KR102160203B1 - 데이노잔틴 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법 및 온도제어를 이용한 데이노잔틴 대량생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 데이노잔틴 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법 및 온도제어를 이용한 데이노잔틴 대량생산 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법으로 제조된 데이노잔틴 고생산능을 갖는 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주는 대사공학적 방법을 도입하여 제조되었음에도 인위적으로 도입된 항생제 내성 유전자를 갖지 않는다. 또한, 상기 DR0862 (crtB) 및 DR1475 (dxs) 유전자가 동시 삽입된 데이노잔틴 고생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주를 통해, IPTG와 같은 유도물질을 이용하지 않고, 배양 온도를 제어함에 따라 DR0862 및 DR1475 유전자의 메신져 RNA (mRNA)발현을 조절함으로써 데이노잔틴의 생산량을 증대시킬 수 있는 바, 매우 경제적인 방법으로 고항산화능을 가진 데이노잔틴의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

데이노잔틴 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법 및 온도제어를 이용한 데이노잔틴 대량생산 방법{Manufacturing method of mutant strain having increased deinoxanthin productivity and the method for deinoxanthin overproduction by controlling cultivation temperature}

본 발명은 데이노잔틴 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법과 온도조절 프로모터를 이용한 카로티노이드 유전자의 과발현 및 데이노잔틴 대량생산 방법에 관한 것으로, 열충격 내성 단백질인 groESL promoter를 이용하여 카로티노이드 유전자인 crtB와 dxs의 과발현을 유도하여 궁극적으로는 데이노잔틴의 생산성을 증대시키는 방법에 관한 것이다.

대사공학 (metabolic engineering)기술은 미생물 등의 유전체를 개량하여 대사회로를 재설계함으로써 목적물질의 생합성 및 생산성의 증대를 위하여 활용되는 기술이다. 대사 (metabolism)란 세포가 외부로부터 에너지원을 흡수하고, 생장 및 세포분화에 필요한 여러 대사산물을 다양한 생합성 경로를 통해 합성하는 일련의 작용을 통칭한다. 인류에 사용되는 대부분의 천연물은 세포 대사작용의 결과물로 다양한 기능을 가진 대사체 (metabolite)이다. 최근, 미생물 유전자의 조작을 통해서 세포 대사의 흐름 (metabolic flux)을 변경하여 유용한 대사물질의 생산량을 증대시키거나, 자연계에서 수득하기 어려운 물질을 생합성하는 합성생물학 (synthetic biology) 및 대사공학 (metabolic engineering) 기법 등이 개발되고 있다. 특히, 최근 대사공학 분야에서 CRISPR/Cas9, Flp/FRT 및 cre/lox와 같은 위치-특이적 유전자 재조합 기술은 식물, 효모, 미생물과 같은 다양한 생명체 모델에 적용되어 특정 대사산물의 대량생산에 이용되고 있다.

한편, 대표적인 극한환경 미생물로 알려진 데이노코쿠스 라디오두란스는 우주 및 방사능 오염지역과 같은 생명체가 생존하기 어려운 환경에서도 생장할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이는 상기 균주의 효율적인 DNA 복구 시스템 (DNA repair system) 및 항산화 효소 그리고 비효소적 대사산물 등으로 인해 방사선에 의한 직접적 DNA 손상과 2차적으로 발생되는 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)으로부터 세포를 보호하고, 치명적인 세포손상에 대해 빠른 시간내에 정상적으로 복구할 수 있는 메카니즘이 발달되었기 때문이다. 특히, 상기 미생물은 세포대사 및 생존에 큰 저해를 유발하는 ROS에 대하여 강력한 소거능력 (scavenging activity)을 가진 신종 카로티노이드인 데이노잔틴 (Deinoxanthin)을 생산할 수 있다고 알려져 있다. 데이노잔틴은 라이코펜 (lycopene), 베타 카로틴 (beta-carotene) 및 루테인 (lutein) 등과 같은 항산화능이 있는 다른 유색 카로티노이드보다 더 높은 항산화력을 가진 것으로 알려져 있으며, HepG2, HT-29 및 PC-3등의 암세포의 분화 (proliferation) 및 생장 (growth)을 효과적으로 저해하는 항암기능도 포함하고 있음이 최근 연구보고에 의해 규명된 바 있다. 또한, 상기 물질은 저수지 등에서 녹조 및 홍조 현상 (algal bloom)을 일으키는 주요원인인 미세조류 (microalgae)의 생장을 저해할 수 있는 항생효과도 보고되는 등 그의 이용범위가 매우 넓은 것으로 알려져 있다.

현재까지의 선행연구결과들로부터 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 카로티노이드 생합성 유전자 및 데이노잔틴 대사회로가 보고된 바 있고, 상기 균주의 효율적인 유전체 개량을 위한 Cre-loxP 시스템 기반 분자유전학적 도구 (genetic tool)가 본 발명자로부터 개발된 바 있어 (대한민국 등록특허 제10-1835852호), 유전자 삽입 및 결실 등의 유전체 편집이 용이하다. 또한, 본 발명자들은 상기 방법을 이용하여 무색 카로티노이드이자 모든 카로티노이드의 전구체인 파이토엔 (phytoene)의 대량생산을 위한 돌연변이 균주 제조방법 개발에 성공한 바 있다 (대한민국 등록특허 제 10-1927892호). 그러나 상기에서 개발된 균주제조 방법을 포함하여 통상의 경우에 사용되는 유전자 과발현 단계는 플라스미드에 의한 외부유전자의 과발현과정이 수반되기 때문에 개량된 균체의 배양 및 발효시 선택마커 (selective marker)로써 고가의 항생제 투여가 필수적이다. 또한, 세포내 플라스미드의 불안정성 (plasmid instability)으로 인하여 최종 산물의 생산성 저하가 초래될 수 있다. 한편, 유전자 과발현을 위한 발현시스템으로써 주로 사용되는 lac 프로모터 및 tac 프로모터와 같은 IPTG (isoproqylthiogalactoside)유도 프로모터 (IPTG-inducible promoter)를 사용하게 되는데, 이는 고가의 유도물질 (inducer)을 사용하게 됨으로써 생산성과 경제성 측면에서 매우 불리하다.

이에, 본 발명자들은 대사공학적 방법을 도입하여 데이노잔틴을 대량생산할 수 있는 데이노코쿠스 라디오두란스 균주를 제조를 위해 노력하던 중 변형된 Cre-loxP 시스템 및 통상의 유전자 도입 방법을 이용하여 열내성 유전자 groE (DR0606)의 프로모터 (promoter) 염기서열과 연결된 DR0862 (crtB) 및 DR1475 (dxs) 유전자단량체 (monomer)가 각각 유전체에 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스의 변이 균주를 제조하였다. 또한, 본 발명자들은 IPTG와 같은 유도물질을 이용하지 않고, 배양 온도를 제어함에 따라 DR0862 및 DR1475 유전자의 메신져 RNA (mRNA)발현을 조절함으로써 데이노잔틴을 대량으로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 Cre-loxP 시스템을 이용하여 열 내성 유전자인 DR0606(groE)의 프로모터 염기서열과 결찰된 DR0862 (crtB) 및 DR1475 (dxs) 유전자가 유전체 내로 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 데이노잔틴 고생산능을 가진 변이 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 온도를 유도인자로 사용하여 상기 변이 균주로부터 데이노잔틴을 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 데이노코쿠스 속 균주의 유전체 내에 DR0862 (crtB) 및 DR1475 (dxs) 유전자가 동시 삽입된 데이노코쿠스 속 변이 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 데이노잔틴 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 제1 선택마커를 포함하는 lox 핵산 단편의 양 말단에 DR0862 및 DR1475가 각각 연결된 플라스미드를 제조하는 단계; 2) 상기 제조된 플라스미드 DNA를 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 도입하여 DR0862 및 DR1475유전자를 각각 삽입시키는 단계; 3) 상기 삽입 유전자에 포함된 제1 선택마커를 제거하는 단계; 및 4) 상기 수득된 변이 균주를 배양하여 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 제거하는 단계를 포함하는 DR0862 및 DR1475 유전자가 동시 삽입된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 방법으로 제조된 데이노잔틴 고생산능을 갖는 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주는 대사공학적 방법을 도입하여 제조되었음에도 인위적으로 도입된 항생제 내성 유전자를 갖지 않는다. 또한, 상기 DR0862 (crtB) 및 DR1475 (dxs) 유전자가 동시 삽입된 데이노잔틴 고생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주를 통해, IPTG와 같은 유도물질을 이용하지 않고, 배양 온도를 제어함에 따라 DR0862 및 DR1475 유전자의 메신져 RNA (mRNA)발현을 조절함으로써 데이노잔틴의 생산량을 증대시킬 수 있는 바, 매우 경제적인 방법으로 고항산화능을 가진 데이노잔틴의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 야생형 데이노코쿠스 라디오두란스가 생산하는 데이노잔틴을 HPLC로 확인한 그래프이다.
도 1b는 데이노잔틴을 LC-MS로 확인한 그래프이다.
도 2는 데이노잔틴의 농도별 검량선을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 DR0862유전자를 데이노코쿠스 라디오두란스의 유전체에 삽입하기 위한 플라스미드 제조방법을 도식화한 그림이다.
도 3b는 DR1475유전자를 데이노코쿠스 라디오두란스의 유전체에 삽입하기 위한 플라스미드 제조방법을 도식화한 그림이다
도 4는 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 유전체에서 DR0862 및 DR1475 유전자를 삽입시키는 과정 및 제 1 선택마커 제거과정을 도식화한 그림이다.
도 5a는 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 유전체에 DR0862와 DR1475유전자가 삽입되고 제 1 선택마커가 제거되었음을 PCR로 확인한 결과이다.
도 5b은 항생제 내성 유전자가 모두 제거되고, DR0862 및 DR1475 유전자가 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 선택배지에서 선별한 결과 사진이다.
도 6a는 본 발명의 방법에 따라 제조된 DR0862 및 DR1475 유전자가 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 생장곡선을 야생형 균주와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 방법에 따라 제조된 DR0862 및 DR1475 유전자가 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 데이노잔틴 생산량을 야생형 균주와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 7a은 데이노코쿠스 라디오두란스 야생형 균주의 배양온도별 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 7b는 데이노코쿠스 라디오두란스 야생형 균주의 배양온도별 DR0606 (groE)유전자의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 8a은 DR0862 및 DR1475 유전자가 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주 (DX)의 배양온도에 따른 DR0862 및 DR1475 유전자의 발현량을 비교한 그래프이다.
도 8b은 DR0862 및 DR1475 유전자가 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주 (DX)의 배양온도에 따른 데이노잔틴 생산량을 비교한 그래프이다.
도 9은 데이노잔틴 및 여러 카로티노이드의 DPPH 소거능을 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 데이노코쿠스 속 균주의 유전체 내에 DR0862 및 DR1475 유전자가 동시 삽입된 데이노코쿠스 속 변이 균주를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, “데이노잔틴(deinoxanthin)”은 C₄₀H₅₄O₃로 구성된 (all-E)-2,1' dihydroxy-3'-4'-didehydro-1',2'-dihydro-β,ψ-carotene-4-one 화합물로 붉은 색을 띄는 카로티노이드를 말한다.

상기 데이노코쿠스 속 균주는 데이노코쿠스 라디오두란스(D. radiodurans), 데이노코쿠스 인디쿠스(D. indicus), 데이노코쿠스 카에니(D. caeni), 데이노코쿠스 아쿠아티쿠스(D. aquaticus), 데이노코쿠스 디폴리머란스(D. depolymerans), 데이노코쿠스 그란디스(D. grandis), 데이노코쿠스 데죠네시스(D. daejeonensis), 데이노코쿠스 라디오톨러란스(D. radiotolerans), 데이노코쿠스 지오써말리스(D. geothermalis), 데이노코쿠스 루버(D. ruber), 데이노코쿠스 안타티커스(D. antarcticus), 데이노코쿠스 프로테오리티쿠스(D. proteolyticus), 데이노코쿠스 라디오푸그난스(D. radiopugnans), 데이노코쿠스 라디오필러스(D. radiophilus), 데이노코쿠스 셀룰로실리티쿠스(D. cellulosilyticus) 및 데이노코쿠스 스웬시스(D. swuensis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 구체적으로는 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "DR0862" 유전자는 파이토엔 합성효소(phytoene synthase)를 암호화하는 유전자로서, 상기 파이토엔 합성효소는 전구체인 제라닐제라닐 파이로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate)를 기질로 하여 파이토엔을 합성할 수 있다. 상기 DR0862 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR0862 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "DR1475" 유전자는 1-디옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase)를 암호화하는 유전자로서, 피루빈산염(pyruvate) 및 글루코즈-3-포스페이트(glucose-3-phosphate)를 기질로 사용하여 1-디옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트를 합성할 수 있다. 상기 DR1475 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR1475 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

상기 DR0862 및 DR1475 유전자는 groE, katE, spac, dr1124 유전자 및 dr2577 유전자의 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프로모터와 연결될 수 있다.

열내성 단백질 중 하나인 GroE 단백질은 분자적 샤페론 (molecular chaperone) 활성을 가지며, 산화 및 열자극 스트레스 등의 환경에서 강한 활성을 나타낸다. 또한, groE 유전자는 데이노코쿠스 라디오두란스의 일반적인 배양 조건에서도 강한 발현력을 갖을 수 있으므로, 통상의 기술분야에서 구성 프로모터 (constitutive promoter)로 매우 잘 알려진 바 있다. 또한, 높은 온도에 즉시 반응하여 그 발현량이 2배 이상 증대되는 특징을 가지고 있다.

