JP4460621B2 - 新規なカロテノイドヒドロキシラーゼ遺伝子及び水酸化されたカロテノイドの製造法及び新規なゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ遺伝子 - Google Patents
新規なカロテノイドヒドロキシラーゼ遺伝子及び水酸化されたカロテノイドの製造法及び新規なゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ遺伝子 Download PDFInfo
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Description
(a)配列番号4記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)配列番号4記載のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド、
(c)配列番号4記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド、
(d)配列番号3記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、β-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド。
(a)配列番号4記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)配列番号4記載のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド、
(c)配列番号4記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド、
(d)配列番号3記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、β-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド。
(4)(2)に記載の遺伝子を、他のカロテノイド生合成遺伝子とともに導入して得られる微生物であって、β-イオノン環の2位の炭素に水酸基を導入できる微生物。
(5)他のカロテノイド生合成遺伝子が、ファルネシルピロリン酸からβ-イオノン環を有するカロテノイドを合成するのに必要とされる遺伝子群の全部又は一部であることを特徴とする(4)に記載の微生物。
(6)微生物が大腸菌であることを特徴とする(3)乃至(5)に記載の微生物。
(7)(3)乃至(6)に記載の微生物を、培地で培養して培養物又は菌体からβ-イオノン環の2位の炭素が水酸化されたカロテノイドを得ることを特徴とする、水酸化されたカロテノイドの製造法。
(8)β-イオノン環の2位の炭素が水酸化されたカロテノイドが、β,β-カロテン-2-オール(2-ヒドロキシ-β-カロテン)、β,β-カロテン-2,2’-ジオール(2,2’-ジヒドロキシ-β-カロテン)、カロキサンチン(2-ヒドロキシゼアキサンチン)、ノストキサンチン(2,2’-ジヒドロキシゼアキサンチン)、2-ヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4’-ジオン(2-ヒドロキシカンタキサンチン)、2,2’-ジヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4’-ジオン(2,2’-ジヒドロキシカンタキサンチン)、2-ヒドロキシアスタキサンチン、2,3,2’,3’-テトラヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4’-ジオン(2,2’-ジヒドロキシアスタキサンチン)であることを特徴とする(7)に記載の水酸化されたカロテノイドの製造法。
(9)下記の化学構造式(I)で示される新規化合物2,2’-ジヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4’-ジオン(2,2’-ジヒドロキシカンタキサンチン)。
(11)以下の(e)、(f)、又は(g)に示すペプチドをコードする遺伝子:
(e)配列番号30記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(f)配列番号30記載のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド、
(g)配列番号29記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド。
(12)(11)に記載の遺伝子を導入して得られる微生物であって、β-イオノン環の3位の炭素に水酸基を導入できる微生物。
(13)(11)に記載の遺伝子を、他のカロテノイド生合成遺伝子とともに導入して得られる微生物であって、β-イオノン環の3位の炭素に水酸基を導入できる微生物。
(14)他のカロテノイド生合成遺伝子が、ファルネシルピロリン酸からβ-イオノン環を有するカロテノイドを合成するのに必要とされる遺伝子群の全部又は一部であることを特徴とする(13)に記載の微生物。
(15)微生物が大腸菌であることを特徴とする(12)乃至(14)に記載の微生物。
(16)(12)乃至(15)に記載の微生物を、培地で培養して培養物又は菌体からβ-イオノン環の3位の炭素が水酸化されたカロテノイドを得ることを特徴とする、水酸化されたカロテノイドの製造法。
(17)以下の(h)、(i)、又は(j)に示すペプチドをコードする遺伝子:
(h)配列番号32記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(i)配列番号32記載のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有するペプチド、
