TWI583793B - 用以產生類胡蘿蔔素之微生物及其應用 - Google Patents

Description

用以產生類胡蘿蔔素之微生物及其應用

本發明係關於一種可產生類胡蘿蔔素之微生物，特別是該微生物包含改良後的類胡蘿蔔素合成基因，使該微生物增量生產類胡蘿蔔素。

茄紅素(lycopene)為一種類胡蘿蔔素(carotenoids)，分子式為C₄₀H₅₆。於自然界中，茄紅素廣泛存在於紅橙色蔬果，如番茄、葡萄柚、西瓜、木瓜等。茄紅素亦存在於人體血漿及組織，其比例大於β-胡蘿蔔素，顯示其於身體防禦之重要性。近來，由於茄紅素之優異抗氧化力及生理作用而受到重視，具有開發成營養品、保健品、化妝品、醫藥等商業價值。

由於茄紅素位於番茄細胞壁內，不易被人體吸收。因此，即使直接食用新鮮番茄，亦不易攝取足夠之茄紅素劑量。現今茄紅素之主要製備方法為化學合成、從植物(如新鮮番茄)提取、由真菌類(如三孢布拉黴菌(Blakeslea trispora))製造、及由細菌製造等模式。其中植物提取為最大宗，但其提取過程必須克服細胞壁之障礙，使用各種方式破壁而增加產率，故工程較繁複、時程較久、或萃取成本較為昂貴。

在所有提取工法中，無論提取來源為植物、真菌、或細菌，都是針對生物體本身，以有機溶劑、超臨界流體、植物油等進行提取，已知目前並無從其培養基中，及於細胞外，直接取得茄紅素之案例。於先前技術(如臺灣專利號：I4670182)已揭示以合成蝦紅素基因之載體轉殖入一光合菌後，使該光合菌具有產生蝦紅素之功能，並於菌體外收取蝦紅素的方法。該方法提供一種更為簡便之類胡蘿蔔素製備方法，可解決提取時程及成本問題。

微生物內部製造茄紅素之途徑主要涉及三種酵素，分別是四異戊二烯焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase；GGPP synthase；Crt E)、八氫茄紅素合成酶(phytoene synthase；Crt B)及八氫茄紅素去飽和酶(phytoene desaturase；Crt I)。Crt E經鏈延長方式以異戊烯基焦磷酸(isoprenyl pyrophosphate；IPP)為原料將法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate；FPP)轉變為香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate；GGPP)，接著，Crt B將GGPP轉變為八氫茄紅素(phytoene)，最後，經由Crt I的作用，形成茄紅素(如圖1所示)。先前已有文獻指出分別透過組合六種不同微生物之CrtE、CrtB及CrtI基因，將其選殖至表現載體，並於大腸桿菌中表達，發現不同程度的茄紅素產生(Applied and Environmental Microbiology(2013),79(2)：610-618)。此外，以茄紅素為基礎，可進一步透過各種合成酵素(如茄紅素環化酶(Crt Y)、β-胡蘿蔔素羥化酶(Crt Z)、2，2’-β羥化酶(Crt G)、β-胡蘿蔔素酮化酶(Crt W)及玉米黃素轉糖酶(Crt X)等)，將其轉化成各種類胡蘿蔔素(如圖2所示)。

但如何更有效的增加植物或菌類中茄紅素或其相關類胡蘿蔔素的產量，為目前相關產業欲解決之難題。

在本發明中，利用改良後的類胡蘿蔔素(如茄紅素)合成基因(如Crt E酵素基因及/或Crt I酵素基因)轉殖入一微生物(如小紅卵屬)中，可促使該微生物生產製造類胡蘿蔔素，且相較於單純轉植野生型(wild type)的類胡蘿蔔素合成基因轉殖，改良後的類胡蘿蔔素合成基因所生成的類胡蘿蔔素產量較多，同時所製造出類胡蘿蔔素與一般類胡蘿蔔素的成份結構相同，故無安全上的疑慮。

此外，本發明亦證實將改良後的類胡蘿蔔素(如茄紅素)合成基因轉殖入一光合菌後，能使該光合菌在培養過程(如於液態培養基中培養)中，可將所生成的類胡蘿蔔素分泌於菌體之外。而一般類胡蘿蔔素(包含茄紅素)屬於脂溶性，不易溶於水，故其意味著經過基因改造之光合菌所分泌出的類胡蘿蔔素為一種水溶性類胡蘿蔔素，且進一步證實該水溶性類胡蘿蔔素可與金屬離子(如鈣離子)結合而產生凝集反應，進而使該水溶性類胡蘿蔔素混合物沉澱出來；同時該水溶性類胡蘿蔔素所萃取出的類胡蘿蔔素與一般類胡蘿蔔素的成份相同。