본 발명에서 상기 groE 유전자의 프로모터는 DR0862 및 DR1475 유전자가 작동가능하게 연결될 수 있다.

상기 용어, "작동가능하게 연결된"은 핵산의 발현을 조절하는 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 가능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 플라스미드의 제조에서 작동가능하게 연결하는 것은 통상의 기술자에 의해 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 상기 groE 프로모터는 groES 유전자(NCBI GeneBank ID: 1800077)의 상위(upstream) 부분의 299 bp를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 구체적으로 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

상기 열내성 유전자 groE (DR0606)의 프로모터 (promoter) 염기서열과 연결된 DR0862 (crtB) 및 DR1475 (dxs) 유전자단량체 (monomer)가 각각 유전체에 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주는 우수한 데이노잔틴 생산능을 가진다.

상기 DR0826(crtB) 유전자는 데이노코쿠스 속 균주 유전체 내의 DRC0004와 DRC0005 유전자 사이에 삽입될 수 있고, DR1475(dxs) 유전자는 데이노코쿠스 속 균주 유전체 내의 DRC0007 유전자 내에 삽입될 수 있고, 바람직하게는 상기 DR0826(crtB) 유전자는 DR chromosome 1의 6401 내지 6560 번째 염기서열 사이에 삽입될 수 있고, DR1475(dxs) 유전자는 DR chromosome 1의 4310-4580번째 염기서열 사이에 삽입될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 상기 유전자 삽입 위치는 데이노코쿠스 라디오두란스 유전체내에서 특정기능을 가진 단백질을 암호화하고 있는 염기서열 (open reading frame)에 제한되지 않는 한도 내에서 어느 염기서열 부위라도 삽입이 가능하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 야생형 데이노코쿠스 라디오두란스가 생산하는 데이노잔틴을 HPLC 및 LC-MS로 확인하였고(도 1 참조), 데이노잔틴의 농도별 검량선을 작성하였다(도 2 참조). 또한, 제1 선택마커를 포함하고, groE 프로모터에 의해 DR0862 또는 DR1475 유전자의 발현이 조절되는 플라스미드를 각각 제조하고(도 3 참조), DR0862 유전자의 데이노코쿠스 라디오두란스 유전체 삽입을 위한 플라스미드를 제조하여 데이노코쿠스 라디오두란스 세포로 도입한 후 pAM2 플라스미드를 삽입하여 변이 균주를 제조하였다(도 4a 참조). DR1475 유전자의 삽입을 위한 플라스미드를 제조하여 상기 데이노코쿠스 라디오두란스 세포로 도입한 후 pAM2 플라스미드를 삽입하여 최종 균주로 선택마커가 제거되고 DR0862와 DR1475가 동시 삽입된 변이 균주를 제조하였으며(도 4b 참조), 최종 균주의 변이를 확인한 결과 선택마커가 최종 변이 균주에서 완전히 제거됨을 확인하였다(도 5 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기의 방법에 따라 제조된 열내성 유전자 groE (DR0606)의 프로모터 (promoter) 염기서열과 연결된 DR0862 (crtB) 및 DR1475 (dxs) 유전자단량체 (monomer)가 각각 유전체에 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주가 우수한 데이노잔틴 생산능을 나타내는 것을 확인하였다(도 6 및 도 7 참조). 또한, 본 발명의 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주로부터 생산된 데이노잔틴의 항산화 효능을 확인한 결과, 데이노잔틴이 다른 카로티노이드에 비해 더 우수한 항산화능을 가진 것을 확인하였다(도 9 참조).

또한, 본 발명은 상술한 특징을 갖는 본 발명에 따른 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 생산 방법을 제공한다.

상기 배양은 통상의 기술분야에 잘 알려진 적당한 배지 및 배양 조건에 따라 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 회분식, 연속식 또는 유가식 배양일 수 있다. 상기 데이노잔틴 생산 방법은 변이 균주를 배양하여 수득된 배양물로부터 데이노잔틴을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 데이노잔틴의 수득은 통상의 기술자에 의해 적절히 수행될 수 있다.

상기 배양하는 단계는 35 내지 39℃에서 수행될 수 있고, 36 내지 38℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 37℃에서 수행될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 37℃에서 배양한 cre-lox 시스템을 이용한 DR0862 및 DR1475 유전자가 동시 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주가 30℃에서 배양된 변이 균주보다 높은 데이노잔틴 생산성을 나타냄을 확인하였다(도 8 참조).

또한, 본 발명은 1) 제1 선택마커를 포함하는 lox 핵산 단편의 양 말단에 DR0862 및 DR1475가 각각 연결된 플라스미드를 제조하는 단계; 2) 상기 제조된 플라스미드 DNA를 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 도입하여 DR0862 및 DR1475유전자를 각각 삽입시키는 단계; 3) 상기 삽입 유전자에 포함된 제1 선택마커를 제거하는 단계; 및 4) 상기 수득된 변이 균주를 배양하여 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 제거하는 단계를 포함하는 cre-lox 시스템을 이용한 DR0862 및 DR1475 유전자가 동시 삽입된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "Cre-loxP 시스템"은 DNA의 특정 부위에서 결실을 수행하는데 이용되는 통상의 위치특이적 재조합 효소기술을 의미한다. 상기 Cre-loxP 시스템은 진핵 및 원핵 생물에 대하여 목적하는 유전자를 돌연변이시키는데에 사용가능하다. 이는 단일 효소인 Cre 재조합 효소 (recombinase)로 구성되어 있고, 짧은 표적 서열인 loxP 서열을 재조합한다. 따라서, 변이를 유발시키고자 하는 위치에 loxP 서열을 배치함으로써, 목적 유전자가 불활성화 또는 결실되거나, 다른 유전자와 치환될 수도 있다. 일반적으로 loxP는 34개의 염기로 구성된 박테리오파지 P1 부위로 비대칭성 8 bp의 염기서열을 포함하고, 중앙에 2개의 염기를 제외하고는, 13 bp 크기인 2쌍의 회문구조(palindromic)를 갖는 것이 특징으로 알려져 있다 (ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT).

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 lox 핵산 단편은 lox 단편을 양 말단에 갖는 제1 선택마커를 포함할 수 있다. 상기 lox 핵산 단편은 lox66 및 lox71으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 lox 유전자를 단편의 양 말단에 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 lox 핵산 단편은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "선택 마커"는 특정 유전자의 산물을 의미한다. 상기 산물을 포함하는 미생물은 이를 포함하지 않는 미생물에는 나타나지 않는 특별한 형질을 가짐으로써, 이에 의해 목적하는 미생물의 선별을 가능하게 한다. 상기 선택 마커는 항생제 내성 유전자일 수 있다. 상기 항생제 내성 유전자는 카나마이신, 클로람페니콜, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 구체적으로, 카나마이신 및 클로람페니콜로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명에서 과발현하기 위한 유전자 DR0862와 DR1475는 데이노코쿠스 라디오두란스의 카로티노이드 생합성 대사경로에서 대사의 흐름을 결정짓는 주요 효소 (rate-limiting enzyme)를 암호화하는 것으로 알려져 있으며, 두 유전자의 동시 과발현 시 카로티노이드 생합성 대사의 방향으로 그 흐름이 증가하여 목적하는 카로티노이드의 생산성이 향상된 선행 연구결과가 보고된 바 있다. 본 발명에서는 데이노코쿠스 라디오두란스의 DR0862와 DR1475 유전자를 외부 플라스미드의 도입없이 세포내에서 과발현시키기 위한 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 데이노코쿠스 라디오두란스 내의 과발현을 위해 상기 DR0862 및 DR1475 유전자에 열내성 단백질인 groE 유전자의 프로모터와 결찰된 플라스미드를 제조하는 단계를 제공한다.

열내성 단백질 중 하나인 GroE 단백질은 분자적 샤페론 (molecular chaperone) 활성을 가지며, 산화 및 열자극 스트레스 등의 환경에서 강한 활성을 나타낸다. 또한, groE 유전자는 데이노코쿠스 라디오두란스의 일반적인 배양 조건에서도 강한 발현력을 갖을 수 있으므로, 통상의 기술분야에서 구성 프로모터 (constitutive promoter)로 매우 잘 알려진 바 있다. 또한, 높은 온도에 즉시 반응하여 그 발현량이 2배 이상 증대되는 특징을 가지고 있다.

본 발명에서 상기 groE 유전자의 프로모터는 DR0862 및 DR1475 유전자가 작동가능하게 연결될 수 있다.

상기 용어, "작동가능하게 연결된"은 핵산의 발현을 조절하는 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 가능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 플라스미드의 제조에서 작동가능하게 연결하는 것은 통상의 기술자에 의해 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 상기 groE 프로모터는 groES 유전자(NCBI GeneBank ID: 1800077)의 상위(upstream) 부분의 299 bp를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 구체적으로 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 데이노잔틴 고생산능을 가진 데이노코쿠스 라디오두란스 변이균주의 제조방법은 DR0862 및 DR1475 유전자를 동시에 데이노코쿠스 라디오두란스의 유전체에 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 도입된 균주는 Cre-loxP 시스템에 의하여 선택마커가 제거되고, groE 프로모터에 의해 DR0862 및 DR1475 유전자가 과발현될 수 있다. 한 균주에서 하나, 둘 또는 그 이상의 유전자를 목적 생명체의 유전체 내에 삽입되도록 조작하는 방법은 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다. 또한, 상기 방법은 통상의 기술자에 의해 적절히 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 DR0862 및 DR1475 유전자가 동시 삽입된 균주에 groE 프로모터, cre 재조합 효소를 코딩하는 유전자, 제2 선택마커 및 온도 감수성 repUts를 포함하는 벡터를 도입하여 제1 선택마커를 결실시키는 단계를 제공한다.

상기 groE 프로모터는 cre 재조합 효소와 작동가능하게 연결될 수 있다.

한편, 상기 제2 선택마커는 Kat 프로모터와 작동가능하게 연결될 수 있다. 이때, 상기 Kat 프로모터는 KatE1 유전자(NCBI GeneBank ID: 1800077)의 상위(upstream) 부분의 138 bp를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "온도 감수성 repUts"는 특정 범위의 온도 내에서만 플라스미드가 복제가 가능하게 하는 유전자인 repU 유전자를 의미한다(H H Nguyen et al, Molecular Microbiology, 2009, 73(2), 240-252) 상기 유전자를 포함하는 플라스미드는 28℃의 배양 온도에서는 복제되어 숙주세포 내에서 플라스미드의 유지를 가능하게 하지만, 37℃의 배양 온도에서는 상기 플라스미드가 복제되지 않아 숙주세포 내에서 제거된다.

상기 repU 유전자 및 이를 포함하는 플라스미드는 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다.

상기 제1 선택마커를 결실시키는 단계는 제1 선택마커의 양 말단에 결합한 lox 유전자가 cre 재조합 효소에 의해 인식되어 이들 부위를 절단함으로써, 제1 선택마커를 데이노코쿠스 속 균주의 유전체로부터 제거할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 수득된 변이 균주를 배양하여 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 제거하는 단계를 제공한다.

상기 제2 선택마커의 제거는, 온도 감수성 마커인 repUts에 의하여 제2 선택마커를 포함하는 벡터가 특정 온도 범위 내에서는 복제되지 않는 특성을 사용할 수 있다. 따라서, 상기 단계는 변이 균주를 특정 온도 범위 내에서 일정 기간 동안 배양함으로써 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 제거할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양을 위한 온도는 30 내지 40℃, 구체적으로 31 내지 39℃, 더욱 구체적으로 33 내지 38℃일 수 있다.

상기 단계에 따라 수득된 변이 균주는 제1 및 제2 선택마커가 모두 제거됨으로써 항생제가 포함된 배지에서는 성장하지 못하는 특성에 기초하여 선별될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 야생형 데이노코쿠스 라디오두란스 균주 (ATCC13939) 배양 산물의 HPLC 및 LC-MS분석을 통한 데이노잔틴의 확인

1-1. 균주의 배양 및 배양 산물의 수득

먼저, 5 g의 트립톤(BD, 프랑스), 3 g의 효모 추출물(BD, 프랑스), 1 g의 포도당(Duksan, 한국)을 1 ℓ의 정제수에 용해하여 TGY 액체 배지를 제조한 후 121℃에서 15분 동안 가압멸균하였다. 상기 제조된 액체 배지를 14 ㎖ 테스트 튜브에 3 ㎖씩 분주하고, 데이노코쿠스 라디오두란스 균주 (ATCC13939)를 접종하여 30℃, 200 rpm의 조건으로 24시간 동안 교반하며 배양하였다. 배양 후, 1%의 배양액을 리터당 10 g의 트립톤, 5 g의 효모 추출물, 10 g의 포도당, 10 g의 소듐 글루타메이드 (Daejung, 한국), 12 g의 HEPES (Sigma, 미국), 0.5 g의 마그네슘 설페이트 (Daejung, 한국), 0.001 g의 망간클로라이드 (Sigma, 미국)를 용해하여 제조한 HEPES 액체배지에 50 ㎖에 재접종하여 30℃, 200 rpm의 조건으로 48시간 동안 교반하며 배양하였다. 배양 후, 배양액을 15분간, 4℃, 4,000 rpm의 조건으로 원심분리하여 세포를 회수하고, 여기에 5 ㎖의 메탄올를 첨가하여 현탁하였다. 1분 동안 초음파분쇄기 (ultrasonicator)로 분쇄한 후 상기와 같은 방법으로 세포로부터 추출물을 수득하였다. 수득된 추출물은 0.25 ㎛의 포어(pore) 크기를 갖는 여과지를 이용하여 여과하여 세포잔여물이 최종 제거된 순수 추출물을 수득하였다.

