KR101961564B1 - 카로티노이드 생합성능이 향상된 변이 균주 및 상기 변이 균주의 제조 방법 - Google Patents

카로티노이드 생합성능이 향상된 변이 균주 및 상기 변이 균주의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카로티노이드 생합성능이 향상된 변이 균주 및 상기 변이 균주의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 데이노코쿠스 속 변이 균주는 야생형의 데이노코쿠스 속 균주에 비해 카로티노이드의 생산이 증가함으로써, 상기 균주의 배양액 및 균체 추출물은 카로티노이드가 갖는 항산화, 항염증 또는 항노화 활성을 가질 뿐만 아니라, 멜라닌의 생성을 억제함으로써 피부 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

카로티노이드 생합성능이 향상된 변이 균주 및 상기 변이 균주의 제조 방법{MUTANT STRAIN HAVING INCREASED CAROTINOID BIOSYNTHESIS ABILITY AND MANUFACTURING METHOD OF SAME}
본 발명은 카로티노이드 생합성능이 향상된 변이 균주 및 상기 변이 균주의 제조 방법에 관한 것이다.
미생물 대사공학은 미생물 등의 유전체를 개량하여 원하는 목적에 맞게 활용하는 기술이다. 유용 대사산물은 미생물의 유전정보와 대사회로로부터 얻을 수 있으며, 미생물 유전자의 조작을 통해서 더 유용한 대사물질이나 그 특성을 개선시킬 수 있는 기술들이 개발되고 있다.
한편, 데이노코쿠스 라디오두란스는 생물체의 DNA 또는 단백질에 직접 손상을 입할 수 있는 이온화 방사선에 대해 내성을 갖는 것으로 알려져 있다. 상기 균주는 이온화 방사선에 의한 DNA 손상을 빠른 시간 내에 복구할 수 있고, 효소적 또는 비효소적 시스템에 의하여 세포 내에 생성된 활성산소종(ROS)를 효과적으로 제거할 수 있는 능력을 지니고 있다. 이와 같은 특성 때문에 데이노코쿠스 라디오두란스는 방사성 폐기물의 정화에 사용되고 있다. 또한, 의약, 보건, 생명공학 등의 다양한 분야에서 데이노코쿠스 라디오두란스를 적용한 기술의 사례가 증가할 것으로 전망된다.
현재까지 보고된 바에 의하면, 데이노코쿠스 라디오두란스의 대사공학적 제어를 위해, 다른 미생물의 유전자를 세포 내로 도입시키거나, 상동적 재조합 방법을 이용한 돌연변이 균주의 제작 기술이 고안되었다. 그러나, 이러한 돌연변이 제작 기술은 반복적인 유전자 클로닝 과정으로 인해 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라, 돌연변이 균주를 선별하기 위한 항생제 마커의 제한성으로 다중 돌연변이 균주를 제작하는데 어려움이 있다. 이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-0836093호는 해수로부터 분리한 데이노코쿠스 종 A2 균주와 상기 균주를 이용하여 아스타잔틴을 생산하는 방법을 개시하고 있다.
한편, 카로티노이드는 항산화 활성을 갖는 C-40 이소프레노이드 화합물로서, 자연계에 널리 분포되어 있는 한 군의 색소를 일컫는 총칭이다. 현재까지 알려진 카로티노이드는 6백여 종에 이르며, 이들은 각각 다른 형태로 존재한다. 카로티노이드는 인체 내에서 비타민 A의 전구체로서의 역할을 하며, 산화 방지 효과와 유해산소 소거작용, 암세포 증식 억제작용 및 발암 억제작용이 강하여 순환기 질환, 암 및 성인병 등을 예방하는 효능을 갖는다. 최근에는 직접적인 자외선에 의한 신체의 면역기능을 카로티노이드가 향상시켜 자외선 노출로부터 피부의 손상을 줄여주거나 멜라닌 생성을 억제함이 밝혀지면서 유럽이나 미국에서 미용 소재로도 각광을 받고 있다. 따라서, 화장품, 식품, 의약품 등에 적용하기 위한 카로티노이드 수요는 날로 증대되고 있다.