本文中所用之術語「一」、「一個」及「該」意指「一個或多個」，此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念。此敘述應被理解為包括一種或至少一種，且除非明顯地另有所指，表示單數時亦包括複數。

本文中的用語「或」其意同「及/或」。

本發明中，野生型(wild type)的Crt E酵素包含一胺基酸序列為SEQ ID NO：16，其可由一包含SEQ ID NO：7的基因序列編碼而得。而改良後或突變後的Crt E酵素則包含一胺基酸序列為SEQ ID NO：19，其可由一包含SEQ ID NO：14的基因序列編碼而得。

本發明中，野生型(wild type)的Crt B酵素包含一胺基酸序列為SEQ ID NO：17，其可由一包含SEQ ID NO：8的基因序列編碼而得。

本發明中，野生型(wild type)的Crt I酵素包含一胺基酸序列為SEQ ID NO：18，其可由一包含SEQ ID NO：9的基因序列編碼而得。而改良後或突變後的Crt I酵素則包含一胺基酸序列為SEQ ID NO：20，其可由一包含SEQ ID NO：15的基因序列編碼而得。

此外，本文中所提的「胺基酸序列」一詞可進一步包含該序列之功能等效物及功能衍生物。根據本發明，「功能等效物」亦尤其意謂在上述胺基酸序列之至少一個序列位置中，具有與特別提及之胺基酸不同之胺基酸，但性質仍與最初未經修飾之胜肽相同的突變體。「功能等效物」因此包含藉由一或多個胺基酸添加、取代、缺失及/或顛倒可獲得之突變體，該等修飾可能發生在任何序列位置處，只要其產生具有根據本發明之性質概況之突變體即可。更特定言之，即使突變體與未經修飾之多胜肽之間的反應模式在性質上相對應，仍存在功能等效物。在上述意義上之「功能等效物」亦為所述多胜肽之「前驅體」以及該等多胜肽之「功能衍生物」。本文 中之「前驅體」為具有或不具有所需生物活性的該等多胜肽之天然或合成前驅體。

本發明提供一種基因改良的Crt E酵素，其包含一SEQ ID NO：19的胺基酸序列。

本發明提供一種基因改良的Crt I酵素，其包含一SEQ ID NO：20的胺基酸序列。

本發明提供一載體，該載體包含合成類胡蘿蔔素所需酵素基因，其中該合成類胡蘿蔔素所需酵素基因包含一Crt E酵素基因、一Crt B酵素基因及一Crt I酵素基因，其中該Crt E酵素基因編碼出含有SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19的Crt E酵素，其中該Crt I酵素基因編碼出含有SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20的Crt I酵素。

而此載體可以轉殖至微生物中。該載體可以視應用於不同狀況及用途可以是環狀(circular)或嵌入(integrated)之質體。一般為在適合宿主有機體中表現重組核酸構築體或基因構築體，宜將其插入宿主特異性載體中，該載體能夠使基因在宿主中最佳表現。載體為熟習此項技術者所熟知且可見於例如「Cloning Vectors」(Pouwels P.H.等人編，Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中。應瞭解除質體之外，載體亦包括熟習此項技術者已知之任何其他載體，諸如噬菌體、病毒(諸如SV40、CMV、桿狀病毒及腺病毒)、轉座子、IS元件、質體、黏質體及線性或環狀DNA。該等載體可在宿主有機體中或染色體自主複製。於一較佳具體實施例中，該載體為pET23-a載體或pBMTB-4載體。

本發明提供一種重組載體，其包含一Crt I酵素基因，其中該Crt I酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：20之胺基酸序列的Crt I酵素。於一較佳具體實施例中，該Crt I酵素基因包含一SEQ ID NO：15的基因序列。

於一具體實施例中，該重組載體進一步包含一Crt E酵素基因及一Crt B酵素基因。於一較佳具體實施例中，該Crt E酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：16或19之胺基酸序列的Crt E酵素。於一更佳具體實施例中，該Crt E酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：19之胺基酸序列的Crt E酵素。於另一具體實施例中，該Crt E酵素基因包含一SEQ ID NO：7或14的基因序列。於一較佳具體實施例中，該Crt E酵素基因包含一SEQ ID NO：14的基因序列。

於一具體實施例中，該Crt B酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：17之胺基酸序列的Crt B酵素。於一較佳具體實施例中，該Crt B酵素基因包含一SEQ ID NO：8的基因序列。於本發明所使用的Crt B酵素為正常或野生型的Crt B酵素。