1-2. 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석을 통한 데이노잔틴 성상 분석

<실시예 1-1>에서 수득된 추출물을 이용하여 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 통해 데이노잔틴 성상을 분석하였다.

구체적으로, 컬럼은 Zorbax Eclipse XDB-C18 5 ㎛(4.6 x 150 ㎜)를 사용하였고, 온도는 30℃, 유속은 0.5 ㎖/min으로 설정하고, UV파장은 470 nm로 설정하여 15분간 분석하였다. 한편, <실시예 1-1>에서 준비된 추출물은 5 ㎕를 주입하였다. 이동상은 아세토니트릴, 메탄올 및 이소프로판올이 40:50:10으로 배합된 것을 사용하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 것과 같이 데이노코쿠스 라디오두란스 추출물은 5.944 min, 6.585 min, 7.003 min, 8.004 min, 13.262 min, 및 14.29 min의 머무름 시간(retention time)에서 각각의 피크가 검출됨을 확인하였다. 특히, 5.944의 머무름 시간에서 가장 높은 피크가 검출 됨을 확인하였다.

또한, 상기와 같은 조건에서 LC-MS분석 이온 스펙트럼 분석결과 583.9 m/z [M+H], 606.4 m/z [M+Na], 그리고 620.4 m/z [M+K]가 검출됨을 확인하였고, 이는 분자량 582.9 인 데이노잔틴과 일치함을 확인하였다 (도 1b).

따라서, HPLC결과에서 나타난 5.944 min의 머무름시간에 검출된 피크가 데이노잔틴임을 최종적으로 확인하였다.

실시예 2. 데이노잔틴 정량을 위한 검량선 작성

데이노잔틴의 대한 효능에 관련된 연구들은 수행된 바 있으나, 현재까지 표준품은 출시되지 않은바, 데이노잔틴의 생산능 검증 및 정량분석을 위한 검량선 작성을 실시하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1-1> 에서 추출된 추출물은 회전농축기 (evaporator)를 이용하여 60℃, 80 rpm에서 1시간 동안 농축하고, 농축된 추출물은 동결건조기 (freeze dryer)를 사용하여 분말형태로 완전히 건조하였다. 건조된 분말을 저울로 10 mg으로 계량하여 10 ㎖의 메탄올에 완전용해하여 최종농도 1 g/L 농도의 표준품을 제조하였다. 표준품을 메탄올로 단계적으로 각각 희석 (serial dilution)하여 검량선 (standard curve)을 작성하였고, 작성된 검량선의 R²값은 0.9998로 그 결과의 신뢰도가 매우 적절함을 확인하였다 (도 2). 또한, 각 농도에 해당되는 검출 피크의 적분값 (area)에 따라 결정된 수식은 y (area) = [3.4246 X 데이노잔틴 농도(mg/L)]+ 2.608로 나타났으며, 추후 실험 예에서의 데이노잔틴 농도는 상기 수식을 기반으로 계산하였다.

실시예 3. groE 프로모터에 의해 DR0862 또는 DR1475 유전자의 발현이 조절되는 제2 선택마커를 포함하는 플라스미드의 제작

DR0862 및 DR1475 유전자는 데이노코쿠스 라디오두란스 염색체 DNA (chromosomal DNA)를 주형으로 사용하여 하기 표 1에 기재된 dr0862F1(서열번호 10) 및 dr0862R1(서열번호 11) 프라이머쌍과 dr1475F1 (서열번호 12) 및 dr1475R1 (서열번호 13)프라이머쌍 각각을 이용하여 PCR을 수행하였다.

구체적으로, 2 ㎕의 DNA 주형, 각각 1 ㎕의 프라이머(10 pmole/㎕) 및 17 ㎕의 멸균증류수의 혼합물을 AccuPower™ pfu PCR premix mix (Bioneer)에 첨가한 뒤, 이를 T-100 Thermal cycler DNA 증폭기(Bio-rad)를 이용하여 수행하였다. PCR과정은 95℃에서 5분 동안 반응시킨 뒤, 95℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 1분의 반응과정을 1회로 하여 이를 25회 반복함으로써 수행되었다.

서열번호	이름	서열(5'→3')
서열번호 10	dr0862F1	aagtactagtatgaggtctagggccggtt
서열번호 11	dr0862R1	ctatgcggccgctcagccgtggaccgcgccca
서열번호 12	dr1475F1	ctagactagtgtgaacgaacttcccggcac
서열번호 13	dr1475R1	taacgcggccgcctacacctcaatcggcacgt

수득된 PCR 산물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하고, 이를 DNA fragment purification kit(Intron lifetechnology)를 이용하여 정제하였다. 정제된 DR0862 또는 DR1475 PCR 산물과 pRADZ3 플라스미드(Meima R. and Lidstrom M. E., Applied environmental microbiology, 66:3856-3867)를 각각 SpeI 및 NotI 제한효소로 절단한 뒤, 결찰시켜 pRADZ3 내에 존재하는 groE 프로모터의 하위에 DR0862 또는 DR1475 유전자가 클로닝되도록 플라스미드 (pRADZ::DR0862, pRADZ::DR1475; 서열번호 6, 서열번호 7))를 제조하였다(도 3).

실시예 4. 데이노코쿠스 라디오두란스 유전체에 groE 유전자 프로모터와 결합된 DR0862과 DR1475 유전자가 동시 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조

4-1. DR0862유전자의 데이노코쿠스 라디오두란스 유전체 삽입을 위한 플라스미드 제조

상기 <실시예 3> 에서 수득한 플라스미드를 주형으로 하여 groE 프로모터와 결합된 DR0862 유전자를 각각 증폭한 후 카나마이신 내성 유전자의 양 말단에 lox66 및 lox71 유전자를 포함하는 플라스미드 pAM1 (대한민국 등록특허: 제10-1835852호)의 카나마이신 유전자 상위부위에 각각 클로닝하였다.

구체적으로, DR0862 유전자의 염기서열이 포함된 플라스미드 주형 DNA 1 ㎕와 하기 표2 에 기재된 groEF1 (서열번호 14)와 dr0862R2 (서열번호 15) 프라이머 (10 pmole/㎕) 용액 각각 1 ㎕, 그리고 멸균 증류수 17 ㎕의 혼합물을 AccuPower™ pfu PCR premix mix (Bioneer)에 첨가하고, 상기 <실시예 3> 의 조건으로 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR증폭물과 pAM1 플라스미드를 각각 제한효소 KpnI과 EcoRV으로 37℃에서 4시간동안 반응하여 절단하고, <실시예 3>의 조건으로 DNA를 정제한 후, 결찰하여 최종산물로써 pAM1 플라스미드의 염기서열 가운데 카나마이신 유전자 상위부위에 DR0862유전자가 삽입된 플라스미드를 수득하였다 (도 4a).

한편, 상동 재조합과정을 이용하여 DR0862유전자를 데이노코쿠스 라디오두란스에 삽입하기 위한 DNA단편을 수득하고, 이 단편 사이에 상기 과정에서 수득된 DNA단편 (DR0862, 카나마이신 내성유전자, lox66 및 lox71 염기서열이 결합된)과 결찰하기 위한 플라스미드를 구축하였다. 데이노코쿠스 라디오두란스 유전체에서 DRC0006 (hypothetical protein)유전자와 DRC0007 (hypothetical protein) 유전자의 염기서열을 일부 포함하는 상위부위 930 bp와 하위부위 914 bp를 각각 PCR 증폭하였다.

구체적으로는 데이노코쿠스 라디오두란스 2 ㎕와 drc0006-1 (서열번호 16)와 drc0006-2 프라이머 쌍(서열번호 17) 또는 drc0007-1 (서열번호 18)과 drc0007-2 (서열번호 19) 프라이머 쌍 1 ㎕를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 <실시예 3> 과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하여 각각의 PCR증폭물을 수득하였다. 그리고 수득된 PCR 증폭물 각각 1 ㎕와 drc0006-1 (서열번호 16)과 drc0007-2 (서열번호 19) 프라이머 쌍 1 ㎕를 첨가하고 역시 상기와 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하여 두 증폭물을 1,850 bp크기의 하나의 증폭물로 연결된 최종산물을 수득하였다. 이는 Enzynomic사의 TOP cloner kit에 포함된 T-vector에 결찰하였다. Escherichia coli DH5a 균주에 형질전환하였다. 상기 과정으로부터 제조된 플라스미드와 DR0862를 포함하고 loxP 염기서열과 카나마이신 내성유전자가 포함된 DNA단편을 각각 stuI으로 절단하고 이들을 결찰하여 데이노코쿠스 라디오두란스의 유전체에 DR0862 유전자를 도입하도록 하는 최종 플라스미드 (pgroDR0862, 서열번호 8)를 제조하였다 (도 4a).

서열번호	이름	서열(5'→3')
서열번호 14	groEF1	ctatggtacctcggcttggaagcacgtatt
서열번호 15	dr0862R2	ctatgatatctcagccgtggaccgcgccca
서열번호 16	drc0006-1	ttacctcactgtgccaagca
서열번호 17	drc0006-2	atgcgcaaatcagaccgtgcaggccttgacgacagccacgcactct
서열번호 18	drc0007-1	agagtgcgtggctgtcgtcaaggcctgcacggtctgatttgcgcat
서열번호 19	drc0007-2	gatgagacatttcctgtgta

4-2. 선택마커가 제거되고, DR0862유전자가 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조

상기 <실시예 4-1> 에서 최종 제조된 플라스미드를 데이노코쿠스 라디오두란스 세포로 도입하여 변이 균주를 제조하였다.

구체적으로, 데이노코쿠스 라디오두란스(ATCC 13939, 농업유전자원정보센터, 한국) 균주를 TGY 배지(0.5%(w/v)의 트립톤, 0.1%(w/v)의 글루코스 및 0.3%(w/v)의 효모 추출물)를 이용하여 30℃의 온도에서 OD₆₀₀의 값이 0.5에 도달할 때까지 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 30 mM의 칼슘클로라이드(CaCl₂)가 포함된 2x TGY 배지에 현탁한 뒤, 현탁액을 얼음에서 1시간 동안 정치시켰다. 이를 다시 원심분리하여 상등액을 제거하고 30 mM의 CaCl₂ 및 10%(v/v) 글리세롤이 포함된 50 ㎕의 TGY 배지를 첨가하여 재현탁한 뒤, 멸균된 1.5 ㎖ 튜브에 50 ㎕ 씩 분주하여 준비하였다. 상기 <실시예 4-1> 에서 제조된 최종 플라스미드 10 ㎕을 분주된 데이노코쿠스 라디오두란스 세포에 넣고 30 mM CaCl₂ 100 ㎕를 추가로 첨가한 뒤, ice에서 30분간 정치하고, 32℃에서 1시간 30분 동안 교반없이 배양하였다. 배양 후, 2X TGY액체배지 800㎕를 첨가하고 30℃, 200 rpm에서 12시간동안 배양하였다. 그 후, 배양액 200 ㎕를 취하여 25 ㎍/㎖의 카나마이신 항생제가 포함된 2X TGY 고체배지에 도말하고 30℃에서 3일간 배양한 뒤 생장된 콜로니로부터 선택마커인 카나마이신 내성유전자를 포함하고 DR0862유전자가 추가 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 수득하였다.

상기 과정으로부터 수득된 변이 균주를 상기 데이노코쿠스 라디오두란스 컴페턴트 세포 (competent cell)제조 방법과 동일한 방법으로 세포를 제조하고, 1 ㎍농도의 pAM2 플라스미드 DNA (대한민국 등록특허: 제10-1835852호)를 첨가하여 형질전환하고 이를 제2 선택마커 클로람페니콜 (3 ㎍/㎖)이 포함된 2X TGY 고체배지로부터 형질 전환된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 수득하였다. 상기 변이 균주를 TGY 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 pAM2 플라스미드를 변이 균주로부터 제거하여, DR0862가 추가 삽입되고 선택마커가 제거된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 제조하였다.

4-3. DR1475유전자의 데이노코쿠스 라디오두란스 유전체 삽입을 위한 플라스미드 제조

상기 <실시예 3> 에서 제조된 DR1475유전자의 염기서열이 포함된 플라스미드 주형 DNA 1 ㎕와 하기 표 2에 기재된 groEF2 (서열번호 20)와 표 3에 기재된 dr1475R2 (서열번호 21) 프라이머 (10 pmole/㎕) 용액 각각 1 ㎕를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 <실시예 4-1> 와 동일한 방법 및 조건으로 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR증폭물과 pAM1 플라스미드를 각각 제한효소 PstI과 EcoRV으로 37℃에서 4시간동안 반응하여 절단하고, 상기 <실시예 3> 과 동일한 방법으로 DNA정제 후, 결찰하여 pAM1 플라스미드의 염기서열 가운데 카나마이신 유전자 상위부위에 DR1475유전자가 삽입된 플라스미드를 수득하였다 (도 4b).

한편, 상기 <실시예 4-1> 과 동일한 방법을 이용하여 DR1475 유전자를 데이노코쿠스 라디오두란스 유전체에 도입하기 위한 DNA단편을 수득하고, 이 단편 사이에 상기 과정에서 수득된 DNA단편 (DR1475, 카나마이신 내성유전자, lox66 및 lox71 염기서열이 결합된)과 결찰하기 위한 플라스미드를 구축하였다. 데이노코쿠스 라디오두란스 유전체에서 DRC0004 유전자 (thiopurine S-methyltransferase)와 DRC0007 (resolvase) 유전자의 염기서열을 일부 포함하는 상위부위 1,150 bp와 하위부위 910 bp를 각각 PCR 증폭하였다. 구체적으로는 데이노코쿠스 라디오두란스 2 ㎕와 하기 표 3에 기재된 drc0004-1 (서열번호 22)와 drc0004-2 (서열번호 23)프라이머 쌍 또는 drc0005-1 (서열번호 24)과 drc0005-2 (서열번호 25) 프라이머 쌍 1 ㎕를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 <실시예 3> 과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 수행하여 각각의 PCR증폭물을 수득하였다. 각각의 PCR 증폭물은 제한효소 KpnI과 XhoI 및 BamHI과 SphI으로 각각 처리 후 정제하고, 상기 과정에서 제조된 DR1475유전자 염기서열이 삽입된 pAM1플라스미드를 동일한 제한효소로 처리된 pAM1에 순차적으로 결찰시켜, 데이노코쿠스 라디오두란스의 유전체에 DR1475 유전자를 도입하도록 하는 최종 플라스미드 (pgroDR1475, 서열번호 9)를 제조하였다 (도 4b).

