KR20200000804A - 라이코펜 고생산능을 갖는 변이 균주 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 라이코펜 고생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주 및 이를 이용한 라이코펜 생산 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주는 야생형 균주 또는 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주에 비하여 우수한 라이코펜 생산능을 가지고, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주는 더욱 우수한 라이코펜 생산능을 가지며, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 배양 시 자외선을 조사하면 라이코펜 생산능이 더욱 증가하고, 폐 바이오매스 성분이 포함된 배지에서 배양시 라이코펜 생산능이 더욱 증가한다. 또한, 본 발명의 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주는 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주에 비하여 우수한 라이코펜 생산능을 가지며, DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실되고 배양 시 자외선을 조사한 변이 균주는 더욱 우수한 라이코펜 생산능을 갖는다. 따라서, 상기 변이 균주들 및 이를 이용한 라이코펜 생산 방법은 친환경적이고 경제적인 라이코펜의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

라이코펜 고생산능을 갖는 변이 균주{Mutant strain having increased lycopene productivity}
본 발명은 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주, DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주, 및 상기 균주들을 이용한 라이코펜 대량 생산 방법에 관한 것이다.
카로티노이드(carotenoids)는 C40 이소프레노이드(isoprenoid) 화합물로, 분자 구조에 따라 노란색, 적색, 주황색 등을 띠는 색소군이다. 현재까지 알려진 카로티노이드는 약 600 여 종에 이르며, 그 예로 파이토엔(phytoene), 라이코펜(lycopene), 베타-카로틴(β-carotene) 및 아스타잔틴(astaxanthin) 등이 있다. 그 중 라이코펜은 붉은색을 나타내는 색소 물질로서 식물 및 미생물에 의해 생산되나 동물은 합성할 수 없으며, 산소에 의해 만들어지는 자유 라디칼들을 중화시키는 강력한 항산화제이다. 라이코펜은 전립선암, 유방암, 폐암, 방광암, 자궁경부암, 피부암 등을 예방하고, 혈중 저밀도 지방단백질의 산화를 억제하고 콜레스테롤의 농도를 감소시켜 동맥질환과 고혈압을 예방하는 효과가 있어 의약 성분으로 많이 사용되며, 피부 미백에 효과적인 성분으로 알려져 있어 자외선 흡수제 등 미용분야에서도 수요가 높다.
라이코펜은 화학 합성법을 이용하여 합성할 수 있으나, 화학 합성법으로 제조된 라이코펜은 천연 라이코펜에 비하여 생체 흡수율이 낮고, 식품 첨가제로서의 안전성에 문제가 되고 있어 일부 국가에서만 사용이 허가된 상태이다. 따라서, 천연 라이코펜의 생산법에 관심이 집중되고 있으며, 특히 미생물을 이용한 라이코펜 생산법이 관심을 끌고 있다.
라이코펜의 생합성은 일반적인 이소프레노이드 경로의 중간 생성물인 FPP(farnesyl pyrophosphate)로부터 이루어진다. FPP와 IPP(isopentenyl pyrophosphate)는 CrtE에 의해 암호화되는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신테이즈(geranylgeranyl pyrophosphate synthase), CrtB에 의해 암호화되는 파이토엔 신테이즈(phytoene synthase), CrtI에 의해 암호화되는 파이토엔 디세투레이즈(phytoene desaturase)에 의해 일련의 반응을 거쳐 라이코펜으로 전환되며, 이후 CrtY에 의해 암호화되는 라이코펜 베타-사이클레이즈(lycopene β-cyclase)에 의해 베타-카로틴으로 전환된다.
상기 라이코펜의 생합성 과정에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자를 미생물에 도입하는 방법을 통해 라이코펜을 생산하는 균주를 개발하는 연구가 일부 진행되었으나, 라이코펜을 고농도로 생산할 수 있는 균주는 개발하기가 쉽지 않다. 따라서, 라이코펜 고생산능을 갖는 균주를 이용하여 라이코펜을 경제적으로 생산할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.
최근, 유용한 대사산물을 경제적으로 생산하기 위하여 바이오매스와 미생물을 이용한 대사 산물 생산방법이 각광받고 있다. 바이오매스(Biomass)란 주변에서 흔히 찾아 볼 수 있는 다양한 조류 및 나무, 꽃, 풀, 가지, 잎, 뿌리, 열매 등 광합성으로 생성되는 모든 식물자원을 의미한다. 최근에는 톱밥, 볏짚부터 음식물쓰레기 및 하수 슬러지, 축산분뇨에 이르기까지 산업 활동에서 발생하는 유기성 폐자원을 모두 바이오매스 자원이라고 지칭한다. 바이오 에너지란 자연계에 있는 바이오매스(biomass)로부터 만들어지는 지속 가능한 에너지원을 말하는데, 바이오 에너지는 수송용 연료로서 그 활용도가 높으며 환경오염 물질의 배출을 적게는 30% 이상, 많게는 90% 까지도 줄일 수 있는 장점으로 인하여, 전 세계적으로 높은 관심을 받고 있다. 바이오 에너지는 옥수수, 사탕수수, 폐기용 셀룰로오스 등과 같은 식물이나 농업 및 환경 폐기물로부터 생산되기 때문에 지구 온난화의 주범이 되는 온실가스인 이산화탄소 (CO2)를 증가시키지 않고 각종 유기성 폐기물을 이용함으로써 폐기물을 줄이는 효과가 있다. 최근에는 미생물을 사용하여 알코올 등 유용한 물질을 만들고 메탄가스 및 퇴비를 만드는 등 바이오매스를 변환하여 이용 하는 방법이 각광받고 있다.
한편, 미생물 대사공학은 미생물 등의 유전체를 개량하여 원하는 목적에 맞게 활용하는 기술로, 특히 Flp/FRT 및 cre/lox와 같은 위치-특이적 재조합 기술은 식물, 효모, 미생물과 같은 다양한 생명체 모델에 적용되어 대사공학분야에 활용되고 있다. 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)는 생물체의 DNA 또는 단백질에 직접 손상을 입할 수 있는 이온화 방사선에 대해 내성을 갖고 있고, 효소적 또는 비효소적 시스템에 의하여 세포 내에 생성된 활성산소종(ROS)을 효과적으로 제거할 수 있는 능력을 지니고 있다. 이러한 특성 때문에 상기 균주는 방사성 폐기물의 정화에 사용되고 있으며, 의약, 보건, 생명공학 등 다양한 분야에서 활용될 수 있다. 데이노코쿠스 라디오두란스의 대사공학적 제어를 위해, 다른 미생물의 유전자를 세포 내로 도입시키거나, 상동적 재조합 방법을 이용한 돌연변이 균주의 제작 기술이 고안되었으나, 이러한 방법은 반복적인 유전자 클로닝 과정으로 인해 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라, 돌연변이 균주를 선별하기 위한 항생제 마커의 제한성으로 다중 돌연변이 균주를 제작하는데 어려움이 있다.
이에, 본 발명자들은 대사공학적 방법을 도입하여 라이코펜을 고생산할 수 있는 데이노코쿠스 속 균주를 제조하기 위해 노력하던 중, 변형된 cre-lox 시스템 및 통상적인 유전자 도입 방법을 이용하여 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에서 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 변이 균주, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주, DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 변이 균주, 및 DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실된 변이 균주를 제조하였으며, 상기 변이 균주들이 우수한 라이코펜 생산능을 보이며, 아울러 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주는 폐바이오매스 성분을 포함하는 배지에서 매우 우수한 라이코펜 생산능을 나타내고 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주 또는 DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실된 변이 균주의 배양 시 자외선을 조사한 경우 우수한 라이코펜 생산능을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-0832584호
본 발명의 목적은 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주, DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주, 및 상기 균주들을 이용한 라이코펜 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 상기 변이 균주를 배양하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 배양액에서 라이코펜을 회수하는 단계를 포함하는, 라이코펜 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주는 야생형 균주 또는 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주에 비하여 우수한 라이코펜 생산능을 가지고, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주는 더욱 우수한 라이코펜 생산능을 가지며, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주를 배양 시 자외선을 조사하면 라이코펜 생산능이 더욱 증가하고, 폐 바이오매스 성분이 포함된 배지에서 배양시 라이코펜 생산능이 더욱 증가한다. 또한, 본 발명의 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주는 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주에 비하여 우수한 라이코펜 생산능을 가지며, DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실되고 배양 시 자외선을 조사한 변이 균주는 더욱 우수한 라이코펜 생산능을 갖는다. 따라서, 상기 변이 균주들 및 이를 이용한 라이코펜 생산 방법은 친환경적이고 경제적인 라이코펜의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 pAM1 플라스미드의 제작 과정을 도식화한 그림이다.
도 2는 pAM2 플라스미드의 제작 과정을 도식화한 그림이다.
도 3은 pAM1 플라스미드의 구조를 도식화한 그림이다.
도 4는 pAM2 플라스미드의 구조를 도식화한 그림이다.
도 5는 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 유전체에서 DR0801 유전자를 결실시키는 과정을 도식화한 그림이다.
도 6은 항생제 내성 유전자가 모두 제거되고, DR0801 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 선별한 결과 사진이다(WT: 야생형; DLY0-1: 카나마이신 내성 유전자를 갖고, DR0801 유전자가 결실된 변이 균주; DLY0-2: 카나마이신 내성 유전자는 제거되고, 클로람페니콜 내성 유전자를 가지며, DR0801 유전자가 결실된 변이 균주; DLY001: 항생제 내성 유전자가 모두 제거되고, DR0801 유전자가 결실된 변이 균주; TGY: 일반 TGY 배지; TGY km: 카나마이신을 함유한 TGY 배지; 및 TGY cm: 클로람페니콜을 함유한 TGY 배지).
도 7은 본 발명에 따라 제조된 DR0801 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 라이코펜 생산능을 HPLC로 확인한 그래프이다(A: 라이코펜 표준품; B: 야생형 데이노코쿠스 라디오두란스 균주; 및 C: DR0801 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주).
