KR101835852B1

KR101835852B1 - Cre-lox 시스템을 이용한 데이노코쿠스 속 미생물의 개량 방법

Info

Publication number: KR101835852B1
Application number: KR1020160180120A
Authority: KR
Inventors: 최용준; 정선욱
Original assignee: 서울시립대학교 산학협력단
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2018-04-19

Abstract

본 발명은 Cre-lox 시스템을 이용하여 데이노코쿠스 속 미생물(Deinococcus sp.)의 유전체를 개량하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 groE 프로모터가 적용된 Cre-lox 시스템을 이용하여 데이노코쿠스 속 미생물의 유전체를 구성하고 있는 여러 유전자를 원하는 목적에 따라 고효율로 결실 및 증폭시킬 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 groE 프로모터가 적용된 Cre-lox 시스템을 이용한 데이노코쿠스 속 미생물의 유전체 개량 기술은 기존의 기술에 비해 약 10배 이상 빠른 속도 및 특이적으로 목적에 적합하게 데이노코쿠스 속 미생물을 개량할 수 있으므로, 향후 데이노코수스 속 미생물의 산업적 적용에 매우 유용하다.

Description

Cre-lox 시스템을 이용한 데이노코쿠스 속 미생물의 개량 방법 {Method for Genetic Engineering of Deinococcus Microorganisms Using Cre-lox System}

본 발명은 Cre-lox 시스템을 이용하여 데이노코쿠스 속 미생물(Deinococcus sp.)의 유전체를 개량하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 groE 프로모터가 적용된 Cre-lox 시스템을 이용하여 데이노코쿠스 속 미생물의 유전체를 구성하고 있는 여러 유전자를 원하는 목적에 따라 고효율로 결실 및 증폭시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.

미생물 대사공학 (metabolic engineering)은 미생물 등의 유전체를 개량하여 원하는 목적에 맞게 활용하는 기술이다 (Kumar, R. R. et al., Indian journal of microbiology 51:403-409, 2011). 유용 대사산물은 미생물의 유전정보와 대사회로 (metabolic pathway)로부터 얻을 수 있으며, 미생물 유전자조작을 통해서 더 유용한 대사물질이나 그 특성을 개선시킬 수 있는 기술들이 개발되고 있다 (Stephanopoulos, G. ACS synthetic biology 1:514-525, 2012). 특히, 대사공학분야에서 Flp/FRT 그리고 Cre/lox와 같은 site-specific 재조합 기술은 식물, 효모, 미생물과 같은 다양한 생명체 모델에 적용되고 있다 (Datsenko, K. A. et al., PNAS 97:6640-6645, 2000; Gilbertson, L. Trends in biotechnology 21:550-555, 2003; Baba, T. et al. Molecular systems biology 2, 2006; Yan, X. et al., Applied and environmental microbiology 74:5556-5562, 2008).

한편, 데이노코쿠스 라디오두란스 (Deinococcus radiodurans)는 생물체의 DNA 또는 단백질에 직접 손상을 입힐 수 있는 이온화방사선 (Ionizing radiation) 에 대하여 내성을 지니고 있는 균주로 알려져 있다 (Makarova, K. S. et al. Microbiology and molecular biology reviews 65:44-79, 2001). 이 균주는 이온화방사선에 의한 DNA 손상을 빠른 시간내에 복구할 수 있으며 (Grimsley, J. K. et al., International journal of radiation biology 60:613-626, 1991), 효소적 그리고 비효소적 시스템에 의하여 세포내에 생성된 활성산소종 (Reactive oxygen species, ROS)을 효과적으로 제거할 수 있는 능력을 지니고 있다 (Shashidhar, R et al., Canadian journal of microbiology 56:195-201, 2010). 이러한 특성으로 인하여 이 균주는 방사성폐기물 정화에 이용되고 있으며 (Brim, H. et al., Applied and environmental microbiology 69:4575-4582, 2003), 또한 의약, 보건, 생명공학 등의 다양한 분야에 이 미생물을 적용한 기술들의 사례가 증가할 것으로 예상된다 (Slade, D. et al., Microbiology and molecular biology reviews 75:133-191, 2011).

현재까지 보고된 연구에서는 데이노코쿠스 라디오두란스의 대사공학적 제어를 위하여 다른 미생물의 유전자를 세포내로 도입시키거나 (Lange, C. C. et al., Nature biotechnology 16:929-933, 1998), 상동적 재조합 (homologous recombination)법을 기초로 한 돌연변이 균주 제작기술이 고안되었다 (Xu, Z. et al., Microbiology 153:1642-1652, 2007). 그러나 이러한 돌연변이 제조기술은 반복적인 유전자 클로닝과정 (gene cloning)으로 인해 많은 시간이 소요되며, 돌연변이주를 선별 (screening)하기 위한 항생제 마커 (antibiotic marker)의 제한성으로 인해 다중돌연변이체 (multiple gene knockout mutant)를 제작하는데 어려움이 있다.

이에, 본 발명자들은 데이노코쿠스 라디오두란스의 대사공학적 제어를 위하여 Cre/lox와 같은 site-specific 재조합 기술을 데이노코쿠스 라디오두란스에 적용하여, 간편하고 효율적으로 돌연변이주를 제조하고자 예의 노력한 결과, groE 프로모터를 적용한 Cre-lox 시스템을 이용하여 데이노코쿠스 라디오두란스에서 cre 재조합효소의 발현이 가능한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 제1 선택마커를 함유하는 lox 핵산 단편의 양 말단에 각각 목적유전자의 상부단편과 하부단편이 퓨전된 DNA 구조체를 데이노코쿠스 속 미생물에 도입하여 목적유전자를 결실시키고, 상기 목적유전자가 결실된 미생물에 groE 프로모터, cre 재조합효소를 코딩하는 유전자, 제2 선택마커 및 온도감수성 repUts를 함유하는 벡터를 도입하여 제1 선택마터를 제거한 다음, 수득된 변이미생물을 배양하여 제2 선택마커가 제거된 데이노코쿠스 속 변이미생물로 수득하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp .) 변이미생물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 제1 선택마커를 함유하는 lox 핵산 단편의 양 말단에 각각 목적유전자의 상부단편과 하부단편이 퓨전된 DNA 구조체를 데이노코쿠스 속 미생물에 도입하여 목적유전자를 결실시키는 단계; (b) 상기 목적유전자가 결실된 미생물에 groE 프로모터, cre 재조합효소를 코딩하는 유전자, 제2 선택마커 및 온도감수성 repUts를 함유하는 벡터를 도입하여 제1 선택마터를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 변이미생물을 배양하여 제2 선택마커를 함유하는 벡터가 제거된 데이노코쿠스 속 변이미생물로 수득하는 단계를 포함하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 (C)단계에서 변이미생물 배양온도는 30~40℃인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 데이노코쿠스 속 미생물은 데이노코쿠스 라디오두란스인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 목적유전자는 dr0053인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 목적유전자의 상부단편 또는 하부단편의 길이는 0.5~1.2kb인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 lox 핵산 단편은 lox71 또는 lox66인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 선택마커를 함유하는 lox 핵산 단편은 서열번호 17로 표시되는 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp .) 변이미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 groE 프로모터는 서열번호 19로 표시되는 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 제1 및 제2 선택마커는 항생제 내성 유전자인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp .) 변이미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항생제 내성 유전자는 카나마이신, 클로람페니콜, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 내성 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 제1 선택마커는 cre 재조합효소의 발현에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp .) 변이미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 (b) 단계의 벡터는 서열번호 21로 표시되는 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp .) 변이미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 groE 프로모터가 적용된 Cre-lox 시스템을 이용한 데이노코쿠스 속 미생물의 유전체 개량 기술은 기존의 기술에 비해 약 10배 이상 빠른 속도 및 특이적으로 목적에 적합하게 데이노코쿠스 속 미생물을 개량할 수 있으므로, 향후 데이노코수스 속 미생물의 산업적 적용에 매우 유용하다.