(j)配列番号31記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有するペプチド。
目的とする遺伝子の供給源となった海洋細菌ブレバンディモナス属(Brevundimonas sp.)SD-212 株(SD212;MBIC 03018)は、火山列島の海水中より単離されたα-プロテオバクテリアである。GC含量は67.1(mol)%である。本海洋細菌が作るカロテノイドは、2-ヒドロキシアスタキサンチン(2-hydroxyastaxanthin)や2-ヒドロキシアドニキサンチン(2-hydroxyadonixanthin)等の2位(2’位)に水酸基が導入されたカロテノイドであることが(株)海洋バイオテクノロジー研究所の横山らにより報告されている(非特許文献2参照)。なお、本細菌は、MBIC 03018として(株)海洋バイオテクノロジー研究所より公開・分譲されている。また、本細菌の16S rDNA配列とgyrB遺伝子配列はそれぞれ、アクセッション番号AB016849、AB014993としてGenBank/DDBJに登録されている。
海洋細菌ブレバンディモナス属(Brevundimonas sp.)SD-212 株(MBIC 03018)が生産する、2位(2’位)に水酸基が導入されたカロテノイドは、横山らによって詳しく分析されている(非特許文献2参照)。それらは、2,3,2’,3’-テトラヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4’-ジオン(2,3,2’,3’-tetrahydroxy-β,β-carotene-4,4’-dione)、2,3,2’,3’-テトラヒドロキシ-β,β-カロテン-4-オン(2,3,2’,3’-tetrahydroxy-β,β-caroten-4-one)、2-ヒドロキシアスタキサンチン(2-hydroxyastaxanthin;2,3, 3’-trihydroxy-β,β-carotene-4,4’-dione)、2-ヒドロキシアドニキサンチン(2-hydroxyadonixanthin;2,3, 3’-trihydroxy-β,β-caroten-4-one)、エリスロキサンチン(erythroxanthin; 3,2’,3’-trihydroxy-β,β-caroten-4-one)である(図2参照)。また、SD-212 株には、前駆体として、アスタキサンチンやアドニキサンチン(4-ケトゼアキサンチン)が存在することも確認されている。β-イオノン環の2位に水酸基を導入する新規な酵素(β-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ;CrtVと記載)の存在を想定すると、これ以外はすべて既存のCrt酵素との組合せにより、上記のすべてのカロテノイドの生合成経路を図2のように推定することができる。
本発明には、以下の(a)、(b)、(c)、又は(d)に示すペプチドが含まれる。
(a)配列番号4記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)配列番号4記載のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド、
(c)配列番号4記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド、
(d)配列番号3記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、β-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド。
(a)配列番号4記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)配列番号4記載のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド、
(c)配列番号4記載のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド、
(d)配列番号3記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、β-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド。
本発明には、以下の(e)、(f)、又は(g)に示すペプチドをコードする遺伝子も含まれる。
(e)配列番号30記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(f)配列番号30記載のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド、
(g)配列番号29記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド。
(e)のペプチドは、ブレバンディモナス属SD-212株から得られたβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有する161個のアミノ酸配列からなるペプチド(CrtZとも呼ぶ)である。
(f)のペプチドは、(e)のペプチドに、β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を失わせない程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段は前述したとおりである。
(g)のペプチドは、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチドである。(g)のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」は前述した通りである。
本発明には、以下の(h)、(i)、又は(j)に示すペプチドをコードする遺伝子も含まれる。
