KR20040085369A

KR20040085369A - 카로티노이드계 색소 생합성에 관여하는 유전자

Info

Publication number: KR20040085369A
Application number: KR1020030020023A
Authority: KR
Inventors: 김영태; 이재형
Original assignee: 김영태; 주식회사 알진텍; 이재형
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2003-03-31
Publication date: 2004-10-08

Abstract

본 발명은 카로티노이드 생합성에 관여하는 유전자에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 카로티노이드 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12로 기재되는 유전자를 포함하는 카로티노이드 생합성 유전자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 카로티노이드 생합성 유전자는 카로티노이드의 대량 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

카로티노이드계 색소 생합성에 관여하는 유전자{Genes involved in the biosynthesis of carotenoids}

본 발명은 카로티노이드 생합성에 관여하는 유전자에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 카로티노이드 생합성에 필요한 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6,서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12의 유전자를 포함하는 카로티노이드 생합성 유전자에 관한 것이다.

카로티노이드(carotenoids)는 항산화 활성을 가지고 있는 C₄₀이소프레노이드 화합물(isopenoid compounds)로서, 자연계에 널리 분포되어 있는 한 군의 색소의 총칭을 말한다. 현재까지 알려진 카로티노이드는 6백여 종에 이르며, 이들은 각각 다른 형태로 존재한다. 카로티노이드는 분자 구조에 따라 노란색, 적색, 주홍색, 주황색 등 여러 색으로 존재한다. 그 예로는 β-카로텐(β-carotene; 당근의 주황색 색소), 리코펜(licopene; 토마토의 적색 색소), 푸코잔틴(fucoxanthin; 해조류의 황갈색 또는 갈색 색소) 등이 있다. 카로티노이드는 인체 내에서 비타민 A의 전구체로서의 역할을 하며, 산화 방지효과와 유해산소 소거작용, 암세포의 증식 억제작용 및 발암 억제작용이 강하여 순환기 질환, 암 및 성인병 등을 예방하는 효능을 가진 것으로 알려져 있다. 최근에는 카로티노이드가 직접적인 자외선에 의한 신체의 면역기능을 향상시켜 자외선 노출로부터 피부의 손상을 줄여주거나 멜라닌 생성을 억제함이 밝혀지면서 유럽이나 미국에서 미용 소재로 각광을 받기 시작했다. 현재 카로티노이드는 건강식품 소재(영양 보충제), 인간을 대상으로 한 약학적 제제와 식품 착색제 또는 동물용 사료의 색소 등으로 사용되고 있다.

카로티노이드 중에서도 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 아스타잔틴(3, 3'-dihydroxy-β,β-carotene-4, 4'-dione)은 천연적으로 생산되는주홍색 또는 밝은 오렌지색의 색소 물질이다.

아스타잔틴은 주로 새우, 붉은 도미류(red seabream), 연어(salmon) 및 바다가재(lobsters) 등과 같은 해양 동물 조직에 존재하는 것으로 알려져 있다(Fujitaet al.,Nippon Suisan Gakkaishi.,49: 1855-1869, 1983; Johnson, E. A.,Crit. Rev. Biotechnol.,11: 297-326, 1991; Neliset al.,J. Appl. Bacteriol.,70: 181-191, 1991). 아스타잔틴은 정상적인 호기적 대사과정 중 활성산소가 세포 내 DNA, 단백질, 지질 등을 손상시키는 것과 더불어 세포와 조직의 노화 및 발암을 유발하는 반응을 억제할 뿐만 아니라, 유리 라디칼(hydroxy or peroxy radicals)의 생성을 억제하는 작용을 한다(Palozzaet al., Arch. Biochem. Biophys., 297: 291-295, 1992; Shimidzuet al., Fish Sci., 62: 134-137, 1996). 또한, 아스타잔틴은 면역 조절 활성(immune modulatory activity) 및 심장 조절 효과(cardioprotective effect)를 갖는 것으로 알려졌다(Jyonuchiet al., Nutr. Cancer., 19: 269-280, 1993). 특히, 아스타잔틴의 항산화력은 다른 카로티노이드의 10배 이상이고, α-토코페롤(tocopherol)의 100배 이상인 것으로 알려져 있다.또한, 현재까지 아스타잔틴의 독성(toxicity)에 대해서는 보고된 바 없다. 따라서, 아스타잔틴은 신경질환(neurodegenerative diseases), 암(cancer), 면역질환(immune disorders), 심장혈관질환(cardiovascular diseases) 등을 포함하는 다양한 질환의 치료 및 예방에 이용되고 있고, 또한 이에 대한 연구가 계속 되고 있다(Beal, H. F.,The Neuroscientist, 3: 21-27, 1991; Chewet al.,Anticancer Res., 19: 1849-1853, 1999; Murillo E.,Arch. Latinoam. Nutr., 42: 409-413, 1992). 또한, 아스타잔틴은 산업적으로 색소증진 물질로 이용되고 있으며, 우리나라에서는 '파피아 색소'라는 명칭으로 식품첨가물로 등록되어 있다. 이러한 이유로 아스타잔틴의 수요는 매년 15% 이상의 소비성장을 보이고 있으며, 이에 따라 아스타잔틴의 중요성이 대두되고 있다.