도 1은 (a) pAM1 벡터 및 (b) pAM2 벡터의 제조 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 lox71, lox66, kat 프로모터 및 카나마이신 내성유전자를 포함하고 있는 pAM1의 벡터를 나타낸 것이다.
도 3은 groE 프로모터, Cre 재조합효소 (recombinase), kat 프로모터, 클로람페니콜 (chloramphenicol) 내성유전자 및 temperature sensitive를 나타내는 repUts를 포함하는 pAM2 벡터를 나타낸 것이다.
도 4는 데이노코쿠스 라디오두란스에서 프로모터에 따른 cre 재조합효소의 발현양을 확인한 결과이다.
도 5는 데이노코쿠스 라디오두란스 유전체에서 dr0053 유전자를 결실하는 과정을 도식화한 것이다.
도 6은 야생형 데이노코쿠스 라디오두란스(WT)와 돌연변이 구조물 (mutagenesis construct)에 의해 상동성 재조합 (homologous recombination)이 일어난 후 카나마이신 항생제 내성 유전자가 제거되지 않은 데이노코쿠스 라디오두란스 (DrAM1), pAM2 벡터가 도입되어 Cre 재조합효소 (recombinase)에 의해 카나마이신 항생제 내성 유전자가 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 (DrAM2) 및 37℃에서 16시간 배양 후 pAM2 벡터가 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스(DrAM3)를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서 유전자의 '불활성화'란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당 유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성 경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.

본 발명에서 ‘위치특이적 재조합 효소’는 특정 DNA 서열을 인식하여 재조합을 일으키는 단일 효소 또는 효소군을 의미하며 서열의 재배치나 결실 등을 유발할 수 있다. 대표적인 예로는 Cre 재조합 효소 등이 있다.

본 발명에서, 'Cre-Lox 재조합'은 DNA의 특정 부위에서 결실, 삽입, 전좌 및 역위를 수행하는 데 사용되는 위치특이적 재조합 효소 기술로, 진핵생물 및 원핵생물 시스템에 적용 가능하다. Cre-Lox 시스템은 단일 효소인 Cre 재조합 효소 (recombinase)로 구성되어 있으며 Lox 서열이라 불리는 짧은 표적 서열을 재조합한다. 이 시스템은 다른 단백질이나 서열을 삽입하지 않고도 구현할 수 있으며, Cre 효소 및 LoxP 서열은 박테리오파지 P1으로부터 유도된다. Lox 서열을 적절히 배치하면 유전자가 활성화 또는 억제되거나 다른 유전자와 교환될 수 있다. Lox P는 34 bp로 구성된 박테리오파지 P1의 부위로 비대칭 8bp 염기 서열을 포함하고 있으며, 중간 2개 염기를 제외하고는 2쌍의 palindromic 13bp 염기서열 사이에 존재한다 (ATAACTTCGTATA - NNNTANNN -TATACGAAGTTAT).

본 발명에서 ‘선택 마커’란 특정 유전자의 산물을 말하는 것으로, 이 산물을 포함하는 미생물은 포함되지 않은 미생물에는 나타나지 않는 특별한 형질을 나타내어 쉽게 구별할 수 있게 된다.

본 발명에서 ‘형질전환’이란 특정 외래의 DNA 가닥을 세포 밖에서 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 가닥을 포함한 숙주 미생물은 ‘형질 전환된 미생물’이라 한다. DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미하는 '형질전환'은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하거나 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포의 염색체에 통합 완성시켜 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명에서 '벡터 (vector)'는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 플라스미드 (plasmid) 및 벡터 (vector)는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 ‘제한효소’란 특정한 DNA 뉴클레오타이드에 서열에 결합하여 DNA 내부를 절단하는 효소를 통칭한다.

본 발명에서 '프로모터'란 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 의미한다. 구체적으로, "프로모터"란, 전사개시점 (+1) 부터 20~30 염기에 대해 상류에 있고, 정확한 위치로부터 RNA 폴리머라아제에 전사를 개시시키는 기능을 담당하는 TATA 박스 또는 TATA 박스 유사의 영역이 포함되지만, 반드시 이들 영역의 전후에 한정되는 것은 아니고, 이 영역 이외에, 발현조절을 위해 RNA 폴리머라아제 이외의 단백질이 회합하기 위해 필요한 영역을 포함해도 된다.

본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 kat 또는 groE일 수 있으며, 선택마커의 프로모터로 kat를 사용하는 것이 바람직하며, cre 재조합효소에 대한 프로모터로 groE 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, kat 프로모터 (P _kat )는 katE1 (NCBI geneID: 1800077) 유전자의 upstream 부위 138bp를 포함하는 염기서열 (서열번호 18)인 것이 바람직하며, groE 프로모터 (P _groES )는 groES (NCBI geneID: 1798916) 유전자의 upstream 부위 335bp를 포함하는 염기서열 (서열번호 19)인 것이 바람직하다.

아울러, 상기 프로모터는 외래 유전자인 목적 유전자의 발현을 유도하도록 작동가능하게 연결되어 있으며 여기서, "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명에서는 데이노코쿠스 라디오두란스 게놈상에서 Dr0053 유전자를 결실시키기 위해서, Dr0053 유전자의 상위부위와 하위부위 약 1kb를 각각 PCR로 증폭하여 PCR 산물을 제작하고, pAM1 벡터를 주형으로 lox71-카나마이신 내성유전자-lox66을 포함하는 PCR 산물을 제작한 다음, fusion PCR로 돌연변이 DNA 구조체를 제작하였다. 이렇게 제작된 돌연변이 구조체를 데이노코쿠스 라디오두란스에 형질전환시킨 후, groE 프로모터, Cre 재조합효소의 유전자 및 클로람페니콜 내성유전자를 포함하는 벡터를 상기 형질전환된 데이노코쿠스 라디오두란스에 도입하고 배양 온도를 조절하여, 최종적으로 모든 선택마커 및 Dr0053이 제거된 돌연변이 데이노코쿠스 라디오두란스를 제조하였다.