(h)配列番号32記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(i)配列番号32記載のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有するペプチド、
(j)配列番号31記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有するペプチド。
(h)のペプチドは、ブレバンディモナス属SD-212株から得られたゲラニルゲラニルピロリン酸活性を有する298個のアミノ酸配列からなるペプチド(CrtEとも呼ぶ)である。
(i)のペプチドは、(h)のペプチドに、ゲラニルゲラニルピロリン酸活性を失わせない程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段は前述したとおりである。
(j)のペプチドは、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のゲラニルゲラニルピロリン酸活性を有するペプチドである。(j)のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」は前述した通りである。
本発明には、3に記載のβ-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ遺伝子を導入して得られる微生物であって、β-イオノン環の2位の炭素に水酸基を導入できる微生物も含まれる。
本発明には、上記に記載の微生物を、培地で培養して培養物又は菌体からβ-イオノン環の2位または3位の炭素が水酸化されたカロテノイドを得ることを特徴とする、水酸化されたカロテノイドの製造法も含まれる。
2-ヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4’-ジオン及び2,2’-ジヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4’-ジオンは、上述のように脂質の過酸化に対して強い抑制効果を持つので、脂質の抗過酸化剤、更には、脂質に限定されない物質一般に対する抗酸化剤として利用できる。
配列番号1:ブレバンディモナス属SD-212株のcrtI遺伝子の部分配列。
配列番号2:EcoRIでpCos5-2から切り出された12 kbの断片の配列。
配列番号3:上記EcoRI断片に含まれるORF11(β-イオノン環-2-ヒドロキシラーゼ遺伝子と推定される)の配列。
配列番号4:ORF11がコードするアミノ酸配列。
配列番号5:ORF1の増幅用のプライマー(フォワード)
配列番号6:ORF1の増幅用のプライマー(リバース)
配列番号7:crtWの増幅用のプライマー(フォワード)
配列番号8:crtWの増幅用のプライマー(リバース)
配列番号9:crtYの増幅用のプライマー(フォワード)
配列番号10:crtYの増幅用のプライマー(リバース)
配列番号11:crtIの増幅用のプライマー(フォワード)
配列番号12:crtIの増幅用のプライマー(リバース)
配列番号13:crtBの増幅用のプライマー(フォワード)
配列番号14:crtBの増幅用のプライマー(リバース)
配列番号15:ORF6の増幅用のプライマー(フォワード)
配列番号16:ORF6の増幅用のプライマー(リバース)
配列番号17:ORF7の増幅用のプライマー(フォワード)
配列番号18:ORF7の増幅用のプライマー(リバース)
配列番号19:crtEの増幅用のプライマー(フォワード)
配列番号20:crtEの増幅用のプライマー(リバース)
配列番号21:idiの増幅用のプライマー(フォワード)
配列番号22:idiの増幅用のプライマー(リバース)
配列番号23:crtZの増幅用のプライマー(フォワード)
配列番号24:crtZの増幅用のプライマー(リバース)
配列番号25:ORF11の増幅用のプライマー(フォワード)
配列番号26:ORF11の増幅用のプライマー(リバース)
配列番号27:ORF12の増幅用のプライマー(フォワード)
配列番号28:ORF12の増幅用のプライマー(リバース)
配列番号29:上記EcoRI断片に含まれるcrtZ(β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ遺伝子と推定される)の配列。
配列番号30:crtZがコードするアミノ酸配列。
配列番号31:上記EcoRI断片に含まれるcrtE(ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ遺伝子と推定される)の配列。
配列番号32:crtEがコードするアミノ酸配列。
本発明に用いられた菌株とプラスミドを表1に示す。菌株の培養は30℃でLB(Luria-Bertani)培地または、2×YT培地(Sambrook et al., 1989)を用いて行った。必要に応じて、アンピシリン(ampicillin;Ap ,100μg/ml)または、クロラムフェニコール(chloramphenicol;Cm,20 μg/ml)を培地に添加した。
H1438:5'-CGGCGGCCGCCCGGGACTAAGCGGTGTCACCCTTGGTTCT-3’
プラスミドpCAR16(Misawa et al., 1990)を鋳型にして、H1431 [NotI部位(下線)、SD配列(H1431の16-21番目の配列)を含む]とH1432[SalI部位(下線)を含む]プライマーを用いてPCRを行い、得られたPCR産物をNotIとSalIで切断して、1.1 kb NotI-crtE-SalI断片を得た。
H1432:5'-CAGTCGACATCCTTAACTGACGGCAGCGAG-3'
上記の0.76 kb AvaI-crtW-NotI断片と1.1 kb NotI-crtE-SalI断片をNotI部位を介して転結し、pACCAR16ΔcrtXをAvaI/SalI消化して得られた、crtY、crtI、crtBを有する大断片と連結することにより、プラスミドpAC-Canthaを得た。
Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y. Nakamura, K., and Harashima, K., Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by the functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli. J. Bacteriol., 172, 6704-6712, 1990
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Yokoyama, A., Miki, W., Izumida, H., Shizuri, Y. 1996. New Trihydroxy-keto- carotenoids isolated from an astaxanthin-producing marine bacterium. Biosci. Biotechnol. Biochem. 60, 200-203, 1996 (非特許文献2)
Misawa, N., Satomi, Y., Kondo, K., Yokoyama, A., Kajiwara, S., Saito, T., Ohtani, T., and Miki, W., Structure and functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the gene level. J. Bacteriol. 177, 6575-6585, 1995 (非特許文献1)
プラスミドの調製、制限酵素処理、ライゲーション反応、形質転換などの通常の遺伝子操作実験は、前述のSambrookら(1989)のMolecular Cloning(前述の文献)に示された方法により行った。
ブレバンディモナス属(Brevundimonas sp.)SD-212 株(SD212;MBIC 03018)を300 mlのMarine Broth (MB)培地(Difco)で25℃、3日間培養した。菌体を集菌後、STE緩衝液(100 mM NaCl, 10 mM Tris・HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)で二回洗浄し、68℃で15分間熱処理をした後、5 mg/ml のリゾチーム(Sigma)と100 μg/mlのRNase A (Sigma)を含むI液 (50 mM グルコース、25 mM Tris・HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0)に懸濁した。37℃で一時間インキュベートした後、250 μg/mlになるようにProtenase K (Sigma)を加え、37℃で10分間インキュベートした。さらに最終濃度が1% になるようにN-Lauroylsarcosin・Naを添加し、転倒混和により穏やかに完全に混合した後37℃で3時間インキュベートした。さらにフェノール/クロロホルム抽出を数回行った後、2倍量のエタノールをゆっくりと添加しながら、析出してきた染色体DNAをガラス棒で巻きつけ、70% エタノールでリンスした後、2 mlのTE緩衝液(10 mM Tris・HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)に溶解して、染色体DNA溶液とした。
カロテノイド産生細菌間のフィトエンデサチュラーゼ(phytoene desaturase;フィトエン脱水素酵素)遺伝子(crtI)の相同性を利用して得られたcrtI-Foプライマー(5’-TTY GAY GCI GGI CCI ACI GT -3’)、crtI-Reプライマー(5’-CCI GGR TGI GTI CCI GCI CC-3’)を合成し、前出した方法により得られた、ブレバンディモナス属SD-212株の染色体DNAを鋳型として用い、PCR法により増幅した。耐熱性DNAポリメラーゼはLa-Taq (TaKaRa)を用い、96℃で5分間熱変性後、98℃で20秒、58℃で30秒、72℃で1分の条件で35サイクルの増幅を行った。増幅産物は、1% アガロースゲル電気泳動で確認後、1.1 kbの長さのDNAをアガロースゲルから切り出し、精製(Qiagene Gel Extraction kit、QIAGENE、もしくはGene Clean II Kit、BIO101)を行った。精製されたDNA断片は、pGEM-T Easyに連結し、大腸菌(DH5α)を形質転換した。このプラスミドをpCRTI-SD212と名づけ、アンピシリンを添加した2 mlのLB液体培地で37℃、一晩培養後、プラスミドを抽出した。抽出されたプラスミドは Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ver.2 (Perkin-Elmer)とmodel 3700 DNA sequencer (Perkin-Elmer)を用い付属のプロトコールに従って塩基配列(部分配列)の決定を行った。決定されたDNA配列(配列番号1)はBlast (Altschul and Lipman, 1990)を用いホモロジー検索を行いフィトエンデサチュラーゼ(phytoene desaturase)遺伝子(crtI)とホモロジーを持つDNA断片であることを確認した。また、PCR後、精製されたDNA断片の一部は実施例7、8に示すコロニーハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いた。
Altschul, S. F. and Lipman, D. J., Protein database search for multiple alignments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5509-5513, 1990.