本文中所述之術語「基因」，意指一段涉及產生功能性RNA之DNA片段。基因單獨包含編碼區及位於編碼區前(5’UTR)及編碼區後(3’UTR)之非編碼區或其組合。功能性RNA可為轉譯為肽、多肽或蛋白質之mRNA。功能性RNA亦可為不轉譯為蛋白質物質但具有其他生理功能之非編碼RNA。非編碼RNA之實例包括(但不限於)轉移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、小RNA及核糖酶等。「基因」可包含編碼序列(表 現序列)間之插入性非編碼序列(插入序列)。「編碼區」或「編碼序列」意指基因中轉錄為mRNA之部分，而mRNA經由三鹼基密碼子轉譯為多肽及用於轉譯該多肽之起始及終止訊號。「編碼區」或「編碼序列」亦意指基因中轉錄為非編碼但具功能性之RNA之部分。

於另一具體實施例中，該重組載體進一步包含一控制序列。該控制序列可以是任何適用於本發明的重組基因表現的啟動子，例如，但不限於：35S啟動子以及泛素啟動子(ubiquitin promoter)。

依據本發明，前述的重組載體除了上述控制序列外，更含有抗藥性基因，該抗藥性基因係為例如，但不限於：諸如npt II基因之康那黴素(kanamycin)之抗藥性基因。

本發明提供一種重組載體，其包含一Crt E酵素基因，其中該Crt E酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：19之胺基酸序列的Crt E酵素。於一較佳具體實施例中，該Crt E酵素基因包含一SEQ ID NO：14的基因序列。於另一具體實施例中，該重組載體不包含一Crt I酵素基因，其中該Crt I酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：20之胺基酸序列的Crt I酵素。

於一具體實施例中，該重組載體進一步包含一Crt B酵素基因及一Crt I酵素基因。於一較佳具體實施例中，該Crt I酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：18之胺基酸序列的Crt I酵素。於另一具體實施例中，該Crt I酵素基因包含一SEQ ID NO：9的基因序列。

本發明進一步提供一種製備一含Crt I酵素之微生物的方法，其包含：(a)構築一包含基因修飾之Crt I酵素基因之重組載體，其中該基因修飾之Crt I酵素基因編碼出含有SEQ ID NO：20的Crt I酵素；(b)將該重組載體轉殖入一微生物；及(c)使用適當的培養方法，使該微生物表現該基因修飾之Crt I酵素基因產生Crt I酵素。

本發明亦提供一種微生物，其包含一種重組載體，其中該重組載體包含一Crt I酵素基因，其中該Crt I酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：20之胺基酸序列的Crt I酵素。因此該微生物可生產基因改良的Crt I酵素。

於一具體實施例中，該微生物為一光合菌。於一較佳具體實施例中，該光合菌係一小紅卵屬(Rhodovulum)。

本發明進一步提供一種製備一含Crt E酵素之微生物的方法，其包含：(a)構築一包含基因修飾之Crt E酵素基因之重組載體，其中該基因修飾之Crt E酵素基因編碼出含有SEQ ID NO：19的Crt E酵素；(b)將該重組載體轉殖入一微生物；及(c)使用適當的培養方法，使該微生物表現該基因修飾之Crt E酵素基因產生Crt E酵素。於一具體實施例中，該重組載體不包含一Crt I酵素基因，其中該Crt I酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：20之胺基酸序列的Crt I酵素。

本發明亦提供一種微生物，其包含一種重組載體，其中該重組載體包含一Crt E酵素基因，其中該Crt E酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：19之胺基酸序列的Crt E酵素。於一具體實施例中，該重組載體不包 含一Crt I酵素基因，其中該Crt I酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：20之胺基酸序列的Crt I酵素。因此該微生物可生產基因改良的Crt E酵素。

本發明提供一種產生類胡蘿蔔素之方法，其包含：(a)提供一含有一合成類胡蘿蔔素所需酵素基因的一重組載體，其中該合成類胡蘿蔔素所需酵素基因包含一Crt E酵素基因、一Crt B酵素基因及一Crt I酵素基因，其中該Crt I酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：20之胺基酸序列的Crt I酵素；(b)將該重組載體轉殖入一微生物中；及(c)使該微生物表現該重組載體上的該合成類胡蘿蔔素所需酵素基因以產生類胡蘿蔔素。

於一具體實施例中，該Crt E酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：16或19之胺基酸序列的Crt E酵素。於一較佳具體實施例中，該Crt E酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：19之胺基酸序列的Crt E酵素。於另一具體實施例中，該Crt E酵素基因包含一SEQ ID NO：7或14的基因序列。於一較佳具體實施例中，該Crt E酵素基因包含一SEQ ID NO：14的基因序列。

於另一具體實施例中，該Crt B酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：17之胺基酸序列的Crt B酵素。於一較佳具體實施例中，該Crt B酵素基因包含一SEQ ID NO：8的基因序列。於本發明所使用的Crt B酵素為正常或野生型的Crt B酵素。