최근에 스위스의 호프만-라로췌(F. Hoffman-LaRoche) 사에서 아스타잔틴의 화학 합성법을 개발하였으나, 화학합성으로 제조된 아스타잔틴은 천연 아스타잔틴에 비해 낮은 생체 흡수율을 보이고, 식품 첨가제로서의 안전성에 문제가 되고 있어 유럽의 일부 국가에서만 사용이 허가된 상태이다. 따라서, 천연 아스타잔틴의 합성법에 관심이 집중되고 있으며, 아스타잔틴을 생산하는 미생물을 이용한 아스타잔틴의 제조에 상업적 관심이 일고 있다. 현재 아스타잔틴을 생산하는 것으로 알려진 미생물로는 효모인 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma; Milleret al.,Int. J. Syst. Bacteriol., 48: 529-536, 1976), 녹색조류인 해마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis; Bubrick,Bioresour Technol., 38: 237-239, 1991), 그람-양성균 브레비박테리움 103(Brevibacterium103; Lizuka &Nishimura,J. Gen. Appl. Microbiol., 15: 127-134, 1969), 그람-음성균 아그로박테리움 아우란티아컴(Agrobacterium aurantiacum; Yokoyamaet al.,Biosci. Biotechnol. Biochem., 58: 1842-1844, 1994), 파라코커스 마르쿠시아이(Paracoccus marcusii; Harkeret al.,Int. J. Syst. Bacteriol., 48: 543-548, 1998) 및 파라코커스 카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens; Tsubokuraet al.,Int. J. Syst. Bacteriol., 49: 277-282, 1999) 등이 알려져 있다.

한편, 최근 6년 동안 카로티노이드 생합성에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자들에 대해 연구되어 왔다. 그 결과, 많은 카로티노이드 생합성 유전자들이 다양한 미생물로부터 클로닝되었으며, 이들의 기능이 규명되었다(Armstrong, G. A.,J. Bacteriol.,176: 4795-4802, 1994; Sandmann, G.,Eur. J. Biochem.,223: 7-24, 1994; Wieland, B.,J. Bacteriol.,176: 7719-7726, 1994). 카로티노이드 생합성 경로는 일반적인 이소프레노이드(isoprenoid) 경로의 중요한 중간 생성물인 FPP(farnesyl pyrophosphate)로부터 파생한다.도 1을 참조하면, FPP와 IPP(isopentenyl pyrophosphate)는crtE에 의해 암호화되는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신테이즈(geranylgeranyl pyrophosphate synthase)에 의해 GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate)로 된다. 이후, GGPP는crtB에 의해 암호화되는 피토엔 신테이즈(phytoene synthase),crtI에 의해 암호화되는 피토엔 디세튜레이즈(phytoene desaturase), 그리고crtY에 의해 암호화되는 리코펜싸이클레이즈(lycopene cyclase)에 의해 일련의 반응을 거쳐 β-카로텐로 전환된다. β-카로텐은crtW에 의해 암호화되는 β-카로텐 케토레이즈(β-carotene ketolase)와crtZ에 의해 암호화되는 β-카로텐 하이드록실레이즈(β-carotene hydroxylase)에 의해 일련의 반응을 거쳐 아스타잔틴으로 전환된다.

카로티노이드 생합성에 관여하는crt유전자(carotenogenic gene)의 염기서열, 이의 구성(organization) 및 단백질의 특성이 로도박터 캡슐라터스(Rhodobacter capsulatus)(Armstronget al., Mol. Gen. Genet., 216: 254-268, 1989)와 에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola)(Sandimannet al., FEMS Microbiol. Lett., 71: 77-82, 1990; Hundleet al., Photochem. Photobiol., 54: 89-93, 1991) 및 에르위니아 우레도보라(Erwinia uredovora)(Misawaet al., J. Bacteriol., 172: 6704-6712, 1990)에서 규명된 바 있다. 또한,crtB,crtI, crtY,crtW및crtZ로 이루어진 카로티노이드 생합성crt유전자가 해양미생물인 아그로박테리움 아우란티아컴으로부터 분리된 바 있으며(Norihikoet al.,J. Bacteriol., 177(22): 6575-6584, 1995), GGPP로부터 β-카로텐까지의 반응을 촉매하는 효소들을 코딩하는 3개의 유전자들(crtB,crtI및crtY)과 이들이 도입된 파피아 로도지마에 대해 보고된 바 있다(WO 97/23633).

이에, 본 발명자들은 아스타잔틴을 생산하는 파라코커스 해운대시스로부터 카로티노이드 생합성에 관여하는 유전자들을 분리하기 위해 연구를 거듭하던 중,crtE,crtB,crtI, crtY,crtW및crtZ유전자, 그리고 이들을 포함하는crt유전자를 클로닝하여 그의 염기서열을 규명하고, 상기crt유전자를 이용하여 카로티노이드를 생산하지 않는 미생물에서 카로티노이드를 생산할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 카로티노이드 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

나아가, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 이용하여 카로티노이드를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 카로티노이드의 생합성 경로를 도시한 것이다.

도 2는 파라코커스 해운대시스로부터 분리된 DNA 단편에 존재하는 첫 번째 ORF(open reading frame)의 아미노산 서열과 알칼리제네스 속 미생물과 브라디리조비움 속 미생물로부터 분리된 β-카로텐 케토레이즈(β-carotene ketolase; crtW)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.

P. haeundaesis: 파라코커스 해운대시스

Alcaligenes_sp: 알칼리제네스 속

Bradyrhizobium_sp: 브라디리조비움 속

Consensus: 일치하는 아미노산 서열

도 3은 파라코커스 해운대시스로부터 분리된 DNA 단편에 존재하는 두 번째 ORF의 아미노산 서열과 알칼리제네스 속 미생물로부터 β-카로텐 하이드록실레이즈(β-carotene hydroxylase; crtZ)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.