도 8은 pRADZ3 내에 존재하는 groE 프로모터의 하위에 DR0862 유전자가 발현되도록 제작한 플라스미드의 구조를 도식화한 그림이다.
도 9는 pRADZ3 내에 포함된 DR0862 유전자의 하위에 groE 프로모터 및 DR1475 유전자가 발현되도록 제작한 플라스미드의 구조를 도식화한 그림이다.
도 10은 라이코펜 표준품을 이용하여 HPLC를 수행한 결과 그래프이다.
도 11은 농도별 라이코펜 표준품을 이용하여 HPLC를 수행한 후, 작성된 검량선 그래프이다.
도 12는 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에서 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주(DR0801-), DR0801 유전자가 결실되고 DR0682 유전자가 과발현된 변이 균주(DR0801-, DR0862+), 및 DR0801 유전자가 결실되고 DR0682 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주(DR0801-, DR0862+, DR1475+)의 라이코펜 생산능을 나타낸 결과 그래프이다.
도 13은 DR0801 유전자가 결실되고 DR0682 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 라이코펜 생산능을 균주의 배양 시간별로 나타낸 결과 그래프이다.
도 14는 DR0801 유전자가 결실되고 DR0682 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 배양 시간에 따른 라이코펜 농도능(주황색), 탄소원(포도당) 소모량(파란색) 및 성장 정도(회색)를 측정한 결과 그래프이다.
도 15는 DR0801 유전자가 결실되고 DR0682 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 배양 시 자외선 조사 여부에 따른 라이코펜 생산능을 나타낸 결과 그래프이다.
도 16은 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에서 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주(DR0801-), 및 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 변이 균주(DR0801-, DR0091-)의 라이코펜 생산능을 나타낸 결과 그래프이다.
도 17은 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에서 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 변이 균주(DR0801-, DR0091-), 및 DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실되고, 배양 과정에서 자외선을 조사한 변이 균주(DR0801-, DR0091-, DR1998-, UV)의 라이코펜 생산능을 나타낸 결과 그래프이다.
도 18은 DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실되고, 배양 과정에서 자외선을 조사한 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 라이코펜 생산능을 균주의 배양 시간별로 나타낸 결과 그래프이다.
도 19는 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주를 폐 바이오매스가 포함된 배지에서 배양시 상기 변이 균주가 생산하는 라이코펜 농도(lycopene titer), 상기 변이 균주의 성장곡선(OD600) 및 상기 변이 균주가 성장 시 사용하는 탄소원(glycerol)의 소모비를 변이 균주의 배양 시간별로 나타낸 도이다.
도 20은 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주를 폐 바이오매스가 포함된 배지에서 배양시 생산한 라이코펜 함량(mg/g DCW), 라이코펜 수율(mg/g glycerol) 및 라이코펜 생산성(mg/L/h)을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "cre-lox 시스템"은 DNA의 특정 부위에서 결실, 삽입, 전좌 및 역위를 수행하는데 사용되는 위치특이적 재조합 효소기술을 의미한다. 상기 cre-lox 시스템은 진핵 및 원핵 생물의 유전자로부터 돌연변이를 유발시키는데 사용가능하다. 이는 단일 효소인 cre 재조합 효소로 구성되어 있고, 짧은 표적 서열인 lox 서열을 재조합한다. 돌연변이를 유발시키고자 하는 위치에 lox 서열을 적절히 배치함으로써, 표적 유전자가 활성화 또는 억제되거나, 다른 유전자와 치환될 수도 있다. 일반적으로 lox P는 34개의 염기로 구성된 박테리오파지 P1 부위로 비대칭인 8 bp의 염기 서열을 포함하고, 중앙에 2개의 염기를 제외하고는, 13 bp 크기인 2쌍의 회문구조(palindromic)를 갖는다(ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT).
본 명세서에서 사용된 용어, "선택 마커"는 특정 유전자의 산물을 의미한다. 상기 산물을 포함하는 미생물은 이를 포함하지 않는 미생물에는 나타나지 않는 특별한 형질을 가짐으로써, 이에 의해 미생물의 구별을 가능하게 한다. 상기 선택 마커는 항생제 내성 유전자일 수 있다. 상기 항생제 내성 유전자는 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 스펙티노마이신(spectinomycin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 구체적으로, 카나마이신 및 클로람페니콜로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "라이코펜 생산량"은 "라이코펜 생산능"과 동일한 의미이고 혼용되어 사용될 수 있으며, 라이코펜 생산량 혹은 라이코펜 생산능은 배양액에 포함된 라이코펜 농도(㎎/ℓ, Lycopene titer), 배양 후 회수한 세포의 라이코펜 함량(mg/g DCW, Lycopene content), 탄소원인 글리세롤의 소모 질량에 대한 라이코펜의 생산 질량을 나타내는 라이코펜 수율(mg/g glycerol, Lycopene yield) 및 시간 당 본 발명의 변이 균주가 생산하는 라이코펜의 농도인 라이코펜 생산성(mg/ℓ/h, Lycopene productivity) 중 어느 하나로 수치화될 수 있다.
본 발명은 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주를 제공한다.
상기 데이노코쿠스 속 균주는 데이노코쿠스 라디오두란스, 데이노코쿠스 인디쿠스(D. indicus), 데이노코쿠스 카에니(D. caeni), 데이노코쿠스 아쿠아티쿠스(D. aquaticus), 데이노코쿠스 디폴리머란스(D. depolymerans), 데이노코쿠스 그란디스(D. grandis), 데이노코쿠스 데죠네시스(D. daejeonensis), 데이노코쿠스 라디오톨러란스(D. radiotolerans), 데이노코쿠스 지오써말리스(D. geothermalis), 데이노코쿠스 루버(D. ruber), 데이노코쿠스 안타티커스(D. antarcticus), 데이노코쿠스 프로테오리티쿠스(D. proteolyticus), 데이노코쿠스 라디오푸그난스(D. radiopugnans), 데이노코쿠스 라디오필러스(D. radiophilus), 데이노코쿠스 셀룰로실리티쿠스(D. cellulosilyticus) 및 데이노코쿠스 스웬시스(D. swuensis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 구체적으로는 데이노코쿠스 라디오두란스일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR0801(CrtY)" 유전자는 라이코펜 베타-사이클레이즈를 암호화하는 유전자로 라이코펜을 베타-카로텐(β-carotene)으로 전환하는 역할을 한다. 상기 DR0801 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR0801 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 DR0801 유전자의 상부 및 하부 단편은 전체 길이의 DR0801 유전자 서열에서 5' 또는 3' 말단으로부터 0.5 내지 1.2 kb, 구체적으로 0.6 내지 1.1 kb, 더욱 구체적으로 0.7 내지 1.0 kb의 길이를 포함할 수 있다. 상기 단편은 데이노코쿠스 속 균주의 유전체에 존재하는 DR0801 유전자와의 상동재조합을 위해 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR0862(CrtB)" 유전자는 파이토엔 신테이즈를 암호화하는 유전자로 GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate)를 기질로 하여 라이코펜의 전구체인 파이토엔을 합성하는 역할을 한다. 상기 DR0862 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR0862 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 DR0801 유전자의 결실은 1) 제1 선택마커를 포함하는 lox 핵산 단편의 양 말단에 DR0801 유전자의 상부 및 하부 단편이 각각 융합된 DNA 구조체를 데이노코쿠스 속 균주에 도입하여 DR0801 유전자를 결실시키는 단계; 2) 상기 단계 1)의 DR0801 유전자가 결실된 균주에 groE 프로모터, cre 재조합 효소를 코딩하는 유전자, 제2 선택마커 및 온도 감수성 repUts를 포함하는 벡터를 도입하여 제1 선택마커를 결실시키는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 수득된 변이 균주를 배양하여 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 제거하는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있으며, 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 방법으로도 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "lox 핵산 단편"은 cre-lox 시스템을 이용하여 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 유전체로부터 원하는 유전자를 제거하기 위한 단편으로서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 lox 핵산 단편은 lox 단편을 양 말단에 갖는 제1 선택마커를 포함할 수 있다. 상기 lox 핵산 단편은 lox71 및 lox66으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 lox 유전자를 단편의 양 말단에 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 lox 핵산 단편은 서열번호 6 또는 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 groE 프로모터는 cre 재조합 효소와 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 용어, "작동가능하게 연결된"은 핵산의 발현을 조절하는 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 벡터의 제조에서 작동가능하게 연결하는 것은 통상의 기술자에 의해 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 상기 groE 프로모터는 groES 유전자(NCBI GeneBank ID: 1800077)의 상위(upstream) 부분의 299 bp를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 구체적으로 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
한편, 상기 제2 선택마커는 Kat 프로모터와 작동가능하게 연결될 수 있다. 이때, 상기 Kat 프로모터는 KatE1 유전자(NCBI GeneBank ID: 1800077)의 상위(upstream) 부분의 138 bp를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 구체적으로 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "온도 감수성 repUts"는 특정 범위의 온도 내에서만 플라스미드가 복제가 가능하게 하는 유전자인 repU 유전자를 의미한다(H. H. Nguyen et al., Molecular Microbiology, 2009, 73(2), 240-252). 상기 유전자를 포함하는 플라스미드는 28℃의 배양 온도에서는 복제되어 숙주세포 내에서 플라스미드의 유지를 가능하게 하지만, 37℃의 배양 온도에서는 상기 플라스미드가 복제되지 않아 숙주세포 내에서 제거된다. 상기 repU 유전자 및 이를 포함하는 플라스미드는 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다.
상기 제1 선택마커를 결실시키는 단계는 cre 재조합 효소가 제1 선택마커의 양 말단에 결합한 lox 유전자를 인식, 이들 부위를 절단함으로써, 제1 선택마커를 데이노코쿠스 속 균주의 유전체로부터 제거하는 방식으로 이루어질 수 있다.