서열번호	이름	서열(5'→3')
서열번호 20	groEF2	ctcgctgcagtcggcttggaagcacgtatt
서열번호 21	dr1475R2	ctcggatatcctacacctcaatcggcacgt
서열번호 22	drc0004-1	cgtaggtaccgtgtggtaccacgccgatca
서열번호 23	drc0004-2	ccatctcgagctcgctgcagcgcaatcgagttcgtgcgaa
서열번호 24	drc0005-1	ccatggatccactctcacgtcaggccattt
서열번호 25	drc0005-2	ctcggcatgctgcttggcacagtgaggtaa

4-4. 선택마커가 제거된 DR0862및 DR1475 유전자가 동시 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 제조

상기 <실시예 4-2> 와 동일한 방법으로 선택마커가 제거되고 DR0862 유전자가 추가 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 수용성 세포 (competent cell)를 제조하고, <실시예 4-3> 에서 제조된 플라스미드 DNA를 첨가하여, 상기 <실시예 4-3> 의 형질전환 방법과 동일한 방법을 수행하여 DR1475 유전자가 추가로 삽입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주를 수득하였다. 수득된 변이 균주로부터 제 1 선택마커 (카나마이신 내성유전자)를 제거하기 위하여 상기 <실시예 4-3> 와 동일한 방법으로 pAM2 플라스미드를 상기 변이 균주에 삽입하여 본 발명에서의 최종균주로써 선택마커가 제거되고 DR0862와 DR1475가 균주의 유전체에 추가 도입된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이균주를 제조하였다.

4-5. 데이노잔틴 고생산을 위한 데이노코쿠스 라디오두란스 최종균주의 변이 확인

상기 <실시예 4-4> 에서 최종 수득된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이균주에서 DR0862와 DR1475 유전자의 동시 삽입 및 제 1선택마커가 제거됨을 확인하기 위하여 상기 변이균주로부터 DNA를 추출하고 상기 유전자들이 삽입된 부위를 PCR하여 그 사이즈를 비교하였다.

구체적으로, 정제된 최종 변이 균주 DNA 2 ㎕, 하기 표 4에 표기된 diaDR0862F (서열번호 26) 및 diaDR0862R (서열번호 27) 프라이머 쌍 또는 diaDR1475F (서열번호 28) 및 diaDR1475R (서열번호 29) 프라이머 쌍 혼합물 (10 pmole/㎕) 1 ㎕, 그리고 7 ㎕의 멸균 증류수를 AccuPower PCR mix (바이오니아, 한국)에 넣고 초기 변성 조건 95℃에서 5분을 수행하고, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃ 5분의 조건을 30 번 반복 수행한 뒤 72℃ 5분 동안 반응하여 PCR하였다. 증폭된 산물은 1% 아가로즈겔에 5㎕ 씩 각각 로딩하여 전기영동하고 DNA밴드 크기를 확인하였다 (도 5a).

한편, 선택마커가 최종 변이 균주에서 완전히 제거되었음을 재확인하기 위하여 균주를 3 ㎖ TGY 액체배지에 접종하고 30℃, 200 rpm의 조건에서 24시간 동안 진탕배양하였다. 배양 후, 10 ㎕의 배양액을 취하여 TGY 고체배지와 25 ㎍/㎖의 카나마이신이 포함된 TGY배지에 각각 떨어뜨린 뒤, 30℃에서 배양하여 세포 생장 유무를 확인하였다.

그 결과, 제 1선택마커가 삽입된 각각의 돌연변이 균주만이 카나마이신 항생제가 포함된 TGY배지에서 생장하는 것을 확인하였고, 야생형 균주와 DR0862 및 DR1475 유전자가 추가 삽입되고 선택마커가 제거된 변이 균주는 각각 항생제가 없는 TGY에서만 생장함이 확인하였다.

이를 통해, 최종 변이 균주의 유전체에서 선택마커가 완벽히 제거되었음을 확인하였고, 상기 DX 균주라고 명명하였다.

서열번호	이름	서열(5'→3')
서열번호 26	diaDR0862F	aatgggtatacctcagaacg
서열번호 27	diaDR0862R	caggcaattactgctccaag
서열번호 28	diaDR1475F	tccgaaagtacagtccgcac
서열번호 29	diaDR1475R	agcgaggtagaacgaatcgt

실험예 1. 데이노코쿠스 라디오두란스 최종 변이균주로부터 데이노잔틴의 생산효과 확인

1-1. 데이노코쿠스 라디오두란스 야생형 및 변이 균주의 생장 곡선 및 데이노잔틴 생산량 비교

상기 <실시예 4-5> 에서 수득한 DX균주의 생장율 변화를 측정하기 위하여 야생형과 함께 상기 <실시예 1-1> 와 동일한 조건 및 방법으로 각 데이노코쿠스 라디오두란스 균주를 배양하였다. UV-vis spectrophotometer (Biotek, 미국)을 이용하여 48시간의 배양시간 동안 6시간의 간격으로 흡광도 (OD₆₀₀)를 측정하였다 (도 6a).

측정결과, DX균주는 30시간의 배양시간 동안은 야생형과 동일한 생장율을 보이는 것으로 나타나며, 그 이후, 야생형의 생장속도에 비해 약간 감소하지만 48시간까지 지속적으로 성장하는 것이 확인되었다. 48시간 동안 데이노코쿠스 라디오두란스 야생형 균주와 DX균주는 각각 18.6 및 15.2의 OD값을 나타내었다.

한편, 48시간동안 배양된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주로부터 데이노잔틴 생산량을 확인하였다. 이를 위하여, 상기 과정에서 48시간 동안 배양된 균주의 배양액 10 ㎖을 15 ㎖ 튜브에 옮기고, 4,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 세포를 회수하고 10 ㎖의 멸균 증류수로 2회 세척하였다. 그런 다음, 동결건조기를 이용하여 12시간 동안 세포를 건조하였다. 건조된 세포의 중량을 측정한 뒤, 1 ㎖의 MeOH를 첨가하여 현탁하고, 초음파분쇄기를 이용하여 1분간 세포를 균질화 (homogenization)하였다. 이 과정을 2회 반복한 후, 추출액은 4,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 세포파쇄물과 분리한 뒤, 데이노잔틴이 포함된 메탄올추출액을 0.2 ㎛ PTPE 주사필터를 통하여 여과하고, 2 ㎖ 갈색 HPLC튜브에 담아 상기 <실시예 1-2> 와 동일한 조건 및 방법으로 HPLC 분석을 실시하였다. 측정 후, 검출된 피크의 면적을 작성된 검량선에 대입하여 데이노잔틴 농도를 환산하고, 데이노코쿠스로 라디오두란스 균주부터 추출된 데이노잔틴 생산량을 확인하였다.

그 결과 도 6b에 나타난 바와 같이, DX균주는 야생형 균주 (37.25 ㎎/L)에 비해 약 3 배 가량 더 높은 농도의 데이노잔틴 (112.38 ㎎/L)을 생산하는 것으로 나타났으며, 1 g의 세포건조중량 (dry cell weight, DCW) 당 약 2.2 ㎎의 데이노잔틴 생산능이 있음을 확인하였다. 이는 야생형 (0.496 ㎎/g DCW)에 비해 4.5 배 가량 증가된 생산성을 나타낸 것이다 (도 6b).

실험예 2. 배양 온도에 따른 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주의 데이노잔틴 생산량 확인.

2-1. 데이노코쿠스 라디오두란스 야생형 균주의 배양온도별 생장곡선

상시 <실시예 1-1> 에서 제조된 TGY　액체 배지를 14 ㎖ 테스트 튜브 3 ㎖씩 분주하고 데이노코쿠스 라디오두란스 균주 (ATCC13939)를 접종하여 30℃, 200 rpm의 조건으로 24시간 동안 교반하며 배양하였다. 배양 후, １%의 배양액을 리터당 10 g의 트립톤, 5 g의 효모 추출물, 10 g의 포도당, 10 g의 소듐 글루타메이드 (Daejung, 한국), 12 g의 HEPES (Sigma, 미국), 0.5 g의 마그네슘 설페이트 (Daejung, 한국), 0.001 g의 망간클로라이드 (Sigma, 미국)을 용해하여 제조한 HEPES 액체배지에 25 ㎖에 재접종하여 30℃, 200 rpm의 조건으로 24 시간 동안 교반하며 배양하고, 그 후, 30℃, 32℃, 37℃ 및 40℃로 온도를 변경하여 48 시간 동안 추가 배양하였다. 그리고 6시간의 간격으로 세포의 생장율을 측정하였다.

그 결과 도 7a에 나타난 바와 같이, 상기의 배양조건에서는 32℃의 배양온도가 가장 높은 세포생장율을 나타내었으며 40℃의 경우 가장 낮은 세포생장율을 보였다 (도 7a).

2-2. 데이노코쿠스 라디오두란스 야생형 균주의 배양온도별 DR0606 ( groE ) 유전자의 발현 변화 측정

상기 <실험예 2-1>에서 배양된 야생형 균주 샘플로부터 열내성 유전자인 DR0606 유전자의 mRNA 발현량을 측정하기 위하여, 각 조건의 배양액을 1 ㎖ 씩 취하여 13,000 rpm, 4℃의 조건에서 3분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 그런 다음, RiboEX (진올, 한국) 용액을 1 ㎖ 첨가하여 현탁하고 2분간 상온에서 반응하였다. 세포파쇄를 위하여 bead beater (MP, 미국)를 이용하여 6,000 rpm에서 1분간 상온 조건에서 세포를 파쇄하고, 200 ㎕의 클로로포름 (대정화학, 한국)을 첨가한 뒤, 30초간 강하게 vortex하였다. 이후, 13,000 rpm, 4℃의 조건에서 15분간 원심분리하여 DNA, RNA등이 포함된 상등액 500 ㎕를 취하고, 여기에 이소프로판올 (대정화학, 한국) 500 ㎕를 첨가하여 RNA를 침전하고, 다시 원심분리하여 RNA 침전물을 수득하였다. RNA 정제를 위하여 1 ㎖의 75% 에탄올을 첨가하여 불순물을 세척하고, 잔존하는 DNA를 제거하기 위하여 DNaseI (타카라, 일본)을 처리한 뒤, 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. RNAeasy clean up kit (Quiagene, 미국)을 이용하여 순수 RNA를 수득하고, RNA의 농도를 1 ㎍으로 정량한 뒤, TOPscript cDNA synthesis kit (엔지노믹스, 한국)를 이용하여 50℃에서 1시간동안 반응하여 cDNA를 합성하였다.

상기 과정에서 합성된 주형 cDNA 2 ㎕와 하기 표 5에 표기한 RTDR0606F(서열번호 30) 및 RTDR0606R (서열번호 31) 프라이머 쌍 2 ㎕, 그리고 2X SYBR green master mix (엔지노믹스, 한국) 10 ㎕, RNase-free 멸균증류수 6 ㎕를 한 튜브에 혼합하여 넣고, 95℃에서 10분 동안 RNA를 변성하고, 그 후, 95℃에서 10초 60℃에서 30초간 총 40회 반복하여 real-time PCR을 수행하고 이를 ΔCt방법으로 groE 유전자의 발현량을 측정하였다. house keeping 유전자로써 DR1343유전자를 이용하였고 사용된 프라이머는 하기 표 6에 표기한 RTDR1343F (서열번호 32) 및 RTDR1343R (서열번호 33)프라이머 쌍을 이용하였으며, 실험방법과 조건은 상기의 실험과 동일하게 하였다.

그 결과 도 7b에 나타난 바와 같이, 데이노코쿠스 라디오두란스 야생형 균주에서 groE 유전자의 발현은 온도가 증가함에 따라 증가하는 것으로 나타났으며, 30℃의 배양조건을 기준으로 하였을 때, 32℃는 1.11 Fold, 37℃는 4.24 Fold, 그리고 40℃의 배양조건에서는 13.65 Fold로 groE의 발현량이 점차 증가하는 것으로 확인되었다. 상기 실험에서 40℃의 배양조건에서 groE의 발현량이 가장 높으나, 이 조건에서는 데이노코쿠스 라디오두란스의 생장이 온도에 의해 크게 저해됨으로 데이노잔틴의 생산에 영향을 줄 수 있을 것이라 예상된다. 따라서, DX 균주에서 groE 프로모터와 연결된 DR0862 및 DR1475의 발현량을 증가시키며, 동시에 DX 균주의 생장을 용이하게 하기 위하여, 추후 데이노잔틴 고생산을 위한 배양온도 조건은 37℃이 가장 적합할 것으로 파악되였다.