P. haeundaesis: 파라코커스 해운대시스

Alcaligenes_sp: 알칼리제네스 속

Consensus: 일치하는 아미노산 서열

도 4는 파라코커스 해운대시스로부터 분리된 DNA 단편에 존재하는 세 번째 ORF의 아미노산 서열과 플라보박테리움 속 미생물로부터 분리된 리코펜 싸이클레이즈(licopene cyclase; crtY)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.

P. haeundaesis: 파라코커스 해운대시스

Flavobacterium_sp: 플라보박테리움 속

Consensus: 일치하는 아미노산 서열

도 5는 파라코커스 해운대시스로부터 분리된 DNA 단편에 존재하는 네 번째 ORF의 아미노산 서열과 플라보박테리움 속 미생물로부터 분리된 피토엔 디세튜레이즈(phytoene desaturase; crtI)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.

P. haeundaesis: 파라코커스 해운대시스

Flavobacterium_sp: 플라보박테리움 속

Consensus: 일치하는 아미노산 서열

도 6은 파라코커스 해운대시스로부터 분리된 DNA 단편에 존재하는 다섯 번째 ORF의 아미노산 서열과 플라보박테리움 속 미생물로부터 분리된 피토엔 신테이즈(phytoene synthase; crtB)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.

P. haeundaesis: 파라코커스 해운대시스

Flavobacterium_sp: 플라보박테리움 속

Consensus: 일치하는 아미노산 서열

도 7은 파라코커스 해운대시스로부터 분리된 DNA 단편에 존재하는 여섯 번째 ORF의 아미노산 서열과 플라보박테리움 속 미생물로부터 분리된 제라닐제라닐 피로포스페이트 신테이즈(geranylgeranyl pyrophosphate synthase; crtE)의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.

P. haeundaesis: 파라코커스 해운대시스

Flavobacterium_sp: 플라보박테리움 속

Consensus: 일치하는 아미노산 서열

도 8은 파라코커스 해운대시스로부터 분리된crt유전자의 구성(organization)을 도시화한 것이다.

도 9는 본 발명의 pCR-XL-TOPO-crtfull 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명의crt유전자가 도입된 형질전환체의 배양액으로부터 추출된 메탄올 추출액의 흡광도 변화(190-890 nm:A및 350-550 nm :B)를 스캐닝한 결과를 도시한 것으로서, 450 nm의 피크는 β-카로텐의 고유 피크이고, 470 nm의 피크는 아스타잔틴의 고유 피크이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카로티노이드 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 카로티노이드 생합성 유전자를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는crt유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 카로티노이드 생합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 카로티노이드 생합성 유전자를 이용하여 카로티노이드를 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 카로티노이드 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 유전자를 제공한다.

상기 유전자는 아스타잔틴을 생산하는 파라코커스 해운대시스(기탁번호:KCCM-10460)로부터 분리된 유전자이다.

본 발명의 카로티노이드 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하다. 상기 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12로 기재되는 염기서열은 각각 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 및 서열번호 13으로 기재되는 아미노산을 암호화하는 서열이다. 본 발명의 6개의 유전자 및 이로부터 코딩되는 단백질에 대하여 하기표 1에 기재하였다.

유전자	유전자명	단백질	단백질의아미노산 서열
서열번호 2	crtW	β-카로텐 케토레이즈(β-carotene ketolase)	서열번호 3
서열번호 4	crtZ	β-카로텐 하이드록실레이즈(β-carotene hydroxylase)	서열번호 5
서열번호 6	crtY	리코펜 싸이클레이즈(licopene cyclase)	서열번호 7
서열번호 8	crtI	피토엔 디세튜레이즈(phytoene desaturase)	서열번호 9
서열번호 10	crtB	피토엔 신테이즈(phytoene synthase)	서열번호 11
서열번호 12	crtE	제라닐제라닐 피로포스페이트 신테이즈(geranylgeranyl pyrophosphate synthase)	서열번호 13

본 발명에 따라 제공되는 유전자들은 다양한 숙주세포에 도입되어 카로티노이드를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 상기 유전자들은 단독으로 사용될 수도 있으며, 2개 이상이 함께 사용될 수도 있다. 예컨대, 리코펜 싸이클레이즈를 코딩하는 서열번호 6으로 기재되는 유전자는crtE,crtB및crtI만을 가지고 있는 미생물에 도입되어 β-카로텐을 생산하는데 사용될 수 있으며, β-카로텐 케토레이즈 및 β-카로텐 하이드록실레이즈를 각각 코딩하는 서열번호 2 및 서열번호 4로 기재되는 유전자는 β-카로텐을 생산하는 미생물(예: 파피라 로도지마 ATCC96815)에 도입되어 아스타잔틴을 생산하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자들을 모두 포함하는 카로티노이드 생합성 유전자를 제공한다.

상기 카로티노이드 생합성 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 카로티노이드 생합성 유전자(carotenoid synthesis gene, 이하 'crt유전자'라 약칭함)는 FPP(farnensyl pyrophosphate)로부터 아스타잔틴을 생산하는 과정에 관여하는 모든 카로티노이드 생합성 유전자들을 포함한다. 본 발명의crt유전자의 구성을도 8에 도시하였다.도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의crt유전자는 6,223 bp의 크기이며, 그 내부에는 5'→3' 방향으로crtW,crtZ,crtY,crtI,crtB및crtE유전자가 순서대로 위치하고 있다. 또한, 그 내부에는KpnⅠ,SmaⅠ,XmaⅠ,ClaⅠ,HindⅢ 및BamHⅠ 인식서열이 하나씩 존재하고 있다.crtW,crtZ,crtY,crtI및crtB유전자들은 종결코돈(stop codon)과 그 다음 유전자의 시작코돈(start codon)이 중첩(overlap)되어 존재한다. 특히,crtE유전자는 상보적 가닥(complementary strand)의 방향으로 존재한다.