ブレバンディモナス属SD-212株の染色体DNAの調製液からファージ粒子を得るところまでの実験方法はStratagene社のSuperCos 1 Cosmid Vector Kitの取扱説明書に従って行った。すなわちブレバンディモナス属SD-212株から得られた染色体DNAをSau3AIで部分消化を行いコスミドベクターのBamHI部位に連結し、LAMBDA INN (Nippon Gene)を用いてファージ粒子にパッケージングした。そして、大腸菌(Escherichia coli)XL1-Blue MR株、及び、プラスミドpACCAR25ΔcrtXを含み ゼアキサンチンを作る大腸菌XL1-Blue MR株に、そのファージを感染させ、抗生物質Ap耐性、及びAp、Cm耐性のコロニーを、Ap、及びAp、Cmを含むLBプレート上に各々、約1,000個ずつ得た。得られたコロニーは滅菌した楊枝を用いて、新たに抗生物質を含むLBプレート上に植え継いだ。なお、この段階で色の変化したコロニーは全く得られなかった。
実施例5で作製したプラスミドpACCAR25ΔcrtXを含み ゼアキサンチンを作る大腸菌を宿主として作製したコスミドライブラリー700コロニーを用いて、各々2 mlずつ培養し、アセトンでカロテノイド色素を抽出した後、HPLC-PDA(フォトダイオードアレィ検出器)分析により、カロテノイドの分析を行った。方法は、実施例11に示されている。コントロールのゼアキサンチンに加えて、新たなカロテノイドが生成していないかどうかの検討を行った。その結果、新たなカロテノイドを合成するものは全く得られなかった。したがって、ブレバンディモナス属SD-212株のカロテノイド生合成遺伝子の発現クローニングは不可能であると結論した。
実施例5で作製した大腸菌XL1-Blue MRを宿主として作製したコスミドライブラリー500コロニーを用いて、実施例4で示したPCR法により増幅したフィトエンデサチュラーゼ遺伝子(crtI)の部分断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション(colony hybridization)法を行い、crtI遺伝子を含むクローンのスクリーニングを行った。まず、大腸菌をプレートに植え37℃で培養した。このとき、大腸菌は一枚のプレートあたり、48コロニーずつ植え付けた。一晩培養後、直径82 mmのHybond-N+メンブレン(Amersham Pharmacia)をプレートに乗せ、注射針で目印をつけた。メンブレンをはがし、菌体が付着した面を上に向け、10% SDS溶液を含んだ3 mmろ紙(Whattman)で5分間インキュベート後、さらに変性溶液(1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH)を含んだ3 mmろ紙で5分間インキュベートを行い、その後メンブレンを中和液(1.5 M NaCl, 0.5M Tris・HCl)に5分間つけた(2回)。さらに2×SSCで2回洗浄した。このとき、細胞の破片を残さないようにキムタオルでメンブレンを強くこすった。処理後、メンブレンは、キムタオル、キムワイプ上で30分間風乾後、80℃で2時間ベーキング(baking)を行い、メンブレンにDNAを固定した。プローブDNAは、Alkphos Direct Labeling and Detection System (Amersham Pharmacia)を用い、添付のプロトコールに従って作製し、コロニーハイブリダイゼーションを行った。その結果、500株のクローンから、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子(crtI)の部分断片をプローブDNAとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法により6個のポジティブクローンが得られた。6個のポジティブクローンに存在するプラスミドを、pCos5-1、pCos5-2、pCos7-1、pCos8-1、pCos9-1、pCos10-1と名づけた。
実施例7で選抜された、6つのポジティブクローンを、Apを添加した2 mlのLB液体培地で37℃、一晩培養した後、プラスミドDNAを抽出した。抽出後のプラスミドDNAは、EcoRIで37℃、数時間インキュベートし、完全消化した後、電気泳動を行った。コントロールとして、ベクターのSuperCos 1、ブレバンディモナス属SD-212の染色体DNAを同様に消化したものを用いた。電気泳動には、小型のサブマリン型の電気泳動漕Mupid(コスモバイオ)を用い1%アガロースゲルを用いて50 Vで約70分電気泳動を行った。なお、電気泳動バッファーには1×TBEバッファーを用いた。ゲルは電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、超純水で脱色後、UV照射下で写真撮影をした(図3)。その後0.4M NaOH溶液を用いてキャピラリーブロッティングを行うことによりナイロンメンブレン(Hybond N+)にトランスファーした。処理後、メンブレンを80℃で2時間、ベーキング(baking)を行い、メンブレンにDNAを固定した。その後、Alkphos Direct Labeling and Detection System (Amersham Pharmacia)を用い、添付のプロトコールに従って、サザンハイブリダイゼーションを行った。また、プローブDNAには、前述したフィトエンデサチュラーゼ遺伝子(crtI)の部分断片を用いた。その結果、6つのポジティブクローンのうちpCos5-2、pCos7-1、pCos9-1の3つのクローンにおいて、12 kbのEcoRI断片にポジティブシグナルが認められた(図3)。コントロールのSD-212染色体DNAは、電気泳動で確認したところ、高分子側でスミアなバンドが認められ、ほとんど消化されていなかった。僅かながらも、高分子側で陽性のシグナルが認められた。ほとんど消化されない原因としては、染色体DNAが部分的にメチル化されEcoRIによる分解が阻害されたことなどが考えられる。さらに、3つのポジティブクローンのプラスミドとSuperCos 1、ブレバンディモナス属SD-212株の染色体DNAをBamHIもしくはBamHI-EcoRIで消化し、同様の実験を行った(図4)。その結果BamHIによる消化を行ったものでは、9 kbのDNA断片にポジティブシグナルが認められ、BamHI-EcoRIによる消化を行ったものでは、8.2 kbのポジティブシグナルが認められた。ブレバンディモナス属SD-212株の染色体DNAの消化物にも、同様のサイズのバンドでポジティブシグナルが薄いながらも認められた。