이러한, Cre-lox 시스템을 적용하기 위해서는 Cre 재조합효소의 발현이 필수적이나, 데이노코쿠스 라디오두란스에서는 Cre 재조합효소의 발현이 어려워 Cre-lox 시스템을 적용하는데 한계가 있었다. 그러나, 본 발명의 groE 프로모터를 적용한 Cre-lox 시스템을 이용하면 데이노코쿠스 라디오두란스에서 목적유전자를 고효율로 결실시킬 수 있다.

일반적인 돌연변이 제조기술은 반복적인 유전자 클로닝과정 (gene cloning)으로 인해 많은 시간이 소요되며, 돌연변이주를 선별하기 위한 항생제 마커의 제한성으로 인해 다중돌연변이체를 제작하는데 한계가 있으나, 본 발명의 groE 프로모터가 적용된 Cre-lox 시스템을 이용한 데이노코쿠스 속 변이미생물의 제조방법은 항생제 마커의 제한성이 없으며, 여러 유전자를 원하는 목적에 따라 고효율로 결실시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 일관점에서 (a) 제1 선택마커를 함유하는 lox 핵산 단편의 양 말단에 각각 목적유전자의 상부단편과 하부단편이 퓨전된 DNA 구조체를 데이노코쿠스 속 미생물에 도입하여 목적유전자를 결실시키는 단계; (b) 상기 목적유전자가 결실된 미생물에 groE 프로모터, cre 재조합효소를 코딩하는 유전자, 제2 선택마커 및 온도감수성 repUts를 함유하는 벡터를 도입하여 제1 선택마터를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 변이미생물을 배양하여 제2 선택마커를 함유하는 벡터가 제거된 데이노코쿠스 속 변이미생물로 수득하는 단계를 포함하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp .) 변이미생물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (C)단계에서 변이미생물 배양온도는 30~40℃ 인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 37℃ 이상에서 데이노코쿠스 속을 배양하는 것이나, 데이노코쿠스 속은 39℃ 이상에서 성장하기 어렵기 때문에 가장 바람직한 배양의 온도는 37~39℃일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 본 발명에 있어서, 사용되는 미생물은 데이노코쿠스 속 미생물이다. 데이노코쿠스 라디오두란스는 생물체의 DNA 또는 단백질에 직접 손상을 입힐 수 있는 이온화방사선 (Ionizing radiation) 에 대하여 내성을 지니고 있는 균주로, 방사성폐기물 정화에 이용되고 있으며 또한 의약, 보건, 생명공학 등의 다양한 분야에 적용 가능하다.

본 발명에서는 데이노코쿠스 속이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 데이노코쿠스 라디오두란스 (D. radiodurans), 데이노코쿠스 인디쿠스 (D. indicus), 데이노코쿠스 카에니 (D. caeni), 데이노코쿠스 아쿠아티쿠스 (D. aquaticus), 데이노코쿠스 디폴리머란스 (D. depolymerans), 데이노코쿠스 그란디스 (D. grandis), 데이노코쿠스 데죠네시스 (D. daejeonensis) 및 데이노코쿠스 라디오톨러란스 (D. radiotolerans)로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 데이노코쿠스 라디오두란스일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 목적유전자는 데이노코쿠스 속 유전체의 유전자로 원하는 목적에 따라 개수에 제한 없이 다수 또한 하나의 유전자를 결실 또는 증폭 시킬 수 있으며, dr0053인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 목적유전자의 상부단편 또는 하부단편의 길이는 0.5~1.2kb인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1kb인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 lox 핵산 단편은 lox66 또는 lox71인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 선택마커를 함유하는 lox 핵산 단편은 lox71, kat 프로모터, 카나마이신 내성유전자 및 lox66을 포함하는 단편인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 17로 표시되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 groE 프로모터는 groES (NCBI geneID: 1798916) 유전자의 upstream 부위 335bp를 포함하는 염기서열인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 19로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 선택마커는 항생제 내성 유전자인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 카나마이신, 클로람페니콜, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 내성 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 제1 선택마커와 제2 선택마커는 서로 상이한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제1 선택마커의 제거는 cre 재조합효소의 발현을 통해 수행될 수 있다. 따라서, lox-cre 시스템이 데이노코쿠스 미생물에 적용되기 위해서는 cre 재조합효소의 발현이 매우 중요하다.

본 발명에 있어서, 상기 온도감수성을 나타내는 repUts를 포함하는 벡터는 복제 안정성이 온도에 의해 조절되는 온도감수성 벡터인 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 상기 제2 선택마커의 제거는 벡터의 복제 안정성을 온도를 조절하여 수행하는 것이 바람직하다.

즉, 항생제 저항성 특성을 이용하여 목적유전자가 불활성화된 균주만을 선별한 후, 부위 특이적 재조합 효소를 발현과 동시에 온도를 조절하여 균주의 염색체 내부에 삽입한 항생제 저항성 유전자를 제거할 수 있다.

상기에서 균주내 Cre 효소의 발현은 당업계에 공지된 방법이 이용될 수 있으며, 예를 들어, cre 유전자를 포함하고 있는 플라스미드를 균주에 도입하여 Cre 효소가 균주내에서 발현되게 할 수 있다. 데이노코쿠스 속에서 cre 효소가 균주내에서 발현되게 하기 위해서는, groE 프로모터를 적용하여 cre 효소를 발현시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 벡터는 groE 프로모터, cre 재조합효소를 코딩하는 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자 및 온도감수성 repUts를 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 21로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp .) 변이미생물을 제조할 수 있다.

본 발명의 돌연변이 기술을 이용하여 데이노코쿠스 속 미생물의 유전체 상에 존재하는 목적유전자를 결실시킨 상기 변이 미생물 또는 균주는 불활성화시킨 목적유전자에 따라 특정 용도로 이용할 수 있다.

[ 실시예 ]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: pAM1 플라스미드의 제작

lox66과 lox71 염기서열을 포함한 카나마이신 (kanamycin) 내성 유전자를 증폭하기 위한 플라스미드 DNA 제작을 위해, 카나마이신 내성유전자를 포함하고 있는 pKatAPH3 플라스미드 (Satoh, K. et al., Microbiology 152:3217-3226, 2006) DNA를 주형으로 하여 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 조합으로 카나마이신 내성유전자를 증폭하였다.

[서열번호 1] : 5'-gcttgatatctaccgttcgtatagcatacattatacgaagttat-3' (Lox66F) [서열번호 2] : 5'-tagaggatcctaccgttcgtataatgtatgctatacgaagttat-3' (Lox71R)

PCR 반응과정은 추출된 pKatAPH3 플라스미드 DNA용액 1 ㎕, 서열번호 1 및 2의 프라이머 조합 2 ㎕ (10 pmole/㎕), 멸균증류수 17 ㎕를 pfu polymerase mix (Bioneer사)에 가하여 DNA 증폭기 (T-100 thermal cycler, Bio-rad사)를 이용하여 95℃에서 5분 동안 반응시킨 후 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분 반응 과정을 30회 반복하여 증폭산물을 생성케 하였다. PCR 증폭산물은 각각의 PCR 증폭물을 1% 아가로즈겔에서 100V, 25분 동안 전기영동하여 확인하였다.