상기 단계에서 groE 프로모터, cre 재조합 효소를 코딩하는 유전자, 제2 선택마커 및 온도 감수성 repUts를 포함하는 벡터는 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 제2 선택마커의 제거는, 온도 감수성 마커인 repUts에 의하여 제2 선택마커를 포함하는 벡터가 특정 온도 범위 내에서는 복제되지 않는 특성을 사용할 수 있다. 따라서, 상기 단계는 변이 균주를 특정 온도 범위 내에서 일정 기간 동안 배양함으로써 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 제거할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양을 위한 온도는 30 내지 40℃, 구체적으로 31 내지 39℃, 더욱 구체적으로 33 내지 38℃일 수 있다.
상기 단계에 따라 수득된 변이 균주는 제1 및 제2 선택마커가 모두 제거됨으로써 항생제가 포함된 배지에서는 성장하지 못하는 특성에 기초하여 선별될 수 있다.
상기 DR0862 유전자의 과발현은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 DR0862 유전자의 과발현은 DR0862 유전자를 발현하는 플라스미드를 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 제작하여 균주에 도입하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 속 변이 균주는 우수한 라이코펜 생산능을 가질 수 있다.
상기 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 속 변이 균주에 DR1475 유전자를 추가적으로 과발현시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR1475(dxs)" 유전자는 1-디옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 신테이즈(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase)를 암호화하는 유전자로, 피루베이트(pyruvate) 및 글루코즈-3-포스페이트(glucose-3-phosphate)를 기질로 사용하여 1-디옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트를 합성함으로써, 라이코펜 생합성의 상위 단계 반응인 이소프레노이드 경로 반응을 유도할 수 있다. 상기 DR1475 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR1475 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드들은 암호화하고 있는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 염기의 결실, 삽입, 치환 또는 추가에 의해 상이한 서열을 갖는 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 공지된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
상기 변이 균주는 DR0801이 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주에 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 DR0862 및 DR1475 유전자를 과발현시켜 제작할 수 있다. 구체적으로, DR0801이 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주에 DR0862 또는 DR1475 유전자가 각각 발현되도록 제작된 플라스미드를 모두 도입하거나, DR0862 및 DR1475 유전자가 모두 발현되도록 제작된 플라스미드를 도입하는 방법으로 제조될 수 있다. 상기 플라스미드를 도입하는 방법은 통상의 기술자에 의해 적절히 수행될 수 있다.
상기 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 속 변이 균주에 DR1475 유전자를 추가적으로 과발현시킨 데이노코쿠스 속 변이 균주는 더욱 우수한 라이코펜 생산능을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 변형된 cre-lox 시스템을 이용하여 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에서 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주를 제조하고(도 1 내지 6 참조), 상기 변이 균주에 DR0862 유전자를 발현하는 플라스미드를 도입하여 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 변이 균주를 제조하였으며(도 8 및 9 참조), DR0801 유전자가 결실된 변이 균주에 DR0862 및 DR1475 유전자를 발현하는 플라스미드를 도입하여 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주를 제조하였다. 또한, 본 발명자들은 야생형의 데이노코쿠스 라디오두란스 균주와 다르게, DR0801 유전자가 결실된 변이 균주는 라이코펜 생산능을 갖고(도 7 참조), DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 변이 균주의 라이코펜 생산능은 더 높으며, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 라이코펜 생산능은 더욱 높음과(도 10 내지 14 참조), 상기 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주는 폐 바이오매스가 포함된 배지에서 배양시 라이코펜 생산능이 현저하게 높아짐을 확인하였고(도 19 및 도 20 참조), DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 배양 시 자외선을 조사하면 라이코펜 생산능이 더욱 증가함을 확인하였다(도 15 참조). 따라서, 상기 변이 균주들은 라이코펜의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR0091" 유전자는 카로티노이드 1,2-수화효소(carotenoid 1,2-hydratase)를 암호화하는 유전자로, 상기 수화효소는 라이코펜의 전구체인 뉴로스포렌(neurosporene)과 같은 카로티노이드의 C1' 및 C2' 위치에 히드록시기를 도입할 수 있다. 상기 DR0091 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR0091 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 DR0091 유전자를 결실시키는 방법은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 방법으로도 수행될 수 있다. 일례로, DR0091 유전자의 결실은 상술한 DR0801 유전자를 결실시키는 방법과 동일한 방법으로 수행될 수 있다.
상기 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주는 우수한 라이코펜 생산능을 가질 수 있다.
상기 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주에서 DR1998 유전자가 더 결실될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR1998" 유전자는 카탈레이즈(catalase)를 암호화하는 유전자로, 상기 카탈레이즈는 세포 내의 과산화수소를 물과 산소로 분해하는 반응을 촉매하는 효소이다. 상기 DR1998 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR1998 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드들은 암호화하고 있는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 염기의 결실, 삽입, 치환 또는 추가에 의해 상이한 서열을 갖는 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 공지된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
상기 DR1998 유전자를 결실시키는 방법은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 방법으로도 수행될 수 있다. 일례로, DR1998 유전자의 결실은 상술한 DR0801 유전자를 결실시키는 방법과 동일한 방법으로 수행될 수 있다.
상기 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주에서 DR1998 유전자가 더 결실된 데이노코쿠스 속 변이 균주는 우수한 라이코펜 생산능을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 변형된 cre-lox 시스템을 이용하여 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에서 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주를 제조하고(도 1 내지 6 참조), 상기 변이 균주에서 DR0091 유전자가 더 결실된 변이 균주를 제조하였으며, 상기 변이 균주에서 DR1998 유전자가 더 결실된 변이 균주를 제조하였다. 또한, DR0801 유전자가 결실된 변이 균주에 비하여, DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 변이 균주의 라이코펜 생산능이 더 높고, DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실되고 배양 시 자외선을 조사한 변이 균주의 라이코펜 생산능이 더욱 높음을 확인하였다(도 16 내지 18 참조). 따라서, 상기 변이 균주들은 라이코펜의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 상술한 특징을 갖는 본 발명에 따른 변이 균주를 배양하는 단계; 및 상기 단계 1)의 배양액에서 라이코펜을 회수하는 단계를 포함하는 라이코펜 대량 생산 방법을 제공한다.
상기 배양은 통상의 기술분야에 잘 알려진 적당한 배지 및 배양 조건에 따라 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 회분식, 연속식 또는 유가식 배양일 수 있다. 상기 라이코펜 생산 방법은 변이 균주를 배양하여 수득된 배양물로부터 라이코펜을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 라이코펜의 수득은 통상의 기술자에 의해 적절히 수행될 수 있다.
상기 라이코펜 대량 생산 방법은 상기 단계 1)의 배양에 자외선을 조사하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 야생형의 데이노코쿠스 라디오두란스 균주와 다르게, DR0801 유전자가 결실된 변이 균주는 라이코펜 생산능을 갖고, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 변이 균주의 라이코펜 생산능은 더 높으며, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 라이코펜 생산능은 더욱 높음을 확인하였고, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 배양 시 자외선을 조사하면 라이코펜 생산능이 더욱 증가함을 확인하였다(도 7, 12 내지 15 참조). 또한, DR0801 유전자가 결실된 변이 균주에 비하여, DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 변이 균주의 라이코펜 생산능이 더 높고, DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실되고 배양 시 자외선을 조사한 변이 균주의 라이코펜 생산능이 더욱 높음을 확인하였다(도 16 내지 18 참조).
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 변이 균주를 옥수수침지액(corn streep liquor) 및 글리세롤이 포함된 배지에서 배양하는 라이코펜 대량 생산 방법을 제공한다.
상기 옥수수침지액(corn streep liquor)은 옥수수전분을 제조하는 과정에서 옥수수를 아황산용액에 침지한 후 젖산발효를 통하여 얻어지는 액으로서 다량의 단백질과 전분질을 함유하고 있으며, 옥수수 전분 제조 시 침지 공정 중에 추출된 가용성 성분을 농축한 액이다. 상기 옥수수침지액은 옥수수 전분 제조 공정에서 발생하는 부산물일 수 있다.
상기 글리세롤(glycerol)은 3개의 수산기를 가진 3가 알코올로, 바이오디젤 생산 공정에서 발생하는 부산물일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주를 폐 바이오매스 성분인 옥수수침지액과 글리세롤이 포함된 배지에서 배양 시 라이코펜 생산능이 더욱 더 높아짐을 확인하였다(도 19 및 도 20 참조). 따라서, 상기 변이 균주들을 이용한 라이코펜 생산 방법은 폐 바이오매스를 활용한 친환경적이고 경제적인 라이코펜 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> DR0801 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
<1-1> 제1 선택마커를 포함하는 플라스미드의 제작
카나마이신 내성 유전자의 양 말단에 lox66 및 lox71 유전자를 포함하는 플라스미드를 다음과 같은 방법으로 제조하였다(도 1).
먼저, pKatAPH3 플라스미드(Satoh K. et al., Microbiology, 152:3217-3226, 2006)를 주형으로 하여 하기 표 1에 기재된 염기서열을 갖는 Lox66F(서열번호 12) 및 Lox71R(서열번호 13) 프라이머를 이용하여 lox66 및 lox71 유전자를 양 말단에 갖도록 카나마이신 내성 유전자를 증폭시켰다. 구체적으로, 1 ㎕의 pKatAPH3, 각각 1 ㎕의 lox66F 및 lox71R 프라이머(10 pmole/㎕) 및 17 ㎕의 멸균증류수의 혼합물을 pfu 폴리머라제 믹스(Bioneer)에 첨가한 뒤, DNA 증폭기(T-100 Thermal cycler, Bio-rad)를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 상기 PCR은 95℃에서 5분 동안 반응시킨 뒤, 95℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 1분의 반응과정을 1회로 하여 이를 30회 반복함으로써 수행되었다.