実施例8で選抜された3つの陽性クローン(pCos5-2、pCos7-1、pCos9-1)のうちpCos5-2を用い、12 kbの挿入断片をEcoRIで切り出し、プラスミドベクターpBluescript II KS-のEcoRI部位に連結し、大腸菌(E. coli)DH5α株を形質転換した。このプラスミドをp5Bre2-15と名づけた。この大腸菌を、Apを添加した2 mlのLB液体培地で37℃、一晩培養後、プラスミドを抽出した。抽出されたプラスミドはBig Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ver.2 (Perkin-Elmer)とmodel 3700 DNA sequencer (Perkin-Elmer)を用い付属のプロトコールに従って塩基配列の決定を行った。決定されたDNA配列(配列番号2)はGeneMark.hmm(Lukashin A. and Borodovsky M.)用い遺伝子コード領域を推定し、SD様配列の確認などを行い、12 kbの断片中に12個のORF(open reading frame)を発見した(図5)。Blast を用い、各ORFのアミノ酸配列レベルでのホモロジー検索を行い、12個のうち7個は、既知のカロテノイド生合成遺伝子(crtW, crtY, crtI, crtB, crtE, crtZ, idi)と相同性を示すことがわかった(表2)。残りの5個の遺伝子(ORF)は、既存のどんな遺伝子とも全体的な相同性は有さない未知遺伝子であった。ブレバンディモナス属SD-212株由来の既知のカロテノイド生合成酵素とホモロジーがあった7個のCrt酵素(1個のIdiを含む)と、他生物由来の相当酵素との同一性(identity;同一のアミノ酸配列の比率)の検索は、正確を期すために以下のようにして行った。すなわち、Blastプログラム(ver. 2)(Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and Lipmann, D. J., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, 1997)を用い、GenBank/DDBJのデータベースからホモロジー検索(tBlastn)を行った。次に、ヒットしたアミノ酸配列を用い、各Crtタンパク質について、Clustal Wプログラム(ver. 1.8)(Higgins, D. G., Thompson, J. D., and Gibson, T. J., Methods Enzymol. 266, 383-402, 1996)、及び、GeneDocプログラム(Nicholas, K. B., Nicholas H. B. Jr., and Deerfield, D. W. II., Embnew. News 4, 14, 1997)による解析を行い、各タンパク質における全領域間の同一性(identity)を求めた。表2には、ブレバンディモナス属SD-212株由来の各Crtタンパク質(1個のIdiを含む)と最もホモロジーが高かった他細菌由来のCrtタンパク質との同一性が示されている。本解析の結果、ブレバンディモナス属SD-212株由来の7個のCrtタンパク質(1個のIdiを含む)は、既知の他生物由来の相当タンパク質とは中程度以下のホモロジーしか示さないことが明らかとなった。表2からわかるように、最も高いホモロジーを示したSD-212株由来のCrtIでも72%の同一性であった。さらに驚くべきことには、SD-212株由来のCrtZとCrtEの場合は、50%を超える同一性を示す既知の他生物由来の相当タンパク質は見出されなく、最も高いものでも、それぞれ、46%及び39%の同一性であった。SD-212株のcrtZ遺伝子は、配列番号2に示された12 kb(11,991 kb)のEcoRI断片の相補鎖における塩基番号1,319から1,804にコードされる遺伝子で、その塩基配列は配列番号29に、コードされるアミノ酸配列(CrtZ)は配列番号30に示されている。SD-212株のcrtE遺伝子は、配列番号2に示された12 kb(11,991 kb)のEcoRI断片の相補鎖における塩基番号2,963から3,859にコードされる遺伝子で、その塩基配列は配列番号31に、コードされるアミノ酸配列(CrtE)は配列番号32に示されている。
Misawa,N., Nakagawa,M., Kobayashi,K., Yamano,S., Izawa,Y.,Nakamura,K. and Harashima,K., Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli. J. Bacteriol. 172, 6704-6712, 1990
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〔実施例10〕 β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質発現用プラスミドの構築
