 한 관점으로서, 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터 및 이의 조절을 받는 crtE, crtI 및 crtB를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

다른 관점으로서, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 상기 대장균을 배양하는 단계 및 이의 배양물로부터 라이코펜을 분리 정제하는 단계를 포함한 라이코펜의 제조방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터 및 이의 조절을 받는 crtE 및 crtI를 포함하고, 또 다른 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터 및 이의 조절을 받는 crtB를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 상기 대장균을 배양하는 단계 및 이의 배양물로부터 라 이코펜을 분리 정제하는 단계를 포함한 라이코펜의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 라이코펜의 생합성에 관여하는 유전자들이 모두 하나의 동일한 프로모터에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 이용한 라이코펜의 제조방법에 관한 것이다. 이하, 이들을 구체적으로 설명한다.

본 발명의 한 관점은 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터 및 이의 조절을 받는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제(geranylgeranyl pyrophosphate synthase; crtE), 파이토엔 탈포화효소(phytoene desaturase; crtI) 및 파이토엔 신타제(phytoene synthase; crtB)를 포함하는 재조합 발현벡터에 관한 것이다.

상기 재조합 발현벡터에서 유전자 crtE, crtI 및 crtB는 모두 동일한 하나의 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터에 의해 조절되는 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 유전자들은 하나의 전사체(transcript)로서 전사되게 된다. 상기 재조합 발현벡터는 crtE, crtI 및 crtB의 전사가 종료되도록 하는 터미네이터(terminator) 뿐만 아니라 대장균 내에서 복제되어야 하므로 대장균의 복제 기원(origin)을 구비하는 것이 적합하다.

또한, 상기 재조합 발현벡터에서 각 유전자의 개시코돈의 업스트림에는 SD 시퀀스(Shine-Dalgarno sequence, AAGGAGG)를 삽입함으로써 유전자의 해독(translation) 과정이 효율적으로 진행되도록 하는 것이 적합하다. SD 시퀀스와 개시코돈 사이의 스페이스에는 임의의 개수의 임의의 뉴클레오타이드를 위치시킬 수 있다.

상기 재조합 발현벡터에서 "대장균에서 기능하는 유도성 프로모터"는 대장균에서 프로모터로서의 기능(즉, 전사의 개시)을 발휘하되, 유도 인자(inducer)에 의해 그의 활성이 제어되는 유도성(inducible) 프로모터를 의미하는 것으로서, 예를 들면 pL 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, araBAD 프로모터 및 T7 프로모터 등이 있다. 본 발명에서는 araBAD 프로모터를 이용하는 것이 바람직하며, 이 경우에는 araBAD 프로모터와 동일 벡터 상에 AraC 단백질을 코딩하는 유전자를 포함시키는 것이 적합하다.

전술한 대장균에서 기능하는 프로모터의 조절을 받는 유전자 "crtE"는 라이코펜 생합성 경로 중에서 파르네실 디포스페이트(Farnesyl diphosphate)를 게라닐게라닐 디포스페이트(Geranylgeranyl diphosphate)로 전환하는데 관여하는 효소이며, "crtB"는 상기 게라닐게라닐 디포스페이트를 파이토엔(phytoene)으로 전환하는데 관여하는 효소이고, "crtI"는 상기 파이토엔을 라이코펜(lycopene)으로 전환하는데 관여하는 효소이다(도 1 참조). 이와 관련하여 라이코펜을 생합성과 관련된 오페론에는 전술된 세 개 유전자 이외의 유전자도 있지만, 이들은 라이코펜을 기질로 하여 베타카로텐 또는 아스타잔틴 같은 다른 카로테노이드를 형성하기 때문에 라이코펜 생합성하기 위한 본 발명의 재조합 발현벡터는 crtE, crtB 및 crtI를 포함하는 것이 바람직하다.

유전자 crtE, crtB 및 crtI는 특히 라이코펜을 생산하는 미생물 또는 식물 내에 존재하기 때문에 그러한 생물체의 게놈 DNA를 주형으로 하고 해당 유전자 별 로 그 유전자의 양 말단에 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머를 이용해서 PCR을 수행함으로써 수득할 수 있다. 물론, 각 유전자별로 공지된 서열을 기반으로 하여 DNA 합성기 등을 이용하여 화학적으로 합성할 수도 있다. 본 발명에서 유전자 crtE, crtB 및 crtI는 어위니아(Erwinia) 속에서 유래된 것이 바람직하며, 어위니아 유레도보라(Erwinia uredovora) 종으로부터 유래된 것이 보다 바람직하다.

본 발명은 재조합 발현벡터의 한 양태로서 araBAD 프로모터와 이의 조절을 받는 어위니아 우레도보라로부터 유래된 crtE, crtI 및 crtB를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터(pTB-EIB)를 제공한다.

한편, 본 발명의 재조합 발현벡터는 저 복제수(low copy number)로 복제될 때 유도 인자에 의해 유전자 crtE, crtI 및 crtB가 효율적으로 발현되어 라이코펜이 대량 생산되기 때문에, 저 복제수로 복제되도록 조작하는 것이 바람직하다. 이를 위하여 상기 재조합 발현벡터는 저 복제수로 복제되도록 하는 유전자를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 프라이머의 리프레서(repressor of primer, rop)를 이용할 수 있는데, 상기 유전자는 pBR322를 주형으로 한 PCR을 통하여 수득할 수 있다.

본 발명은 재조합 발현벡터의 다른 양태로서 araBAD 프로모터와 이의 조절을 받는 어위니아 우레도보라로부터 유래된 crtE, crtI 및 crtB를 포함하되, 저 복제수로 복제되도록 하는 rop를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터(pTB-EIBrop)를 제공한다.

본 발명의 다른 관점은 전술된 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균에 관한 것이다. 대장균 균주로는 XL1-Blue, Top10, BL21(DE3), DH5α 및 DH10B 등이 이용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 DH5α를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 대장균 균주를 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환시키기 위해서는 먼저 세포막을 수용성(competent)으로 만들어야 한다. 이러한 방법은 대장균 세포를 염화칼슘(CaCl₂) 용액 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 염화마그네슘(MgCl₂)의 혼합 용액에 노출시키는 것을 포함한다. 이러한 화합물들은 DNA와 복합체를 형성하여 세포내로 DNA의 유입을 용이하게 해준다. 또한 대장균 세포막은 전기천공에 의해서도 수용성이 될 수 있는데, 상기 전기 전류는 DNA가 세포내로 유입되도록 세포막을 파열시키는 역할을 한다.