於一具體實施例中，該類胡蘿蔔素為一水溶性類胡蘿蔔素。於一較佳具體實施例中，該類胡蘿蔔素為一茄紅素。於一更佳具體實施例中，該茄紅素為一水溶性茄紅素。

於一具體實施例中，該微生物為一光合菌。於一較佳之具體實施例中，該光合菌係小紅卵屬(Rhodovulum)。

本發明另提供一種產生類胡蘿蔔素之方法，其包含：(a)提供一含有一合成類胡蘿蔔素所需酵素基因的一重組載體，其中該合成類胡蘿蔔素所需酵素基因包含一Crt E酵素基因、一Crt B酵素基因及一Crt I酵素基因，其中該Crt E酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：19之胺基酸序列的Crt E酵素，其中該Crt I酵素基因不會編碼出含有一SEQ ID NO：20之胺基酸序列的Crt I酵素；(b)將該重組載體轉殖入一微生物中；及(c)使該微生物表現該重組載體上的該合成類胡蘿蔔素所需酵素基因以產生類胡蘿蔔素。因此上述方法，僅突變Crt E酵素基因使其產生改良的Crt E酵素，而Crt I酵素基因為正常或野生型的Crt I酵素基因。

本發明進一步提供一種產生類胡蘿蔔素的方法，其包含：(a)提供一含有合成類胡蘿蔔素所需酵素基因的載體，其中該合成類胡蘿蔔素所需酵素基因包含一Crt E酵素基因、一Crt B酵素基因及一Crt I酵素基因，其中該Crt E酵素基因編碼出含有SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19的Crt E酵素，其中該Crt I酵素基因編碼出含有SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20的Crt I酵素；(b)將該具有合成類胡蘿蔔素所需酵素基因的載體轉殖入一微生物，以產生一基因重組之微生物；及(c)使用適當的培養方法，使該基因重組之微生物表現該合成類胡蘿蔔素所需酵素基因以產生類胡蘿蔔素。

因此透過上述方法，本發明介由基因改造技術至少將Crt E、Crt B及Crt I酵素基因轉殖入微生物中，其中該Crt E及Crt I酵素基因至少其中一個為改良或經突變的基因或兩個皆是改良或經突變的基因，故可產生改良或經突變的Crt E及/或Crt I酵素蛋白，即本發明讓該微生物的體內至少有一個改良或經突變的類胡蘿蔔素合成酵素蛋白，以促使該微生物可生產類胡蘿蔔素取得，且該胡蘿蔔素的產量相較於單純轉殖入野生型的Crt E、Crt B及Crt I酵素基因的情況顯著增加。於本發明中，該載體上的Crt E酵素基因、Crt B酵素基因及Crt I酵素基因，包含下列情況的排列組合：(1)該Crt E酵素基因編碼出含有SEQ ID NO：19的Crt E酵素，和Crt B酵素基因及Crt I酵素基因編碼出野生型的Crt B及Crt I酵素；(2)該Crt I酵素基因編碼出含有SEQ ID NO：20的Crt I酵素，和Crt B酵素基因及Crt E酵素基因編碼出野生型的Crt B及Crt E酵素；及(3)該Crt E酵素基因編碼出含有SEQ ID NO：19的Crt E酵素，該Crt I酵素基因編碼出含有SEQ ID NO：20的Crt I酵素，和Crt B酵素基因具有編碼出野生型的Crt B酵素。

於一具體實施例中，當有編碼出含有SEQ ID NO：16的Crt E酵素之該Crt E酵素基因時，Crt I酵素基因不為編碼出含有SEQ ID NO：18的Crt I酵素的基因。故Crt E和Crt I酵素基因不同時為野生型的Crt E和Crt I酵素基因，即於本發明中不同時為野生型的Crt E和Crt I酵素。

於另一具體實施例中，該合成類胡蘿蔔素所需酵素基因進一步包含Crt Y、Crt Z、Crt G、Crt W及或/Crt X酵素基因。

本文所述之「類胡蘿蔔素」包含但不限於係指茄紅素 (lycopene)、β-胡蘿蔔素(β-carotene)、玉米黃素(zeaxanthin)、玉米黃素β-D-雙葡萄糖苷(zeaxanthin β-D-diglucoside)、眉藻黄素(caloxanthin)、眉藻黄素β-D-葡萄糖苷(caloxanthin β-D-diglucoside)、念珠藻黄素(nostoxanthin)、蝦青素(astaxanthin)、2-羥基蝦青素(2-hydroxyastaxanthin)、2,2’-雙羥基蝦青素(2,2’-dihydroxyastaxanthin)、蝦青素β-D-葡萄糖苷(astaxanthin β-D-glucoside)、蝦青素β-D-雙葡萄糖苷(astaxanthin β-D-diglucoside)、4,4'二酮-β-胡蘿蔔素(canthaxanthin)、2-羥基-4,4'二酮-β-胡蘿蔔素(2-hydroxy canthaxanthin)、2,2’-雙羥基-4,4'二酮-β-胡蘿蔔素(2,2’-dihydroxy canthaxanthin)、β-阿朴-4’-胡蘿蔔醛、β-阿朴-8’-胡蘿蔔醛、β-阿朴-12’-胡蘿蔔醛、β-阿朴-8’-胡蘿蔔酸、隱黃質、檸黃質、葉黃素、蕃、圓酵母紅素-醛、圓酵母紅素-乙酸乙酯、鏈孢黃質-乙酯或去氫紅盤菌黃質，同時亦包括天然胡蘿蔔素。於一較佳具體實施例中，該類胡蘿蔔素為一茄紅素。