各種ORFの機能を明らかにするため、大腸菌ベクターpUC18(TOYOBO)のコードするβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)のリード配列との融合タンパク質となるように各ORFを、プラスミドp5Bre2-15のDNAを鋳型としてPCRで増幅し、β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質発現用の各種プラスミドの構築を行った。この方法により大腸菌で機能発現されることを期待したからである。具体的には、各ORFを5’末端側にEcoRI部位を、3’末端側にBamHIもしくはXbaI部位を持つ増幅産物が得られるように設計した配列番号(5〜28)のプライマーを用いてPCRにて増幅した。耐熱性DNAポリメラーゼはLa-Taq (TaKaRa)を用い、各々96℃で5分間熱変性後、98℃で20秒、56℃で30秒、72℃で1分の条件で35サイクルの増幅を行った。増幅産物の一部は、1%アガロースゲル電気泳動で確認した。残りの増幅産物はエタノール沈殿後、EcoRIによる消化と、BamHIもしくはXbaIによる消化を行い。1%アガロースゲル電気泳動を行った。次に目的の長さのDNAをアガロースゲルから切り出し、精製(Qiagene Gel Extraction kit、QIAGENE、もしくはGene Clean II Kit、BIO101)を行った。切り出されたDNAはpUC18のEcoRIと、BamHIもしくはXbaI部位に連結し、大腸菌DH5αに形質転換した。このβ-ガラクトシダーゼ融合タンパク質発現用プラスミドでは、各ORFの本来の開始のアミノ酸配列Metの前に、β-ガラクトシダーゼの7個のアミノ酸からなるリーダ配列MetThrMetIleThrAsnSerが付加されるようにデザインされている。
実施例10で示したプラスミドのうち、crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ, crtW遺伝子を含むプラスミドを有する大腸菌を、Apを添加した2 mlのLB液体培地で37℃、一晩培養後、プラスミドを抽出した。抽出されたプラスミドはBig Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ver.2 (Perkin-Elmer)とmodel 3700 DNA sequencer (Perkin-Elmer)を用い付属のプロトコールに従って塩基配列の確認を行った。各プラスミドの名前をそれぞれpUCBre-E (lacZ::crtE)、pUCBre-B (lacZ::crtB)、pUCBre-I (lacZ::crtI)、pUCBre-Y (lacZ ::crtY)、pUCBre-Z (lacZ::crtZ)、pUCBre-W (lacZ ::crtW)と名づけた。
実施例10で示したプラスミドのうち、機能の推定ができないORF1, ORF6, ORF7, ORF11, ORF12を含むプラスミドを有する大腸菌を、Apを添加した2 mlのLB液体培地で37℃、一晩培養後、プラスミドを抽出した。抽出されたプラスミドはBig Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ver.2 (Perkin-Elmer)とmodel 3700 DNA sequencer (Perkin-Elmer)を用い付属のプロトコールに従って塩基配列の確認を行った。各プラスミドの名前をそれぞれpUCBre-O1(lacZ::SD212-ORF1)、pUCBre-O6(lacZ::SD212-ORF6)、pUCBre-O7(lacZ::SD212-ORF7)、pUCBre-O11(lacZ::SD212-ORF11)、pUCBre-O12(lacZ::SD212-ORF12)と名づけた。その後、表3の左に示す各種カロテノイド生産性プラスミド(Cm耐性)を有する大腸菌にこれらのプラスミドを導入し、Ap、Cmを添加した2 mlのLB液体培地で1 mMのIPTG添加による誘導下で30℃、48培養後、遠心分離により集菌し、菌体をSTEで二回洗浄後、200 μlのアセトンを添加し、ボルテックすることにより色素を菌体からアセトンへ移した。その後、遠心分離を行い、上清をろ過し、HPLC-PDAシステムにより、実施例11と同様方法により色素の分析を行った。
pUCBre-O11及びpACCAR25ΔcrtXを導入した大腸菌を2 L(リットル)の2xYT培地で培養し、8,000 rpmで10分間遠心することにより、菌体を集めた。菌体をSTE緩衝液(実施例3参照)で懸濁し、8,000 rpmで10分間遠心することにより、再度、菌体を集めた。菌体にアセトン−メタノール(1:1)400 mlを加えて1時間撹拌した。濾過後、濾液を減圧濃縮し、267 mgの抽出物を得た。これをシリカゲル-60(15 g)カラムクロマトグラフィーで分離した。溶媒はヘキサン−酢酸エチル(8:2)(7:3)(6:4)および(1:1)各100 mlで順次溶出し、着色した3フラクションを得た。1つはゼアキサンチンであったので、残りの2フラクションの同定を行った。同定はHPLC-PDA-MS分析、1H-NMR分析により行った。HPLC-PDA-MS分析は、PDA(フォトダイオードアレィ)検出器付きセミミクロHPLCシステムとして資生堂製Nano Space SI-2を用い、これにサーモクエスト(ThermoQuest)社製イオントラップ型質量分析装置LCQ advantageシステムを接続した機器を用いて行った。カラムはC30 カラムである野村化学社製Deverosil C30-UG-3(1.0 mm i.d. × 150 mm)を用い、プレカラムとしてDeverosil C30-UG-Sを用いた。溶出条件として、0.1 ml/min の流速で、96%メタノール(A)で12分、Aからtert-メチルブチルエーテル(TMBE)(B)へのグラジエント(B: 0-60%、12〜72分)、そのままの状態で72〜82分溶出した。MSは大気圧化学イオン化法(APCI)により検出した。1H-NMRはバリアン社製INOVA750システムを用いて重クロロホルム中で測定した。