본 발명의 재조합 벡터는crt유전자를 기본 벡터에 삽입하여 제조한 것이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 기본 벡터는 유전자의 클로닝 또는 발현에 일반적으로 사용되는 벡터라면 제한없이 사용될 수 있다. 또한, 벡터는 숙주세포에 따라 달라질 수 있다. 즉, 숙주세포로 대장균을 사용하는 경우에는 대장균의 복제기원을 가지고 있는 대장균용 벡터를 사용하는 것이 바람직하고, 효모를 사용하는 경우에는 효모의 복제기원을 가지고 있는 효모용 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 대장균과 효모의 복제기원을 둘 다 가지고 있는 셔틀 벡터(shuttle vector)를 사용할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pCR-XL-TOPO 벡터를 사용하여crt유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하였으며, 이를 'pCR-XL-TOPOcrtfull'이라 명명하였다.

또한, 본 발명은 상기 카로티노이드 생합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 형질도입한 균주를 제공한다.

상기에서 숙주세포는 대장균 또는 효모를 사용할 수 있으며, 대장균은 XLl-Blue, TOPO, BL21(DE3) 코돈 플러스(codon plus), DH1 및 DH5α 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 서열번호 1로 기재되는crt유전자를 포함하는 재조합 벡터 pCR-XL-TOPO crtfull을 대장균인 BL21(DE3) 코돈 플러스에 형질도입한 균주를 제조하였다.

또한, 본 발명은 카로티노이드 생합성 유전자를 이용하여 카로티노이드를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 카로티노이드 생산 방법은

1) 서열번호 1의crt유전자를 클로닝하는 단계;

2) 단계 1의 유전자를 삽입한 재조합 벡터를 제조하는 단계;

3) 단계 2의 재조합 벡터를 숙주세포에 형질도입하는 단계;

4) 단계 3의 형질도입된 균주를 배양하여 그 배양액으로부터 카로티노이드를 회수하는 단계를 포함한다.

상기에서 숙주세포로는 대장균을 사용할 수 있다. 이 때 대장균으로는 일반적인 형질전환에 사용되는 것이라면 제한없이 사용될 수 있으나, XLl-Blue, TOPO, BL21(DE3) 코돈 플러스(codon plus), DH1 및 DH5α로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 BL21(DE3) 코돈 플러스를 사용하였다. 또한, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 숙주세포는 대장균에만 제한되는 것은 아니며, 효모를 사용할 수 있다.

상기에서 배양은 단계 1 내지 단계 3을 통해 제조된 균주를 생육가능한 배지에서 1차 배양하고 배양액으로부터 균체를 회수한 후, 다시 상기 균체에 유기용매를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 2차 배양하는 것이 바람직하다. 이 때 배양액에 카로티노이드의 생성을 유도하는 유도제(inducer), 예컨대 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranside)를 추가로 첨가할 수 있으며, 또한 카로티노이드 기질, 예컨대 FPP(farnesyl pyrophosphate), GGPP(geranylgeranyl diphosphate) 또는 GPP(geranylpyrophosphate)를 추가로 첨가할 수 있다. 상기 배양액으로부터 카로티노이드를 용출하기 위한 유기용매로는 메탄올, 아세톤 또는 에틸에테르를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 메탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 배양액으로부터 카로티노이드의 회수는 HPLC(high performance liquid chromatography) 또는 TLC(thin-layer chromatography)를 이용하여 당업계에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 단계를 통해crt유전자를 포함하는 형질전환 균주로부터 생산된 아스타잔틴의 양을 측정한 결과, 110 ㎍/g(dryweight)를 생산하여 아스타잔틴 생산균주인 파라코커스 해운대시스가 생산하는 아스타잔틴의 양(25 ㎍/g(dry weight)) 보다 훨씬 뛰어남을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 아스타잔틴을 생산하는 방법은 아스타잔틴을 생산하지 않는 균주에서도 카로티노이드 생합성 유전자를 이용하여 대량으로 아스타잔틴을 생산함을 알 수 있어, 아스타잔틴을 이용한 식품첨가물로써의 색소 생산, 의약품의 제조 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 카로티노이드 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자들을 클로닝하기 위하여 파라코커스 해운대시스로부터 게노믹 DNA 라이브러리(genomic DNA library)를 구축하였다. 게노믹 DNA 라이브러리는 당업계에게 공지된 통상의 방법에 따라 구축할 수 있으며, 구체적으로 본 발명에서는 코스미드 벡터(cosmid vector)를 이용하여 게노믹 DNA 라이브러리를 구축하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 '색 상보화(color complementation)' 방법을 이용하여 게노믹 DNA 라이브러리로부터 카로티노이드 생합성에 관여하는 유전자들을 클로닝하였다. 카로티노이드를 생산하지 않는 미생물(예: 대장균)은 카로티노이드를 생산하는 미생물(예: 본 발명의 파라코커스 해운대시스)로부터 클로닝된 카로티노이드 생합성 관련 유전자들에 의해 형질전환됨으로써 카로티노이드를 생산할 수 있는 능력을 갖게 된다. 예컨대,crtE,crtB,crtI및crtY유전자가 도입된 대장균은 β-카로텐을 생산하고, 이에 따라 세포는 노란색을 띈다. 또한,crtE,crtB,crtI, crtY,crtW및crtZ유전자가 모두 도입된 대장균은 아스타잔틴을 생산하고, 이에 따라 세포는 오렌지색을 띈다. 따라서, 본 발명자들은 파라코커스 해운대시스의 게노믹 DNA 라이브러리를 카로티노이드의 공통된 기질인 FPP(farnesyl pyrophosphate)를 첨가한 배지에서 배양하였다. 그 결과, 오렌지색을 띄는 13개의 콜로니를 선발할 수 있었다. 이후, 각 콜로니로부터 코스미드 벡터를 분리하여 벡터 내부에 삽입된 DNA 단편(insert)의 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 가장 작은 크기의 DNA 단편은 6,223 bp의 크기임을 확인하였다. 상기 DNA 단편의 염기서열을 서열번호 1로 기재하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 카로티노이드를 생산하는 유전자가 존재하는 것으로 추정되는 6,223bp의 DNA 단편의 염기서열을 분석하여 6개의 ORF를 찾아내었다. 이들을 NCBI GenBank 상에서 분석한 결과, 각 ORF로부터 유추되는 아미노산 서열은 FPP로부터 아스타잔틴을 생성하는 반응에 관여하는 6개의 효소들의 아미노산 서열과 매우 높은 상동성을 나타내었다(도 2내지도 7참조). 이 결과로부터 본 발명자들은 본 발명에서 분리한 DNA 단편에 카로티노이드 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는crt유전자가 존재함을 확인할 수 있었다(도 8참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명에서 분리된crt유전자를 카로티노이드를 생산하지 않는 대장균에 도입하여 상기crt유전자에 의해 암호화되는 각 단백질에 의해 대장균에서 카로티노이드가 생산되는지 확인하였다. 이를 위해,crt유전자가 삽입된 재조합 벡터 pCR-XL-TOPO-crtfull을 제작하였다(도 9참조). 이후, 상기 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 오렌지색을 띄는 형질전환체를 선발하였다. 상기 형질전환체가 아스타잔틴을 생산하는지 확인하기 위하여, 상기 형질전환체를 배양하여 균체를 회수한 후, 메탄올을 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이후, 상등액을 수득하여 190-900nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과,도 10에 도시된 바와 같이, β-카로텐과 아스타잔틴의 고유 피크를 확인할 수 있었다. 보다 정확한 분석을 위하여, 상기 상등액의 일부를 취하여 HPLC 분석을 수행하였다. 이 때 표준물질로는 시그마(Sigma)에서 구입한 β-카로텐과 아스타잔틴을 사용하였다. 그 결과, 본 발명에 따라 분리된crt유전자가 도입된 형질전환체가 β-카로텐과 아스타잔틴을 생산함을 확인할 수 있었다. 본 발명의 형질전환체에서 생산된 아스타잔틴의 양은 110 ㎍/g(dry weight)이었다. 이는 아스타잔틴을 생산하는 균주인 파라코커스 해운대시스가 아스타잔틴을 25 ㎍/g(dry weight) 정도 생산하는 것과 비교할때에crt유전자를 대장균에 도입함으로써 아스타잔틴을 훨씬 더 대량으로 생산할 수 있음을 나타내는 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 카로티노이드 생합성 유전자의 클로닝을 위한 게노믹 DNA의 준비