현재 상업적으로 시판중인 카로티노이드는 대부분 화학적으로 합성되고 있으며, 당근 및 토마토 등에서 유래된 생물학적 카로티노이드가 일부 존재하나 이는 매우 고가이다. 상업적인 수요 증대에 따른 카로티노이드의 대량생산을 위해 생물체 내에서 카로티노이드의 생합성에 관련된 많은 연구가 진행되고 있다. 세균, 조류 등과 같은 미생물로부터 담배, 고추 등과 같은 고등식물로부터 수많은 카로티노이드 생합성 관련 유전자가 동정 및 분석되었다.
효모인 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 녹색조류인 해마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis), 그람-양성균인 브레비박테리움 103(Brevibacterium 103) 및 그람-음성균인 아그로박테리움 아우란티아컴(Agrobacterium aurantiacum) 등의 균주가 카로티노이드를 생산하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이들 생물체로부터 생산되는 카로티노이드의 양은 상업적 사용을 위해 요구되는 정도에 이르지 못하고 있어, 고농도로 카로티노이드를 생산할 수 있는 균주의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 미생물을 이용하여 생물학적 카로티노이드를 대량 생산할 수 있는 방안을 연구하던 중, 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 dr0862(crtB) 및 dr1475(dxs) 유전자를 과발현시킬 수 있는 발현 벡터를 도입하여 변이 균주를 제조하고, 상기 균주가 고농도의 카로티노이드를 생산함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-0836093호
본 발명의 목적은 특정 유전자를 과발현하는 데이노코쿠스 속 변이 균주 및 상기 변이 균주의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 변이 균주 또는 상기 변이 균주의 배양액을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 변이 균주를 이용하여 카로티노이드를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 데이노코쿠스 속 변이 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 데이노코쿠스 속 변이 균주 또는 상기 균주의 배양액을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 데이노코쿠스 속 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 카로티노이드 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 데이노코쿠스 속 변이 균주는 야생형의 데이노코쿠스 속 균주에 비해 카로티노이드의 생산이 증가함으로써, 상기 균주의 배양액 및 균체 추출물은 카로티노이드가 갖는 항산화, 항염증 또는 항노화 활성을 가질 뿐만 아니라, 멜라닌의 생성을 억제함으로써 피부 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 pRADZ3::PgroE-dr0862(A) 및 pRADZ3::PgroE-dr0862-PgroE-dr1475(B) 플라스미드의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 데이노코쿠스 속 균주에서 카로티노이드의 합성이 증가한 것을 확인한 결과 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 데이노코쿠스 속 균주의 세포독성을 HaCaT 세포에서 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 데이노코쿠스 속 균주의 세포독성을 HDFn 세포에서 확인한 결과 그래프이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 데이노코쿠스 속 균주의 세포독성을 Raw264.7 세포에서 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 데이노코쿠스 속 균주의 세포독성을 B16F10 세포에서 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 데이노코쿠스 속 균주의 균체 추출물 및 배양액의 DPPH 라디칼 스캐빈저 활성을 확인한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 데이노코쿠스 속 균주의 균체 추출물 및 배양액의 산화질소 생성 억제 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 데이노코쿠스 속 균주의 균체 추출물 및 배양액의 멜라닌 합성 저해 효과를 확인한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 데이노코쿠스 속 변이 균주를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR0862(crtB) 유전자"는 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase)를 암호화하는 유전자를 의미한다. 상기 파이토엔 합성 효소는 카르티노이드의 생합성 단계에서 탄소수 40개인 파이토엔을 중합하는데 관여하는 효소 단백질이다. 상기 DR0862(crtB) 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR0862(crtB) 유전자는 서열번호 7로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "DR1475(dxs) 유전자"는 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase)를 암호화하는 유전자를 의미한다. 상기 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소는 피루베이트(pyruvate)와 D-글리세랄데하이드-3-포스페이트(D-glyceraldehyde-3-phosphate)가 반응하여 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트를 합성하는 과정을 촉진하는 효소 단백질이다. 상기 DR1475(dxs) 유전자는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 DR1475(dxs) 유전자는 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 구성하는 폴리뉴클레오티드는 암호화하고 있는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 염기의 결실, 삽입, 치환 또는 추가에 의해 상이한 서열을 갖는 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 공지된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
상기 발현 벡터는 원하는 숙주세포에서 본 발명에 따른 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터라면 어떤 것이든 사용할 수 있다. 상기 용어, "벡터(vector)"는 숙주세포에서 목적 펩티드를 발현시킬 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.