서열번호 이름 서열(5'→3')
서열번호 12 Lox66F gcttgatatctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttat
서열번호 13 Lox71R tagaggatcctaccgttcgtataatgtatgctatacgaagttat
서열번호 14 GroEF cgtggcggccgctcggcttggaagcacgtatt
서열번호 15 GroER tacgggcagtaaattggacatatccactagtaacggccgcc
서열번호 16 CreF ggcggccgttactagtggatatgtccaatttactgcccgta
서열번호 17 CreR agcttatcgataccgtcgacctaatcgccatcttccagca
서열번호 18 pKatF tgctggaagatggcgattaggtcgacggtatcgataagct
서열번호 19 pKatR ccagtgatttttttctccatatgctctccttcgcctcgct
서열번호 20 CmF agcgaggcgaaggagagcatatggagaaaaaaatcactgg
서열번호 21 CmR gcgactcgaggtcgactctagaggatcctc
수득한 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하고, 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 정제하였다. 상기 정제한 PCR 산물을 제한효소 EcoRV 및 BamHI로 절단하고, 동일한 제한부위를 절단한 pKatAPH3와 결찰(ligation)시켜 카나마이신 내성 유전자의 양 말단에 lox66 및 lox71 유전자를 포함하는 플라스미드를 제조하였다. 상기 제조된 플라스미드를 pAM1(서열번호 10)이라 명명하였다(도 3).
<1-2> groE 프로모터에 의해 cre 유전자의 발현이 조절되는 제2 선택마커를 포함하는 플라스미드의 제작
cre 재조합 효소, 클로람페니콜 내성 유전자 및 groE 프로모터 유전자를 포함하는 플라스미드를 다음과 같은 방법으로 제조하였다(도 2).
<1-2-1> groE 프로모터 유전자의 수득
데이노코쿠스 라디오두란스 유전자를 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 기재된 GroEF(서열번호 14) 및 GroER(서열번호 15)의 프라이머 각 0.5 ㎕ 및 AccuPower™ pfu PCR premix(Bioneer)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, groE 프로모터 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
<1-2-2> cre 유전자의 수득
NCBI Accession number_ab449974의 서열을 참고하여 인공적으로 합성한 폴리뉴클레오티드(Bioneer)를 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 기재된 CreF(서열번호 16) 및 CreR(서열번호 17)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, cre 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
<1-2-3> groE 프로모터 유전자 및 cre 유전자의 연결
상기 실시예 1-2-1 및 1-2-2에서 수득한 PCR 산물을 혼합하여 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 기재된 GroEF(서열번호 14) 및 CreR(서열번호 17)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, groE 프로모터 유전자 및 cre 유전자가 융합된 형태의 PCR 산물을 수득하였다.
<1-2-4> KatE1 프로모터 유전자의 수득
데이노코쿠스 라디오두란스 유전자를 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 기재된 pKatF(서열번호 18) 및 pKatR(서열번호 19)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, KatE1 프로모터 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
<1-2-5> 클로람페니콜 내성 유전자의 수득
pRAD1 플라스미드(Meima R. et al., Applied and environmental microbiology, 66:3856-3867, 2000)를 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 기재된 CmF(서열번호 20) 및 CmR(서열번호 21)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, 클로람페니콜 내성 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
<1-2-6> KatE1 프로모터 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자의 연결
상기 실시예 1-2-4 및 1-2-5에서 수득한 PCR 산물을 혼합하여 주형으로 사용하고, 상기 표 1에 기재된 pKatF(서열번호 18) 및 CmR(서열번호 21)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, KatE1 프로모터 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자가 융합된 형태의 PCR 산물을 수득하였다.
<1-2-7> 제2 선택마커를 포함하는 플라스미드의 제작
상기 실시예 1-2-3에서 수득한 PCR 산물을 13840 플라스미드(Nguyen, H. H. et al., Molecular microbiology, 73:240-252, 2009)와 함께 제한효소 NotI 및 XhoI(Enzynomics)로 절단한 뒤, 결찰시켜 Cre 발현 벡터를 제조하였다. 이어서 상기 실시예 1-2-6에서 수득한 PCR 산물을 상기 Cre 발현 벡터와 함께 제한효소 XhoI(Enzynomics)로 절단한 뒤, 결찰시켜 제조된 플라스미드를 pAM2(서열번호 11)라고 명명하였다(도 4).
<1-3> DR0801 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
<1-3-1> DR0801 유전자의 상위 및 하위 부위의 수득
데이노코쿠스 라디오두란스의 DNA를 주형으로 하여, 하기 표 2에 기재된 프라이머 1 및 2(서열번호 22 및 23)와 프라이머 5 및 6(서열번호 26 및 27)을 각각 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, DR0801 유전자의 상위 및 하위 부위의 1 kb의 PCR 산물을 각각 수득하였다.
서열번호 이름 서열(5'→3')
서열번호 22 프라이머 1 tacagcgtcaacatcatccg
서열번호 23 프라이머 2 agcttatcgataccgtcgacgaagatttgatacacgcggc
서열번호 24 프라이머 3 gccgcgtgtatcaaatcttcgtcgacggtatcgataagct
서열번호 25 프라이머 4 gctttagcctgagacacatgcatgcctgcaggtcgactct
서열번호 26 프라이머 5 agatgcgacctgcaggcatgcatgtgtctcaggctaaagc
서열번호 27 프라이머 6 tcagaacctctccctaacgc
<1-3-2> lox 유전자를 양쪽에 포함하는 카나마이신 내성 유전자의 증폭
상기 실시예 1-1에서 제작된 pAM1 플라스미드를 주형으로 하여, 상기 표 2에 기재된 프라이머 3 및 4(서열번호 24 및 25)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, lox71 및 lox66 유전자를 양 말단에 포함하는 카나마이신 내성 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
<1-3-3> DR0801 유전자의 상위 및 하위 부위와 lox 유전자를 양쪽에 포함하는 카나마이신 내성 유전자의 연결
상기 실시예 1-3-1 및 1-3-2에서 수득한 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하고, 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 각각 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 혼합하여 주형으로 사용하고, 상기 표 2에 기재된 프라이머 1(서열번호 22) 및 프라이머 6(서열번호 27)을 사용하였으며, PCR 과정에서 72℃에서 3분 동안 반응시킨 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, DR0801 유전자의 상위 및 하위 부위와 lox 유전자를 양쪽에 포함하는 카나마이신 내성 유전자가 융합된 형태의 PCR 산물을 수득하였다(도 5). 수득한 PCR 산물은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하고, 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 정제하였다.
<1-3-4> DR0801 유전자가 결실된 변이 균주의 제조
데이노코쿠스 라디오두란스(ATCC 13939, 농업유전자원정보센터, 대한민국) 균주를 TGY 배지(0.5%(w/v)의 트립톤, 0.1%(w/v)의 글루코스 및 0.3%(w/v)의 효모 추출물)를 이용하여 30℃의 온도에서 OD600의 값이 0.5에 도달할 때까지 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 30 mM의 염화칼슘(CaCl2)이 포함된 2×TGY 배지에 현탁한 뒤, 현탁액을 얼음에서 1시간 동안 방치하였다. 이를 다시 원심분리하여 상층액을 제거하고 30 mM의 염화칼슘 및 10%(v/v) 글리세롤이 포함된 TGY 배지를 첨가하여 재현탁한 뒤, 멸균된 1.5 ㎖ 튜브에 50 ㎕ 씩 분주하여 준비하였다.
상기 실시예 1-3-3에서 정제한 PCR 산물 10 ㎕, 50 ㎕의 데이노코쿠스 라디오두란스 세포 및 30 mM의 염화칼슘이 포함된 50 ㎕의 2×TGY 배지를 혼합하고, 상기 혼합물을 얼음에서 30분 동안 방치한 뒤, 32℃에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 900 ㎕의 2×TGY 배지를 첨가하고, 이를 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양된 균주를 25 ㎍/㎖의 카나마이신이 포함된 2×TGY 고체 배지에 200 ㎕ 씩 도말하고, 30℃에서 3 내지 4일 동안 배양하였다. 배양된 균주로부터 DNA를 추출하여 DR0801 유전자가 결실되었는지를 염기서열 분석으로 확인하고, 최종 선별된 균주를 DLY0-1으로 명명하였다.
<1-4> DR0801 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주로부터 제1 선택마커의 제거
상기 실시예 1-2에서 제작한 pAM2 플라스미드를 상기 실시예 1-3-4에 기재된 방법 및 조건으로 상기 실시예 1-3에서 제조된 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주에 형질전환하였다. 상기와 같은 형질전환으로 lox71 및 lox66 서열로 둘러싸인 제1 선택마커 부위가 제거되면, 해당 부위에 흔적서열인 lox72가 남게 된다(도 5). 형질전환된 균주로부터 카나마이신 내성 유전자가 제거된 균주를 선별하기 위해, 상기 균주의 혼합물을 3 ㎍/㎖의 클로람페니콜이 포함된 2×TGY 고체 배지에 200 ㎕ 씩 도말하고, 30℃에서 3 내지 4일 동안 배양하였다. 배양된 균주로부터 DNA를 추출하여 카나마이신 내성 유전자가 결실되었는지 여부를 염기서열 분석으로 확인하고, 최종 선별된 균주를 DLY0-2으로 명명하였다.
<1-5> DR0801 유전자 및 제1 선택마커가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주로부터 제2 선택마커의 제거
상기 실시예 1-2에서 제작한 pAM2 플라스미드는 온도감수성 플라스미드로서 37℃의 조건에서는 데이노코쿠스 라디오두란스 균주 내에서 복제되지 않는다. 따라서, 이를 이용하여 DLY0-2 균주로부터 pAM2 플라스미드를 다음과 같은 방법으로 제거하였다.
구체적으로, DLY0-2 균주를 37℃에서 TGY 액체 배지를 사용하여 24시간 동안 배양하여 준비하였다. 준비된 DLY0-2 균주를 2×TGY 고체 배지에 부피비로 1:10,000이 되도록 희석하여 도말하고, 이를 30℃에서 2일 동안 배양하였다. 형성된 단일 콜로니를 멸균된 팁(tip)을 이용하여 카나마이신 또는 클로람페니콜이 포함된 2×TGY 고체 배지, 또는 항생제를 포함하지 않는 2×TGY 고체 배지에 접종하고, 30℃에서 1일 동안 배양하였다. 배양 후, 항생제를 포함하지 않는 배지에서만 성장한 단일 콜로니를 최종적으로 선별하여 이를 DLY001로 명명하였다(도 6).