파라코커스 해운대시스(KCCM-10460)을 PPES-II 배지(트립톤 1 g/ℓ, 박토-소이톤 1 g/ℓ, 페릭 시트레이트 0.01 g/ℓ, 폴리펩톤 2 g/ℓ 및 염화나트륨 3 g/ℓ)에서 25℃에서 10일간 배양하였다. 이후, 배양액을 13,000 rpm에서 원심분리하여세포를 수득하였다. 이후, 세포로부터 게노믹 DNA를 분리하기 위해, STE 완충용액(10 mM Tris, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8.0)에서 세포를 현탁시킨 후, 68℃에서 15분간 반응시켰다. 원심분리하여 세포를 수득한 후, 용액 I(50 mM 글루코스, 25 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8.0)에 재현탁시켰다. 5 ㎎/㎖ 라이소자임(lysozyme)과 100 ㎍/㎖ RNase A를 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 그리고 나서, 단백질 분해효소(Proteinase) K를 250 ㎍/㎖ 되도록 첨가한 후, 37℃에서 3시간 동안 다시 반응시켰다. N-라우로일살코신(N-lauroylsarcosine)을 총부피의 1%가 되도록 넣고, 37℃에서 반응시켰다. 이후, 페놀-클로로포름 추출법(phenol-chloroform extraction)에 따라 게노믹 DNA를 분리하였다. 동일 부피의 페놀-클로로포름을 넣어 추출한 뒤 2배 부피의 100% 에탄올을 넣어 게노믹 DNA를 침전시킨 후, 70% 에탄올로 세척하였다. 그리고 나서, TE 완충용액을 첨가하여 65℃에서 완전히 녹인 후, 이후의 실험에 사용하였다.

<실시예 2> 게노믹 DNA 라이브러리(Genomic DNA library) 구축

<2-1> 코스미드 벡터(cosmid vector) 준비

코스미드 벡터(SuperCos 1 Cosmid Vector, Stratagene) 25 ㎍에XbaI(9 U/㎍) 제한효소를 첨가하고, 총 반응액이 200 ㎕가 되게 하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 절단하였다. 이후, 페놀-클로로포름 추출법에 따라 벡터 DNA를 분리한 후, 100% 에탄올로 침전시켰다.XbaI으로 절단된 벡터를 탈 인산화(dephosphorylation)시키기 위해 CIAP 효소(Promega)를 첨가하여 37℃에서30분 동안 반응시켰다. 이후, 다시 페놀-클로로포름 추출법으로 벡터를 분리한 후, 100% 에탄올로 침전시켰다. 상기 분리된 벡터를 다시BamH I(5 U/㎍)으로 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 페놀-클로로포름 추출법으로 분리하고 에탄올로 침전시켰다. 이후, TE 완충용액에 용해시켜 1 ㎍/㎕가 되도록 하였다.