상기 프로모터는 groE, katE, spac, dr1124 유전자의 프로모터 및 dr2577 유전자의 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 발현 벡터에 포함된 두 종류의 유전자에 각각 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 용어, "작동가능하게 연결된"은 핵산의 발현을 조절하는 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 가능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 벡터의 제조에서 작동가능하게 연결하는 것은 통상의 기술자에 의해 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 상기 groE 프로모터는 groES 유전자(NCBI GeneBank ID: 1800077)의 상위(upstream) 부분의 299 bp를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 구체적으로 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 한편, 상기 katE 프로모터는 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 spac 프로모터는 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 dr1124 유전자의 프로모터는 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 나아가, 상기 dr2577 유전자의 프로모터는 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 발현 벡터는 선택 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 용어, "선택 마커"는 특정 유전자의 산물을 의미한다. 상기 산물을 포함하는 미생물은 이를 포함하지 않는 미생물에는 나타나지 않는 특별한 형질을 가짐으로써, 이에 의해 미생물의 구별을 가능하게 한다. 상기 선택 마커는 항생제 내성 유전자일 수 있다. 상기 항생제 내성 유전자는 카나마이신, 클로람페니콜, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자가 도입된 데이노코쿠스 속 변이 균주는 증대된 카로티노이드 생산능을 가질 수 있다.
상기 데이노코쿠스 속 균주는 데이노코쿠스 라디오두란스(D. radiodurans), 데이노코쿠스 인디쿠스(D. indicus), 데이노코쿠스 카에니(D. caeni), 데이노코쿠스 아쿠아티쿠스(D. aquaticus), 데이노코쿠스 디폴리머란스(D. depolymerans), 데이노코쿠스 그란디스(D. grandis), 데이노코쿠스 데죠네시스(D. daejeonensis) 및 데이노코쿠스 라디오톨러란스(D. radiotolerans)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나, 구체적으로는 데이노코쿠스 라디오두란스일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하고(도 1 참조), 제조된 발현 벡터를 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 도입시켜 수득된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주가 높은 카로티노이드 생산능을 가짐을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명은 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조 방법을 제공한다.
상기 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DR0862(crtB) 유전자는 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase)를 암호화하는 유전자로서, 서열번호 7로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 한편, 상기 DR1475(dxs) 유전자는 1-데옥시-D-자일룰로스-5-포스페이트 합성효소(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase)를 암호화하는 유전자로서, 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터도 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법은 상술한 바와 같은 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 데이노코쿠스 속 변이 균주에 도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 도입은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 형질전환 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 형질전환은 물리적인 방법으로서, 미세주입법, 리포좀을 이용한 방법, 직접적인 DNA 흡수 방법(directed DNA uptake), 수용체 매개 DNA 트랜스퍼 방법(receptor-mediated DNA transfer), Ca++을 이용한 DNA 운반 방법 또는 바이러스를 이용한 유전자 운반 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하고(도 1 참조), 제조된 발현 벡터를 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 도입시켜 수득된 데이노코쿠스 라디오두란스 변이 균주가 높은 카로티노이드 생산능을 가짐을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 데이노코쿠스 속 변이 균주 또는 상기 균주의 배양액을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 데이노코쿠스 속 변이 균주는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 데이노코쿠스 속 변이 균주는 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 데이노코쿠스 속 변이 균주 또는 상기 균주의 배양액은 증대된 함량의 카로티노이드를 포함할 수 있다. 상기 카로티노이드는 항산화, 항노화 및 항암 활성을 나타낼 뿐만 아니라 자외선에 대한 피부 보호 효과 및 멜라닌 생성 억제 효과 등이 보고되어 있어, 화장품, 식품, 의약품 등에 적용할 수 있다. 따라서, 증대된 카로티노이드 생산성을 갖는 본 발명에 따른 데이노코쿠스 속 변이 균주 또는 상기 배양액은 피부 개선용 화장료 조성물로 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 화장료 조성물은 항산화, 항노화, 멜라닌 생성 억제 또는 항염증 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 본 발명에 따른 데이노코쿠스 속 변이 균주 또는 상기 균주의 배양액을 0.1 내지 50 중량%, 구체적으로 1 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 피부의 개선을 목적으로 피부에 직접 도포될 수 있다.