서열번호	이름	서열(5'→3')
서열번호 30	RTDR0606F	GTCAAGGAAGGCGACACCGT
서열번호 31	RTDR0606R	TCGACAATGGCGAGCAGGTC
서열번호 32	RTDR1343F	CAACGACCTGACCGACAACC
서열번호 33	RTDR1343R	GGCTGCTTTCGTCGTACTCC

2-3. 배양온도 조절에 따른 DX 균주의 DR0862 및 DR1475 유전자 발현량 측정 및 생산량 비교

상기 <실험예 2-2> 에서 나타난 groE 유전자의 발현패턴 및 데이노코쿠스 라디오두란스 야생형 균주의 생장율을 토대로 설정된 배양온도 37℃에서 DX 균주의 groE, DR0862, 및 DR1475 유전자의 발현량을 측정하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 2-2> 와 동일조건 및 방법으로 배양된 DX균주로부터 RNA 추출 및 cDNA합성 후, 이를 주형으로 하기 표5에 표기된 RTDR0862F (서열번호 34) 및 RTDR0862R (서열번호 35) 또는 RTDR1475F (서열번호 36) 및 RTDR1475R (서열번호 37) 프라이머쌍을 사용하는 것을 제외하고는 상기 <실험예 2-2> 와 같은 방법으로 real-time PCR을 수행하였다.

그 결과 도 8a에 나타난 바와 같이, 37℃의 배양조건에서 groE, DR0862, 그리고 DR1475 유전자는 비교군인 30℃의 배양조건에서 보다 각각 5.9 fold, 18.6 fold, 그리고 13.6 fold의 발현량이 증가하는 것으로 나타났다 (도 8a).

한편, 상기와 같은 배양조건의 DX균주 10 ㎖로부터 데이노잔틴을 추출하여, HPLC분석을 통해 데이노잔틴의 생산량을 확인하였다.

그 결과 도 8b에 나타난 바와 같이, 37℃에서 배양한 DX균주는 159.9 ㎎/L로 30℃에서 배양된 DX균주 (109.74 ㎎/L) 에서보다 약 31.4% 더 높은 데이노잔틴 생산성을 나타내었고, 세포건조중량 1 g당 데이노잔틴 3.7 mg을 생산함으로 30℃의 배양조건 (2.1 mg/g DCW) 보다 약 42.3%의 데이노잔틴 생산량의 증대가 확인되었다 (도 8b).

상기의 실험결과로부터 데이노코쿠스 라디오두란스에 의한 데이노잔틴의 생합성에 중요한 역할을 하는 DR0862 및 DR1475 유전자의 과발현은 최종적으로 데이노잔틴의 생산성 증대에 큰 영향을 미치는 것이 확인되었다.

서열번호	이름	서열(5'→3')
서열번호 34	RTDR0862F	CAGGCCGTATTCGTCGAGCA
서열번호 35	RTDR0862R	AACTCGGTCAGGCGATGCAG
서열번호 36	RTDR1475F	CTGCGCGGGATGCTCAAGTA
서열번호 37	RTDR1475R	ATTTCAGGTCCGGCCACGTC

실험예 3. 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주로부터 생산된 데이노잔틴의 항산화 효능 확인

데이노잔틴 고생산능을 가진 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주 DX로부터 데이노잔틴을 추출하여 산화스트레스 유발 물질인 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)를 이용하여 데이노잔틴의 항산화 소거능을 확인하고, 다른 카로티노이드들과 비교하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 2-1>의 실험조건과 동일한 배양배지 및 배양조건에서 DX균주를 배양하고, 이로부터 메탄올을 이용하여 데이노잔틴을 추출한 뒤, 20 mg/L의 농도가 되도록 이를 정량하였다. 다른 카로티노이드는 표준품을 사용하였으며, 그 종류는 아스타잔틴 (cayman, 미국), 라이코펜 (Sigma, 미국), 베타-카로틴 (Sigma, 미국), 파이토엔 (TRC, 캐나다)을 각각 20 mg/L 사용하였다. 양성대조군으로 비타민 C 종류중 하나인 10 mg/L 농도의 아스코브산 (대정화금, 한국)을 사용하였고, DPPH (TCI,일본)은 25 mg/L를 에탄올에 용해하여 사용하였다. 200 ㎕의 DPPH 용액을 96 well titer plate에 분주하고, 각 카로티노이드 20 ㎕를 첨가한 뒤, 암조건 (dark condition)에서 30분간, 반응하고 이를 517nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 일련의 계산식 [(Control_A517nm - Sample_A517/Control_A517nm)X 100]을 통하여 DPPH소거능 (%)을 계산하였다.

그 결과 도 9 에 나타난 바와 같이, 데이노잔틴은 다른 카로티노이드보다 약 21.7% ~ 50.1% 더 우수한 항산화능을 가진 것으로 나타났다(도 9).