본 발명에 따른 대장균은 라이코펜의 대사 전구체를 생산하는데 관여하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 추가로 형질전환되는 것이 바람직하다. 도 1에 나타낸 바와 같이 라이코펜의 대사 전구체는 다양하기 때문에 상기 재조합 발현벡터는 이들 중 임의의 전구체를 생산하는데 관여하여 궁극적으로는 라이코펜의 생산량을 증가시킬 수 있는 임의의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터라면 충분하다. 본 발명에서는 이소펜티닐 디포스페이트 이소머라제(isophentenyl diphosphate isomerase, idi) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 공동 형질전환시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 관점은 상기 대장균을 배양하는 단계와 이의 배양물로부터 라이코펜을 분리하는 단계를 포함하는 라이코펜의 제조방법에 관한 것이다.

상기 배양 단계는 당업계에 공지된 대장균 배양 방법에 따라 진행될 수 있다. 본 발명에서는 한 양태로 영양배지 2X YT를 이용하여 약 37℃에서 약 24시간 동안 약하게 진탕하면서 배양물의 흡광도(O.D₆₀₀)가 0.4 내지 1.0에 도달할 때까지 지속한다. 이후의 배양 방법은 재조합 발현벡터의 복제수에 따라 달라진다.

즉, 본 발명에서는 재조합 발현벡터가 높은 복제수로 복제되는 경우에는 유도인자를 사용하지 않는 것이 바람직하데 반하여 재조합 발현벡터가 낮은 복제수로 복제되는 경우에는 유도 인자를 사용하는 것이 바람직하다. 왜냐하면 재조합 발현벡터가 높은 복제수로 복제되는 경우에는 유도 인자에 의해 해당 유전자가 과도하게 발현되어 이들이 응집체(inclusion body)를 형성함으로써 라이코펜 생합성이 효율적으로 이루어지지 않는데 반하여 재조합 발현벡터가 낮은 복제수로 복제되는 경우에는 유도 인자에 의해 해당 유전자가 적정량 발현됨으로써 라이코펜 생합성이 효율적으로 이루어지기 때문이다. 이에 따라 본 발명에서 전자의 경우에는 어떠한 조치도 취하지 않고 전술된 배양 방법을 유지하지만, 후자의 경우에는 배양물의 O.D₆₀₀이 0.4 내지 1.0에 도달하였을 때 유도 인자를 배양액 중 최종 농도가 약 1mM이 되도록 첨가하는 것이 적합할 것이다. 유도 인자를 첨가하는 시점과 농도는 유도 인자의 종류에 따라 달라질 수 있다.

이러한 배양 과정을 통하여 얻은 배양물로부터 라이코펜을 분리 및 정제하기 위하여 대장균 균체만을 분리한 후 여기에 유기용매를 처리하고 섞어준 다음 유기용매층만을 분리하는 과정을 통하여 라이코펜이 대장균 균체로부터 유기용매로 용 출되도록 한다. 이와 같이 라이코펜을 용출하기 위한 유기 용매로는 메탄올, 아세톤, 헥산 등을 사용할 수 있는데, 아세톤을 이용하는 것이 보다 바람직하다.

한편, 본 발명은 라이코펜의 생합성에 관여하는 유전자들 중 일부는 동일한 프로모터에 의해 조절되게 하고, 다른 유전자들은 별도의 프로모터에 의해 조절되게 한 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 이용한 라이코펜의 제조방법에 관한 것이다. 이하, 이들을 구체적으로 설명한다.

본 발명의 또 다른 관점은 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터 및 이의 조절을 받는 crtE 및 crtI를 포함하고, 또 다른 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터 및 이의 조절을 받는 crtB를 포함하는 재조합 발현벡터에 관한 것이다.

상기 재조합 발현벡터에서는 crtE와 crtI가 하나의 동일한 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터의 조절을 받는데 반하여 crtB는 상기 프로모터와는 다른 별도의 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터의 조절을 받게 된다. 따라서, crtE와 crtI는 하나의 전사체로서 전사되는데 반하여 crtB는 별도의 전사체로서 전사되게 된다. 상기 재조합 발현벡터도 crtE와 crtI의 전사가 종료되도록 하는 터미네이터와 crtB의 전사가 종료되도록 하는 터미네이터 뿐만 아니라 대장균 내에서 복제되어야 하므로 대장균의 복제 기원을 구비하는 것이 적합하다.

상기 재조합 발현벡터에서도 각 유전자의 개시코돈의 업스트림에는 SD 시퀀스(AAGGAGG)를 삽입함으로써 유전자의 해독 과정이 효율적으로 진행되도록 하는 것 이 적합하다. SD 시퀀스와 개시코돈 사이의 스페이스에는 임의의 개수의 임의의 뉴클레오타이드를 배열할 수 있다.

상기 재조합 발현벡터에서 "대장균에서 기능하는 유도성 프로모터"는 대장균 내에서 프로모터로서의 기능을 발휘하되, 유도 인자에 의해 그의 활성이 제어되는 프로모터를 의미하는 것으로서, 예를 들면 pL 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, araBAD 프로모터 및 T7 프로모터 등이 있다. 본 발명에서는 araBAD 프로모터를 이용하는 것이 바람직하며, 이 경우에는 araBAD 프로모터와 동일 벡터 상에 AraC 단백질을 코딩하는 유전자를 포함시키는 것이 적합하다.

대장균에서 기능하는 프로모터의 조절을 받는 유전자 "crtE"는 라이코펜 생합성 경로 중에서 파르네실 디포스페이트(Farnesyl diphosphate)를 게라닐게라닐 디포스페이트(Geranylgeranyl diphosphate)로 전환하는데 관여하는 효소이며, "crtB"는 상기 게라닐게라닐 디포스페이트를 파이토엔(phytoene)으로 전환하는데 관여하는 효소이고, 또 다른 대장균에서 기능하는 프로모터의 조절을 받는 유전자 "crtI"는 상기 파이토엔을 라이코펜(lycopene)으로 전환하는데 관여하는 효소이다(도 1 참조). 이와 관련하여 라이코펜을 생합성과 관련된 오페론에는 전술된 세 개 유전자 이외의 유전자도 있지만, 이들은 라이코펜을 기질로 하여 베타카로텐 또는 아스타잔틴 같은 다른 카로테노이드를 형성하기 때문에 라이코펜 생합성하기 위한 본 발명의 재조합 발현벡터는 crtE, crtB 및 crtI를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명은 재조합 발현 벡터의 한 양태로서 araBAD 프로모터와 이의 조절을 받는 어위니아 유레도보라로부터 유래된 crtE 및 crtI를 포함하고, 별도의 araBAD 프로모터와 이의 조절을 받는 crtB를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터(pTB-EI4B)를 제공한다.