화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 크림, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체로서 용매, 용매화제, 유탁화제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르설페이드, 알칼아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 담체 성분 이외에도, 보조제로서 항산화제, 안정화제, 용해화제, 보습제, 안료, 향료, 자외선 차단제, 발색제, 계면활성제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 물질이라면 모두 사용가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 데이노코쿠스 속 변이 균주를 배양하여, 배양액 및 균주 추출물을 수득하였다. 상기 수득된 변이 균주의 배양액 및 균주 추출물은 독성이 없으면서도(도 3 내지 6 참조), 높은 DPPH 라디칼 스캐빈저 활성을 나타내었으며(도 7 참조), 산화질소 및 멜라닌의 생성을 억제하였다(도 8 및 9 참조).
따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 데이노코쿠스 속 변이 균주가 항산화, 항염증 활성을 나타내고, 멜라닌의 생성을 억제함으로써 피부를 개선하기 위한 화장료 조성물로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 데이노코쿠스 속 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 카로티노이드 생산 방법을 제공한다.
상기 배양은 통상의 기술분야에 잘 알려진 적당한 배지 및 배양 조건에 따라 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 회분식, 연속식 또는 유가식 배양일 수 있다. 상기 카로티노이드 생산 방법은 변이 균주를 배양하여 수득된 배양물로부터 카로티노이드을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 카로티노이드의 수득은 통상의 기술자에 의해 적절히 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. dr0862(crtB) 및 dr1475(dxs) 유전자를 발현하는 벡터의 제작
데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans) ATCC13939에서 카로티노이드를 대량생산하기 위해, dr0862(crtB) 및 dr1475(dxs) 유전자를 과발현시킬 수 있는 벡터를 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
먼저, 데이노코쿠스 라디오두란스의 게놈 DNA를 주형으로 하여, SpeI 제한효소 절단위치를 포함하는 링커를 갖고 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성되는 프라이머 및 NotI 제한효소 절단위치를 포함하는 링커를 갖고 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성되는 프라이머를 이용하여 987 bp 크기의 dr0862 ( crtB ) 유전자를 증폭시켰다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
Dr0862 F aagtACTAGTatgaggtctagggccggtt 서열번호 1
DR0862 R ctatGCGGCCGCtcagccgtggaccgcgccca 서열번호 2
DR1475(speI)F ctagACTAGTgtgaacgaacttcccggcac 서열번호 3
DR1475(notI)R taacGCGGCCGCctacacctcaatcggcacgt 서열번호 4
Dr1475 F taacGCGGCCGCtcggcttggaagcacgtatt 서열번호 5
Dr1475 R gttaGGATCCctacacctcaatcggcacgt 서열번호 6
증폭된 유전자에 SpeI 및 NotI 제한 효소를 처리하고, 동일한 효소로 처리된 pRADZ3 플라스미드에 클로닝하여 pRADZ3::PgroE-dr0862로 명명된 플라스미드를 제조하였다. 동일한 방법으로 SpeI 제한효소 절단위치를 포함하는 링커를 갖는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 구성되는 프라이머 및 NotI 제한효소 절단위치를 포함하는 링커를 갖는 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 구성되는 프라이머를 이용하여 1,890 bp 크기의 dr1475 ( dxs ) 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 dr1475 ( dxs ) 유전자를 pRADZ3 플라스미드에 클로닝하여 pRADZ3::PgroE-dr1475로 명명된 플라스미드를 제조하였다(도 1A). 제조된 pRADZ3::PgroE-dr1475 플라스미드를 주형으로 NotI 제한효소 절단위치를 포함하는 링커를 갖는 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 구성되는 프라이머 및 BamHI 제한효소 절단위치를 포함하는 링커를 갖는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열로 구성되는 프라이머를 이용하여 groE 프로모터를 포함하는 dr1475(dxs) 유전자를 증폭시켰다. 수득된 PCR 산물에 NotI 및 BamHI 제한효소를 처리하고, 동일한 효소를 처리한 pRADZ3::PgroE-dr0862 플라스미드에 클로닝하여 pRADZ3::PgroE-dr0862-PgroE-dr1475로 명명된 플라스미드를 제조하였다(도 1B). 따라서, 상기로부터 데이노코쿠스 라디오두란스에 dr0862 ( crtB ) 및 dr1475 ( dxs ) 유전자를 도입하기 위한 발현 벡터를 수득하였다.