<110> University of Seoul Industry Cooperation Foundation <120> Manufacturing method of mutant strain having increased deinoxanthin producitivity and the method for deinoxanthin overproduction by controlling cultivation temperature <130> 2020P-06-004 <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox66 <400> 1 taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lox71 <400> 2 ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34 <210> 3 <211> 978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR0862 <400> 3 gtgaggtcta gggccggttt gtctcttaga ctgccgacga ggaccctcac cgtgacggac 60 tattcacctg ccctgccctg caccgaactg cgccgcccgc cgctggcgca ggcagtgagg 120 tactgccggg acctgacgcg gcagcacagc aagacgtttt atctggggtc gcaactgttt 180 tcgccacccg agcgggccgc cgtgtgggcg gtctacgccg cctgccgcgc cggggacgac 240 atcgtggacg aggcgggaaa cggggaccgc gagcgcgaac tccgtgagtg gcgcagccgg 300 attgacgcgg cgtttgcggg gcaaccggcg gacgacccca tcagcacggc gctggcgtgg 360 gcggcggggc gctacgccat tccccacagc gcctttgccg agctgcacga gggcctgaac 420 atggacctgc gtgggcacga gtaccgcgac atggacgacc tgttgctcta ctgccgccgg 480 gtggccgggg tggtggggtt catggtcgcg cctatcagcg gctaccgggg cggcgcggcg 540 acgctgaacg acgccttgca actcggtcag gcgatgcagc tcaccaacat cctgcgcgac 600 gtgggcgagg acctgacgcg cggacgggtc tacctgccgc agagcctgct cgacgaatac 660 ggcctgtcac gcgccgcgct ggagcgctgg ggccagggcg aaccgctcag ccccgcctac 720 cgcgccctga tgacgcacct cggcgggctg gcgcgcgagt ggtacgccgc tggccgcgcc 780 gggattccgc agctcgacgg acgcggcccg ctggcggtgc tgaccgccgc ccgcgcctac 840 gagggcattc tggacgacct cgaacgcgcc ggctacgaca atttcgggcg ccgcgcctac 900 gtgagtggcc ggcgcaaact gctgatgctg ccgcaggcgt ggtgggaact gcgctcgctg 960 ggcgcggtcc acggctga 978 <210> 4 <211> 1890 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR1475 <400> 4 gtgaacgaac ttcccggcac gtccgatacc ccgctgctcg accagattca tggccccaaa 60 gacctcaaac gcctctcgcg ggagcagttg cccgcgctga ccgaggagct gcgcggcgaa 120 atcgtgcgtg tctgctcgcg cggcggcctg cacctcgcgt cctcgctcgg cgcggtggac 180 atcatcacgg cgctgcatta cgtgctcgac tcgccgcgcg accggattct cttcgacgtg 240 gggcatcagg cctacgccca caaaatcctg accgggcggc gcgaccagat ggccgacatc 300 aagaaagaag gcggcatcag cggctttacc aaggtttccg agtccgaaca cgacgcgatt 360 acggtgggcc acgcctccac ctccctcgcc aacgcgctcg gcatggcgct cgcgcgtgac 420 gcgcagggca aggatttcca cgtcgctgcc gtcatcggcg acggctcgct gaccggcggg 480 atggccctcg ccgcgctcaa caccatcggc gacatgggcc gcaagatgct gatcgtgctc 540 aacgacaacg agatgagcat ctcggaaaat gtcggggcca tgaacaaatt catgcgcggg 600 ctgcaagtcc agaagtggtt tcaggaaggc gaaggtgcgg gcaaaaaagc ggtggaagcc 660 gtcagcaagc cgctcgccga cttcatgagc cgggcgaaaa actccacccg ccacttcttc 720 gaccccgcca gcgtcaaccc cttcgccgcg atgggcgtgc gctacgtcgg cccggtggac 780 ggccacaacg tgcaggaact ggtgtggctg ctcgaaagac tggtggacct cgatggcccg 840 accatcctcc acatcgtcac caccaagggc aagggcctga gctacgccga ggccgacccg 900 atctactggc acggcccggc caagttcgac ccggcgaccg gcgagtacgt gccgagcagc 960 gcctattcgt ggagcgccgc cttcggtgag gccgtgaccg agtgggcgaa gaccgacccg 1020 cgcaccttcg tcgtcacgcc cgccatgcgc gagggcagcg ggctggtcga attcagccgc 1080 gtacacccgc accgttacct cgacgtgggc atcgccgagg aagtcgcggt gacgacggcg 1140 gcgggcatgg cgctgcaagg gatgcggccc gtcgtcgcca tctactccac cttcctgcaa 1200 cgcgcctacg accaggtgtt gcacgacgtg gcgattgagc acctcaacgt caccttctgc 1260 atcgaccgcg cgggcatcgt gggggcggac ggggccacgc acaacggcgt gttcgacctc 1320 agcttcctgc gctctatccc cggcgtccgc atcgggctgc cgaaagacgc cgccgaactg 1380 cgcgggatgc tcaagtacgc ccagacgcac gacggcccct ttgccatccg ctacccgcgc 1440 ggcaatacgg cgcaggtgcc cgccgggacg tggccggacc tgaaatgggg cgagtgggaa 1500 cggctgaagg ggggcgacga cgtggtgatt ctggcgggcg gcaaggcgct cgactatgcc 1560 ttgaaggccg ccgaggacct ccccggtgtg ggcgtggtca atgcccgctt cgtcaagccg 1620 ctcgacgaag agatgctgcg cgaggtgggg ggccgggccc gcgccctgat tacggtggaa 1680 gacaacaccg tcgtcggcgg cttcgggggc gcggtgctcg aggcgctgaa cagcatgaac 1740 ctgcatccca ccgtgcgcgt tctcggcatt cccgacgagt ttcaggaaca cgccactgcc 1800 gagagcgtcc acgcccgcgc cggcatcgac gccccggcga ttcggacggt gctcgccgaa 1860 ctcggggtgg acgtgccgat tgaggtgtag 1890 <210> 5 <211> 299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> groE promotor <400> 5 tggaagcacg tattgtcgcc ctacatatat acgttaaagc taacagctgg caaggggata 60 cccccattcc ccgtcccagc gccccttgag cgtcatagac tcagattgtc agcttcggtc 120 agttgacatt tttcttatcg gcgctctacc atccgtgacg gattgaaggc gctgggcggg 180 aaaaagctcg ccggcacgac tctccgccat tccatctcac tcacaggagg accccacatg 240 ctgaaacctt taggcgaccg cgttctggtt gaaattatcg aagaagccga gcagaagac 299 <210> 6 <211> 7919 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRADZ::DR0862 <400> 6 ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 60 cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 120 aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 180 attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 240 tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 300 aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 360 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 420 cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 480 gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 540 agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 600 ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 660 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 720 acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 780 gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 840 ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 900 agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 960 cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 1020 tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 1080 gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac 1140 gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc 1200 ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg 1260 caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat 1320 aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagctcgcg aggcctcgag 1380 atctatcgat tcacaaaaaa taggcacacg aaaaacaagt taagggatgc agtttatgca 1440 tgccatggta cccgggagct cgaattctag aagcttctgc agacgcgtca tctgcagaat 1500 tcggcttgga agcacgtatt gtcgccctac atatatacgt taaagctaac agctggcaag 1560 gggatacccc cattccccgt cccagcgccc cttgagcgtc atagactcag attgtcagct 1620 tcggtcagtt gacatttttc ttatcggcgc tctaccatcc gtgacggatt gaaggcgctg 1680 ggcgggaaaa agctcgccgg cacgactctc cgccattcca tctcactcac aggaggaccc 1740 cacatgctga aacctttagg cgaccgcgtt ctggttgaaa ttatcgaaga agccgagcag 1800 aagacaagcc gaattccagc acactggcgg ccgttactag tatgaggtct agggccggtt 1860 tgtctcttag actgccgacg aggaccctca ccgtgacgga ctattcacct gccctgccct 1920 gcaccgaact gcgccgcccg ccgctggcgc aggcagtgag gtactgccgg gacctgacgc 1980 ggcagcacag caagacgttt tatctggggt cgcaactgtt ttcgccaccc gagcgggccg 2040 ccgtgtgggc ggtctacgcc gcctgccgcg ccggggacga catcgtggac gaggcgggaa 2100 acggggaccg cgagcgcgaa ctccgtgagt ggcgcagccg gattgacgcg gcgtttgcgg 2160 ggcaaccggc ggacgacccc atcagcacgg cgctggcgtg ggcggcgggg cgctacgcca 2220 ttccccacag cgcctttgcc gagctgcacg agggcctgaa catggacctg cgtgggcacg 2280 agtaccgcga catggacgac ctgttgctct actgccgccg ggtggccggg gtggtggggt 2340 tcatggtcgc gcctatcagc ggctaccggg gcggcgcggc gacgctgaac gacgccttgc 2400 aactcggtca ggcgatgcag ctcaccaaca tcctgcgcga cgtgggcgag gacctgacgc 2460 gcggacgggt ctacctgccg cagagcctgc tcgacgaata cggcctgtca cgcgccgcgc 2520 tggagcgctg gggccagggc gaaccgctca gccccgccta ccgcgccctg atgacgcacc 2580 tcggcgggct ggcgcgcgag tggtacgccg ctggccgcgc cgggattccg cagctcgacg 2640 gacgcggccc gctggcggtg ctgaccgccg cccgcgccta cgagggcatt ctggacgacc 2700 tcgaacgcgc cggctacgac aatttcgggc gccgcgccta cgtgagtggc cggcgcaaac 2760 tgctgatgct gccgcaggcg tggtgggaac tgcgctcgct gggcgcggtc cacggctgag 2820 cggccgctcg agcatgcatc tagaagcttc tgcagacgcg tcgacgtcat atggatccga 2880 ttcgacctgc aggcatgcaa gctgtacgcc tcagctacca ttcttgcagc cgcgttcagg 2940 gtcttgacgt gttctttgta tctatcagca aactgagaac ccaattctgg atcatccttg 3000 taacgccaac tctccgacca ttccgaagga acgccttgta gtcctcctga gccgttaggg 3060 tatgtcttta gtccaatcaa atgggacatt tgcagacagg aacgcacaag tgtctcacgt 3120 cgcttctcta tttcaatatc taaaaattct tcactcttat cgttgcttga catattaaaa 3180 ctgtctaact gatccagttc acttatatgg aaagtatcac taaagtcatg gcttctcaga 3240 aattcaatac ttcccattga tggggaccgg ttaaccaaat cgataaaaat ttttctgtca 3300 tgtttcagat aagtttttgg cgcgttgatt ttataataaa gccgccattc ttgtgccaac 3360 aacgccacga aaagagccac agcagcagcg gccacatccc attgaaaatc tttcgccaga 3420 ccaaccgcca ggagaaccaa gccgaaatag ttagcccagc gaactaaaaa actatctata 3480 aacgtattaa gaaacgttcg ggtcatattt ccgtgaatca tatcaggacg taaatttgca 3540 catgacgcat ttccgggggc ttttatccct cggacttctt ttcaggcccc ttctcggcct 3600 ttctgtgacc ctgttttttc aggccgcgaa ctgcgcctgg tcgggcctga cccccacacg 3660 ctggccttcg tactcacgca gcctgcccag caggtcggcc agcgcggcat tgaccacggc 3720 ggcgaggttg cggggcggcg ttccgcctgc ggtctggtcg tgcttcacgt cgcgcagcac 3780 gcgcaccagc accgcgccca cgtcgtcgga cacgtcccgg ccagcgtcgg cggcgcgggt 3840 gatgttccaa atgagtttcc gccagaagcc cagcgagtcg gccccgtccc cgaaagctgc 3900 cgctagcgcc cgcgcctgcc tgtccacgat ctcggcgcgg taggccgggc gggtttcccg 3960 gtgggcgtcg gcaagctccc acacgacgtt ttcagcgagg gagggcgcgg gccggacagt 4020 catgttatcg gagggggagg gaagagcgga ttttatcgcc caggtgctca caacttcgta 4080 tgtcacggca accggggcgc ttttttcgcg cagttccccg cctgtcacat cctcacaggg 4140 ttcttgactc tccggcacgc tcttagggag agggtggagc atgttgtaga cggtgcgccc 4200 ggccttcgcg tcggcgttca ggtcgcgcca gttccggccc caatcgtcat gcatcaggcg 4260 gacatatccc gccttccctt ccagcacgcg cctcggcttg agcgtcacgg cccacagcgt 4320 cccggttgcc acagactcgc cgcgcaggtc gcccatgtgg gcatcacagg ccaccagccc 4380 gacccggcgc agatattgaa ggttctcgta gaaggcggac ttcttcagac ccacatgcac 4440 catgagcagc tcggcgggca ggtggaacac agcgcgggtg acgtgttccg catagccgca 4500 ggcgcgggcc acgtccagcg ccaccgagaa cagggcgcgg aagatgcgcc gggccgactc 4560 gcggcagggg gcgtcatcta ggcaggcggt gagggtctgc accagttcgg cgcgtgtggc 4620 gatggtcaac ggcgcgggcg cgggctggga ctgctgggcg atggtgggca cgggcggcgg 4680 cgagatggac cgggccgagc tggaaatttc ccgtgtgagc gcaggtttag gcgcatggtt 4740 accttcctgc agtgaaatct gcgaaatcag gcccgcttcg aggagtcgga ccatgaatgg 4800 attgtgtctc aagaaaaaag cctcccctct tgtcagaggg gagggtcccg gtctaccatg 4860 ctctcagcga cgagatagct ggggtttgtg accctgcact ctgacaaagc cctcaccgaa 4920 aggtgggggt ttagtcattt ggcctagtaa agcagaacag aggcgatttg tcacgcaaag 4980 gcccgccgcc cgaggggaaa caggcggcgg gccaatggct cggcgttgtt agctgggggt 5040 cgcaccaggg aagcacagaa gcccttccct gagcagggtt tcaccgtgtg gtgtcccttc 5100 gtccttgaag gcgaactggt aggccaggcc gtaatgctcc tgcaccatct tttgctcatc 5160 caccgcgaca aagaaacggc gggtgttcgc cgggctgctg agggtctgcc actcgccgga 5220 cgcgcccacc gcataggcgt ctccggctcc acattcctcg gcctgctgat actgatactt 5280 cgtccacagc atcaccgcct tatcgggcac ctgcgcgaag ctcaccagcg ccccgaaccg 5340 cccggcgctc gtggtgaagg tggacgactg caccatgtcg gacagttcca gcgtggcagg 5400 cgcgggcgtg ttcgtcggcg cgtacaccgt ccccgcctcg cacacgacca gcggggcggc 5460 ccccgtgccg aactcggcgg cgctgccgtt tgccagcgtg agcgccgaag acgccaccgc 5520 gcaggtaccc atgggtgccg accaccagca ggtccacgcc gtgcgccgcc tcggtgagca 5580 cctcgattgg acggcccctc agggtctgaa ccctcccctg cacgcccgcc tccccgatga 5640 gtgtctgcgc cgtctgctgc gcctgccggg cattctgctc cagcatctcc cggacgtagt 5700 cgggattcag tcccgcccac tgaacgaagc cgctgaccgg cggctcctcg atcacagtca 5760 cgacctccag ctcggcgcct gccgccttcc cgagcgttat ggcctgcttc aaggcgcgct 5820 ggctgggctc acttccgtca aaggccacca cgaatcgcat ccgtcctcct ccctgaccag 5880 tcaggttcag caagcagggt aagcctctcc cagcactccg gggcttcaca cggccttggg 5940 tcttttctgc atacccatga gcctcagtac ccgacagttt ccggcagggc ttgaaaaagt 6000 tcggctgaca cgcgagaact ggacgcgtct cccgatgtcc tggccaagtt gacccgctgc 6060 ttcaccgcgc acttcccgga gttccgcaag aactaggtcg agctgctctc cctcatggtc 6120 ctcgccctcc ttaggggcaa ggacgtccgg catgctaaac tcgccgcgcg cttccccgga 6180 agcgcgcaca ccgcctccgt catccggcgg gtggaacgct tcttcgaccg tcatcctctt 6240 cggccagctg atgtcgcccg ggtcgttctg acgctccttc ccgccgcgca gccacgcgaa 6300 tttatccttg accggaccaa ctggaagtat gggcagacgg acgtgaacgt cttgttgctg 6360 gccgtcattt ggcgggacgt cgccatcccc ctgctctacg agttgctgcc ccatgggggc 6420 agcagcgaca ccgagattcg gcacaccctg atggacgatg ccctgtgcct gctgtccgcc 6480 gctgacatcc gggtgctgta tgccgaccgc gaattcccag cttgagtagg acaaatccgc 6540 cgagcttcga cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa aatcactgga 6600 tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca 6660 gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc 6720 gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg 6780 aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt 6840 gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt 6900 gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac 6960 ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc 7020 aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc 7080 gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg 7140 gcgattcagg ttcatcatgc cgtttgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa 7200 ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat ttttttaagg cagttattgg 7260 tgcccttaaa cgcctggttg ctacgcctga ataagtgata ataagcggat gaatggcaga 7320 aattcgtcga ggcggcacct cgctaacgga ttcaccactc caagaattgg agccaatcaa 7380 ttcttgcgga gaactgtgaa tgcatcccgc aagaggcccg gcagtcaggt ggcacttttc 7440 ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 7500 cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 7560 gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 7620 ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 7680 tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 7740 aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 7800 ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 7860 agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgc 7919 <210> 7 <211> 8831 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRADZ::DR1475 <400> 7 ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 60 cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 120 aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 180 attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 240 tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 300 aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 360 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 420 cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 480 gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 540 agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 600 ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 660 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 720 acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 780 gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 840 ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 900 agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 960 cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 1020 tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 1080 gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac 1140 gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc 1200 ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg 1260 caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat 1320 aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagctcgcg aggcctcgag 1380 atctatcgat tcacaaaaaa taggcacacg aaaaacaagt taagggatgc agtttatgca 1440 tgccatggta cccgggagct cgaattctag aagcttctgc agacgcgtca tctgcagaat 1500 tcggcttgga agcacgtatt gtcgccctac atatatacgt taaagctaac agctggcaag 1560 gggatacccc cattccccgt cccagcgccc cttgagcgtc atagactcag attgtcagct 1620 tcggtcagtt gacatttttc ttatcggcgc tctaccatcc gtgacggatt gaaggcgctg 1680 ggcgggaaaa agctcgccgg cacgactctc cgccattcca tctcactcac aggaggaccc 1740 cacatgctga aacctttagg cgaccgcgtt ctggttgaaa ttatcgaaga agccgagcag 1800 aagacaagcc gaattccagc acactggcgg ccgttactag tatgaacgaa cttcccggca 1860 cgtccgatac cccgctgctc gaccagattc atggccccaa agacctcaaa cgcctctcgc 1920 gggagcagtt gcccgcgctg accgaggagc tgcgcggcga aatcgtgcgt gtctgctcgc 1980 gcggcggcct gcacctcgcg tcctcgctcg gcgcggtgga catcatcacg gcgctgcatt 2040 acgtgctcga ctcgccgcgc gaccggattc tcttcgacgt ggggcatcag gcctacgccc 2100 acaaaatcct gaccgggcgg cgcgaccaga tggccgacat caagaaagaa ggcggcatca 2160 gcggctttac caaggtttcc gagtccgaac acgacgcgat tacggtgggc cacgcctcca 2220 cctccctcgc caacgcgctc ggcatggcgc tcgcgcgtga cgcgcagggc aaggatttcc 2280 acgtcgctgc cgtcatcggc gacggctcgc tgaccggcgg gatggccctc gccgcgctca 2340 acaccatcgg cgacatgggc cgcaagatgc tgatcgtgct caacgacaac gagatgagca 2400 tctcggaaaa tgtcggggcc atgaacaaat tcatgcgcgg gctgcaagtc cagaagtggt 2460 ttcaggaagg cgaaggtgcg ggcaaaaaag cggtggaagc cgtcagcaag ccgctcgccg 2520 acttcatgag ccgggcgaaa aactccaccc gccacttctt cgaccccgcc agcgtcaacc 2580 ccttcgccgc gatgggcgtg cgctacgtcg gcccggtgga cggccacaac gtgcaggaac 2640 tggtgtggct gctcgaaaga ctggtggacc tcgatggccc gaccatcctc cacatcgtca 2700 ccaccaaggg caagggcctg agctacgccg aggccgaccc gatctactgg cacggcccgg 2760 ccaagttcga cccggcgacc ggcgagtacg tgccgagcag cgcctattcg tggagcgccg 2820 ccttcggtga ggccgtgacc gagtgggcga agaccgaccc gcgcaccttc gtcgtcacgc 2880 ccgccatgcg cgagggcagc gggctggtcg aattcagccg cgtacacccg caccgttacc 2940 tcgacgtggg catcgccgag gaagtcgcgg tgacgacggc ggcgggcatg gcgctgcaag 3000 ggatgcggcc cgtcgtcgcc atctactcca ccttcctgca acgcgcctac gaccaggtgt 3060 tgcacgacgt ggcgattgag cacctcaacg tcaccttctg catcgaccgc gcgggcatcg 3120 tgggggcgga cggggccacg cacaacggcg tgttcgacct cagcttcctg cgctctatcc 3180 ccggcgtccg catcgggctg ccgaaagacg ccgccgaact gcgcgggatg ctcaagtacg 3240 cccagacgca cgacggcccc tttgccatcc gctacccgcg cggcaatacg gcgcaggtgc 3300 ccgccgggac gtggccggac ctgaaatggg gcgagtggga acggctgaag gggggcgacg 3360 acgtggtgat tctggcgggc ggcaaggcgc tcgactatgc cttgaaggcc gccgaggacc 3420 tccccggtgt gggcgtggtc aatgcccgct tcgtcaagcc gctcgacgaa gagatgctgc 3480 gcgaggtggg gggccgggcc cgcgccctga ttacggtgga agacaacacc gtcgtcggcg 3540 gcttcggggg cgcggtgctc gaggcgctga acagcatgaa cctgcatccc accgtgcgcg 3600 ttctcggcat tcccgacgag tttcaggaac acgccactgc cgagagcgtc cacgcccgcg 3660 ccggcatcga cgccccggcg attcggacgg tgctcgccga actcggggtg gacgtgccga 3720 ttgaggtgta ggcggccgct cgagcatgca tctagaagct tctgcagacg cgtcgacgtc 3780 atatggatcc gattcgacct gcaggcatgc aagctgtacg cctcagctac cattcttgca 3840 gccgcgttca gggtcttgac gtgttctttg tatctatcag caaactgaga acccaattct 3900 ggatcatcct tgtaacgcca actctccgac cattccgaag gaacgccttg tagtcctcct 3960 gagccgttag ggtatgtctt tagtccaatc aaatgggaca tttgcagaca ggaacgcaca 4020 agtgtctcac gtcgcttctc tatttcaata tctaaaaatt cttcactctt atcgttgctt 4080 gacatattaa aactgtctaa ctgatccagt tcacttatat ggaaagtatc actaaagtca 4140 tggcttctca gaaattcaat acttcccatt gatggggacc ggttaaccaa atcgataaaa 4200 atttttctgt catgtttcag ataagttttt ggcgcgttga ttttataata aagccgccat 4260 tcttgtgcca acaacgccac gaaaagagcc acagcagcag cggccacatc ccattgaaaa 4320 tctttcgcca gaccaaccgc caggagaacc aagccgaaat agttagccca gcgaactaaa 4380 aaactatcta taaacgtatt aagaaacgtt cgggtcatat ttccgtgaat catatcagga 4440 cgtaaatttg cacatgacgc atttccgggg gcttttatcc ctcggacttc ttttcaggcc 4500 ccttctcggc ctttctgtga ccctgttttt tcaggccgcg aactgcgcct ggtcgggcct 4560 gacccccaca cgctggcctt cgtactcacg cagcctgccc agcaggtcgg ccagcgcggc 4620 attgaccacg gcggcgaggt tgcggggcgg cgttccgcct gcggtctggt cgtgcttcac 4680 gtcgcgcagc acgcgcacca gcaccgcgcc cacgtcgtcg gacacgtccc ggccagcgtc 4740 ggcggcgcgg gtgatgttcc aaatgagttt ccgccagaag cccagcgagt cggccccgtc 4800 cccgaaagct gccgctagcg cccgcgcctg cctgtccacg atctcggcgc ggtaggccgg 4860 gcgggtttcc cggtgggcgt cggcaagctc ccacacgacg ttttcagcga gggagggcgc 4920 gggccggaca gtcatgttat cggaggggga gggaagagcg gattttatcg cccaggtgct 4980 cacaacttcg tatgtcacgg caaccggggc gcttttttcg cgcagttccc cgcctgtcac 5040 atcctcacag ggttcttgac tctccggcac gctcttaggg agagggtgga gcatgttgta 5100 gacggtgcgc ccggccttcg cgtcggcgtt caggtcgcgc cagttccggc cccaatcgtc 5160 atgcatcagg cggacatatc ccgccttccc ttccagcacg cgcctcggct tgagcgtcac 5220 ggcccacagc gtcccggttg ccacagactc gccgcgcagg tcgcccatgt gggcatcaca 5280 ggccaccagc ccgacccggc gcagatattg aaggttctcg tagaaggcgg acttcttcag 5340 acccacatgc accatgagca gctcggcggg caggtggaac acagcgcggg tgacgtgttc 5400 cgcatagccg caggcgcggg ccacgtccag cgccaccgag aacagggcgc ggaagatgcg 5460 ccgggccgac tcgcggcagg gggcgtcatc taggcaggcg gtgagggtct gcaccagttc 5520 ggcgcgtgtg gcgatggtca acggcgcggg cgcgggctgg gactgctggg cgatggtggg 5580 cacgggcggc ggcgagatgg accgggccga gctggaaatt tcccgtgtga gcgcaggttt 5640 aggcgcatgg ttaccttcct gcagtgaaat ctgcgaaatc aggcccgctt cgaggagtcg 5700 gaccatgaat ggattgtgtc tcaagaaaaa agcctcccct cttgtcagag gggagggtcc 5760 cggtctacca tgctctcagc gacgagatag ctggggtttg tgaccctgca ctctgacaaa 5820 gccctcaccg aaaggtgggg gtttagtcat ttggcctagt aaagcagaac agaggcgatt 5880 tgtcacgcaa aggcccgccg cccgagggga aacaggcggc gggccaatgg ctcggcgttg 5940 ttagctgggg gtcgcaccag ggaagcacag aagcccttcc ctgagcaggg tttcaccgtg 6000 tggtgtccct tcgtccttga aggcgaactg gtaggccagg ccgtaatgct cctgcaccat 6060 cttttgctca tccaccgcga caaagaaacg gcgggtgttc gccgggctgc tgagggtctg 6120 ccactcgccg gacgcgccca ccgcataggc gtctccggct ccacattcct cggcctgctg 6180 atactgatac ttcgtccaca gcatcaccgc cttatcgggc acctgcgcga agctcaccag 6240 cgccccgaac cgcccggcgc tcgtggtgaa ggtggacgac tgcaccatgt cggacagttc 6300 cagcgtggca ggcgcgggcg tgttcgtcgg cgcgtacacc gtccccgcct cgcacacgac 