상기 실시예 1-1 내지 1-5를 통하여 최종적으로 DR0801 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
< 실험예 1> DR0801 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 라이코펜 생산효과 확인
상기 실시예 1에서 제조한 DR0801 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 라이코펜 생산능을 야생형의 데이노코쿠스 라디오두란스 균주와 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<1-1> 균주의 배양 및 배양 산물의 수득
하기 표 3에 기재된 조성의 배양 배지를 pH 7.5로 보정하여 액체 배지를 제조하였다.
성분(입수처) 최종 농도
Na2HPO4 (Junsei, 일본) 30 g/ℓ
KH2PO4 (Junsei) 15 g/ℓ
(NH4)2SO4 (Junsei) 9.9 g/ℓ
MnCl2 (Sigma-Aldrich, 미국) 5 μM
MgCl2 (Junsei) 0.8 mM
CaCl2 (Duksan, 대한민국) 0.18 mM
포도당(glucose, Duksan) 10 g/ℓ
100×비타민 믹스
(BME vitamins 100×solution, Sigma-Aldrich)		 10 ㎖/ℓ
L-시스테인 (L-cystein, Sigma-Aldrich) 50 ㎎/ℓ
L-메티오닌 (L-methionine, Sigma-Aldrich) 25 ㎎/ℓ
L-히스티딘 (L-histidine, Sigma-Aldrich) 25 ㎎/ℓ
효모추출물 (yeast extract, Acumedia, 미국) 1 g/ℓ
제조한 액체 배지를 2개의 250 ㎖ 삼각 플라스크에 100 ㎖씩 분주하여 가압멸균하고, 멸균된 액체 배지에 상기 실시예 1에서 제조한 변이 균주 1 ㎖ 또는 야생형의 데이노코쿠스 라디오두란스 균주를 접종하였다. 상기 균주는 30℃, 200 rpm의 조건으로 120시간 동안 교반하며 배양하였다. 배양 후, 배양액을 4℃, 4,000 rpm의 조건으로 15분간 원심분리하여 세포를 회수하고 동결건조하였다. 여기에 0.5 ㎖의 메탄올을 첨가하여 5분간 초음파를 가하고, 추가로 2.5 ㎖의 아세톤을 첨가하여 다시 5분간 초음파를 가한 뒤, 4℃, 4,000 rpm의 조건으로 15분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상층액을 0.2 ㎛의 포어(pore) 크기를 갖는 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE) 여과지를 이용하여 감압여과하였다.
<1-2> 고성능 액체크로마토그래피( HPLC ) 분석을 통한 라이코펜 생산량 확인
상기 실험예 1-1에서 각 균주로부터 수득한 잔사를 이용하여 HPLC를 통해 라이코펜의 생산량을 분석하였다.
구체적으로, 컬럼은 Zorbax Eclipse XDB-C18 5 ㎛(4.6 ×250 ㎜)를 사용하였고, 온도는 40℃, 유속은 1.5 ㎖/min으로 설정하였다. 이동상은 40% 아세토니트릴(acetonitrile), 50% 메탄올 및 10% 이소프로필알코올(isopropyl alcohol)의 혼합 용액을 사용하였다. 상기 실험예 1-1에서 수득한 잔사는 각 5 ㎕씩 주입하였다. 이 때, 비교를 위한 표준품으로는 라이코펜(Lycopene analytical standard, >85%, Sigma-Aldrich, 스위스)을 사용하였다.
그 결과, 야생형 균주에서는 라이코펜이 생산되지 않았으나, DR0801 유전자가 결실된 균주에서는 우수한 라이코펜 생산능을 나타냄을 확인하였다(도 7).
< 실시예 2> DR0801 유전자가 결실되고, DR0862 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
상기 실시예 1에서 제조한 DR0801 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 DR0862(CrtB) 유전자를 과발현하는 플라스미드를 형질전환하여, DR0801 유전자가 결실되고, DR0862 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
구체적으로, DR0862 유전자는 데이노코쿠스 라디오두란스 유전자를 주형으로 사용하여 하기 표 4에 기재된 dr0862F1(서열번호 28) 및 dr0862R1(서열번호 29) 각각의 프라이머 0.5 ㎕, 및 AccuPower™ pfu PCR premix(Bioneer)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하여 수득하였다.
서열번호 이름 서열(5'→3')
서열번호 28 dr0862F1 aagtactagtatgaggtctagggccggtt
서열번호 29 dr0862R1 ctatgcggccgctcagccgtggaccgcgccca
서열번호 30 dr1475F1 ctagactagtgtgaacgaacttcccggcac
서열번호 31 dr1475R1 taacgcggccgcctacacctcaatcggcacgt
상기 수득한 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하고, 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물과 pRADZ3 플라스미드(Meima R. et al., Applied and environmental microbiology, 66:3856-3867, 2000)를 각각 제한효소 SpeI 및 NotI로 절단한 뒤, 결찰시켜 pRADZ3 내에 존재하는 groE 프로모터의 하위에 DR0862 유전자가 발현되도록 플라스미드를 제조하였다(도 8). 제조한 플라스미드를 상기 실시예 1-3-4와 동일한 방법 및 조건으로 상기 실시예 1에서 제조한 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주에 형질전환함으로써 DR0801 유전자가 결실되고, DR0862 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
< 실시예 3> DR0801 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 DR0801 유전자가 결실되고, DR0862 유전자가 과발현된 변이 균주에 DR1475(dxs) 유전자를 과발현하는 플라스미드를 형질전환하여, DR0801 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
구체적으로, PCR 수행 시, 상기 표 4에 기재된 dr1475F1(서열번호 30) 및 dr1475R1(서열번호 31) 각각의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실험을 수행하여, groE 프로모터의 하위에 DR1475 유전자가 발현된 pRADZ3 플라스미드를 제조하였다. 제조한 플라스미드를 주형으로 사용하여, 하기 표 5에 기재된 groF(서열번호 32) 및 dr1475R2(서열번호 33) 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하였다.
서열번호 이름 서열(5'→3')
서열번호 32 groF ataggcggccgctcggcttggaagcacgtatt
서열번호 33 dr1475R2 gttacctaggctacacctcaatcggcacgt
수득된 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하고, 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물과 상기 실시예 2에서 제조된 DR0862 유전자가 포함된 pRADZ3 플라스미드를 각각 제한효소 NotI 및 AvrII로 절단한 뒤, 결찰시켜 pRADZ3 내에 포함된 DR0862 유전자의 하위에 groE 프로모터 및 DR1475 유전자가 발현되도록 플라스미드를 제조하였다(도 9). 제조한 플라스미드를 상기 실시예 1-3-4와 동일한 방법 및 조건으로 상기 실시예 1에서 제조한 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주에 형질전환함으로써 DR0801 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.
< 실험예 2> DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주, 및 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 라이코펜 생산효과 확인
상기 실시예 2 및 3에서 제조한 변이 균주들 및 상기 실시예 1에서 제조한 변이 균주의 라이코펜 생산능을 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<2-1> 균주의 배양 및 배양 산물의 수득
상기 실험예 1-1의 표 3에 기재된 것과 동일한 액체 배지를 제조하여, 가압멸균하고, 이를 50 ㎖씩 250 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고, 상기 실시예 1 내지 3에서 제조된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 각각 500 ㎕씩 접종하였다. 상기 실시예 2 및 3에서 제조된 균주의 배양액에는 3 ㎍/㎖ 농도의 클로람페니콜을 첨가하고, 상기 실험예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 배양하고 세포를 회수하여, 라이코펜이 함유된 배양 산물을 수득하였다.
<2-2> HPLC 분석을 통한 라이코펜 생산량 확인
상기 실험예 2-1에서 수득한 잔사를 이용하여 HPLC를 통해 라이코펜의 생산량을 분석하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 조건 및 방법으로 HPLC를 수행하였으며, 표준품으로 사용한 라이코펜을 50 ㎎/ℓ부터 3.125 ㎎/ℓ까지의 농도로 희석하여 검량선을 작성하였다(도 10 및 11). 작성된 검량선을 사용하여 실시예 1 내지 3에서 제조된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 라이코펜 생산량을 계산하였다.
그 결과, DR0801 유전자가 결실된 변이 균주는 3.2 ㎎/g DCW(dry cell weight)의 라이코펜을 생산한 반면, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 변이 균주는 14.7 mg/g DCW의 라이코펜을 생산하였으며, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주는 53.7 mg/g DCW의 라이코펜을 생산하여 가장 높은 라이코펜 생산능을 보였다(도 12).
<2-3> 배양 시간에 따른 라이코펜 생산량 확인
상기 실험예 2-2에서 가장 많은 양의 라이코펜을 생산하는 것으로 확인된 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주를 이용하여 배양 시간에 따른 라이코펜 생산량을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에서 제조한 변이 균주를 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144 또는 168 시간 동안 배양한 것을 제외하고는 상기 실험예 2-1과 동일한 조건 및 방법으로 배양 산물을 수득하였다. 수득한 배양 산물을 이용하여 상기 실험예 2-2와 동일한 조건 및 방법으로 라이코펜 생산량을 확인하였다.
그 결과, 라이코펜 생산량은 배양 24시간 경과 후에 급증하였으며, 120시간 배양한 경우에 가장 높은 생산량을 보였다(53.7 ㎎/g DCW, 도 13).