pUCBre-O11及びpAC-Canthaを導入した大腸菌を2リットルの2xYT培地で培養し、8,000 rpmで10分間遠心することにより、菌体を集めた。菌体をSTE緩衝液(実施例3参照)で懸濁し、8,000 rpmで10分間遠心することにより、再度、菌体を集めた。菌体にアセトン-メタノール(1:1)400 mlを加えて1時間撹拌した。濾過後、濾液を減圧濃縮し、85 mgの抽出物を得た。これをシリカゲル-60(15 g)カラムクロマトグラフィーで分離した。溶媒はヘキサン−酢酸エチル(8:2)(7:3)および(1:1)各100 mlで順次溶出し、着色した3フラクションを得た。1つはカンタキサンチンであったので、残りの2フラクションの同定を行った。HPLC-PDA-MS分析(RT 9.30分、λmax 472 nm、m/z 597.2 [M+H]+、及び、RT 17.62 分、λmax 474 nm、m/z 581.2 [M+H]+)、高分解(HR)FABMS分析、1Hならびに各種二次元NMR分析により、これらは、2,2’-ジヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4’-ジオン(2,2’-dihydroxy-β,β-carotene-4,4’-dione;2,2’-ジヒドロキシカンタキサンチン、新規化合物(I))、及び、2-ヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4’-ジオン(2-hydroxy-β,β-carotene-4,4’-dione;2-ヒドロキシカンタキサンチン)であると同定された(図10参照)。
各種カロテノイドにおける種々の生理活性作用は多様であるが、活性酸素による生体内脂質の過酸化を抑制する活性がその基本であると考えられる。したがって、実施例14で合成された2つのカロテノイドを用いて、フリーラジカルにより引き起こされる脂質過酸化のin vitro抑制効果を、ラット脳ホモジネートを用いて調べた。このアッセイは、基本的にKuboらの方法に準拠して行った (Kubo, K., Yoshitake, Y., Kumada, K., Shuto K., Nakamizo, N. Radical scavenging action of flunarizine in rat brain in vitro. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 272, 283-295, 1984)。100 mMリン酸緩衝液(pH7.4)0.6 ml中に、被検試料のメタノール溶液0.05 ml、1 mMアスコルビン酸0.1 ml(最終濃度100 μM)、及びH2O 0.05 mlを添加し、37℃で5分間のプレインキュベーションを行った後、2.5%(w/v)ラット脳ホモジネートを0.2 ml添加することで反応を開始させ、37℃で1時間、振盪しながらインキュベートを行った。20%(w/v)トリクロロ酢酸、0.5%(w/v)2-チオバルビツール酸、及び0.2 N塩酸を含む混合液1 mlを上記反応液に添加することで反応を停止した。これを100℃で30分間煮沸処理して発色させ、冷却後、3000 rpmで5分間遠心分離した。遠心分離上清の532 nmでの吸光度(A532)を測定した。被検試料添加群のA532が、被検試料無添加群のA532と比べ半分低下するのに必要な被検試料濃度をIC50として算出し、これをラット脳ホモジネートにおける脂質過酸化抑制作用とした。本実験結果を表4に示す。表4から明らかなように、2-ヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4’-ジオン(2-ヒドロキシカンタキサンチン)及び2,2’-ジヒドロキシ-β,β-カロテン-4,4’-ジオン(2,2’-ジヒドロキシカンタキサンチン)は、脂質の過酸化に対して強い抑制効果を持つことが示された。特に後者の新規物質は、強力な脂質の過酸化の抑制作用を示した。
Claims (7)
- 以下の(e)又は(f)に示すペプチドをコードする遺伝子:
(e)配列番号30記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(f)配列番号30記載のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド。 - 以下の(g1)又は(g2)のDNAからなる遺伝子:
(g1)配列番号29記載の塩基配列からなるDNA、
(g2)配列番号29記載の塩基配列からなるDNAと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチドをコードするDNA。 - 請求項1又は2に記載の遺伝子を導入して得られる微生物であって、β-イオノン環の3位の炭素に水酸基を導入できる微生物。
- 請求項1又は2に記載の遺伝子を、他のカロテノイド生合成遺伝子とともに導入して得られる微生物であって、β-イオノン環の3位の炭素に水酸基を導入できる微生物。
- 他のカロテノイド生合成遺伝子が、ファルネシルピロリン酸からβ-イオノン環を有するカロテノイドを合成するのに必要とされる遺伝子群の全部又は一部であることを特徴とする請求項4に記載の微生物。
- 微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項3乃至5のいずれかに記載の微生物。
- 請求項3乃至6のいずれかに記載の微生物を、培地で培養して培養物又は菌体からβ-イオノン環の3位の炭素が水酸化されたカロテノイドを得ることを特徴とする、水酸化されたカロテノイドの製造法。
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