<2-2> 게노믹 DNA 라이브러리 구축

상기 실시예 1에서 얻은 파라코커스 해운대시스의 게노믹 DNA 100 ㎍에 Sau3A I(10 U)을 처리하여 부분적으로 효소 반응시켰다. 반응 종결 후, 0.5 M EDTA를 첨가하였다. 이후, 페놀-클로로포름 추출법으로 게노믹 DNA를 분리한 후, 100% 에탄올로 침전시켰다. 부분 효소 반응된 게노믹 DNA를 TE 완충용액에 용해시키고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 CIAP 효소를 처리하여 탈 인산화시켰다. 다시 페놀-클로로포름 추출법으로 DNA를 분리한 후, 상기 실시예 <2-1>에서 준비된 코스미드 벡터와 라이게이션(ligation)시키기 위해, T4 라이게이즈(ligase, Promega), 10 ×라이게이즈 완충용액(Promega)을 넣고 12℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응후 상기 라이게이션 혼합액(liation mixture)을 대장균인 XL1-Blue(Stratagene)에 형질도입하여 게노믹 DNA 라이브러리를 제작하였다.

<실시예 3> 색소 생성 유전자를 함유하는 형질도입 균주의 탐색 및 분석

LB agr 배지에 카로티노이드 계통의 공통된 기질 중의 하나인 FPP(Sigma)를 1%가 되도록 첨가한 후, 상기 실시예 2에서 제조된 게노믹 라이브러리를 상기 플레이트에 도말하여 37℃에서 배양하였다. 배양된 콜로니 중에서 오렌지색을 띄는 13개의 콜로니를 선별하였다(약 2000개 중 13개). 상기 선별된 13개의 콜로니로부터 코스미드 벡터를 분리하였다. 이후, 프라이머 워킹 시퀀싱(primer working sequencing)을 수행하여 각 코스미드 벡터에 삽입된 DNA 단편의 염기서열을 결정하였다. 이 때 염기서열의 결정은 (주)제노텍에 의뢰하여 수행하였다.

그 결과, 코스미드 벡터에 삽입된 DNA 단편 중에서 가장 작은 크기의 DNA 단편은 6,223 bp이었으며, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가졌다. 이에 상기 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 단편으로 포함하고 있는 코스미드 벡터를 'COSCRT'라 명명하였다.

<실시예 4> 카로티노이드 생합성 관련 유전자를 포함하는 DNA 단편의 서열 분석

상기 실시예 3에서 얻은 DNA 단편의 서열을 NCBI ORF Finder 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)을 사용하여 ORF를 분석하였다.

그 결과, 상기 실시예 3에서 얻은 DNA단편에는 6개의 ORF가 포함되어 있었다. 각 ORF는 β-카로텐 케토레이즈(β-carotene ketolase)를 코딩하는crtW, β-카로텐 하이드록실레이즈(β-carotene hydroxlylase)를 코딩하는crtZ, 리코펜 싸이클레이즈(licopene cyclase)를 코딩하는crtY, 피토엔 디세튜레이즈(phytoenedesaturase)를 코딩하는crtI, 피토엔 신테이즈(phytoene synthase)를 코딩하는crtB및 제라닐제라닐 피로포스페이트신테이즈(geranylgeranyl pyrophosphate synthase)를 코딩하는crtE의 염기서열과 높은 상동성을 나타내었다. 상기 효소들은 모두 카로티노이드 생합성에 관여하는 효소들이다.

또한, 각 ORF로부터 유추되는 아미노산 서열과 알칼리제네스 속(Alcaligenessp.)(Misawaet al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 209(3): 867-876, 1995), 브라디리조비움 속(Bradyrhizobiumsp.)(Hannibalet al., J. Bacteriol.,182(13): 3850-3853, 2000) 및 플라보박테리움 속(Flavobacteriumsp.)(Pasamoteset al., Gene, 185(1): 35-41, 1997)에서 분리된 각 카로티노이드 생합성 효소들의 아미노산 서열과의 상동성 비교 결과를도 2내지도 7에 나타내었다. 이에, 본 발명에서 클로닝된 6개 ORF 유전자의 염기서열 및 이로부터 유추되는 아미노산 서열을 서열번호 2 내지 13으로 각각 기재하였다. 즉,crtW,crtZ,crtY,crtI및crtB의 유전자는 각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12이며, 상기 유전자 각각의 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 및 서열번호 13이다.

상기 결과로부터 상기 코스미드 벡터에 삽입된 DNA 단편에 카로티노이드 생합성에 관여하는crt유전자가 존재함을 확인할 수 있었다.

본 발명의crt유전자의 구성을도 8에 도시하였다.도 8에 도시된 바와 같이, 각crtW,crtZ,crtY,crtI및crtB는 종결 코돈과 시작 코돈이 중첩되고 있음을 볼 수 있다. 특히,crtE유전자는 상보적 가닥의 방향성을 가지는 것을 볼 수 있으며, 서열 내에KpnI,XmaI,SmaI,ClaI,HindⅢ 및BamHⅠ인식 서열이 하나씩존재함을 볼 수 있다.