6360 cagcggggcg gcccccgtgc cgaactcggc ggcgctgccg tttgccagcg tgagcgccga 6420 agacgccacc gcgcaggtac ccatgggtgc cgaccaccag caggtccacg ccgtgcgccg 6480 cctcggtgag cacctcgatt ggacggcccc tcagggtctg aaccctcccc tgcacgcccg 6540 cctccccgat gagtgtctgc gccgtctgct gcgcctgccg ggcattctgc tccagcatct 6600 cccggacgta gtcgggattc agtcccgccc actgaacgaa gccgctgacc ggcggctcct 6660 cgatcacagt cacgacctcc agctcggcgc ctgccgcctt cccgagcgtt atggcctgct 6720 tcaaggcgcg ctggctgggc tcacttccgt caaaggccac cacgaatcgc atccgtcctc 6780 ctccctgacc agtcaggttc agcaagcagg gtaagcctct cccagcactc cggggcttca 6840 cacggccttg ggtcttttct gcatacccat gagcctcagt acccgacagt ttccggcagg 6900 gcttgaaaaa gttcggctga cacgcgagaa ctggacgcgt ctcccgatgt cctggccaag 6960 ttgacccgct gcttcaccgc gcacttcccg gagttccgca agaactaggt cgagctgctc 7020 tccctcatgg tcctcgccct ccttaggggc aaggacgtcc ggcatgctaa actcgccgcg 7080 cgcttccccg gaagcgcgca caccgcctcc gtcatccggc gggtggaacg cttcttcgac 7140 cgtcatcctc ttcggccagc tgatgtcgcc cgggtcgttc tgacgctcct tcccgccgcg 7200 cagccacgcg aatttatcct tgaccggacc aactggaagt atgggcagac ggacgtgaac 7260 gtcttgttgc tggccgtcat ttggcgggac gtcgccatcc ccctgctcta cgagttgctg 7320 ccccatgggg gcagcagcga caccgagatt cggcacaccc tgatggacga tgccctgtgc 7380 ctgctgtccg ccgctgacat ccgggtgctg tatgccgacc gcgaattccc agcttgagta 7440 ggacaaatcc gccgagcttc gacgagattt tcaggagcta aggaagctaa aatggagaaa 7500 aaaatcactg gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga acattttgag 7560 gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga tattacggcc 7620 tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat tcacattctt 7680 gcccgcctga tgaatgctca tccggaattc cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg 7740 atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg agcaaactga aacgttttca 7800 tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat 7860 gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt 7920 ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt ggccaatatg 7980 gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg 8040 ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat gccgtttgtg atggcttcca tgtcggcaga 8100 atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta atttttttaa 8160 ggcagttatt ggtgccctta aacgcctggt tgctacgcct gaataagtga taataagcgg 8220 atgaatggca gaaattcgtc gaggcggcac ctcgctaacg gattcaccac tccaagaatt 8280 ggagccaatc aattcttgcg gagaactgtg aatgcatccc gcaagaggcc cggcagtcag 8340 gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 8400 caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 8460 ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 8520 gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 8580 tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 8640 ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 8700 tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 8760 atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 8820 gagaattatg c 8831 <210> 8 <211> 7026 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pgroDR0862 <400> 8 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240 gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattctt acctcactgt 300 gccaagcagg cggctcacat tttctttcac gattcgttct acctcgctgg cgggaatttg 360 ccaaatcttg ctcagtcctt ctaccaccga tttgacgtcc caaggaagcg cagcctgccc 420 atcaagttcg aggaatggcc catccgtttc ggtcaacact cgatcccttg gcatagaccg 480 gattaaagct gcaccttttt gggttctcac catggtggga cctactgaaa accaacaccc 540 cagggaaatg gcccggcgca gttctgtaac cgagcccgag taccaatgca ggatgggggt 600 accgctgcgt gggttggcct cgagacagtt caagacctcg ctctcagcgc ggcggctatg 660 aatagagagg attcggcctc catgatcctc gcagcggcgc aggatgtgct gaaagacagc 720 gaactgctga gtccaggtgc cacgcaagct gggactgccg tcgagcccta cttctcccac 780 gaagcgtgtt tcgggaagat aacggtcaaa ccatgggaga tcggcagctc gttcgctcac 840 cacctcagga tgaaagccca gggcagtcca cacgtgcgga cgcccagcgg ccaaagccag 900 agttccccgc cacgcagctg gcgtcgttgt aaccgaaagg acagtgagtt gcctctcttc 960 gcatgcccgg gccacggcca cagggtctgg atacagatct aggtgaacgt gaaagtcaat 1020 catggcacct ttaggaggcg gtgaagtgcc cccaactcct ccatagaacg cttcaccata 1080 gcctccattg ctgcccggtc gccgattcgc cggtcactca aggaagctcc caaaaaccgc 1140 tgcacacctt cttgctccac ggtgatgatc gccaaggcca aggagcggac atcatcgaag 1200 agtgcgtggc tgtcgtcaag gtcggcttgg aagcacgtat tgtcgcccta catatatacg 1260 ttaaagctaa cagctggcaa ggggataccc ccattccccg tcccagcgcc ccttgagcgt 1320 catagactca gattgtcagc ttcggtcagt tgacattttt cttatcggcg ctctaccatc 1380 cgtgacggat tgaaggcgct gggcgggaaa aagctcgccg gcacgactct ccgccattcc 1440 atctcactca caggaggacc ccacatgctg aaacctttag gcgaccgcgt tctggttgaa 1500 attatcgaag aagccgagca gaagacaagc cgaattccag cacactggcg gccgttacta 1560 gtgatatcta ccgttcgtat agcatacatt atacgaagtt atgaattcga gctcgcatgg 1620 agaccgaggg cccttgacat tgagaatgat tctcaatatg gtgcagggag cttcgggcct 1680 cttgccgcgc agcagagcca gcgaggcgaa ggagagcata tgagccatat tcaacgggaa 1740 acgtcttgct cgaagccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa 1800 tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgattgta tgggaagccc 1860 gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat 1920 gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt 1980 atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccgggaa aacagcattc 2040 caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc 2100 ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt 2160 cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat 2220 gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca 2280 ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac 2340 gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag 2400 gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt 2460 tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc 2520 gatgagtttt tctaatcaat aacttcgtat agcatacatt atacgaacgg taggatcctc 2580 tagagtcgac ctgcaggcat gccctgcacg gtctgatttg cgcattctgt gagcatttcg 2640 cccttcgtct tgagggcata cgggttgatc agcgctacgt tgaggcccac agcttgtagg 2700 actgcttgaa gctgttgcaa gaagacggga tgggctgtcc gggtactcaa actgccgatg 2760 cgcatgggtg tcagaggggg attcagggca ataaacccat tctcattgat atatatcggc 2820 actgcccgtg cctgctgaaa acgtgtcgtg gcagtggccg ctaaaaccgc atacgccaag 2880 aagatcagcg tccgtgaacg ttgtgagtcc tcgcctgggg tcgggcattc agccgcgtga 2940 ttcagttgca gatgggtcgt gcggccaagg tcagtggcga tctccctttg cttagcggcg 3000 tctcctgcga ccagttgact cacggcaagg ggattgtgcc cttcagccac taggtcgatc 3060 atccctacca aactgtccaa tccccctgag agcaaggcca cgcagtcttc aataagcggg 3120 ccaataggtt ctttaggttg gtactggtat ccgcctgggc tgaacgtgat gctccagcga 3180 tccgtcgtca ggtaggcgag cgcctcttcc agcgcccggg cttgagcatt ccataggtca 3240 gcatctgtta cagagatggt taaggacagt tcacgcgtcc acccatctgg gctttcgctc 3300 ctgggagagg aaagatccgc agctaaaacg gacagcgtaa agctcagaaa atcccaggat 3360 tggctcggaa tcggccacct ctttcgaatc accgcttccc ggaggctggc accgatgccg 3420 acttgatgag tgttcagtcg tcggccatag agagcaacaa ttgttgaccc gttcgagacc 3480 gctgcgggtg ggttgggggt acacaggaaa tgtctcatcg aattctgcag atatccatca 3540 cactggcggc cgctcgagca tgcatctaga gggcccaatt cgccctatag tgaatcgtat 3600 tacaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 3660 cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 3720 accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctatacgtac ggcagtttaa ggtttacacc 3780 tataaaagag agagccgtta tcgtctgttt gtggatgtac agagtgatat tattgacacg 3840 ccggggcgac ggatggtgat ccccctggcc agtgcacgtc tgctgtcaga taaagtctcc 3900 cgtgaacttt acccggtggt gcatatcggg gatgaaagct ggcgcatgat gaccaccgat 3960 atggccagtg tgccggtctc cgttatcggg gaagaagtgg ctgatctcag ccaccgcgaa 4020 aatgacatca aaaacgccat taacctgatg ttctggggaa tataaatgtc aggcatgaga 4080 ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttcacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg 4140 tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa cgcaagcgca 4200 aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta 4260 tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc 4320 tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaagc 4380 tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca 4440 ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc 4500 ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc 4560 aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg 4620 ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg 4680 gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct 4740 gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct 4800 acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa 4860 gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa 4920 ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc 4980 gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt 5040 ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct 5100 gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc 5160 gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgaat tgaaaaagga 5220 agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 5280 ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 5340 gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 5400 gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 5460 tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 5520 acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 5580 aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 5640 cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 5700 gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 5760 cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 5820 tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 5880 tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 5940 ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 6000 tctacacgac ggggagccag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 6060 gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 6120 ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 6180 tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 6240 agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 6300 aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 6360 cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 6420 agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 6480 tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gattcaagac 6540 gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 6600 gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 6660 ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 6720 gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 6780 ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 6840 ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 6900 acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 6960 gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgaatcagtg agcgaggaag 7020 cggaag 7026 <210> 9 <211> 6375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pgroDR1475 <400> 9 ggtaccggta ccacgccgat cacgtcagga agttgcttca ccagcttggc ttcagtcctc 60 agaagccaga atcgcgtgcc ttggaacgcg atgagcaggc ggttcagacc tgggtcgagc 120 agacgctccc cagcttgaaa aaaaaaggtt gagcagggta tgactctcgt cttcctcgat 180 gaaagtggct tcagcctgaa accgacggtg acccggactt gggccgcccg aggacaaacg 240 ccgatcatca cggccaaagc cagttgggac aagctctcga ctattggtgc gataacgact 300 acgggccagt tcttacaaca gacctaccca ggcgccattc gaggccagca ggtcgtggcg 360 ttctgccgac atctcctccg ccacgtccaa ggcaagctcg ttgtgttgat ggacaacgct 420 cgtatccaca aaacgaaggc cctgagggcc ttcgtcgagc agcagccccg tcttaccgtc 480 gagtatctcc cgccctacgc tcctgaactc aatcccattg agcgggtgtg ggcctacata 540 aaaggatcag tcctcggaaa cttctgcccc aaaactgtcg gtgagttgaa ggcaaggcta 600 aactccgcgt ggcaacgtgt tcgttacatt cggcttcccc agcgccttac tcaccgctac 660 tgttcgtctc caacctaagc cggagtcaat aacgtcgatt gaaccagggc ttaacctaga 720 gaaggcccga ttttccgcca tttgcgatga gtaatttatg agtcaccaag aatcgtgcga 780 gaatgagagt ttgtgcaacg aatttggagc gctgatgcca acagcttttt gggcttgcaa 840 aactctgttg cacaaccgaa atcaatggca attgggtatt gcaagcatct aaaaaatgtg 900 atttgagtta ctaggggaat atttcgcacg aactcgattg cgctgcagcg agctcgagtc 960 ggcttggaag cacgtattgt cgccctacat atatacgtta aagctaacag ctggcaaggg 1020 gataccccca ttccccgtcc cagcgcccct tgagcgtcat agactcagat tgtcagcttc 1080 ggtcagttga catttttctt atcggcgctc taccatccgt gacggattga aggcgctggg 1140 cgggaaaaag ctcgccggca cgactctccg ccattccatc tcactcacag gaggacccca 1200 catgctgaaa cctttaggcg accgcgttct ggttgaaatt atcgaagaag ccgagcagaa 1260 gacaagccga attccagcac actggcggcc gttactagta tgaacgaact tcccggcacg 1320 tccgataccc cgctgctcga ccagattcat ggccccaaag acctcaaacg cctctcgcgg 1380 gagcagttgc ccgcgctgac cgaggagctg cgcggcgaaa tcgtgcgtgt ctgctcgcgc 1440 ggcggcctgc acctcgcgtc ctcgctcggc gcggtggaca tcatcacggc gctgcattac 1500 gtgctcgact cgccgcgcga ccggattctc ttcgacgtgg ggcatcaggc ctacgcccac 1560 aaaatcctga ccgggcggcg cgaccagatg gccgacatca agaaagaagg cggcatcagc 1620 ggctttacca aggtttccga gtccgaacac gacgcgatta cggtgggcca cgcctccacc 1680 tccctcgcca acgcgctcgg catggcgctc gcgcgtgacg cgcagggcaa ggatttccac 1740 gtcgctgccg tcatcggcga cggctcgctg accggcggga tggccctcgc cgcgctcaac 1800 accatcggcg acatgggccg caagatgctg atcgtgctca acgacaacga gatgagcatc 1860 tcggaaaatg tcggggccat gaacaaattc atgcgcgggc tgcaagtcca gaagtggttt 1920 caggaaggcg aaggtgcggg caaaaaagcg gtggaagccg tcagcaagcc gctcgccgac 1980 ttcatgagcc gggcgaaaaa ctccacccgc cacttcttcg accccgccag cgtcaacccc 2040 ttcgccgcga tgggcgtgcg ctacgtcggc ccggtggacg gccacaacgt gcaggaactg 2100 gtgtggctgc tcgaaagact ggtggacctc gatggcccga ccatcctcca catcgtcacc 2160 accaagggca agggcctgag ctacgccgag gccgacccga tctactggca cggcccggcc 2220 aagttcgacc cggcgaccgg cgagtacgtg ccgagcagcg cctattcgtg gagcgccgcc 2280 ttcggtgagg ccgtgaccga gtgggcgaag accgacccgc gcaccttcgt cgtcacgccc 2340 gccatgcgcg agggcagcgg gctggtcgaa ttcagccgcg tacacccgca ccgttacctc 2400 gacgtgggca tcgccgagga agtcgcggtg acgacggcgg cgggcatggc gctgcaaggg 2460 atgcggcccg tcgtcgccat ctactccacc ttcctgcaac gcgcctacga ccaggtgttg 2520 cacgacgtgg cgattgagca cctcaacgtc accttctgca tcgaccgcgc gggcatcgtg 2580 ggggcggacg gggccacgca caacggcgtg ttcgacctca gcttcctgcg ctctatcccc 2640 ggcgtccgca tcgggctgcc gaaagacgcc gccgaactgc gcgggatgct caagtacgcc 2700 cagacgcacg acggcccctt tgccatccgc tacccgcgcg gcaatacggc gcaggtgccc 2760 gccgggacgt ggccggacct gaaatggggc gagtgggaac ggctgaaggg gggcgacgac 2820 gtggtgattc tggcgggcgg caaggcgctc gactatgcct tgaaggccgc cgaggacctc 2880 cccggtgtgg gcgtggtcaa tgcccgcttc gtcaagccgc tcgacgaaga gatgctgcgc 2940 gaggtggggg gccgggcccg cgccctgatt acggtggaag acaacaccgt cgtcggcggc 3000 ttcgggggcg cggtgctcga ggcgctgaac agcatgaacc tgcatcccac cgtgcgcgtt 3060 ctcggcattc ccgacgagtt tcaggaacac gccactgccg agagcgtcca cgcccgcgcc 3120 ggcatcgacg ccccggcgat tcggacggtg ctcgccgaac tcggggtgga cgtgccgatt 3180 gaggtgtagg atatctaccg ttcgtatagc atacattata cgaagttatg aattcgagct 3240 cgcatggaga ccgagggccc ttgacattga gaatgattct caatatggtg cagggagctt 3300 cgggcctctt gccgcgcagc agagccagcg aggcgaagga gagcatatga gccatattca 3360 acgggaaacg tcttgctcga agccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg 3420 gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg 3480 gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt 3540 tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa 3600 gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccgggaaaac 3660 agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc 3720 agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg 3780 cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga 3840 ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataagct 3900 tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat 3960 ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg 4020 ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa 4080 acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt 4140 gatgctcgat gagtttttct aatcaataac ttcgtatagc atacattata cgaacggtag 4200 gatccactct cacgtcaggc catttcttac taaaaattgc gaaggtgtca gagaccccgg 4260 caagcaggat acaagtgtag cgaagtaacc caaaacttgc aatgactgac aatgaactcg 4320 ctattccaaa atatggcgca tatcactgtt agctttgcat agactctcag gcaacccctg 4380 cactgtgtca gctttttaga gcctcataaa gcgtatccct gttcaccccc agctcacggg 4440 caagaaccgt ctttttttcc ccagcagcca cccttgcccg gagttgttca acctgctcag 4500 gggtcagcgc ccgtttgcgg cccttgtact tcccggcctg ctttgcttta gcgatgcctt 4560 cccgctgatt ttcaaggttc tgcgcccgca ggaactcggc caccgcgccc agcatggtca 4620 gcagcagggt attcatcggg ttgtcctcac tagtgaagac cacgccttcg cgctggaatt 4680 ccacccgcac cccgcgcccc gacagctcgg tgacgatacg ccgcaggtcg tccacattgc 4740 gggccagcct gtccatcgag tgaacaatca cggtatcgcc ttcgcggacg taggccagca 4800 gctcctgcaa tctgggccgt ctggcatcct tgcctgatgc cttgtcttca aagattctgt 4860 ccagctctac accatccaac tgacgggcgg tgttttggtc tgtggtggat acccggatat 4920 agccgacgcg ctgccctctg gtcatgctgc cctctatttt gtcgggatag ggtttagagt 4980 tgccccgaca tatgtcggaa tatagcaaaa tggattctat tccgacactc ggatgccgat 5040 ttcatcagga ggcttgcttg tcgggaatgg gtatacctca gaacgacaaa aggatttacc 5100 tcactgtgcc aagcagcatg caagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 5160 aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc 5220 ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 5280 ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 5340 cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 5400 tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 5460 aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 5520 aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 5580 tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 5640 ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 5700 cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 5760 ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 5820 ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 5880 gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 5940 agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg 6000 cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 6060 aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 6120 aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 6180 ctcacgttaa gggattttgg tcatggccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa 6240 gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca 6300 aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc 6360 agtgaattcg agctc 6375 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr0862F1 <400> 10 aagtactagt atgaggtcta gggccggtt 29 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr0862R1 <400> 11 ctatgcggcc gctcagccgt ggaccgcgcc ca 32 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1475F1 <400> 12 ctagactagt gtgaacgaac ttcccggcac 30 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1475R1 <400> 13 taacgcggcc gcctacacct caatcggcac gt 32 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> groEF1 <400> 14 ctatggtacc tcggcttgga agcacgtatt 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr0862R2 <400> 15 ctatgatatc tcagccgtgg accgcgccca 30 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> drc0006-1 <400> 16 ttacctcact gtgccaagca 20 <210> 17 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> drc0006-2 <400> 17 atgcgcaaat cagaccgtgc aggccttgac gacagccacg cactct 46 <210> 18 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> drc0007-1 <400> 18 agagtgcgtg gctgtcgtca aggcctgcac ggtctgattt gcgcat 46 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> drc0007-2 <400> 19 gatgagacat ttcctgtgta 20 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> groEF2 <400> 20 ctcgctgcag tcggcttgga agcacgtatt 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1475R2 <400> 21 ctcggatatc ctacacctca atcggcacgt 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> drc0004-1 <400> 22 cgtaggtacc gtgtggtacc acgccgatca 30 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> drc0004-2 <400> 23 ccatctcgag ctcgctgcag cgcaatcgag ttcgtgcgaa 40 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> drc0005-1 <400> 24 ccatggatcc actctcacgt caggccattt 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> drc0005-2 <400> 25 ctcggcatgc tgcttggcac agtgaggtaa 30 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> diaDR0862F <400> 26 aatgggtata cctcagaacg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> diaDR0862R <400> 27 caggcaatta ctgctccaag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> diaDR1475F <400> 28 tccgaaagta cagtccgcac 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> diaDR1475R <400> 29 agcgaggtag aacgaatcgt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RTDR0606F <400> 30 gtcaaggaag gcgacaccgt 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RTDR0606R <400> 31 tcgacaatgg cgagcaggtc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RTDR1343F <400> 32 caacgacctg accgacaacc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RTDR1343R <400> 33 ggctgctttc gtcgtactcc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RTDR0862F <400> 34 caggccgtat tcgtcgagca 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RTDR0862R <400> 35 aactcggtca ggcgatgcag 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RTDR1475F <400> 36 ctgcgcggga tgctcaagta 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RTDR1475R <400> 37 atttcaggtc cggccacgtc 20