1% 아가로즈겔에 포함된 PCR증폭물을 잘라내어 하나의 1.5ml 튜브에 넣고 Gel extraction kit (DNA fragment purification kit, Intron lifetechnology사)를 사용하여 제조사에서 권고한 방법으로 정제하고, 정제된 DNA는 제한효소 EcoRV와 BamHI (Enzynomics사)으로 절단하여 같은 제한효소 처리된 pKatAPH3와 결찰 (ligation) 시켰다. 제한효소 반응조건은 다음과 같다. 완충용액 5 ㎕, EcoRV 1 ㎕, BamHI 1 ㎕, PCR 증폭물 또는 pKatAPH3 DNA 용액 20 ㎕, 그리고 멸균 증류수 23 ㎕를 1.5 ml 튜브에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. DNA 결찰 (DNA ligation) 반응은 제한효소 처리된 PCR 증폭물 5 ㎕, pKatAPH3 1 ㎕, T4 DNA ligase (Enzynomics사) 1 ㎕, 완충용액 1 ㎕, 그리고 멸균된 증류수 2 ㎕를 1.5 ml 튜브에 첨가하여 16℃에서 4시간 반응시켰다.

DNA ligation 혼합용액은 대장균 (E. coli)에 형질전환하고, 형질전환된 대장균으로부터 plasmid preparation kit (intron lifetechnology사)를 이용하여 제조사에 권고된 방법으로 플라스미드 DNA를 추출하고 해당 염기서열을 분석하여 최종적으로 클로닝된 플라스미드를 확인하였으며 이를 pAM1 (서열번호 20)이라 명명하였다 (도 2).

실시예 2: pAM2 플라스미드의 제작

Cre 재조합효소 (recombinase)와 클로람페니콜 (chloramphenicol) 내성 유전자 및 groE 프로모터를 포함하는 플라스미드 DNA 제작을 위해, groES 프로모터와 cre 유전자를 PCR로 증폭한 다음 각각의 증폭산물을 fusion PCR하고, katE1 프로모터와 클로람페니콜 내성 유전자를 PCR로 증폭한 다음 각각의 증폭산물을 fusion PCR 하였다. 최종적으로 groES - cre 증폭산물과 katE1 -클로람페니콜 증폭산물을 다시 fusion PCR 한 후, p13840 플라스미드 (Nguyen, H. H. et al., Molecular microbiology 73:240-252, 2009)에 클로닝하였다 (도 1b).

groES 프로모터의 PCR은 데이노코쿠스 라디오두란스에서 추출한 DNA용액 1 ㎕를 주형으로 사용하여, 서열번호 3 및 4의 프라이머 조합 1 ㎕ (10 pmole/㎕) 및 멸균증류수 18 ㎕를 AccuPower^TM pfu PCR premix mix (Bioneer사)를 사용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 증폭산물 1을 생성케 하였다.

[서열번호 3] : 5'-cgtggcggccgctcggcttggaagcacgtatt-3' (GroEF)

[서열번호 4] : 5'-tacgggcagtaaattggacatatccactagtaacggccgcc-3' (GroER)

cre 유전자의 염기서열은 NCBI accession number: ab449974를 참고로 하여 인공적으로 합성 (Bioneer사)하여 주형으로 사용하고, 서열번호 5 및 6의 프라이머 조합으로 cre 유전자를 증폭하였다. PCR 반응과정은 실시예 1과 동일한 조건으로 증폭산물 2를 생성케 하였다.

[서열번호 5] : 5'-ggcggccgttactagtggatatgtccaatttactgcccgta-3' (CreF)

[서열번호 6] : 5'-agcttatcgataccgtcgacctaatcgccatcttccagca-3' (CreR)

증폭산물 1과 증폭산물 2를 연결하기 위하여, 증폭산물 1 및 2의 혼합액 1 ㎕, 서열번호 3 및 6의 프라이머 조합 1 ㎕ (10 pmole/㎕) 및 멸균증류수 18 ㎕를 AccuPower^TM pfu PCR premix mix (Bioneer사)를 사용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 증폭산물 3을 생성케 하였다.

동일한 방법으로, 데이노코쿠스 라디오두란스 DNA를 주형으로 하여 서열번호 7 및 8의 프라이머 조합으로 katE1 프로모터를 증폭하여 증폭산물 4를 생성시켰다.

[서열번호 7] : 5'-tgctggaagatggcgattaggtcgacggtatcgataagct-3' (pKatF)

[서열번호 8] : 5'-ccagtgatttttttctccatatgctctccttcgcctcgct-3' (pKatR)

클로람페니콜 내성 유전자의 증폭은 pRAD1 플라스미드 (Meima, R. et al., Applied and environmental microbiology 66:3856-3867, 2000) DNA 1 ㎕, 서열번호 9 및 10의 프라이머 조합 1 ㎕ (10 pmole/㎕), 멸균증류수 18 ㎕를 AccuPower^TM pfu PCR premix mix (Bioneer사)를 사용하여 역시 실시예 1과 동일한 조건으로 증폭하여 증폭산물 5를 생성시켰다.

[서열번호 9] : 5'-agcgaggcgaaggagagcatatggagaaaaaaatcactgg-3' (CmF)

[서열번호 10] : 5'-gcgactcgaggtcgactctagaggatcctc-3' (CmR)

증폭산물 4와 증폭산물 5를 연결하기 위하여, 증폭산물 4 및 5의 혼합액 및 서열번호 7과 10의 프라이머 조합을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 증폭산물 6을 생성케 하였다.

최종적으로, 증폭산물 3 (groES - cre )과 증폭산물 6 (katE1 -클로람페니콜)을 연결하기 위해, 증폭산물 3 및 6의 혼합액 1 ㎕, 서열번호 3 및 10의 프라이머 조합 1 ㎕ (10 pmole/㎕), 멸균증류수 18 ㎕를 AccuPower^TM pfu PCR premix mix (Bioneer사)를 사용하여 역시 실시예 1과 동일한 조건으로 증폭하여 증폭산물 7을 생성시켰다.

증폭된 증폭산물 7은 제한효소 NotI과 XhoI (Enzynomics사)로 절단하여 p13840 플라스미드에 클로닝하였다. 클로닝이 완료된 플라스미드는 염기서열 분석을 통하여 확인하였고 이를 pAM2 (서열번호 21)로 명명하였다 (도 3).

실시예 3: 데이노코쿠스 라디오두란스 dr0053 유전자 돌연변이 제작

3-1: 데이노코쿠스와 pAM1 증폭 및 이들의 fusion PCR

데이노코쿠스 라디오두란스로부터 DNA를 추출하여 dr0053 유전자의 상위부위 1kb 그리고 하위부위 1kb를 서열번호 11 및 12 그리고 서열번호 15 및 16의 프라이머 조합을 사용하여 증폭하였다. PCR 반응은 추출된 데이노노쿠스 라디오두란스 DNA 용액 1 ㎕, 서열번호 11 및 12 그리고 서열번호 15 및 16의 프라이머 조합 2 ㎕ (10 pmole/㎕), 멸균증류수 17 ㎕를 AccuPower^TM pfu PCR premix mix (Bioneer사)에 가하여 DNA 증폭기 (T-100 thermal cycler, Bio-rad사)를 이용하여 95℃에서 5분 동안 반응시킨 후 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분 반응 과정을 30회 반복하여 증폭산물 8 및 9를 생성케 하였다.