於一具體實施例中，該類胡蘿蔔素為一水溶性類胡蘿蔔素。於另一具體實施例中，該茄紅素為一水溶性茄紅素。

本文所述之「轉殖」包含但不限於利用基因槍法、電擊原生質體法、微針穿刺法、微脂體包覆法及共軛轉殖(Conjugation)等轉殖技術，以目標基因導入到目的生物體的基因組中，從而達到改造生物的目的。於一較佳的具體實施例中，該轉殖係共軛轉殖方法。

本文所述之「微生物」可為本身具有產生類胡蘿蔔素之微生物，即該微生物本身具有生產類胡蘿蔔素之過程中所需之各種酵素、因子 及材料。因此本發明改良兩種合成類胡蘿蔔素之所需酵素，即Crt E酵素及Crt I酵素，以提高該微生物所生產的類胡蘿蔔素之產量。

本發明的「微生物」，其係得自植物、動物、細菌、真菌、昆蟲、原蟲、病毒或黴漿菌。此外，本文所述之「微生物」一詞包含但不限於原核微生物及真核微生。於一具體實施例中，該微生物係指一原核微生物。於一較佳之具體實施例中，該原核微生物係指一細菌。於一更佳之具體實施例中，該細菌包含一革蘭氏陽性菌和一革蘭氏陰性菌。

於另一具體實施例中，該細菌係一革蘭陰性菌。於一較佳具體實施例中，該革蘭陰性菌係一光合菌。

於一具體實施例中，該微生物為一光合菌。於一較佳之具體實施例中，該光合菌係小紅卵屬(Rhodovulum)。

本文所述之「光合菌」一詞包含但不限於可利用光能進行光合作用之細菌。於一具體實施例中，該光合菌包含但不限於紅螺菌科(Rhodospirillaceae)、紅硫菌科(Chromatiaceae)、綠硫菌科(Chlorobiaceae)及滑行絲狀綠硫菌科(Chloroflexaceae)。

本發明提供一種製備類胡蘿蔔素的方法，其包含以下步驟：(a)培養一生產類胡蘿蔔素之微生物於一培養基中，其中該微生物分泌類胡蘿蔔素於該培養基中，其中該微生物為一具有合成類胡蘿蔔素所需酵素基因的微生物，其中該合成類胡蘿蔔素所需酵素基因包含一Crt E酵素基因、一Crt B酵素基因及一Crt I酵素基因，其中該Crt E酵素基因編碼出含 有SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19的Crt E酵素，其中該Crt I酵素基因編碼出含有SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20的Crt I酵素；(b)收集該培養基，以分離出一含有類胡蘿蔔素之培養液；(c)加入一凝集劑於該含有類胡蘿蔔素之培養液；及(d)以固液分離方式處理該培養液，收集與該凝集劑反應而沉澱的固態之類胡蘿蔔素。

於一具體實施例中，該微生物表現一含有SEQ ID NO：19的Crt E酵素及/或一含有SEQ ID NO：20的Crt I酵素。

於一具體實施例中，該類胡蘿蔔素為一茄紅素。於一較佳具體實施例中，該類胡蘿蔔素為一水溶性類胡蘿蔔素。

於一具體的實施例中，該凝集劑包含但不限於含有金屬離子的溶液。於一較佳的具體實施例中，該凝集劑包含但不限於二價金屬離子的溶液。於一更佳的具體實施例中，該金屬離子係一鈣金屬離子。

於另一具體實施例中，該凝集劑包含但不限於硫酸鎂、氯化鈣、氯化鋅或氯化鈉之水溶液。於一較佳的具體實施例中，該凝集劑係一氯化鈣或一氯化鋅之水溶液。於一更佳的具體實施例中，該凝集劑係一氯化鈣之水溶液。

於一具體的實施例中，該培養基包含但不限於一固態培養基或一液態培養基。於一較佳的具體實施例中，該培養基係一液態培養基。於另一較佳的具體實施例中，該培養基係一培養液。是以，若直接使用培養液培養該分泌水溶性類胡蘿蔔素之微生物，可簡易的透過離心分離的方 式分離該微生物與該培養液，直接取得含有水溶性類胡蘿蔔素之培養液，再透過凝集及固液分離的方式取得該類胡蘿蔔素，有利於縮短及減少一般類胡蘿蔔素之製程及成本。