한편, 본 발명의 재조합 발현벡터는 저 복제수로 복제될 때 유도 인자에 의해 유전자 crtE, crtI 및 crtB 가 효율적으로 발현되어 라이코펜이 대량 생산되기 때문에, 본 발명의 재조합 발현벡터는 저 복제수로 복제되도록 조작하는 것이 바람직하다. 이를 위하여 재조합 발현벡터가 저 복제수로 복제되도록 하는 유전자를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 rop를 이용할 수 있는데, 상기 유전자는 pBR322를 주형으로 한 PCR을 통하여 수득할 수 있다.

본 발명은 재조합 발현벡터의 다른 양태로서 araBAD 프로모터와 이의 조절을 받는 어위니아 유레도보라로부터 유래된 crtE 및 crtI를 포함하고, 별도의 araBAD 프로모터와 이의 조절을 받는 crtB를 포함하되, 저 복제수로 복제되도록 하는 rop를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터(pTB-EI4Brop)를 제공한다.

본 발명은 대장균의 한 양태로서 본 발명의 재조합 발현벡터pTB-EI4B로 형질전환되어 2005년 12월 29일자 한국유전자은행(Korean Collection for Type Culture, 대전 유성구 어은동 52번지 한국생명공학원내 소재)에 수탁되어 수탁번호 KCTC10885BP를 부여받은 대장균을 제공한다.

본 발명은 대장균의 다른 양태로서 본 발명의 재조합 발현벡터 pTB-EI4Brop로 형질전환되어 2005년 12월 29일자 한국유전자은행(KCTC)에 수탁되어 수탁번호 KCTC10886BP를 부여받은 대장균을 제공한다.

한편, 본 발명에 따른 대장균은 라이코펜의 대사 전구체를 생산하는데 관여하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 추가로 형질전환되는 것이 바람직하다. 도 1에 나타낸 바와 같이 라이코펜의 대사 전구체는 다양하기 때문에 상기 재조합 발현벡터는 이들 중 임의의 전구체를 생산하는데 관여하여 궁극적으로는 라이코펜의 생산량을 증가시킬 수 있는 임의의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터라면 충분하다. 본 발명에서는 이소펜티닐 디포스페이트 이소머라제(isophentenyl diphosphate isomerase, idi) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 공동 형질전환시키는 것이 바람직하다.

상기 배양 단계는 당업계에 공지된 대장균 배양 방법에 따라 진행될 수 있다. 본 발명에서는 한 양태로 영양배지 2xYT를 이용하여 약 37℃에서 약 24시간 동안 약하게 진탕하면서 배양물의 흡광도(O.D₆₀₀)가 0.4 내지 1.0에 도달할 때까지 지속한다. 이후의 배양 방법은 재조합 발현벡터의 복제수에 따라 달라진다.

즉, 본 발명에서는 재조합 발현벡터가 높은 복제수로 복제되는 경우에는 유도인자를 사용하지 않는 것이 바람직하데 반하여 재조합 발현벡터가 낮은 복제수로 복제되는 경우에는 유도 인자를 사용하는 것이 바람직하다. 왜냐하면 재조합 발현벡터가 높은 복제수로 복제되는 경우에는 유도 인자에 의해 해당 유전자가 과도하게 발현되어 이들이 응집체를 형성함으로써 라이코펜 생합성이 효율적으로 이루어지지 않는데 반하여 재조합 발현벡터가 낮은 복제수로 복제되는 경우에는 유도 인자에 의해 해당 유전자가 적정량 발현됨으로써 라이코펜 생합성이 효율적으로 이루어지기 때문이다. 이에 따라 본 발명에서 전자의 경우에는 어떠한 조치도 취하지 않고 전술된 배양 방법을 유지하지만, 후자의 경우에는 배양물의 O.D₆₀₀이 0.4 내지 1.0에 도달하였을 때 유도 인자를 배양액 중 최종 농도가 약 1mM이 되도록 첨가하는 것이 적합할 것이다. 유도 인자를 첨가하는 시점과 농도는 유도 인자의 종류에 따라 달라질 수 있다.

이러한 배양 과정을 통하여 얻은 배양물로부터 라이코펜을 분리하기 위하여 대장균 균체만을 분리한 후 여기에 유기용매를 처리하고 섞어준 다음 유기용매층만을 분리하는 과정을 통하여 라이코펜이 대장균 균체로부터 유기용매로 용출되도록 한다. 이와 같이 라이코펜을 용출하기 위한 유기용매로는 메탄올, 아세톤, 헥산 등을 이용할 수 있는데, 아세톤을 이용하는 것이 보다 바람직하다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 합성 오페론의 제조

합성 오페론의 구성 요소인 라이코펜 생합성 유전자 crtE, crtI, crtB를 어위니아 유레도보라(ATCC(R) 19321)로부터 NCBI의 염기서열 정보를 이용하여 PCR을 통하여 확보하였다. PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다.

주형: 어위니아 유레도보라 생산물: crtE(SD)

포워드: AGCATATGACGGTCTGCGCAAA (Nde I) --- 서열번호: 1

리버스: ATTGTAATCCTCCTTATTAACTGACGGCAG --- 서열번호: 2

주형: 어위니아 유레도보라 생산물: crtI(SD)

포워드: TAAGGAGGATTACAATATGAAACCAACTACGGTA --- 서열번호: 3

리버스: GAAGCTT GAATTCCTCCTTATCATATCAGATCCTCCAGTA (Hind III, EcoR I)

--- 서열번호: 4

주형: 어위니아 유레도보라 생산물: crtB

포워드: CAGAATTCAATATGAATAATCCGTCGTTAC (EcoR I) --- 서열번호: 5

리버스: AGGAATTC AAGCTTCTAGAGCGGGCGCTGCCAG (EcoR I, Hind III)

--- 서열번호: 6

PCR은 TaKaRa에서 판매하는 Ex Taq^TM(PR001)을 사용하였으며, 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 주형DNA를 전변성화 시킨 후, 94℃에서 45초, 55℃에서 45초, 72℃에서 1분을 한 싸이클(cycle)로 30회 반복 수행한 다음 마지막에 72℃에서 10 분간 반응시켜 수행하였다(이하, 기술되는 모든 PCR은 특별한 언급이 없는한 상기의 조건을 따른 것으로 한다). PCR이 종료된 다음 각각의 PCR 산물은 1% 아가로스 젤 상에서 분리 후 목적 DNA 절편만을 취하였다. 회수된 목적 DNA 절편은 젤 정제 키트(gel purification kit, Bioneer, K-3035, Korea)를 이용하여 젤로부터 목적 DNA만을 회수하였다.