[서열번호 11] : 5'-tgcctcctcgccggtaaaca-3' (53-1)

[서열번호 12] : 5'-agcttatcgataccgtcgacttccttttcctcctgatgga-3' (53-2)

[서열번호 15] : 5'-agagtcgacctgcaggcatggcgtgccttctttgcaagtc-3' (53-5)

[서열번호 16] : 5'-cacgaatggcgtgcagcgt-3' (53-6)

lox71-kanamycine-lox66을 포함하는 항생제 내성 유전자의 PCR 반응은 대장균으로부터 추출한 pAM1 플라스미드 DNA용액 1㎕, 서열번호 13 및 14의 프라이머 조합 2 ㎕ (10 pmole/㎕), 멸균증류수 17 ㎕를 pfu polymerase mix (Bioneer사)에 가하여 DNA 증폭기 (T-100^TM thermal cycler, Bio-rad사)를 이용하여 95℃에서 5분 동안 반응시킨 후 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분 반응 과정을 30회 반복하여 증폭산물 10을 생성케 하였다.

[서열번호 13] : 5'-tccatcaggaggaaaaggaagtcgacggtatcgataagct-3' (53-3)

[서열번호 14] : 5'-gacttgcaaagaaggcacgccatgcctgcaggtcgactct-3' (53-4)

각각의 3개 PCR 증폭물을 1% 아가로즈겔에서 100V, 25분 동안 전기영동하여 확인하였고, 1% 아가로즈겔에 포함된 PCR 증폭물을 잘라내어 하나의 1.5ml 튜브에 넣고 Gel extraction kit (DNA fragment purification kit, Intron lifetechnology사)를 사용하여 제조사에서 권고한 방법으로 정제하였다. 정제된 산물들은 fusion PCR을 위한 주형으로 사용하였다.

그 다음, 정제된 PCR 용액 2 ㎕, 서열번호 11 및 16의 프라이머 조합 2 ㎕ (10 pmole/㎕), 멸균증류수 16 ㎕를 AccuPower^TM pfu PCR premix mix (Bioneer사)에 첨가하여 DNA 증폭기 (T-100 thermal cycler, Bio-rad사)를 이용하여 95℃에서 5분 동안 반응시킨 후 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 3분 반응 과정을 30회 반복하는 fusion PCR을 수행하여 증폭산물 11을 생성케 하였다. fusion PCR 증폭산물은 전기영동법으로 확인하고, 위와 동일한 방법으로 정제하였다.

3-2: dr0053 돌연변이 균주

정제된 fusion PCR 산물인 도 5의 DNA construct를 데이노코쿠스 라디오두란스로의 도입을 위하여 데이노코쿠스 라디오두란스 세포를 TGY 배지 (Tryptone 0.5%, Glucose 0.1%, Yeast extract 0.3%)에서 OD600 0.5까지 30℃에서 배양하고 원심분리한 다음, 30 mM 칼슘클로라이드 (CaCl₂)가 포함된 2 X TGY 배지 (Tryptone 1%, Glucose 0.2%, Yeast extract 0.6%)로 서스펜션 (suspension)한 뒤 ice에서 1시간 정치시킨다. 그 후 원심분리하여 상등액을 제거하고, 30 mM 칼슘클로라이드 (CaCl₂)와 10% glycerol이 포함된 TGY배지를 첨가하여 서스펜션한뒤 멸균된 1.5 ml 튜브에 50 ㎕씩 분주하여 사용하였다.

이렇게 준비한 데이노코쿠스 라이오듀런스 세포 50 ㎕에 fusion PCR 산물 10 ㎕와 30 mM 칼슘클로라이드 (CaCl₂)가 포함된 50℃의 2 X TGY 용액을 첨가하고 ice에서 30분동안 정치시킨뒤, 32℃에서 1.5시간 반응시킨다. 반응 후 2 X TGY 용액 900 ㎕를 첨가하여 30℃에서 12시간 배양한 뒤, 25 ㎍/ml의 kanamycin이 포함된 2 X TGY agar 배지(Tryptone 1%, Glucose 0.2%, Yeast extract 0.6%, Bactoagar 1.5%)에 200 ㎕ 도말하여 30℃ 정치배양기에서 3~4일간 배양하였다. 최종적으로 dr0053 돌연변이 후보균주는 염기서열분석으로 돌연변이 여부를 확인하였고 DrAM1으로 명명하였다.

실시예 4: DrAM1 돌연변이에 포함된 항생제 내성 유전자 제거

실시예 2의 pAM2 플라스미드를 실시예 3의 방법으로 DrAM1 돌연변이 균주에 도입하였다. pAM2 플라스미드를 포함하고 있는 DrAM1 균주를 3 ㎍/ml의 클로람페니콜 항생제와 0.4 mM isoprophyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)가 포함된 2 X TGY agar 배지에서 분리하고, 염기서열분석을 통하여 최종적으로 카나마이신 내성유전자가 제거된 균주를 선별하였으며, 이를 DrAM2로 명명하였다.

DrAM1 돌연변이에 포함된 카나마이신 내성유전자의 제거는 pAM2 플라스미드의 cre 재조합효소가 발현됨과 동시에 제거된다. 따라서, pAM2 플라스미드의 cre 재조합효소의 발현 정도가 데이노코쿠스 속 변이 제조에 중요하므로, 본 실시예에서는 cre 재조합효소를 데이노코쿠스 라디오두란스 내에서 안정적으로 발현시킬 수 있는 조건을 확립하였다.

groES와 katE1 유전자는 데이노코쿠스에서 높은 발현량을 보이는 유전자들로 알려져 있으며, 이 유전자들의 프로모터인 GroE 및 KatE 프로모터 부위는 돌연변이 제작시 항생제 내성 유전자를 발현시키기거나 외부 또는 내부 유전자를 발현시키기 위하여 사용되고 있다 (Satoh, K. et al., Microbiology 152:3217-3226, 2006; Chen et al., Molecular microbiology 73:240-252, 2009; Jeong et al., BBRC 469,:443-448 , 2015). 두 프로모터의 strength 또한 높은 것으로 알려져 있어, 원하는 유전자를 데이노코쿠스 라디오두란스 내에서 안정적으로 발현시킬 수 있을 것으로 예상하였다.

하지만, KatE 프로모터를 사용하여 Cre를 발현시켰을 경우 데이노코쿠스 라디오두란스에서 Cre 발현이 거의 되지 않았으나, GroE 프로모터를 사용할 경우 데이노코쿠스 라디오두란스에서 Cre 발현이 정상적으로 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4). 따라서, 본 발명의 pAM2 벡터에서 GorE 프로모터를 사용하여, 데이노코쿠스 라디오두란스에서 Cre 발현을 최적화 하였다.