<실시예 5> 대장균에서의 crt 유전자의 발현 실험

본 발명자들은 상기 실시예 3에서 분리한 파라코커스 해운대시스의crt유전자로부터 발현된 단백질들에 의해 카로티노이드가 생성되는지 확인하기 위하여, 먼저, 상기crt유전자를 HL프리믹스(HLpremix, Bioneer)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 이 때 프라이머로는 서열번호 14 및 15로 기재되는 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 또한, PCR은 94℃에서 5분 동안 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 68℃에서 1분, 72℃에서 6분 한 후 94℃에서 30초, 66℃에서 30초 및 72℃에서 6분을 한 싸이클(cycle)로 하여 총 25 회 반복수행한 다음, 마지막으로 72℃에서 20분 동안 반응시켜 수행하였다 이후, PCR 산물을 Topo-XL-vector(invitrogen)에 삽입한 후, 이를 대장균에 형질도입하였다. 이 때 대장균으로는 XL1-Blue(Stratagene), TOPO(Invitrogen), BL21(DE3) 코돈 플러스(Stratagene), DH1(Takara) 및 DH5α(Takara)를 사용하였다. 그 결과, BL21(DE3), XL1-Blue, BL21(DE3) 코돈 플러스 형질전환체들이 오렌지색을 띄는 것을 확인할 수 있었다. 이후, 각 대장균에 대하여 형질전환체 하나씩을 선발하여 배양한 결과, 형질전환된 BL21(DE3) 코돈 플러스가 가장 많은 아스타잔틴을 생산해 내는 것을 확인할 수 있었다.

이후, 본 발명자들은 상기 실시예 3에서 분리한 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는crt유전자를 유전자 발현용 벡터인 pCR-XL-TOPO 벡터(Invitrogen)에 삽입하여 이를 'pCR-XL-TOPO-crtfull'이라 명명하였다(도 9). 이후, 상기 pCR-XL-TOPO-crtfull 벡터를 BL21(DE3) 코돈 플러스 세포에 형질도입시킨 후, 오렌지색을 띄는 균주를 선별하였다. 선별된 균주를 50 ㎖ LB 배지에서 37℃, 8시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액을 13,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 버리고, 균체를 회수하였다. 회수된 균체에 메탄올 20 ㎖를 첨가하여 볼텍싱(vortexing)한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이후, 13,000 rpm으로 원심분리한 후, 상등액을 수득하였다. 카로테노이드의 생성 유무를 확인하기 위하여, 190-900 nm의 파장 및 400-550 nm의 파장으로 상기 상등액의 흡광도를 스캐닝하였다. 그 결과, 450 nm와 470 nm에서 피크(peak)를 확인하였으며, 이것이 β-카로텐과 아스타잔틴의 고유 피크임을 확인하였다(도 10).

보다 정확한 분석을 위해, 상기 상등액 1 ㎖를 취하여 직경 0.45 ㎛의 필터로 여과한 후, HPLC 분석(column: 4.6×50mm, uBondapak C18, Waters, Milford, MA; mobile phase: acetonitrile-methanol-water(49:44:7 v/v), Flow: 10ml/min, Detector: 470nm)을 수행하였다. 이 때 표준물질로는 시그마(Sigma)에서 구입한 β-카로텐과 아스타잔틴을 사용하였다. 그 결과, 본 발명의 균주로부터 생산된 물질이 아스타잔틴과 β-카로텐임을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 균주로부터 생산된 아스타잔틴의 양을 측정한 결과, 110 ㎍/g(dry weight)으로 확인되었다. 이상의 결과는 어떤 유도제나 카로티노이드 기질을 첨가하지 않은 상태에서의 결과로서 본 발명에서 분리한 6,223 bp의 염기서열만으로 대장균에서 β-카로텐과 아스타잔틴을 대량으로 생산할 수 있음을 알 수 있다. 이는 아스타잔틴을 생산하는 파라코커스 해운대시스(기탁번호:KCCM-10460)가 25 ㎍/g의 아스타잔틴을 생산하는 것에 비해 훨씬 많은 양임을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 아스타잔틴을 생산하는 파라코커스 해운대시스로부터 카로티노이드 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 6개의 유전자 및 이를 포함하는crt유전자를 클로닝하였다. 또한, 상기crt유전자를 이용하여 카로티노이드를 생산하지 않는 대장균에서 카로티노이드를 생산할 수 있음을 규명하였다. 본 발명의 유전자 및 이를 포함하는crt유전자는 β-카로텐, 아스타잔틴과 같은 카로티노이드의 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