<2-4> DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 폐 바이오매스 배지에서 라이코펜 생산능 확인
<2-4-1> 배양 시간에 따른 라이코펜 생산량 확인
상기 실시예 3에서 제조한 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 폐 바이오매스 배지에서 라이코펜 생산능을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 하기 표 6에 기재된 조성의 폐바이오매스 성분인 옥수수침지액(Corn steep liquor)과 글리세롤이 포함된 배지를 제조하고, 1.8L의 배지를 5L의 발효조에 넣고 가압 멸균하였다. 그 후 배양기(MARADO-05S-XS, CNS, 대한민국)를 이용하여 액체 배지에 2 L/min의 멸균된 공기를 12시간 동안 주입하면서 200rpm으로 교반하여 액체 배지를 산소 포화상태로 만들었다. 제조된 산소 포화 배양액에 3 ㎍/㎖ 농도의 클로람페니콜을 첨가하고, 상기 실시예 3에서 제조한 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주를 200ml씩 접종하였다. 배양 온도는 37℃, pH는 2M H2SO4 와 2M NaOH를 이용하여 pH 6.95- pH 7.0로 일정하게 유지하였다. 또한 교반 강도를 200 내지 600rpm 범위에서 조절하여 배양액의 용존산소량(dissolved oxygen, DO)를 30% 이상으로 유지하고, 12시간마다 라이코펜 생산량을 확인하기 위해 배양 산물을 수득하였다. 수득한 배양 산물을 이용하여 상기 실험예 2-2와 동일한 조건 및 방법으로 라이코펜 생산량을 확인하였다.
그 결과, 상기 실험예 2-3의 경우 라이코펜 함량은 53.7 mg/g DCW 였으나, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주를 폐 바이오매스 성분이 포함된 배지에서 배양한 경우 라이코펜 함량은 202.2 mg/g DCW, 라이코펜 수율은 21.7mg/g glycerol 및 라이코펜 생산성은 5.93mg/ℓ/h 로 라이코펜 생산량이 크게 증가하였다(202.5 mg/g DCW)(도 20). 상기 결과는 상기 실험예 2-3의 경우보다 약 4배 라이코펜 함량(Lycopene content)이 높으므로 폐 바이오매스 성분이 포함된 배지에서 상기 변이 균주를 배양시 매우 높은 효율로 라이코펜을 생산할 수 있음을 보여준다.
성분 (입수처) 최종 농도
Tryptone (BD, 미국) 10 g/ℓ
Corn steep liquor (SIGMA, 미국) 20 g/ℓ
Glycerol (JUNSEI, 일본) 20 g/ℓ
MgSO4·7H2O (DAEJUNG, 대한민국) 0.5 g/ℓ
MnCl2 (SIGMA, 미국) 5μM
HEPES (SIGMA, 미국) 50mM
<2-4-2> DR0801 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 성장, 탄소원 소모비 및 라이코펜의 생산량 비교 분석
상기 실험예 2-4-1에서 확인한 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 라이코펜 생산량을 상기 균주의 성장곡선 및 상기 균주가 성장 시 사용하는 탄소원의 소모비와 비교 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 2-4-1에서 수득한 배양산물을 이용한 HPLC 분석으로 배양 배지 내 글리세롤 농도를 측정하여 탄소원의 소모 정도를 확인하였다. 컬럼은 MetaCarb 87H 컬럼(4.6 × 250 mm)을 사용하였고, 컬럼 온도는 60℃, RID 온도는 40℃, 유속은 0.5 ㎖/min으로 설정하였다. 이동상은 0.005 N H2SO4 용액을 사용하였으며, 상기 배양 산물의 주입량은 5 ㎕로 설정하였고, HPLC-RI 검출기를 사용하여 검출하였다. 또한, 96-웰 플레이트에 상기 배양 산물을 웰 당 100 ㎕씩 넣고, 600 nm에서 마이크로플레이트 리더(BioTek Epoch Microplate Spectrophotometer)로 흡광도를 측정하여 상기 균주의 성장곡선을 도출하였다.
그 결과, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주를 폐 바이오매스가 포함된 배지에서 배양한 경우 배양 배지에 포함된 탄소원인 글리세롤(20g/ℓ)을 배양 후 72시간 이내에 모두 소모하였고 추가로 첨가한 글리세롤(20g/ℓ)도 거의 모두 소모하여 총 32.8g/ℓ의 글리세롤을 소모하였다. 또한, 배양 66시간 후 동안 최대 세포 성장을 보였으며(OD600=10.5), 배양 120시간 후 OD600 값은 7.7이었다. 아울러, 배양 120시간째에 라이코펜을 가장 많이 생산하였다(711.4 ㎎/ℓ)(도 19). 상기 결과는 하기 실험예 3의 경우보다 약 10배 배양액의 라이코펜 농도(Lycopene titer)가 높으며 세포 성장을 나타내는 OD600 값도 증가하였고, 탄소원 소모량도 증가한 바, 폐 바이오매스 성분이 포함된 배지에서 상기 변이 균주를 배양시 매우 높은 효율로 라이코펜을 생산할 수 있음을 보여준다.
< 실험예 3> DR0801 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 성장, 탄소원 소모비 및 라이코펜의 생산량 비교 분석
상기 실험예 2-3에서 확인한 DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 라이코펜 생산량을 상기 균주의 성장곡선 및 상기 균주가 성장 시 사용하는 탄소원의 소모비와 비교 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에서 제조한 변이 균주를 상기 실험예 2-3과 동일한 조건 및 방법으로 배양하여 라이코펜 생산량을 측정하였다. 또한, 상기 실험예 2-1에서 수득한 배양 산물을 이용하고, 상기 실험예 2-4-2와 동일한 방법으로 탄소원의 소모 정도 및 균주의 성장곡선을 도출하였다.
그 결과, 상기 변이 균주는 배양 168시간 동안 배양 배지에 포함되는 거의 모든 탄소원을 소모하였고, 배양 168시간 동안 최대 세포 성장을 보였으며(OD600=3.4), 배양 120시간째에 라이코펜을 가장 많이 생산하였다(75.5 ㎎/ℓ)(도 14).
< 실험예 4> DR0801 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 배양 시 자외선 조사에 따른 라이코펜 생산량 증가 효과 확인
토마토에 자외선을 조사하면 라이코펜 함량이 증가한다는 점에 착안하여, 상기 실시예 3에서 제조한 변이 균주의 배양 시, 자외선을 조사하여 라이코펜 생산량이 증가되는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 변이 균주의 배양 과정 중 미생물 생장 대수기(exponential phase)부터 UV-C를 조사하고, 총 72시간 동안 배양한 것을 제외하고는 상기 실험예 2-1 및 2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 상기 균주의 라이코펜 생산량을 측정하였다.
그 결과, DR0801 유전자가 결실되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 배양 시 자외선을 조사한 경우, 자외선을 조사하지 않은 경우에 비하여 라이코펜 생산량이 증가하였다(도 15).
< 실시예 4> DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
데이노코쿠스 라디오두란스의 DNA를 주형으로 하여, 하기 표 7에 기재된 dr0091-1 및 dr0091-2(서열번호 34 및 35)와 dr0091-5 및 dr0091-6(서열번호 38 및 39)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하여, DR0091 유전자의 상위 및 하위 부위의 1 kb PCR 산물을 각각 수득하였다.
상기 실시예 1-1에서 제작된 pAM1 플라스미드를 주형으로 하여, 하기 표 7에 기재된 dr0091-3 및 dr0091-4(서열번호 36 및 37)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하여, lox71 및 lox66 유전자를 양 말단에 포함하는 카나마이신 내성 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
서열번호 이름 서열(5'→3')
서열번호 34 dr0091-1 agccacagcgttgttgacca
서열번호 35 dr0091-2 agcttatcgataccgtcgacttctcgctcgcctacttcac
서열번호 36 dr0091-3 gtgaagtaggcgagcgagaagtcgacggtatcgataagct
서열번호 37 dr0091-4 gcaggctgggctctgattgcatgcctgcaggtcgactct
서열번호 38 dr0091-5 agagtcgacctgcaggcatgcaatcagagcccagcctgc
서열번호 39 dr0091-6 catcctgaccactgcgaatg
상기 각 PCR 산물을 상기 실시예 1-3-3과 동일한 방법으로 연결하고, 상기 실시예 1에서 제조한 DR0801 유전자가 결실된 변이 균주를 사용하여 상기 실시예 1-3-4와 동일한 조건 및 방법으로 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 변이 균주를 제조하였다.
< 실험예 5> DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 라이코펜 생산효과 확인
상기 실시예 4에서 제조한 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 라이코펜 생산능을 상기 실시예 1에서 제조한 DR0801 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주와 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1 및 4에서 제조한 변이 균주들을 72시간 동안 배양한 것을 제외하고는 상기 실험예 2-1 및 2-2와 동일한 조건 및 방법으로 균주 배양 및 HPLC 분석을 수행하여 라이코펜 생산량을 측정하였다.
그 결과, DR0801 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주는 3.72 mg/g DCW의 라이코펜을 생산한 반면, DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주는 4.67 mg/g DCW의 라이코펜을 생산하여, 약 25%의 라이코펜 생산량 증가율을 보였다(도 16).
< 실시예 5> DR0801 , DR0091 및 DR1998 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조
DR1998 유전자는 세포 내 과산화수소를 분해하는 역할을 하는 카탈레이즈를 암호화하는 유전자로, 상기 유전자를 결실시키면 카탈레이즈와 동일한 역할을 하는 라이코펜의 생산이 증가할 것으로 예상되어, 상기 실시예 4의 변이 균주에서 DR1998 유전자가 더 결실된 변이 균주를 제조하였다. 구체적으로, 데이노코쿠스 라디오두란스의 DNA를 주형으로 하여, 하기 표 8에 기재된 dr1998-1 및 dr1998-2(서열번호 40 및 41)와 dr1998-5 및 dr1998-6(서열번호 44 및 45)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하여, DR1998 유전자의 상위 및 하위 부위의 1 kb PCR 산물을 각각 수득하였다.
상기 실시예 1-1에서 제작된 pAM1 플라스미드를 주형으로 하여, 하기 표 7 기재된 dr1998-3 및 dr1998-4(서열번호 42 및 43)의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하여, lox71 및 lox66 유전자를 양 말단에 포함하는 카나마이신 내성 유전자의 PCR 산물을 수득하였다.