실시예 5: 항생제 내성 유전자 및 목적유전자가 모두 제거된 데이노코쿠스 속 변이미생물

pAM2 플라스미드는 온도감수성 플라스미드로써 37℃에서는 데이노코쿠스 라디오두란스에서 복제되지 않기 때문에 DrAM2 균주로부터 pAM2 플라스미드를 제거시킬 수 있다. DrAM2 균주를 37℃에서 24시간 배양한 뒤 2 X TGY agar 배지에 1: 10000으로 희석하여 도말하여 30℃ 배양기에서 2일간 배양하였다. 2 X TGY agar 배지에서 형성된 단일콜로니를 멸균 팁 (tip)을 이용하여 카나마이신 항생제 또는 클로람페니콜 항생제가 포함된 2 X TGY agar 배지 그리고 항생제가 없는 2 X TGY agar 배지에 각각 접종하고 30℃ 배양기에서 1일간 배양하였다. 항생제가 포함되지 않은 배지에서만 생장하는 단일콜로니를 최종적으로 선별하고 이를 DrAM3로 명명하였다 (도 6).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> University of seoul Industry Cooperation Foundation <120> Method for Genetic Engineering of Deinococcus Microorganisms Using Cre-lox System <130> P16-B321 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox66F <400> 1 gcttgatatc taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 44 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox71R <400> 2 tagaggatcc taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 44 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GroEF <400> 3 cgtggcggcc gctcggcttg gaagcacgta tt 32 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GroER <400> 4 tacgggcagt aaattggaca tatccactag taacggccgc c 41 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CreF <400> 5 ggcggccgtt actagtggat atgtccaatt tactgcccgt a 41 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CreR <400> 6 agcttatcga taccgtcgac ctaatcgcca tcttccagca 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKatF <400> 7 tgctggaaga tggcgattag gtcgacggta tcgataagct 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKatR <400> 8 ccagtgattt ttttctccat atgctctcct tcgcctcgct 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmF <400> 9 agcgaggcga aggagagcat atggagaaaa aaatcactgg 40 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CmR <400> 10 catcctcgag gtcgacggta tcgataagct 30 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 53-1 <400> 11 tgcctcctcg ccggtaaaca 20 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 53-2 <400> 12 agcttatcga taccgtcgac ttccttttcc tcctgatgga 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 53-3 <400> 13 tccatcagga ggaaaaggaa gtcgacggta tcgataagct 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 53-4 <400> 14 gacttgcaaa gaaggcacgc catgcctgca ggtcgactct 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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ggttgatgcg agtgattttg 660 atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aagcttttgc 720 cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg 780 acgaggggaa attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc 840 aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc 900 tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc 960 tcgatgagtt tttctaatca ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggtaggatcc 1020 tcta 1024 <210> 18 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pkat <400> 18 ggtatcgata agcttgatat cgaattcgag ctcgcatgga gaccgagggc ccttgacatt 60 gagaatgatt ctcaatatgg tgcagggagc ttcgggcctc ttgccgcgca gcagagccag 120 cgaggcgaag gagagcat 138 <210> 19 <211> 335 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgroES <400> 19 tcggcttgga agcacgtatt gtcgccctac atatatacgt taaagctaac agctggcaag 60 gggatacccc cattccccgt cccagcgccc cttgagcgtc atagactcag attgtcagct 120 tcggtcagtt gacatttttc ttatcggcgc tctaccatcc gtgacggatt gaaggcgctg 180 ggcgggaaaa agctcgccgg cacgactctc cgccattcca tctcactcac aggaggaccc 240 cacatgctga aacctttagg cgaccgcgtt ctggttgaaa ttatcgaaga agccgagcag 300 aagacaagcc gaattccagc acactggcgg ccgtt 335 <210> 20 <211> 2336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAM1 <400> 20 ggtaccgggc cccccctcga ggtcgacggt atcgataagc ttgatatcta ccgttcgtat 60 agcatacatt atacgaagtt atgaattcga gctcgcatgg agaccgaggg cccttgacat 120 tgagaatgat tctcaatatg gtgcagggag cttcgggcct cttgccgcgc agcagagcca 180 gcgaggcgaa ggagagcata tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct cgaagccgcg 240 attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg 300 gcaatcaggt gcgacaatct atcgattgta tgggaagccc gatgcgccag agttgtttct 360 gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaactg 420 gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc 480 atggttactc accactgcga tccccgggaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc 540 tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat 600 tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga 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aaaaggccgc gttgctggcg 1500 tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 1560 tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 1620 cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 1680 agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 1740 tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 1800 aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 1860 ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 1920 cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 1980 accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 2040 ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 2100 ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 2160 gtcatggcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 2220 cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 2280 cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc gagctc 2336 <210> 21 <211> 10227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAM2 <400> 21 tgtctaacaa ttcgttcaag ccgacgccgc ttcgcggcgc ggcttaactc aagcgttaga 60 tgcactaagc acataattgc tcacagcctc gcgaaccatc aagcttatcg ataccgtcga 120 ggaacctctt acgtgccaat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 180 ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 240 ttattcggtc gaaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 300 cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 360 cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 420 cagcggtggc ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 480 tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 540 tcaagaactc tgtagcaccg cctacagacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 600 ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 660 aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 720 cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 780 ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 840 agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 900 ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 960 acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 1020 cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 1080 gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gaggatctag 1140 cacaagagcg gaaagatgtt ttgttctaca tccagaacaa cctctgctaa aattcctgaa 1200 aaattttgca aaaagttgtt gactttatct acaaggtgtg gcataatgtg tggaattgtg 1260 agcgctcaca attaagcttg aattcccggg cggccgctcg gcttggaagc acgtattgtc 1320 gccctacata tatacgttaa agctaacagc tggcaagggg atacccccat tccccgtccc 1380 agcgcccctt gagcgtcata gactcagatt gtcagcttcg gtcagttgac atttttctta 1440 tcggcgctct accatccgtg acggattgaa ggcgctgggc gggaaaaagc tcgccggcac 1500 gactctccgc cattccatct cactcacagg aggaccccac atgctgaaac ctttaggcga 1560 ccgcgttctg gttgaaatta tcgaagaagc cgagcagaag acaagccgaa ttccagcaca 1620 ctggcggccg ttactagtat gtccaattta ctgcccgtac accaaaattt gcctgcatta 1680 ccggtcgatg caacgagtga tgaggttcgc aagaacctga tggacatgtt cagggatcgc 1740 caggcgtttt ctgagcatac ctggaaaatg cttctgtccg tttgccggtc gtgggcggca 1800 tggtgcaagt tgaataaccg gaaatggttt cccgcagaac ctgaagatgt tcgcgattat 1860 cttctatatc ttcaggcgcg cggtctggca gtaaaaacta tccagcaaca tttgggccag 1920 ctaaacatgc ttcatcgtcg gtccgggctg ccacgaccaa gtgacagcaa tgctgtttca 1980 ctggttatgc ggcggatccg aaaagaaaac gttgatgccg gtgaacgtgc aaaacaggct 2040 ctagcgttcg aacgcactga tttcgaccag gttcgttcac tcatggaaaa tagcgatcgc 2100 tgccaggata tacgtaatct ggcatttctg gggattgctt ataacaccct gttacgtata 2160 gccgaaattg ccaggatcag ggttaaagat atctcacgta ctgacggtgg gagaatgtta 2220 atccatattg gcagaacgaa aacgctggtt agcaccgcag gtgtagagaa ggcacttagc 2280 ctgggggtaa ctaaactggt cgagcgatgg atttccgtct ctggtgtagc tgatgatccg 2340 aataactacc tgttttgccg ggtcagaaaa aatggtgttg ccgcgccatc tgccaccagc 2400 cagctatcaa ctcgcgccct ggaagggatt tttgaagcaa ctcatcgatt gatttacggc 2460 gctaaggatg actctggtca gagatacctg gcctggtctg gacacagtgc ccgtgtcgga 2520 gccgcgcgag atatggcccg cgctggagtt tcaataccgg agatcatgca agctggtggc 2580 tggaccaatg taaatattgt catgaactat