회수된 PCR 산물 crtE(SD)와 crtI(SD)를 주형으로 하여 SOE(Splicing Overlapping Extension) PCR을 수행함으로써 crtEI를 확보하였다. 이때 사용된 프라이머는 다음과 같다.

주형: crtE(SD) 와 crtI(SD) 생산물: crtEI

포워드: AGCATATGACGGTCTGCGCA (Nde I) --- 서열번호: 7

리버스: GAAGCTT GAATTCCTCCTTATCATATCAGATCCTCCAGTA (Hind III, EcoR I)

--- 서열번호: 8

반응 조건은 94℃에서 5분 동안 주형DNA를 전변성화 시킨 후, 94℃에서 45초, 50℃에서 45초, 72℃에서 1분30초를 한 싸이클로 10회 반복 수행한 다음 다시 94℃에서 45초, 58℃에서 45초, 72℃에서 1분30초를 한 싸이클로 20회 반복 수행 한 후 마지막에 72℃에서 10분간 반응시켜 종료하였다. 종결된 PCR 산물은 1% 아가로스 젤 상에서 크기에 따라 분리되었고 이후 목적 DNA만을 취하고 젤 정제 키트 를 사용하여 젤로부터 목적 DNA만을 순수 분리하였다.

이상과 같이 회수된 crtEI 및 crtB는 T-GEM 벡터(Promega, A3600, USA)에 삽입시켜 각각 T-crtEI 및 T-crtB로 명명하였다. 이들은 (주)제노텍에서 염기서열 분석을 의뢰하여 염기서열을 확인하였다(이하, PCR을 통해 T-GEM vector에 삽입된 벡터는 특별한 언급이 없는 한 염기서열 분석이 끝난 것으로 간주한다).

crtI유전자는 유전자 염기 서열 내부에 Nde I 부위를 가지고 있기 때문에 향후 Nde I 제한 효소 처리 시 crtI 내부가 잘리는 문제가 발생하기 때문에 crtI의 단백질 서열은 유지하면서 DNA triplet 코돈상의 가변적인 염기 하나만을 바꿈으로써 Nde I 부위를 제거하였다. 이때 위치 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis) PCR 방법을 수행하였다.

주형: T-crtEI 생산물: T-crtEI*

포워드: CCAGAGTCAGCCTTATGGAAACGACA (ΔNde I) --- 서열번호: 9

리버스: TGTCGTTTCCATAAGGCTGACTCTGG (ΔNde I) --- 서열번호: 10

반응 조건은 94℃ 5분 동안 전변성, 이후 94℃ 45초, 55℃ 45초, 68℃ 6분을 하나의 싸이클로 18회 반복 수행하였다(이후 특별한 언급이 없는 한 위치 지정 돌연변이는 상기의 조건에서 수행하였다). 이때 사용된 폴리머레이즈는 Turbo pfu^TM(Stratagene, #600252-52, USA)을 사용하였다. PCR 반응 혼합액에 10 unit 의 Dpn I을 37℃에서 1시간 처리하여 메틸화된 DNA를 제거한 후 DH5α에 형질전환시켜 엠피실린(100ug/ml)이 함유된 LB(Luria-Bertani) 배지에 도말하였다. 형성된 여러 콜로니를 동일한 액상 배지에서 배양한 후 플라스미드를 취하여 Nde I 처리를 함으로써 Nde I 부위가 제거된 목적 플라스미드, T-crtEI*를 확보하였다.

이후 T-crtEI* 및 T-crtB를 각각 EcoR I 과 Hind III로 제한효소 처리를 한 후 1% 아가로스 젤 상에서 분리를 하되 전자는 벡터 부분(약 5.45 kb)을 후자는 crtB 유전자 부분(0.95 kb)을 취하여 젤 정제 키트를 사용해서 목적 DNA만을 회수하였다. 회수된 목적 DNA를 이용하여 TaKaRa Ligation kit ver. 2(#6022)를 이용하여 16℃에서 2시간 동안 라이게이션(ligation)반응을 수행하였다. 반응 후 상기 라이게이션 혼합액(ligation mixture)을 대장균 DH5α에 형질전환시키고 선별배지로 엠피실린(100ug/ml)이 함유된 LB(Luria-Bertani) 배지(이하, 특별한 언급이 없는 한 상기의 배지를 의미함)에 도말하여 형성된 콜로니로부터 합성오페론 pT-EIB를 확보하였다(도 2 참조).

이후 T-crtEI* 및 T-crtB를 각각 EcoR I 과 Hind III로 제한효소 처리를 한 후 1% 아가로스 젤 상에서 분리를 하되 전자는 벡터 부분(약 5.45 kb)을 후자는 crtB 유전자 부분(0.95 kb)을 취하여 젤 정제 키트를 사용하여 목적 DNA만을 회수 하였다. 회수된 목적 DNA를 이용하여 TaKaRa Ligation kit ver. 2(#6022)를 이용하여 16℃에서 2시간 동안 라이게이션(ligation)반응을 수행하였다. 반응 후 상기 라이게이션 혼합액(ligation mixture)을 대장균 DH5α에 형질전환 시키고 선별배지로 엠피실린(100ug/ml)이 함유된 LB(Luria-Bertani) 배지(이하, 특별한 언급이 없는 한 상기의 배지를 의미함)에 도말하여 형성된 콜로니로부터 합성오페론 pT-EIB를 확보하였다(도 2 참조).

<실시예 2> 라이코펜 발현 벡터 pTB-EIB의 제조

상기 실시예에서 제조한 합성 오페론을 대장균에서 유도 발현시키기 위하여 araBAD 프로모터-터미네이터 카세트를 제작하여 이를 pTB로 명명하였다. pTB의 제조과정은 다음과 같다.

Invitrogen사에서 시판하고 있는 벡터 pBAD/His C를 주형으로 하여 위치 지정 돌연변이 및 SOE-PCR을 수행하였다(도 3의 A 참조). 우선 pBAD/His C의 MCS부위의 Nde I 부위를 없애기 위하여 위치 지정 돌연변이 PCR을 수행하였다. 이때 사용된 프라이머는 다음과 같다.

주형: pBAD/His C 생산물: pBAD/His C*

포워드: GCAGCTGGTACCTTATGGGAATTCGA (ΔNde I) --- 서열번호: 11

리버스: TCGAATTCCCATAAGGTACCAGCTGC (ΔNde I) --- 서열번호: 12

반응 조건은 앞서 언급한 위치 지정 돌연변이 PCR 프로토콜을 사용했으며, 다만 68℃에서의 연장(extension) 시간은 5분으로 변경하였다. 실시예 1에서의 위치 지정 돌연변이 PCR 방법과 동일한 방법으로 Nde I이 제거된 pBAD/His C*를 확보하였다.