本發明所述之含類胡蘿蔔素之微生物的方法，其中該微生物所生成的類胡蘿蔔素包含但不限於應用於醫藥、保健食品、化妝品、動物飼料、燃料輔助劑等領域之用途。於一具體實施例中，該類胡蘿蔔素係用於製備化妝品、保養品、食品、保健食品、健康食品、動物用藥品或人類用藥品。

本發明所提供之製備一含類胡蘿蔔素之微生物的方法，與其他習用技術相互比較時，更具有下列之優點：

(1)本發明利用微生物改造的方法，即將改良後的類胡蘿蔔素合成基因(如Crt E或I)轉殖入一微生物中，可使該微生物增量生產類胡蘿蔔素(如茄紅素)，而使該微生物菌體內的類胡蘿蔔素含量與純度可大幅提高。

(2)本發明相較於一般從植物(如番茄)或從其他微生物提取之方法，本發明具有可兼從微生物培養液中取得類胡蘿蔔素(如茄紅素)，可達到方便萃取與產量高之優點。

(3)本發明的方法可使該微生物增量產生茄紅素，而該茄紅素可透過其他酵素轉化成其它類胡蘿蔔素(如圖2所示)，因此本發明可使上游的茄紅素的產量增加，也就代表本發明於該微生物上除了轉殖入改 良的茄紅素合成基因(Crt E及/或Crt I)外，若再進一步轉殖其他酵素基因(Crt Y、Crt Z、Crt G、Crt W或Crt X)入該微生物，因該上游的茄紅素的產量增加，故其他酵素基因僅是提供將該茄紅素轉化成其它類胡蘿蔔素的功能，因此所轉化出的類胡蘿蔔素之產量也會增加。

圖1為茄紅素合成路徑的示意圖。

圖2為各種類胡蘿蔔素合成路徑的示意圖。

圖3為含有Crt EBI基因的載體之設計。(A)為pET23-a載體。(B)為pBMTB-4載體。

圖4為不同突變體中茄紅素含量之比較。

圖5為所取得茄紅素之TLC分析。

圖6為所改造菌株之茄紅素含量。

圖7為所取得茄紅素之質譜鑑定。

本發明的精神在於使微生物具有生產類胡蘿蔔素的功能，且提高類胡蘿蔔素的產量。依於此精神，本發明包括但不限於上述與下開之說明。實施方式則如下範例所示。

實施例一

菌株與培養條件

本發明所舉示為可生產類胡蘿蔔素(carotenoids)的菌株，進而是可以生產茄紅素的菌株，特別是指經基因改造之光合菌。本發明以小紅卵屬(Rhodovulum)為例，使其具有生產茄紅素的能力，而光合菌之基因改造方法與基本培養條件為習知技藝，請參照文獻如FEMS Microbiol Lett(2006),265：69-75、美國專利申請號10/585419及Hunter CN(J.Bacteriol(1994),176(12)：3692-3697)、以及臺灣專利號：I467018。

小紅卵屬原始菌種可取自各大生物資源中心或國際菌種保存中心，諸如菌株ATCC 35886(BCRC 16417)，或自行篩選光合菌。所取得之菌株依標準程序培養，後續基因改良之方法如下：(1)將小紅卵屬光合菌株透過選擇利福平(Rifampicin，50微克/毫升)培養，篩選具抗性菌落並冷凍保存；並依臺灣專利號：I467018中的實施方法取得剔除crtCD基因之小紅卵屬光合菌株；(2)以常見表達載體pET23a為骨幹，先依序將茄紅素生合成酵素CrtE、CrtB及CrtI以反轉錄聚合酵素鏈反應(PCR)方法選殖至該載體(本發明所用引子為SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6；另外，並用野生型(wild-type；WT)的CrtE、CrtB及CrtI的基因序列，其分別為SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9)，形成構築體pET23-a-CrtIBE，並再將Crt IBE整組片段轉殖入載體pBMTB-4之EcoRI限制酶切位中，其係以四環黴素(tetracycline)為篩選標的(如圖3所示)；以及(3)改良後小紅卵屬細菌生產茄紅素：將上述含Crt IBE基因建構之載體以大腸桿菌菌株S17-1為媒介進行共軛(conjugation)轉殖入小紅卵屬光合菌改造株；並以利福平及四環黴素進行菌株篩選。最後，改良完成的 菌株其生產之色素經由色層分析、核磁共振、及質譜鑑定為茄紅素，顯示具有生產茄紅素之能力。上述方法所取得的基因改造之光合菌株的培養條件：生長溫度26℃、無須光照；持續通氣或振盪以提供足夠的氧氣。