atccgtaacc tggatagtga aacaggggca 2640 atggtgcgcc tgctggaaga tggcgattag gtcgacggta tcgataagct tgatatcgaa 2700 ttcgagctcg catggagacc gagggccctt gacattgaga atgattctca atatggtgca 2760 gggagcttcg ggcctcttgc cgcgcagcag agccagcgag gcgaaggaga gcatatggag 2820 aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcccaat ggcatcgtaa agaacatttt 2880 gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga ccgttcagct ggatattacg 2940 gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt atccggcctt tattcacatt 3000 cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa ttccgtatgg caatgaaaga cggtgagctg 3060 gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc atgagcaaac tgaaacgttt 3120 tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat atattcgcaa 3180 gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc tatttcccta aagggtttat tgagaatatg 3240 tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa cgtggccaat 3300 atggacaact tcttcgcccc cgttttcacg atgggcaaat attatacgca aggcgacaag 3360 gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc 3420 agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaatttttt 3480 taaggcagtt attggtgccc ttaaacgcct ggttgctacg cctgaataag tgataataag 3540 cggatgaatg gcagaaattc gtcgaagctc tagaggatcc tctagagtcg acctcgagtt 3600 cgcgaacggc cggagaaaaa atccccccgg tggcaatccg gggggttttt tctcggatct 3660 tactttgatt ttagtacaaa aaatgaattt cattacaaac aggctttaac gaaaaaggaa 3720 gagttgcaag ccgcgctaga tggcctgaca gctggtagat accgcattat tatccgcctc 3780 atacaaccaa cggggcaccc catccaacat tcgcagcagg tggaagaaga taaccaatcg 3840 cagggacaaa ctcagctgga cgaaatctct tttgaaaccg acgcagacgc cgagttttaa 3900 gtttttgaag tctgcgcgac catccccagc cccaccacat cgggcaacgc tgccgccgcc 3960 gccgccacgc gccgggtgtc ggtctgcgcg taaatcatgg tcgtttgaat gttctcatgg 4020 cccagcaact ctttgatttc gtcgagcgtc cgcccgttat tgagcaacgt ggtggcgaac 4080 gtgtgccgca gcttgtgcgg gctgacggtg gccgggtcga ggcccgcacg ctcggcggcg 4140 gtgtcgagca tcttgccgat ggtccgggcc tgcatttgtt ggccgtacct tttccccgac 4200 agcggcgacc atacccaggg cgtgaccggg ttcccgtgcg tcttgcgctc cctgagccag 4260 cgcatcagcg ccccttgtgc agtgggcgag agcggcacgc gcctttcctt gtcgcccttg 4320 ccgatgacgc gcacggcgac gggcgagccg tcctgatact cgatgtccgc gaacttcatc 4380 gccagcattt cggagatgcg gaggcccgtc ccgtacagga aagcgacaat gcaccagttt 4440 ttcagcccgc gctgggggga cttgtcgcgg taaacgactt ctagcagctt ggacacgtcc 4500 tccagggtga gtttgaccgg ggcgcgtttc ggaatcttcg gggtggtcag gtcggcggtg 4560 atgtcctgca cgccgggcag cttttgcacg cgcaccagaa accgccagaa cgaacgccag 4620 gagttcacca gtcggtgaaa gcgccggggc gatgggtcgg cggcagccag gaaagcccgc 4680 aggtcggcgg cggagagttc cccccagtcg cgcccgcgca agtgctgggg cttgtcctcg 4740 gcgtccagcc aggagcggag cagccgaaca tctttcaggt actcgcgcac ggtggccgga 4800 ctgcgcccct gttccttcgc caagtagtgc gcccagattt caatttgatt ctgtgcagac 4860 attcaaacct cctagtggtc tggggtcgcc cagcgggggg caattttagc tattttactg 4920 aaaataataa ttttccgcct ttagacttag ccactcagac cgaaggcgca aaccgtccca 4980 gacagcaaat aagccgcatt aaggggggtc ggcgcggggt tccctgcacc caactttacg 5040 gaaaataatt cagctttacg gaaaataaca cgttgggaaa ggtaaagaag gggttaagcc 5100 ttgttgcatg gtctggcatg gttaagcaaa ctgggggtat gcctcccaag tcaagcaagc 5160 ccaagccagc gcccgccgtg ctgcccgctg acctctcggc ggtggccttc gtgaccgatg 5220 ctcaggcggc ggcttacctg gggctgtcca tccgctcggc acggtacttg gtcgaagaag 5280 gcaaactgaa acgggtctac cctcgcccgc gtgcggcccg catcaccgcc gagagcctga 5340 ccgggtacag gcaggccata gaagaaggtc gcccgccccg aatctggacg cagccgggca 5400 atgtccacac gcccgcgccc gctgcaccag cacccgcgcc ggagaagaag aaggggctgc 5460 tttcccggtg gggcctgggc gggggctaaa acctaagcag gctgcatggc acagcttttt 5520 gtttcacagt tcttgcgctg tagtagcaac tttagaacta ggcgatgtca tctgaaaaaa 5580 gctggggttt agcatatttc agaagagaat cgtacgcctc agctaccatt cttgcagccg 5640 cgttcagggt cttgacgtgt tctttgtatc tatcagcaaa ctgagaaccc aattctggat 5700 catccttgta acgccaactc tccgaccatt ccgaaggaac gccttgtagt cctcctgagc 5760 cgttagggta tgtctttagt ccaatcaaat gggacatttg cagacaggaa cgcacaagtg 5820 tctcacgtcg cttctctatt tcaatatcta aaaattcttc actcttatcg ttgcttgaca 5880 tattaaaact gtctaactga tccagttcac ttatatggaa agtatcacta aagtcatggc 5940 ttctcagaaa ttcaatactt cccattgatg gggaccggtt aaccaaatcg ataaaaattt 6000 ttctgtcatg tttcagataa gtttttggcg cgttgatttt ataataaagc cgccattctt 6060 gtgccaacaa cgccacgaaa agagccacag cagcagcggc cacatcccat tgaaaatctt 6120 tcgccagacc aaccgccagg agaaccaagc cgaaatagtt agcccagcga actaaaaaac 6180 tatctataaa cgtattaaga aacgttcggg tcatatttcc gtgaatcata tcaggacgta 6240 aatttgcaca tgacgcattt ccgggggctt ttatccctcg gacttctttt caggcccctt 6300 ctcggccttt ctgtgaccct gttttttcag gccgcgaact gcgcctggtc gggcctgacc 6360 cccacacgct ggccttcgta ctcacgcagc ctgcccagca ggtcggccag cgcggcattg 6420 accacggcgg cgaggttgcg gggcggcgtt ccgcctgcgg tctggtcgtg cttcacgtcg 6480 cgcagcacgc gcaccagcac cgcgcccacg tcgtcggaca cgtcccggcc agcgtcggcg 6540 gcgcgggtga tgttccaaat gagtttccgc cagaagccca gcgagtcggc cccgtccccg 6600 aaagctgccg ctagcgcccg cgcctgcctg tccgcgatct cggcgcggta ggccgggcgg 6660 gtttcccggt gggcgtcggc aagctcccac acgacgtttt cagcgaggga gggcgcgggc 6720 cggacagtca tgttatcgga gggggaggga agagcggatt ttatcgccca ggtgctcaca 6780 acttcgtatg tcacggcaac cggggcgctt ttttcgcgca gttccccgcc tgtcacatcc 6840 tcacagggtt cttgactctc cggcacgcta ttagggagag ggtggagcat gttgtagacg 6900 gtgcgcccgg ccttcgcgtc ggcgttcagg tcgcgccagt tccggcccca atcgtcatgc 6960 atcaggcgga catatcccgc cttcccttcc agcacgcgcc tcggcttgag cgtcacggcc 7020 cacagcgtcc cggttgccac agactcgccg cgcaggtcgc ccatgtgggc atcacaggcc 7080 accagcccga cccggcgcag atattgaagg ttcacgtaga aggcggactt cttcagaccc 7140 acatgcacca tgagcagctc ggcgggcagg tggaacacag cgcgggtgac gtgttccgca 7200 tagccgcagg cgcgggccac gtccagcgcc accgagaaca gggcgcggaa gatgcgccgg 7260 gccgactcgc ggcagggggc gtcatctagg ctggcggtga gggtctgcac cagttcggcg 7320 cgtgtggcga tggtcaacgg cgcgggcgcg ggctgggact gctgggcgat ggtgggcacg 7380 ggcggcggcg agatggaccg ggccgagctg gaaatttccc gtgtgagcgc aggtttaggc 7440 gcatggttac cttcctgcag tgaaatctgc gaaatcaggc ccgcttcgag gagtcggacc 7500 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cccgatgagt gtctgcgccg tctgctgcgc ctgccgggca ttctgctcca gcatctcccg 8400 gacgtagtcg ggattcagtc ccgcccactg aacgaagccg ctgaccggcg gctcctcgat 8460 cacagtcacg acctccagct cggcgcctgc cgccttcccg agcgttatgg cctgcttcaa 8520 ggcgcgctgg ctgggctcac ttccgtcaaa ggccaccacg aatcgcatcc gtcctcctcc 8580 ctgaccagtc aggttcagca agcagggtaa gcctctccca gcactccggg gcttcacacg 8640 gccttgggtc ttttctgcat acccatgagc tcagtacccg acagtttccg gcagggcttg 8700 aaaaagttcg gctgacacgc gagaactgga cgcgtctccc gatgtcctgg ccaagttgac 8760 ccgctgcttc accgcgcact tcccggagtt ccgcaagaac taggtcgagc tgctctccct 8820 catggtcctc gccctcctta ggggcaagga cgtccggcat gctaaactcg ccgcgcgctt 8880 ccccggaagc gcgcacaccg cctccgtcat ccggcgggtg gaacgcttct tcgaccgtca 8940 tcctcttcgg ccagctgatg tcgcccgggt cgttctgacg ctccttcccg ccgcgcagcc 9000 acgcgaattt atccttgacc ggaccaactg gaagtatggg cagacggacg tgaacgtctt 9060 gttgctggcc gtcatttggc gggacgtcgc catccccctg ctctacgagt tgctgcccca 9120 tgggggcagc agcgacaccg agattcggca caccctgatg gacgatgccc tgtgcctgct 9180 gtccgccgct gacatccggg tgctgtatgc cgaccgcgaa ttccacgcaa ctggtccaga 9240 accttgaccg aacgcagcgg tggtaacggc gcagtggcgg ttttcatggc ttgttatgac 9300 tgtttttttg gggtacagtc tatgcctcgg gcatccaagc agcaagcgcg ttacgccgtg 9360 ggtcgatgtt tgatgttatg gagcagcaac gatgttacgc agcagggcag tcgccctaaa 9420 acaaagttaa acatcatgag ggaagcggtg atcgccgaag tatcgactca actatcagag 9480 gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc tggccgtaca tttgtacggc 9540 tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg atttgctggt tacggtgacc 9600 gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg accttttgga aacttcggct 9660 tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca ccattgttgt gcacgacgac 9720 atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat ttggagaatg gcagcgcaat 9780 gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca ttgatctggc tatcttgctg 9840 acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag cggcggagga actctttgat 9900 ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa ccttaacgct atggaactcg 9960 ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta cgttgtcccg catttggtac 10020 agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg ccgactgggc aatggagcgc 10080 ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctagac aggcttatct tggacaagaa 10140 gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag ttggaagaat ttgtccacta cgtgaaaggc 10200 gagatcacca aggtagtcgg caaataa 10227