다음으로 pBAD/His C*를 주형으로 하여 SOE-PCR을 수행하여 불필요한 부분은 제거하였다. 먼저 제거하고자 하는 부위를 기준으로 앞, 뒤로 각각의 PCR을 수행하여 두 개의 PCR 산물을 얻은 후 이들을 이용하여 SOE-PCR을 수행하였다. 이때, 새로이 Nde I 부위를 BAD 프로모터의 RBS(ribosome binding site) 부위로부터 8 베이스 떨어진 곳에 위치하도록 프라이머를 제작하였다.

주형: pBAD/His C* 생산물: araBAD

포워드: CAATCTAGATAATTATGACAACTTGA (Xba I) --- 서열번호: 13

리버스: GATCTCGAGATCGATCATATGTAATTCCTCC (Nde I) --- 서열번호: 14

주형: pBAD/His C* 생산물: 터미네이터

포워드: CAGGAGGAATTACATATG ATCGAT CTCGAGATCTGCAGC (Nde I, Cla I, Xho I, Pst I) --- 서열번호: 15

리버스: GAGAGCTCCAGATAAAACGAA (Sac I) --- 서열번호: 16

각각의 PCR 산물은 1% 아가로스 젤 상에서 분리하여 그 크기가 각각 1.2 kb 와 0.7 kb로 확인 되었으며, 이들은 젤 정제 키트를 이용하여 순수 정제되었다. 이들 DNA는 SOE-PCR을 위한 주형으로 사용되었다.

주형: araBAD, 터미네이터 생산물: araBAD 카세트

포워드: CAATCTAGATAATTATGACAACTTGA (Xba I) --- 서열번호: 17

리버스: GAGAGCTCCAGATAAAACGAA (Sac I) --- 서열번호: 18

SOE-PCR을 사용하여 얻은 PCR산물은 1% 아가로스 젤 상에서 그 크기에 따라 분리되었으며, 약 1.9 kb를 갖는 산물을 젤로부터 절취하여 젤 정제 키트를 사용하여 순수 정제 후 T-GEM 벡터에 삽입시켜 pTB 벡터를 완성하였다.

pTB 벡터는 araBAD 프로모터-터미네이터 카세트 내에 인위적으로 삽입시킨 Nde I 부위 외에도 T-GEM vector 고유의 Nde I 부위를 가지고 있기 때문에 T-GEM vector의 Nde I 부위를 제거하였다. Nde I 부위의 제거는 위치 지정 돌연변이 방법을 사용하였으며, 사용된 프라이머는 다음과 같다.

주형: pTB 생산물: pTB*

포워드: CCTGCAGGTCGACAATATGGGAGAGCTC (ΔNde I) --- 서열번호: 19

리버스: GAGCTCTCCCATATTGTCGACCTGCAGG (ΔNde I) --- 서열번호: 20

이 반응의 연장(extension) 시간은 5분으로 실시하였다. 이하 절차는 상기의 실시예와 동일하며, 적절한 선별방법에 따라 pTB*를 확보하였다.

라이코펜 생합성 벡터 pTB-EIB는 상기의 pTB* 와 실시예 1의 pT-EIB를 토대로 제조되었다. pTB*는 Nde I 과 Hind III를 처리하여 1% 아가로스 젤에서 전기영동 결과 약 5 kb 정도의 벡터로 사용될 목적 DNA를 분리하였고, pT-EIB는 Nde I 과 Hind III 및 Pvu I을 처리하여 3.4 kb 정도의 EIB절편을 확보하였다. 이들 절편들은 젤로부터 순수 분리되어 라이게이션 반응에 이용되었다. 라이게이션 반응은 상기 실시예 1에서 언급한 것과 동일하게 실시되었으나 반응시간은 12시간 이상 진행한 후 형질전환에 이용되었다. 형질전환을 통해 선별배지에서 생성된 콜로니 중 핑크빛을 나타내는 콜로니들이 라이코펜 생합성 벡터를 지닌 형질전환 균주로 확인되었다(도 3B 참조).

<실시예 3> 2개의 araBAD 발현 시스템을 가지는 pTB-EI4B의 제조

2개의 araBAD 발현시스템을 가지는 pTB-EI4B는 pTB* 와 T-crtEI*로부터 제작되었다. 우선 pTB* 와 T-crtEI* 모두 Nde I 과 Hind III로 처리한 후 1% 아가로스 젤 전기영동을 실시하여 전자는 5 kb 가량의 벡터부분을 후자는 2.45 kb 가량의 EI 절편을 취하였다. 젤 정제 키트를 사용하여 순수 정제 후 라이게이션 및 형질전환을 시도하였다. 선별배지에서 자란 콜로니를 대상으로 플라스미드를 회수하여 제한 효소 처리 후 pTB-EI를 확보하였다(도 4 참조).

또 다른 araBAD 프로모터-터미네이터 카세트를 제작하기 위하여 PCR을 수행하였으며, 이렇게 얻어진 벡터를 pTB4로 명명하였다. 다음은 pTB4를 제작하는 과정이다.

주형: pTB 생산물: pTB4

포워드: CAGTCGACAAGAAACCAATTGTCCATATT (Sal I) --- 서열번호: 21

리버스: CACTCGAGCAGCTAAAACGAA (Xho I) --- 서열번호: 22

얻어진 PCR 산물은 T-GEM 벡터에 삽입되어 pTB4가 확보되었다. 이후로 상기의 실시예 2에서와 마찬가지로 T-GEM 벡터 고유의 Nde I 부위를 제거하기 위해 위치 지정 돌연변이를 통하여 동일한 방법으로 Nde I 부위를 제거하여 pTB4*를 얻었다.

상기 pTB4*에 삽입될 crtB 유전자의 말단이 Nde I, Hind III를 갖도록 PCR을 수행하였다.