서열번호 이름 서열(5'→3')
서열번호 40 dr1998-1 TCCTTGACCAGCCGGGTGCA
서열번호 41 dr1998-2 AGCTTATCGATACCGCTGACCACACTCTCCTTCGCCTCGCTGGCT
서열번호 42 dr1998-3 gtcgacggtatcgataagcttgatatctaccgttcgtata
서열번호 43 dr1998-4 catgcctgcaggtcgactctagaggatcctaccgttcgta
서열번호 44 dr1998-5 AGAGTCGACCTGCAGGCATGACTGAGACAAGCTGAGCACG
서열번호 45 dr1998-6 TGCGGATTTTCATAGAGGTA
상기 각 PCR 산물을 상기 실시예 1-3-3과 동일한 방법으로 연결하고, 상기 실시예 4 에서 제조한 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 변이 균주를 사용하여 상기 실시예 1-3-4와 동일한 조건 및 방법으로 DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실된 변이 균주를 제조하였다.
< 실험예 6> DR0801 , DR0091 및 DR1998 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 라이코펜 생산효과 확인
상기 실시예 5에서 제조한 DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 라이코펜 생산능을 상기 실시예 4에서 제조한 DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주와 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 토마토에 자외선을 조사하면 라이코펜 함량이 증가한다는 점에 착안하여, 상기 실시예 5에서 제조한 변이 균주의 배양 시, 자외선을 조사하여 배양하였다.
<6-1> 균주의 배양 및 배양 산물의 수득
DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 배양하는 과정에서 배양 24시간 후부터 자외선을 조사한 것, 및 2종 변이 균주를 총 72시간 동안 배양한 것을 제외하고는 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 변이 균주를 배양하고, 배양 산물을 수득하였다.
<6-2> HPLC 분석을 통한 라이코펜의 생산량 확인
상기 실시예 4 및 5에서 제조한 변이 균주를 사용하여 상기 실험예 2-2와 동일한 조건 및 방법으로 라이코펜 생산량을 측정하였다.
그 결과, DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주는 5.20 mg/g DCW의 라이코펜을 생산한 반면, DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실되고, 배양 과정 중 자외선을 조사한 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주는 17.53 mg/g DCW의 라이코펜을 생산하여, 약 337%의 라이코펜 생산량 증가율을 보였다(도 17).
<6-3> 배양 시간에 따른 라이코펜 생산량 확인
상기 실험예 5-2에서 보다 많은 양의 라이코펜을 생산하는 것으로 확인된 DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실되고, 배양 과정 중 자외선을 조사한 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 이용하여 배양 시간에 따른 라이코펜 생산량을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 5에서 제조한 변이 균주를 0, 24, 48, 72 또는 96 시간 동안 배양한 것을 제외하고는 상기 실험예 2-1과 동일한 조건 및 방법으로 배양 산물을 수득하였다. 수득한 배양 산물을 이용하여 상기 실험예 2-2와 동일한 조건 및 방법으로 라이코펜 생산량을 확인하였다.
그 결과, 상기 변이 균주를 72시간 배양한 경우에 가장 많은 라이코펜을 생산하였다(17.53 ㎎/g DCW, 도 18).
결론적으로, 상기 실시예 및 실험예를 통하여, 야생형의 데이노코쿠스 라디오두란스 균주와 다르게, DR0801 유전자가 결실된 변이 균주는 라이코펜 생산능을 가지고, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 변이 균주의 라이코펜 생산능은 더 높으며, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 라이코펜 생산능은 더욱 높음을 확인하였고, DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현된 변이 균주의 배양 시 자외선을 조사하면 라이코펜 생산능이 더욱 증가함을 확인하였다. 또한, DR0801 유전자가 결실된 변이 균주에 비하여, DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 변이 균주의 라이코펜 생산능이 더 높고, DR0801, DR0091 및 DR1998 유전자가 결실되고 배양 시 자외선을 조사한 변이 균주의 라이코펜 생산능이 더욱 높음을 확인하였다. 따라서, 상기 변이 균주들 및 이를 이용한 라이코펜 생산 방법은 라이코펜의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> University of seoul Industry Cooperation Foundation <120> Mutant strain having increased lycopene productivity <130> 2018P-05-036 <150> KR 10-2018-0073030 <151> 2018-06-25 <160> 45 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1233 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans <400> 1 tcaaatcttc agccccgcag cggcggccag tgcccggcca ctcgcggcgg gctgcgcgag 60 ggcggcacgg gcgagcggca ggcgtacccg gccccccgtc tgcgcgaaca cccgcagcat 120 ggtccgcgcc agggtgcccg cgtcggtgtc ggggtgcagg aaacgcgccc actgctcgcg 180 cggcaggccg aagaaggtgc cgaaaaaatg cggcagctcg gcccgttcca gccccagcag 240 cgcccccacg ccgagcagat gcacctcgcg ggcggcgcgt cgctccgggg accacagggc 300 ggcccagcca gcggcggcgg cgtctttacc ctggcaaagg gctgtggcaa tggcggtggc 360 cactcccggc gcgtcactga gtgccccggc cacctgaaaa ccgctcaccg gatggacccg 420 gcccgccgcc gcgccgtaag cgagcacgcc gccaggcgcg ggggcctggg cattcatggg 480 aaaggccacc cattcctcgc tctcggtggc gtggggcggt gtgccctggg cgctcagccg 540 ggcgagcagc cgccgccgca actcggcgcg ggtcggagca ggccgggcaa tcaggctcgt 600 ttcctccacg aaatagcggt ccccgccgag gtgcatggcg tagagaaagg tcgcctcgcc 660 ccgcttcagc tccggcgcgg gcgtgcggta gtccatccac accatgctgc cgggtgtgac 720 cggcgggcgg cgaaagcggg ccaccacccc gtaggccgtc tgcaacgccg cgccaccggg 780 aaaccggacc ggagacacga gcgccccatg cccactggcg tccacgacca gccgggtctg 840 ccaacgctcg ccgcccgcgc cgtacacggt ccagcctgcg ccgctgcgct cggcgtgcag 900 ggcggctcct tccacccagg tccagtcggc aagcccgcgc agggtccgca gcaacgcggc 960 gttgtcgagc agcgcataag gctgccccag cgatgtgggc tggggaccgg tgtacgcgcg 1020 cacgtcggtc cagacctgct ccgcgcagcc tcgcgcccag gtgggcaggt cgccgagcca 1080 ggccccgtag gtggcgggaa aaggccgggg tggatgcggt gcgagctgct gcacgtccag 1140 tccccgcgcg gcgagttcgg cgctcagggc ggtgccgctc gggccgccgc cgatgaccag 1200 cacgtcggaa ctcgcggggg aaaaaggcgc cat 1233 <210> 2 <211> 978 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans <400> 2 gtgaggtcta gggccggttt gtctcttaga ctgccgacga ggaccctcac cgtgacggac 60 tattcacctg ccctgccctg caccgaactg cgccgcccgc cgctggcgca ggcagtgagg 120 tactgccggg acctgacgcg gcagcacagc aagacgtttt atctggggtc gcaactgttt 180 tcgccacccg agcgggccgc cgtgtgggcg gtctacgccg cctgccgcgc cggggacgac 240 atcgtggacg aggcgggaaa cggggaccgc gagcgcgaac tccgtgagtg gcgcagccgg 300 attgacgcgg cgtttgcggg gcaaccggcg gacgacccca tcagcacggc gctggcgtgg 360 gcggcggggc gctacgccat tccccacagc gcctttgccg agctgcacga gggcctgaac 420 atggacctgc gtgggcacga gtaccgcgac atggacgacc tgttgctcta ctgccgccgg 480 gtggccgggg tggtggggtt catggtcgcg cctatcagcg gctaccgggg cggcgcggcg 540 acgctgaacg acgccttgca actcggtcag gcgatgcagc tcaccaacat cctgcgcgac 600 gtgggcgagg acctgacgcg cggacgggtc tacctgccgc agagcctgct cgacgaatac 660 ggcctgtcac gcgccgcgct ggagcgctgg ggccagggcg aaccgctcag ccccgcctac 720 cgcgccctga tgacgcacct cggcgggctg gcgcgcgagt ggtacgccgc tggccgcgcc 780 gggattccgc agctcgacgg acgcggcccg ctggcggtgc tgaccgccgc ccgcgcctac 840 gagggcattc tggacgacct cgaacgcgcc ggctacgaca atttcgggcg ccgcgcctac 900 gtgagtggcc ggcgcaaact gctgatgctg ccgcaggcgt ggtgggaact gcgctcgctg 960 ggcgcggtcc acggctga 978 <210> 3 <211> 1890 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans <400> 3 gtgaacgaac ttcccggcac gtccgatacc ccgctgctcg accagattca tggccccaaa 60 gacctcaaac gcctctcgcg ggagcagttg cccgcgctga ccgaggagct gcgcggcgaa 120 atcgtgcgtg tctgctcgcg cggcggcctg cacctcgcgt cctcgctcgg cgcggtggac 180 atcatcacgg cgctgcatta cgtgctcgac tcgccgcgcg accggattct cttcgacgtg 240 gggcatcagg cctacgccca caaaatcctg accgggcggc gcgaccagat ggccgacatc 300 aagaaagaag gcggcatcag cggctttacc aaggtttccg agtccgaaca cgacgcgatt 360 acggtgggcc acgcctccac ctccctcgcc aacgcgctcg gcatggcgct cgcgcgtgac 420 gcgcagggca aggatttcca cgtcgctgcc gtcatcggcg acggctcgct gaccggcggg 480 atggccctcg ccgcgctcaa caccatcggc gacatgggcc gcaagatgct gatcgtgctc 540 aacgacaacg agatgagcat ctcggaaaat gtcggggcca tgaacaaatt catgcgcggg 600 ctgcaagtcc agaagtggtt tcaggaaggc gaaggtgcgg gcaaaaaagc ggtggaagcc 660 gtcagcaagc cgctcgccga cttcatgagc cgggcgaaaa actccacccg ccacttcttc 720 gaccccgcca gcgtcaaccc cttcgccgcg atgggcgtgc gctacgtcgg cccggtggac 780 ggccacaacg tgcaggaact ggtgtggctg ctcgaaagac tggtggacct cgatggcccg 840 accatcctcc acatcgtcac caccaagggc aagggcctga gctacgccga ggccgacccg 900 atctactggc acggcccggc caagttcgac ccggcgaccg gcgagtacgt gccgagcagc 960 gcctattcgt ggagcgccgc cttcggtgag gccgtgaccg agtgggcgaa gaccgacccg 1020 cgcaccttcg tcgtcacgcc cgccatgcgc gagggcagcg ggctggtcga attcagccgc 1080 gtacacccgc accgttacct cgacgtgggc atcgccgagg aagtcgcggt gacgacggcg 1140 gcgggcatgg cgctgcaagg gatgcggccc gtcgtcgcca tctactccac cttcctgcaa 1200 cgcgcctacg accaggtgtt gcacgacgtg gcgattgagc acctcaacgt caccttctgc 1260 atcgaccgcg cgggcatcgt gggggcggac