Claims

다음 단계를 포함하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법:
(a) 제1 선택마커를 함유하고 서열번호 17로 표시되는 lox 핵산 단편의 양 말단에 각각 목적유전자의 상부단편과 하부단편이 퓨전된 DNA 구조체를 데이노코쿠스 속 미생물에 도입하여 목적유전자를 결실시키는 단계;
(b) 상기 목적유전자가 결실된 미생물에 groE 프로모터, cre 재조합효소를 코딩하는 유전자, 제2 선택마커 및 온도감수성 repUts를 함유하고 서열번호 21로 표시되는 벡터를 도입하여 제1 선택마커를 제거하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 수득된 변이미생물을 배양하여 제2 선택마커를 함유하는 벡터가 제거된 데이노코쿠스 속 변이미생물로 수득하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 (C)단계에서 변이미생물 배양온도는 30~40℃ 인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp .) 변이미생물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 데이노코쿠스 속 미생물은 데이노코쿠스 라디오두란스인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp .) 변이미생물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 목적유전자는 dr0053인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 목적유전자의 상부단편 또는 하부단편의 길이는 0.5~1.2kb인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 lox 핵산 단편은 lox71 또는 lox66인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 선택마커를 함유하는 lox 핵산 단편은 서열번호 20으로 표시되는 벡터 유래인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 groE 프로모터는 서열번호 19로 표시되는 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 및 제2 선택마커는 항생제 내성 유전자인 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 항생제 내성 유전자는 카나마이신, 클로람페니콜, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 내성 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 선택마커는 cre 재조합효소의 발현에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 Cre-lox 시스템을 이용한 목적유전자가 결실된 데이노코쿠스 속 (Deinococcus sp.) 변이미생물의 제조방법.
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