Claims (11)

1. 데이노코쿠스 속 균주의 유전체 내에 groE 프로모터에 연결된 DR0862 및 DR1475 유전자가 동시 삽입된 데이노잔틴 고생산능을 갖는 데이노코쿠스 속 변이 균주.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 데이노코쿠스 속 균주가 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)인 것을 특징으로 하는, 데이노코쿠스 속 변이 균주.
   
4. 삭제
5. 제1항의 데이노코쿠스 속 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 데이노잔틴 생산 방법.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 배양하는 단계는 35 내지 39℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 데이노잔틴 생산 방법.
   
7. 1) 제1 선택마커를 포함하는 lox 핵산 단편의 양 말단에 DR0862 및 DR1475가 각각 연결된 플라스미드를 제조하는 단계;
   2) 상기 제조된 플라스미드 DNA를 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 도입하여 DR0862 및 DR1475유전자를 각각 삽입시키는 단계;
   3) 상기 균주를 제2선택 마커를 포함하는 벡터로 형질 전환하여 상기 삽입 유전자에 포함된 제1 선택마커를 제거하는 단계; 및
   4) 상기 수득된 변이 균주를 배양하여 제2 선택마커를 포함하는 벡터를 제거하는 단계를 포함하는, DR0862 및 DR1475 유전자가 유전체 내에 동시 삽입된 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 데이노코쿠스 속 균주가 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)인, 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 lox 핵산 단편이 lox66 및 lox71으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 lox 유전자를 단편의 양 말단에 포함하는, 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
   
10. 제7항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 선택마커가 항생제 내성 유전자인, 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 항생제 내성 유전자가 카나마이신, 클로람페니콜, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조방법.
    
    

Images