주형: 어위니아 유레도보라 생산물: crtB(NH)

포워드: CACATATGAATAATCCGTCGTTAC (Nde I) --- 서열번호: 23

리버스: AGGAATTC AAGCTTCTAGAGCGGGCGCTGCCAGA (EcoR I, Hind III)

--- 서열번호: 24

PCR을 통해 얻은 산물, crtB(NH)는 T-GEM 벡터에 삽입되어 T-crtB(NH)라 명명되었다.

pTB4* 와 T-crtB(NH) 모두 Nde I 과 Hind III 처리하여 1% 아가로스 젤에 전기영동 한 결과 전자는 약 3.8 kb 정도의 벡터부분을 회수하였고, 후자는 약 0.95 kb 정도의 crtB 절편을 회수하였다. 회수된 젤로부터 목적 DNA를 각각 순수 정제한 후 라이게이션 반응 및 형질전환을 통해서 선별배지로부터 콜로니를 확인하였으며, 이들로부터 pTB4B를 확보하였다.

상기에서 확보된 pTB-EI와 pTB4B를 가지고 목적 벡터 pTB-EI4B를 제조하였다. pTB-EI를 Sal I으로 처리한 후 벡터로 사용하기 위하여 SAPPing(Shrimp Alkaline Phosphotase, Roche, Swiss) 처리를 통하여 탈인산화(dephosphorylatio) 반응을 수행하였다. 또한, pTB4B는 Sal I 과 Xho I으로 처리하여 crtB를 포함하는 araBAD 카세트, 약 1.8 kb 크기의 DNA를 아가로스 젤로부터 회수하였다. 회수된 DNA는 젤 정제 키트를 사용하여 순수 정제를 하였고, 탈인산화된 pTB-EI 와 crtB를 포함하는 araBAD 카세트는 라이게이션 반응 및 형질전환을 통하여 선별배지에서 콜로니를 형성하였다. 이후 플라스미드 회수 및 제한효소 절단실험을 통하여 pTB-EI4B를 확보하였다.

<실시예 4> pTB-EIB 및 pTB-EI4B의 저 복제수 벡터로의 전환

실시예 2와 3을 통해 확보된 재조합 벡터 pTB-EIB 와 pTB-EI4B를 저 복제수 벡터로 전환하기 위해 pBR322 벡터의 rop 유전자가 이용되었다(도 5 참조). 우선 rop 유전자를 pBR322로부터 클로닝하기 위하여 PCR을 수행하였다.

주형: pBR322 생산물: rop

포워드: CAACTAGTACACGGAGGCATCAGTGAC (Spe I) --- 서열번호: 25

리버스: GGACTAGTATGTGTCAGAGGTTTTCA (Spe I) --- 서열번호: 26

PCR을 통하여 얻은 산물 rop 은 T-GEM 벡터에 삽입 후 Spe I 으로 절단하여 1% 아가로스 젤 상에서 크기별로 분리 후 목적 젤 정제 키트를 사용하여 목적 DNA를 회수하였다. 또한, pTB-EIB 및 pTB-EI4B 벡터 역시 Spe I으로 처리하여 1% 아가로스 젤로부터 젤 정제 키트를 사용하여 벡터로 사용될 DNA 부분을 회수하였고, 이들은 상기의 실시예 3에서와 마찬가지로 탈 인산화반응을 취한 후 앞서 정제한 rop 유전자와 라이게이션 및 형질전환을 수행하여 목적 플라스미드 pTB-EIBrop 및 pTB-EI4Brop을 제조하였다.

<실시예 5> 라이코펜 생합성에 필요한 전구체 증강 발현벡터의 제조

본 발명에 사용된 이소펜티닐 디포스페이트 아이소머레이즈(isopentenyl diphosphate isomerase, idi) 유전자는 대장균 K-12균주인 W3110으로부터 PCR을 통해서 클로닝 하였다.

주형: W3110 생산물: idi

포워드: GAACATATGCAAACGGAACACGTCA (Nde I) --- 서열번호: 27

리버스: GATCGATCAGCTTGCGAGACGCATC (Cla I) --- 서열번호: 28

얻어진 PCR 산물은 1% 아가로스 젤로부터 분리 후 젤 정제 키트를 사용하여 순수 분리하였으며, T-GEM 벡터에 삽입하였다.

또한 발현벡터로는 플라스미드 양립성을 고려하여 pACYC177(New England Biolabs, ER2420)을 주형으로 사용하였다. 여기에 사용된 발현 시스템은 Trc 프로모터-터미네이터 카세트로 이는 pTrc99A(Pharmacia, 27-5007)로부터 PCR을 통하여 확보하였으며 발현벡터의 제조에 관한 자세한 내용은 다음과 같다. (도 6 참조).

우선 Trc99A로부터 발현시스템을 클로닝하기 위해서 PCR을 수행하였다.

주형: pTrc99A 생산물: Trc 카세트

포워드: CAAGGATCCGACTGCACGGTGCACCAATG (BamH I) --- 서열번호: 29

리버스: TGTCTGCAGAAGAGTTTGTAGAAACGC (Pst I) --- 서열번호: 30

얻어진 산물 Trc 카세트는 1% 아가로스에서 분리 후 목적 DNA만 회수되어 젤 정제 키트를 이용해 순수 분리 후 T-GEM 벡터에 삽입되었다. 이후 이를 T-trcA로 명명하였다. T-trcA는 벡터제조상의 이유로 MCS 부위의 몇몇 제한효소 인식부위를 위치 지정 돌연변이를 통해 변경하였다.

1) Nco I --> Nde I 으로 변경

주형: T-trcA 생산물: T-trcA1

포워드: CACAGGAAACAGCATATGGAATTCCGAG (Nde I) --- 서열번호: 31

생산물: CTCGGAATTCCATATGCTGTTTCCTGTG (Nde I) --- 서열번호: 32

2) Hind III --> Cla I

주형: T-trcA1 생산물: T-trcA2

포워드: ACCTGCAGGCATCGATGCTTGGCTGTTTTG (Cla I) --- 서열번호: 33

리버스: CAAAACAGCCAAGCATCGATGCCTGCAGGT (Cla I) --- 서열번호: 34

상기의 위치 지정 돌연변이를 통해 얻어진 T-trcA2는 Trc 카세트의 MCS 내부와 T-GEM 벡터 자체가 가지는 2개의 Nde I 인식부위를 가지고 있으므로 실시예 2에서 T-GEM 벡터 소유의 Nde I 인식부위를 없앤 것과 동일한 프라이머를 가지고 위치 지정 돌연변이를 수행함으로써 Nde I 인식부위가 하나만 존재하는 T-trcA3를 완성하였다.

상기의 T-trcA3를 Nde I 과 Cla I 으로 제한효소 처리 후 앞서 얻어진 산물 idi를 동일한 제한효소 처리 후 라이게이션을 하여 T-trc::idi를 얻게 되었다. T-trc::idi로부터 BamH I 과 Pst I을 처리하여 나온 약 1.6 kb 크기의 절편을 역시 동일한 효소로 처리한 pACYC177의 벡터 부분(약 3.0 kb)과 라이게이션을 함으로써 pATrc::idi를 제조하였다.