ggggccacgc acaacggcgt gttcgacctc 1320 agcttcctgc gctctatccc cggcgtccgc atcgggctgc cgaaagacgc cgccgaactg 1380 cgcgggatgc tcaagtacgc ccagacgcac gacggcccct ttgccatccg ctacccgcgc 1440 ggcaatacgg cgcaggtgcc cgccgggacg tggccggacc tgaaatgggg cgagtgggaa 1500 cggctgaagg ggggcgacga cgtggtgatt ctggcgggcg gcaaggcgct cgactatgcc 1560 ttgaaggccg ccgaggacct ccccggtgtg ggcgtggtca atgcccgctt cgtcaagccg 1620 ctcgacgaag agatgctgcg cgaggtgggg ggccgggccc gcgccctgat tacggtggaa 1680 gacaacaccg tcgtcggcgg cttcgggggc gcggtgctcg aggcgctgaa cagcatgaac 1740 ctgcatccca ccgtgcgcgt tctcggcatt cccgacgagt ttcaggaaca cgccactgcc 1800 gagagcgtcc acgcccgcgc cggcatcgac gccccggcga ttcggacggt gctcgccgaa 1860 ctcggggtgg acgtgccgat tgaggtgtag 1890 <210> 4 <211> 939 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans <400> 4 tcaactggca cgccgcaccc cgcgcgcgag cagcgctccc agccccatca cggcgagtgt 60 gacccccgct tccgccagcc gccccaccag caccagcccg cccggcagaa aaaaagcctc 120 ggtgaagtag gcgagcgaga aggacggcga taagccctca gccttctgct tctctttggc 180 atcaaaaagc cccggcgcca gacgcttcat gccccaggca atcgccgtgc ccaccgccca 240 ccagccgaga aagttctgca ccggcgcccc ggcccacagc gggtgggggt cgctccagcg 300 ccagtagttc tgcgccgtca tcagcggttc gaggcccacg tcccagcacg tgatgagcag 360 ccccgccagc caggggcgcc cgcccgcgag ttgcagcccg gcgagggtaa aggcgaacca 420 gcccagcggc acgataagcg gcaccgtgag cacggtgggc gcgggggcgg tggcgtagga 480 gtactgccca aaaggaaccc ccgtccggct gccgagcagt tccacgccca gcccggcgag 540 gcaggcgagg gcggcgagct gcgcggcctg gccccagccc gcccgctgcg cggcgtagct 600 cagtccggcg acgaacagcg ccccggtgct gagcagcccc agcagcgcaa acccctgcgg 660 ccacagcggc accggaatct tgagggccac ggagagcgcg agccacccca accacggcgg 720 cgtctcagcg agcagccgtt gccagcgccg ccgcagggtg gccccgaacg ctgaccccag 780 cgcgtccccc gccagcgcaa acaccccgga gagcggcagc cccagcgcaa tcagagccca 840 gcctgcggac tgctcggcca gcgccagcag cgcccccaga aaggcgaggc cgaggccagc 900 ggcggccagc ccccagcgca ggaggggggg cgagatcaa 939 <210> 5 <211> 1611 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans <400> 5 atgagcgacg aaaacaacaa gggcgtcggc acggcggtgc agggcgtggg cggtccccgc 60 gacgggcgca ccgcccccgg cgagcaaggc accaccctga ccacccgcca gggccacccc 120 gttcacgaca accagaacag ccgcacggtg ggcagccgtg gcccgatgac gctggaaaac 180 taccagttca tcgaaaagct ctcgcacttc gaccgcgagc gcattcccga gcgtgtggtg 240 cacgcccgcg gcgtcggcgc ccacggcgtg ttcagagcga cgggcaaggt cggcgacgag 300 ccggtgagca agtacacccg cgccaagctg tttcaggaag acggcaagga aacgcccgtc 360 ttcgtgcgct tctcgacggt gggtcacggc acccactcgc ccgaaacgct gcgtgacccg 420 cgcgggttcg ccgtcaagtt ctacaccgaa gacggcaact gggacctcgt cggcaacaac 480 ctcaaaatct tcttcatccg tgacgcgctg aagttccccg acctgatcca cagccagaag 540 cccagcccga ccaccaacat ccagtcgcag gagcgcatct tcgatttctt cgcgggctcc 600 cccgaagcga cccacatgat taccctgctg tactcgccct ggggcattcc ggcgagctac 660 cgcttcatgc agggcagcgg cgtgaacacc tacaagtggg tcaacgacca gggtgaaggc 720 gtgctggtca agtaccactg ggaacccgtg cagggcgtgc gcaacctgac gcagatgcag 780 gccgacgagg tgcaggcgac caacttcaac cacgcgaccc aggacctgca cgacgccatc 840 gagcgcggcg actttcccca gtgggacctg ttcgtgcaga tcatggaaga cggcgagcac 900 cccgaactcg actttgaccc cctcgacgac accaagatct ggccccgcga gcagttcccc 960 tggcggcacg tcggccagat gacgctgaac cgcaaccccg aaaacgtgtt tgccgaaacc 1020 gagcaggccg ccttcgggac cggcgtgctg gtggacggcc tggacttcag cgacgacaag 1080 atgctccagg gccgcacctt cagctactcc gacacccagc gctaccgcgt cggccccaac 1140 tacctgcaac tgccgatcaa cgcgcccaaa aagcacgtcg ccaccaacca gcgcgacggg 1200 cagatggcct accgggtgga tacctttgag ggccaggacc agcgtgtgaa ctacgagccg 1260 agccttctca gcggtcccaa ggaagcgcct cgccgcgccc ccgagcacac 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<220> <223> primer 2 <400> 23 agcttatcga taccgtcgac gaagatttga tacacgcggc 40 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 24 gccgcgtgta tcaaatcttc gtcgacggta tcgataagct 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 25 gctttagcct gagacacatg catgcctgca ggtcgactct 40 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 26 agatgcgacc tgcaggcatg catgtgtctc aggctaaagc 40 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 27 tcagaacctc tccctaacgc 20 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr0862F1 <400> 28 aagtactagt atgaggtcta gggccggtt 29 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr0862R1 <400> 29 ctatgcggcc gctcagccgt ggaccgcgcc ca 32 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1475F1 <400> 30 ctagactagt gtgaacgaac ttcccggcac 30 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1475R1 <400> 31 taacgcggcc gcctacacct caatcggcac gt 32 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> groF <400> 32 ataggcggcc gctcggcttg gaagcacgta tt 32 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1475R2 <400> 33 gttacctagg ctacacctca atcggcacgt 30 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr0091-1 <400> 34 agccacagcg ttgttgacca 20 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr0091-2 <400> 35 agcttatcga taccgtcgac ttctcgctcg cctacttcac 40 <210> 36 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr0091-3 <400> 36 gtgaagtagg cgagcgagaa gtcgacggta tcgataagct 40 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr0091-4 <400> 37 gcaggctggg ctctgattgc atgcctgcag gtcgactct 39 <210> 38 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr0091-5 <400> 38 agagtcgacc tgcaggcatg caatcagagc ccagcctgc 39 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr0091-6 <400> 39 catcctgacc actgcgaatg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1998-1 <400> 40 tccttgacca gccgggtgca 20 <210> 41 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1998-2 <400> 41 agcttatcga taccgctgac cacactctcc ttcgcctcgc tggct 45 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1998-3 <400> 42 gtcgacggta tcgataagct tgatatctac cgttcgtata 40 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1998-4 <400> 43 catgcctgca ggtcgactct agaggatcct accgttcgta 40 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1998-5 <400> 44 agagtcgacc tgcaggcatg actgagacaa gctgagcacg 40 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1998-6 <400> 45 tgcggatttt catagaggta 20

Claims (12)

  1. DR0801 유전자가 결실되고 DR0862 유전자가 과발현된 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DR0801 유전자가 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DR0862 유전자가 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  4. 제1항에 있어서, DR1475 유전자를 추가적으로 과발현시킨, 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  5. 제4항에 있어서, 상기 DR1475 유전자가 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  6. DR0801 및 DR0091 유전자가 결실된 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  7. 제6항에 있어서, 상기 DR0091 유전자가 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  8. 제6항에 있어서, DR1998 유전자가 더 결실된, 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  9. 제8항에 있어서, 상기 DR1998 유전자가 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 라이코펜 생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  10. 1) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 변이 균주를 배양하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 배양액에서 라이코펜을 회수하는 단계;
    를 포함하는, 라이코펜 대량 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단계 1)의 배양에 자외선을 조사하는 단계를 더 포함하는, 라이코펜 대량 생산 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 단계 1)의 배양은 옥수수침지액(corn streep liquor) 및 글리세롤이 포함된 배지에서 이루어지는 것인, 라이코펜 대량 생산 방법.
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