實施例二

基因突變

以定點突變法(site-directed mutagenesis)進行茄紅素生合成基因突變。以上述所建構之含Crt IBE基因之pET23-a載體為模版，針對Crt E與Crt B的基因上將欲突變位置之順向與反向加入引子(Crt E突變所用之引子序列為SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11，Crt I突變所用之引子序列為SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13)，再加入DNA聚合酶，並以PCR方法擴增。經過18個PCR循環後，於37℃下加入限制酶DpnI，將原始質體分解。

經飽和突變之線型質體以連接酶(ligase)連接後，首先轉型至大腸桿菌JM109，並塗抹於LB培養盤，其篩選基因為Amp^R。於37℃培養箱中培養隔夜後，將菌落全數刮下，並抽取質體，此為一涵蓋各Crt基因突變體之質體庫(plasmid library)。接著，將質體庫之質體轉型至大腸桿菌細胞，再次塗抹於LB培養盤。於37℃培養箱中培養隔夜後，觀察菌落顏色變化，並挑選有顏色變化之菌落。將選取之菌落進一步培養於LB培養基，並於37℃培養箱中培養隔夜後，取4ml的菌液離心，之後秤重，並觀察各突變體離心後之沉澱物顏色變化。

實施例三

大腸桿菌突變體茄紅素產量比較

將大腸桿菌突變體沉澱物秤重，之後以200μl的磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗。離心移除PBS後，再加入50μl的PBS進行回溶，接著加入450μl的正己烷/丙酮(1/1；v/v)，並於25℃萃取3小時以上。最後，以14000rpm離心5分鐘，取上層(有機層)進行分析。

以茄紅素有機萃取液進行薄層層析法分析，其中薄層層析之移動相(mobile phase)條件為正己烷/丙酮(10/1；v/v)。將25μl的樣本點染於層析片上，於密閉玻璃槽中運行數分鐘後，觀察層帶之產生及變化，分別挑選高茄紅素產量之突變體進行基因定序。經定序後，突變體之突變位點變化如下：Crt E H234N(將CAC改成AAT，即SEQ ID NO：14)及Crt I I480V(將ATT改成GTG，即SEQ ID NO：15)。另外，本發明亦定序野生型的Crt E、Crt B及Crt I酵素蛋白的胺基酸序列，和改良後的Crt E及Crt I酵素蛋白的氨基酸序列，其分別序列如下：(1)野生型的Crt E酵素蛋白的胺基酸序列為SEQ ID NO：16；(2)野生型的Crt B酵素蛋白的胺基酸序列為SEQ ID NO：17；(3)野生型的Crt I酵素蛋白的胺基酸序列為SEQ ID NO：18；(4)改良後的Crt E酵素蛋白的胺基酸序列為SEQ ID NO：19；以及(5)改良後的Crt I酵素蛋白的胺基酸序列為SEQ ID NO：20。

利用ImageJ軟體，以影像對比分析方式，在同樣菌量的基礎下進行各突變體間之茄紅素相對量化比較。如圖4所示，相較於野生型(含野生型的Crt IBE基因組)的產量，單點突變體CrtE H234N與CrtI I480V 皆有2倍以上的茄紅素產量增加，而雙點突變株(E&I double mutation；Crt E及I雙突變)則具有加成性的效果，使整體茄紅素的產量高達相較於野生型(WT)產量的6.9倍。

實施例四

收集光合菌培養液及菌體中的茄紅素

將突變體質體以大腸桿菌菌株S17-1為媒介進行小紅卵屬細菌共軛轉殖。將該些基因改造之光合菌培養於一培養液中，本發明發現該培養液逐漸變紅，即該培養液及菌體具有茄紅素，代表該些光合菌產生茄紅素並將部分茄紅素分泌於該培養液。

另取1.8ml的培養液，加入0.1ml至0.2ml的氯化鈣水溶液混合均勻；加入氯化鈣培養液出現從透明澄清轉為混濁與色素凝集之狀況。所凝集的茄紅素混合物可以用離心或過濾的方式取得，以小型離心為例：將加入凝集劑的培養液取2ml置於離心管中以桌上型離心機8000g離心3分鐘，該色素混合物將與培養液分離而沉澱於離心管底。欲進一步確認茄紅素存在，以茄紅素有機萃取液進行薄層層析法(Thin Layer Chromatography；TLC)分析，其中薄層層析之移動相(mobile phase)條件為正己烷/丙酮(10/1；v/v)。該色素經TLC分析與茄紅素標準品Rf值相同。

另將培養所得之含Crt IBE基因構築體之菌體以丙酮多次萃取後，萃取液從TLC分析可見色素種類非常單一便於後續純化，且色素之 Rf值與茄紅素標準品(standard)一致(如圖5所示)。