<실시예 6> 대장균 형질전환체의 제조 및 선별

하나한이 기술한 방법에 따라 (Hanahan D. 1985, DNA cloning 1, 109-135, IRL press) 상기 재조합 발현벡터 pTB-EIB, pTB-EI4B, pTB-EIBrop, pTB-EI4Brop 등으로 대장균 DH5α를 형질전환시킨 다음, 엠피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. 또한, 상기의 벡터들을 pATrc::idi 벡터와 공동 형질전환시킴으로써 엠피실린 및 카나마이신이 함께 들어있는 LB agar 배지에서 배양하게 되면 시간이 지남에 따라 콜로니의 색깔이 붉어짐을 확인하였다.

<실시예 7> 대장균 형질전환체의 배양 및 라이코펜의 생산

대장균 형질전환체의 배양은 형질전환체가 지니고 있는 벡터의 복제수에 따라 다르게 진행된다. 고 복제수를 가지는 형질전환체(pTB-EIB 및 pTB-EI4B)의 경우는 2X YT(1.6% bacto-tryptone, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl)배지에 콜로니를 접종한 후 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. 특별한 조치 없이 계속 배양해 나가면 자발적인 라이코펜 생합성 유전자의 발현에 의해 배양액이 다소 붉어지고 24시간 후 배양액으로부터 세포들을 원심분리기를 통해 침전시키면 붉은색 세포침전물을 확인할 수 있다.

저 복제수를 가지는 형질전환체(pTB-EIBrop 및 pTB-EI4Brop)의 경우 역시 2X YT(1.6% bacto-tryptone, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl)배지에 콜로니를 접종한 후 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. 배양액의 O.D₆₀₀가 0.4에 이르렀을 때에 최종농도가 1mM이 되도록 아라비노스(arabinose)를 첨가하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. 이후 24시간 동일 조건에서 배양하게 되면 배양액의 색이 붉어지고 원심분리기를 통해 세포를 회수하면 붉어진 세포들을 확인할 수 있다.

<실시예 8> 배양물로부터 라이코펜의 추출

세포배양액을 원심분리하여 균체침전물을 회수하고 대장균체 침전물을 증류수로 1-2회 재 현탁한 후 다시 원심분리하여 균체침전물을 회수하였다. 회수된 균체침전물은 적당량의 아세톤을 첨가하고 볼텍스(vortex)를 통하여 잘 섞은 후 60℃ 항온기에서 15분간 방치하였다. 아세톤 처리된 균체침전물은 재차 볼텍스를 통하여 잘 섞어주고, 이후 원심분리기를 통하여 세포로부터 라이코펜이 녹아들어간 유기 용매층을 분리하였다. 세포침전물이 하얗게 될 때까지 동일한 작업을 반복하여 세포로부터 라이코펜을 회수하였다. 아세톤에 녹아있는 라이코펜은 갈색 유리병에 보관하고 이들의 정량은 스펙트로포토미터(spectrophotometer, U-2800, HITACHI, Japan)를 통해 A₄₇₀에서 흡광도를 통해 결정되었다.

<실시예 9> 라이코펜의 생산량 분석

상기 실시예 8을 통하여 재조합 발현벡터로 별로 얻은 라이코펜의 양을 기반으로 하여 라이코펜의 생산성을 다음과 같이 비교 분석하였다.

<9-1> 본 발명과 종래 기술에서의 라이코펜 생산량 비교

본 발명에 따라 pTB-EI4B 또는 pTB-EI4Brop로 형질전환된 대장균으로부터 얻은 라이코펜 생산량과 문헌에 개시된 동일 유전자를 사용하여 얻은 라이코펜의 생산량을 표 1에 비교 정리하였다.

하기 표 1에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따라 제조된 재조합 발현벡터들로부터 상대적으로 우수한 결과를 확인할 수 있었다. 또한, 고 복제수로 복제되는 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 보다는 저 복제수로 복제되는 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균에서 더 많은 라이코펜을 얻을 수 있었다.

본 발명과 종래 기술에서의 라이코펜 수율 비교

벡터 이름	유전자 출처 /발현 숙주세포	생산량	참고문헌
pTB-EI4B	Erwinia sp. / DH5α	2.5 mg / g DCW	본 발명의 실시예
pTB-EI4Brop	Erwinia sp. / DH5α	3.5 mg / g DCW	본 발명의 실시예
pAC-LYC04	Erwinia sp. / DH5α	1.5 mg / g DCW	Kim et al. Biotechnol. Bioeng. 2001, vol.72, pp.408-415
pACCRT-EIB	Erwinia sp. / JM109	0.2 mg / g DCW	Kajiwara et al. Biochem. J. 1997, vol.324, pp.421-426

<9-2> 재조합 발현벡터 pATrc::idi에 의한 라이코펜의 생산량 비교

본 발명에 따른 재조합 발현벡터 pTB-EIB, pTB-EI4B, pTB-EIBrop, pTB-EI4Brop로 각각 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생산량과 상기 재조합 발현벡터와 동시에 pATrc::idi로 형질전환된 대장균에서의 라이코펜 생산량을 비교한 결과, pATrc::idi과 함께 동시에 형질전환된 경우에 약 2-3배 많은 양의 라이코펜을 생합성함을 확인하였다.

<9-3> 유전자 배열에 따른 라이코펜 생산량의 비교

pTB-EIB로 형질전환된 대장균 보다는 pTB-EI4B로 형질전환된 대장균에서 더 많은 양의 라이코펜이 생산되는 것을 확인할 수 있었다(도 7). 이를 통하여 crtE와 crtB 및 crtI가 모두 하나의 프로모터의 조절을 받는 것보다는 crtB만은 별도의 프로모터의 조절을 받도록 하는 것이 라이코펜의 생산에 효율적임을 알 수 있었다.

<실시예 10> 재조합 발현벡터의 복제수에 따른 형질전환체의 아라비노스 농도에 대한 단백질의 발현 양상 및 라이코펜 생산성

고 복제수를 가지는 재조합 발현벡터(pTB-EI4B)로 형질전환된 대장균을 2x YT(1.6% Bacto-tryptone, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl)배지에 콜로니를 접종한 후 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. 배양액의 O.D₆₀₀이 0.4에 이르렀을 때에 아라비노스를 최종농도가 각각 0 mM, 0.01mM, 0.1mM, 1mM, 2 mM, 10mM 되도록 첨가하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. 이후 24시간 동일 조건에서 배양하여 각각의 유도 발현된 배양액을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 통하여 발현양상을 비교하였으며(도 8a), 이 때 생산된 라이코펜의 양을 실시예 8의 절차에 따라 측정하여 도 8b에 나타내었다.