<110> KIM, Young Tae LEE, Jae Hyung ALGENETECH <120> Genes involved in the biosynthesis of carotenoids <130> 3p-01-31 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6223 <212> DNA <213> crt gene <400> 1 gttccacgac tggggcatcc ccacgaccgc gtcgctgcgc gccatcgcgc cgatgatggg 60 gccggaccgg gttctggtcg ggtcgggcgg ggtgcgtcac gggctggacg ccgcgcgggc 120 catccgcctc ggcgcggacc tcgtggggca ggcggcccgc gcgctgcccg ccgcgcgcca 180 cagcgccgag gccctgtccg atcacctgtc cgacgtcgtg acccagctgc gcatcgcgat 240 gttctgcacc ggatcgggcg accttgcagc gctgcgctgc gcgcctctgc tggtgccggg 300 gccgggtggc caatggtcgc aagcaacggg gatggaaacc ggcgatgcgg gactgtagtc 360 tgcgcggatc gccggtccgg gggacaagat gagcgcacat gccctgccca aggcagatct 420 gaccgccacc agcctgatcg tctcgggcgg catcatcgcc gcgtggctgg ccctgcatgt 480 gcatgcgctg tggtttctgg acgcggcggc gcatcccatc ctggcgatcg cgaatttcct 540 ggggctgacc tggctgtcgg tcggtctgtt cttcatcgcg catgacgcga tgcacgggtc 600 ggtcgtgccg gggcgtccgc gcggcaatgc ggcgatgggc cagctggtcc tgtggctgta 660 tgccggattt tcgtggcgca 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ggtcgaacag gaacaggacc tgaagaccgg cgtgctgttc 540 atcgccgggc tggagatgct ggccgtgatc aaggagttcg acgccgagga gcagacccag 600 atgatcgact ttggccgtca gctgggccgc gtgttccagt cctatgacga cctgctggac 660 gtcgtgggcg accaggcggc gcttggcaag gataccggtc gcgatgccgc ggcccccggc 720 ccgcggcgcg gccttctggc cgtgtcagac ctgcagaacg tgtcccgtca ttacgaggcc 780 agccgcgccc aactggacgc gatgctgcgc agcaagcgcc ttcaggctcc ggaaatcgcg 840 gccctgctgg aacgggttct gccctacgcc gcgcgcgcct ag 882 <210> 13 <211> 293 <212> PRT <213> crtE amino acid <400> 13 Met Arg Arg Asp Val Asn Pro Ile His Ala Thr Leu Leu Gln Thr Arg 1 5 10 15 Leu Glu Glu Ile Ala Gln Gly Phe Gly Ala Val Ser Gln Pro Leu Gly 20 25 30 Ala Ala Met Ser His Gly Ala Leu Ser Ser Gly Arg Arg Phe Arg Gly 35 40 45 Met Leu Met Leu Leu Ala Ala Glu Ala Ser Gly Gly Val Cys Asp Thr 50 55 60 Ile Val Asp Ala Ala Cys Ala Val Glu Met Val His Ala Ala Ser Leu 65 70 75 80 Ile Phe Asp Asp Leu Pro Cys Met Asp Asp Ala Gly Leu Arg Arg Gly 85 90 95 Arg Pro Ala Thr His Val Ala His Gly Glu Ser Arg Ala Val Leu Gly 100 105 110 Gly Ile Ala Leu Ile Thr Glu Ala Met Ala Leu Leu Ala Gly Ala Arg 115 120 125 Gly Ala Ser Gly Thr Val Arg Ala Gln Leu Val Arg Ile Leu Ser Arg 130 135 140 Ser Leu Gly Pro Gln Gly Leu Cys Ala Gly Gln Asp Leu Asp Leu His 145 150 155 160 Ala Ala Lys Asn Gly Ala Gly Val Glu Gln Glu Gln Asp Leu Lys Thr 165 170 175 Gly Val Leu Phe Ile Ala Gly Leu Glu Met Leu Ala Val Ile Lys Glu 180 185 190 Phe Asp Ala Glu Glu Gln Thr Gln Met Ile Asp Phe Gly Arg Gln Leu 195 200 205 Gly Arg Val Phe Gln Ser Tyr Asp Asp Leu Leu Asp Val Val Gly Asp 210 215 220 Gln Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Gly Arg Asp Ala Ala Ala Pro Gly 225 230 235 240 Pro Arg Arg Gly Leu Leu Ala Val Ser Asp Leu Gln Asn Val Ser Arg 245 250 255 His Tyr Glu Ala Ser Arg Ala Gln Leu Asp Ala Met Leu Arg Ser Lys 260 265 270 Arg Leu Gln Ala Pro Glu Ile Ala Ala Leu Leu Glu Arg Val Leu Pro 275 280 285 Tyr Ala Ala Arg Ala 290 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for crt gene <400> 14 gttccacgac tggggcatc 19 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for crt gene <400> 15 tccactgacc ttgttggaca aattgccg 28

Claims

카로티노이드 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12로 기재되는 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자.
제 1항에 있어서, β-카로텐 케토레이즈(β-carotene ketolase)를 코딩하는crtW유전자의 염기서열인 것을 특징으로 하는 서열번호 2로 기재되는 유전자.
제 1항에 있어서, β-카로텐 하이드록실레이즈(β-carotene hydroxylase)를 코딩하는crtZ유전자의 염기서열인 것을 특징으로 하는 서열번호 4로 기재되는 유전자.
제 1항에 있어서, 리코펜 사이클레이즈(licopene cyclase)를 코딩하는crtY유전자의 염기서열인 것을 특징으로 하는 서열번호 6으로 기재되는 유전자.
제 1항에 있어서, 피토엔 디세튜레이즈(phytoene desaturase)를 코딩하는crtI유전자의 염기서열인 것을 특징으로 하는 서열번호 8로 기재되는 유전자.
제 1항에 있어서, 피토엔 신테이즈(phytoene synthase)를 코딩하는crtB유전자의 염기서열인 것을 특징으로 하는 서열번호 10으로 기재되는 유전자.
제 1항에 있어서, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신테이즈(geranylgeranyl pyrophosphate synthase)를 코딩하는crtE유전자의 염기서열인 것을 특징으로 하는 서열번호 12로 기재되는 유전자.
제 2항 내지 제 7항의 유전자를 모두 포함하는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는crt유전자.
제 8항의crt유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 9항에 있어서, 도 9에 도시된 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 pCR-XL-TOPO-crtfull 재조합 벡터.
제 10항의 재조합 벡터를 형질도입한 대장균 형질전환체.
1) 제 8항의crt유전자를 클로닝하는 단계;

2) 단계 1의crt유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

3) 단계 2의 재조합 벡터를 숙주세포에 형질도입하는 단계;

4) 단계 3의 형질도입된 균주를 배양하여 그 배양액으로부터 카로티노이드를 회수하는 단계인 것을 특징으로 하는 카로티노이드를 생산하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 제 10항의 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균 또는 효모인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 제 11항의 대장균을 배양하여 그 배양액으로부터 카로티노이드를 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 카로티노이드는 β-카로텐 또는 아스타잔틴인 것을 특징으로 하는 방법.