另外，萃取液以OD472進行茄紅素含量分析，換算其茄紅素占菌體乾重比之結果如圖6所示。圖6中顯示未經任何改造的原始光合菌株(original host)且其不含茄紅素，而將含Crt IBE基因組的構築體(即野生型)以及其突變(CrtE mutant H234N與CrtI mutant I480V)之構築體(即Crt E突變和Crt I突變)送進光合菌株之後所得之改造菌株具有優異的茄紅素含量，其占菌體之乾重比(%)可達1.65，且Crt E與Crt I的單點突變確實比野生株的基因組提高了茄紅素的產量。從上述結果亦可合理推測Crt E與Crt I的雙點突變將進一步提高茄紅素的產量。

實施例五

茄紅素萃取、純化及保存

所獲得之茄紅素粗產物以正己烷/丙酮混合液進行溶解，再將混合液倒入1公升萃取瓶，並於-20℃靜置分層。取分層後混合液上層並以無水硫酸鎂除水，經濾紙過濾後，其濾液以減壓旋轉濃縮機抽乾。抽乾後的固體以少量乙醚(10-20毫升)回溶，單離出固體後將乙醚抽乾得到暗紅色產物。

實施例六

茄紅素化學成份分析

單離之茄紅素產物係經核磁共振及質譜鑑定，其係分別使用核磁共振儀(BRUKER AVANCE-500 NMR SPECTROMETER，德國)及質 譜儀(Waters Quattro micro API MS)鑑定。本發明茄紅素之化學鑑定結果可經由文獻比對證實(Advanced Synthesis and Catalysis(2008),350：365-369)。

如圖7所示，茄紅素之化學鑑定數據如下：¹H NMR：δ 5.9-6.7(m,16 H,double bond H)、δ 5.11(m,2 H,double bond H)、δ 2.11(m,8 H,4 X CH₂)、δ 1.97(s,12 H,4 X CH₃)、δ 1.82(s,6 H,2 X CH₃)、δ 1.68(s,6 H,2 X CH₃)、δ 1.61(s,6 H,2 X CH₃)；HR-MS(EI)：m/z=536.3，經計算為C₄₀H₅₆。

上列詳細說明係本發明之一較佳實施方式之具體說明，然其並非用以限定本創作，故任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內作些許之等效實施或變更，均應包含至本發明之申請專利範圍內。

<110> 鴻林堂生物科技股份有限公司

<120> 用以產生類胡蘿蔔素之微生物及其應用

<130> 2470-BNS-TW

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 1

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 3

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 5

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 6

<210> 7

<211> 876

<212> DNA

<213> Rhodobacter sphaeroides

<400> 7

<210> 8

<211> 888

<212> DNA

<213> Pantoea agglomerans

<400> 8

<210> 9

<211> 1503

<212> DNA

<213> Paracoccus sp.N81106

<400> 9

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 10

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(8)

<223> n is a,c,g,or t

<400> 11

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 12

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> n is a,c,g,or t

<400> 13

<210> 14

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Crt E mutation gene

<400> 14

<210> 15

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Crt I mutation gene

<400> 15

<210> 16

<211> 292

<212> PRT

<213> Rhodobacter sphaeroides

<400> 16

<210> 17

<211> 296

<212> PRT

<213> Pantoea agglomerans

<400> 17

<210> 18

<211> 501

<212> PRT

<213> Paracoccus sp.N81106

<400> 18

<210> 19

<211> 292

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Crt E mutation protein

<400> 19

<210> 20

<211> 501

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Crt I mutation protein

<400> 20

Claims (10)

1. 一種Crt I酵素，其包含一SEQ ID NO：20的胺基酸序列。
2. 一種重組載體，其包含一Crt I酵素基因，其中該Crt I酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：20之胺基酸序列的Crt I酵素。
3. 如申請專利範圍第2項所述之重組載體，其進一步包含一Crt E酵素基因及一Crt B酵素基因。
4. 如申請專利範圍第3項所述之重組載體，其中該Crt E酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：19之胺基酸序列的Crt E酵素。
5. 一種微生物，其包含申請專利範圍第2項所述之重組載體。
6. 一種產生類胡蘿蔔素之方法，其包含：(a)提供一含有一合成類胡蘿蔔素所需酵素基因的一重組載體，其中該合成類胡蘿蔔素所需酵素基因包含一Crt E酵素基因、一Crt B酵素基因及一Crt I酵素基因，其中該Crt I酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：20之胺基酸序列的Crt I酵素；(b)將該重組載體轉殖入一微生物中；及(c)使該微生物表現該重組載體上的該合成類胡蘿蔔素所需酵素基因以產生類胡蘿蔔素。
7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該Crt E酵素基因編碼出含有一SEQ ID NO：19之胺基酸序列的Crt E酵素。
8. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該類胡蘿蔔素為一茄紅素。
9. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該微生物為一光合菌。
10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該光合菌係一小紅卵屬(Rhodovulum)。