저 복제수를 가지는 재조합 발현벡터(pTB-EI4Brop)로 형질전환된 대장균을 전술된 바와 동일한 배지 및 조건하에서 배양하였다. 다만 유전자의 발현 유도시 배양액의 O.D₆₀₀이 0.4에 이르렀을 때에 아라비노스를 최종농도가 각각 0mM, 0.1mM, 0.5mM, 1mM, 5mM, 10mM 되도록 첨가하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다(도 9a). 이 때 생산된 라이코펜의 양을 실시예 8의 절차에 따라 측정하여 도 9b에 나타내었다.

이상, 전기영동 결과와 라이코펜의 생산량을 대비하여 보면 고 복제수로 복제되는 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균에서 더 많은 효소가 발현되지만, 저 복제수로 복제되는 재조합 발현벡터 pTB-EI4Brop로 형질전환된 대장균에서 더 많은 양의 라이코펜이 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 재조합 발현벡터가 높은 복제수로 복제되는 경우에는 유도 인자에 의해 해당 유전자가 과도하게 발현되어 이들이 응집체를 형성함으로써 라이코펜 생합성이 효율적으로 이루어지지 못하는데 반하여 재조합 발현벡터가 낮은 복제수로 복제되는 경우에는 유도 인자에 의해 해당 유전자가 적정량 발현됨으로써 라이코펜 생합성이 효율적으로 이루어지기 때문인 것으로 추정된다.

본 발명에 따른 재조합 발현벡터, 대장균 및 제조방법을 통하여 라이코펜을 대량으로 생산할 수 있다.

<110> Acebiotech Co. Ltd. <120> Method for Mass-Production of Lycopene by E.coli <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agcatatgac ggtctgcgca aa 22 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 attgtaatcc tccttattaa ctgacggcag 30 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 taaggaggat tacaatatga aaccaactac ggta 34 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gaagcttgaa ttcctcctta tcatatcaga tcctccagta 40 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cagaattcaa tatgaataat ccgtcgttac 30 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aggaattcaa gcttctagag cgggcgctgc cag 33 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 agcatatgac ggtctgcgca 20 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaagcttgaa ttcctcctta tcatatcaga tcctccagta 40 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccagagtcag ccttatggaa acgaca 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgtcgtttcc ataaggctga ctctgg 26 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gcagctggta ccttatggga attcga 26 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tcgaattccc ataaggtacc agctgc 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 caatctagat aattatgaca acttga 26 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gatctcgaga tcgatcatat gtaattcctc c 31 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 caggaggaat tacatatgat cgatctcgag atctgcagc 39 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gagagctcca gataaaacga a 21 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 caatctagat aattatgaca acttga 26 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gagagctcca gataaaacga a 21 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cctgcaggtc gacaatatgg gagagctc 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gagctctccc atattgtcga cctgcagg 28 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cagtcgacaa gaaaccaatt gtccatatt 29 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cactcgagca gctaaaacga a 21 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cacatatgaa taatccgtcg ttac 24 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 aggaattcaa gcttctagag cgggcgctgc caga 34 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 caactagtac acggaggcat cagtgac 27 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ggactagtat gtgtcagagg ttttca 26 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gaacatatgc aaacggaaca cgtca 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gatcgatcag cttgcgagac gcatc 25 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 caaggatccg actgcacggt gcaccaatg 29 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tgtctgcaga agagtttgta gaaacgc 27 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 cacaggaaac agcatatgga attccgag 28 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ctcggaattc catatgctgt ttcctgtg 28 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 acctgcaggc atcgatgctt ggctgttttg 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 caaaacagcc aagcatcgat gcctgcaggt 30

Claims

대장균에서 기능하는 유도성 프로모터 및 이의 조절을 받는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타제(geranylgeranyl pyrophosphate synthase; crtE) 유전자, 파이토엔 탈포화효소(phytoene desaturase; crtI) 유전자 및 파이토엔 신타제(phytoene synthase; crtB) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 1항에 있어서, 각 유전자의 개시코돈의 업스트림에는 SD 시퀀스를 삽입하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 1항에 있어서, 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터는 araBAD 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 3항에 있어서, pTB-EIB인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 1항에 있어서, 저 복제수로 복제되도록 조작된 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 5항에 있어서, 프로모터의 리프레서(rop) 유전자가 포함된 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 6항에 있어서, pTB-EIBrop인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균.
제 8항에 있어서, 라이코펜의 대사 전구체를 생산하는데 관여하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터에 의해 추가로 형질전환된 대장균.
제 9항에 있어서, 유전자는 이소펜티닐 디소페이트 이소머라제(idi)인 것을 특징으로 하는 대장균.
제 8항에 따른 대장균을 배양하는 단계와 이의 배양물로부터 라이코펜을 분리하는 단계를 포함한 라이코펜의 제조방법.
제 11항에 있어서, 대장균 숙주세포가 저 복제수로 복제되도록 조작된 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 경우에는 배지에 유도 인자를 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 라이코펜의 제조방법.
대장균에서 기능하는 유도성 프로모터 및 이의 조절을 받는 crtE 및 crtI를 포함하고, 또 다른 대장균에서 기능하는 유도성 프로모터 및 이의 조절을 받는 crtB를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 13항에 있어서, 각 유전자의 개시코돈의 업스트림에는 SD 시퀀스를 삽입하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 13항에 있어서, 대장균에서 기능하는 프로모터는 araBAD 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 15항에 있어서, pTB-EI4B인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 13항에 있어서, 저 복제수로 복제되도록 조작되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 17항에 있어서, 유전자 rop가 포함된 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 18항에 있어서, pTB-EI4Brop인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 13항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균.
제 20항에 있어서, KCTC10885BP 또는 KCTC10886BP인 것을 특징으로 하는 대장균.
제 20항에 있어서, 라이코펜의 대사 전구체를 생산하는데 관여하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터에 의해 추가로 형질전환된 대장균.
제 22항에 있어서, 라이코펜의 대사 전구체를 생산하는데 관여하는 유전자는 idi인 것을 특징으로 하는 대장균.
제 20항에 따른 대장균을 배양하는 단계와 이의 배양물로부터 라이코펜을 분리하는 단계를 포함한 라이코펜의 제조방법.
제 24항에 있어서, 대장균 숙주세포가 저 복제수로 복제되도록 조작된 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 경우에는 배지에 유도 인자를 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 라이코펜의 제조방법.