실시예 2. dr0862 ( crtB ) 및 dr1475 ( dxs ) 유전자를 과발현하는 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 제조
상기 제조된 발현 벡터를 도입하여 dr0862 ( crtB ) 및 dr1475 ( dxs ) 유전자를 과발현하는 데이노코쿠스 라디오두란스 균주를 제조하였다.
구체적으로, 데이노코쿠스 라디오두란스 균주를 OD 0.25까지 배양하고, 여기에 30 mM의 CaCl2를 첨가함으로써 형질전환 세포(competent cell)를 제조하였다. 제조된 형질전환 세포에 실시예 1에서 수득한 플라스미드를 1 ㎍ 첨가하고, 이를 얼음에서 30분 동안 정치시켰다. 이를 다시 32℃에서 1시간 30분 동안 정치시킨 뒤, 1 ㎖의 2x TGY 배지를 첨가하고 30℃에서 5시간 동안 배양하였다. 한편, 3 ㎍/㎖의 클로람페니콜이 포함된 2x TGY 고체 배지를 제조하여 준비하였다. 배양된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 배양액을 200 ㎕ 취하여 상기 준비된 2x TGY 고체 배지에 도말하였다. 균주가 도말된 고체 배지를 30℃에서 3 내지 4일 동안 배양하여 콜로니의 형성을 관찰하고, 그 결과 사진을 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, dr0862 ( crtB ) 및 dr1475 ( dxs ) 유전자가 모두 도입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주는 야생의 데이노코쿠스 라디오두란스 균주에 비해 더욱 붉은 색의 콜로니를 형성하였다(도 2).
실험예 1. dr0862 ( crtB ) 및 dr1475 ( dxs ) 유전자가 모두 도입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 세포독성 확인
1-1. 샘플의 준비
실시예 2 제조된 dr0862 ( crtB ) 및 dr1475 ( dxs ) 유전자가 모두 도입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주를 2x TGY 배양 배지(50 g/ℓ 트립톤, 50 g/ℓ 효모 추출물 및 1 g/ℓ 글루코스)에 접종하였다. 접종된 균주는 30℃ 및 150 rpm의 조건으로 3일 이상 배양하고, 배양이 끝난 배양액을 5,000 rpm의 조건으로 20분 동안 원심분리하였다. 먼저, 상등액은 0.45 ㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터로 여과하여 배양액 샘플(2x배양액) 로서 준비하였다. 한편, 펠렛은 펠렛 무게에 20배 정도 되는 부피의 70% 에탄올을 첨가하고, 60℃에서 30분 동안 음파처리하여 용해시켰다. 용해된 균주를 농축하여 에탄올을 제거하고, 무게를 측정한 뒤 증류수에 현탁하여 균체 추출물 샘플(2x균체추출물)로서 준비하였다.
1-2. 세포독성 확인
먼저, B16F10, HaCaT, HDFn(primary dermal fibroblast normal; human, neonatal, ATCC® PCS-201-010™) 및 Raw264.7 세포주는 소태아혈청(FBS) 및 1x 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 RPMI-1640에 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 2x104개가 되도록 분주하고, 이를 하룻밤 동안 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양된 세포에 0.625, 1.25, 2.5 또는 5 ㎎/㎖의 농도가 되도록 실험예 1-1에서 준비한 배양액 또는 균체 추출물 샘플을 첨가하였다. 48시간 후, 배양된 세포의 세포독성을 EZ-Cytox 키트(EZ-300, DoGen, 대한민국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. 구체적으로, 1:9의 부피비가 되도록 WST-1 시약을 세포의 배양 배지와 혼합하여 혼합액을 제조하고, 상기 혼합액을 세포에 첨가하였다. 이를 1 내지 2시간 동안 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하고, 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 값으로부터 세포 생존율은 샘플을 첨가하지 않은 대조군의 값을 기준으로 표준화하여 계산하였다.
그 결과, 도 3 내지 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 배양액 및 균체 추출물은 세포독성이 없었다(도 3 내지 6).
실험예 2. dr0862 ( crtB ) 및 dr1475 ( dxs ) 유전자가 모두 도입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 항산화 활성 확인
dr0862 ( crtB ) 및 dr1475 ( dxs ) 유전자가 모두 도입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 항산화 활성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 실험예 1-1에서 준비한 2x배양액 또는 2x균체추출물을 96-웰 플레이트에 1.25, 2.5, 5, 10 또는 20 ㎎/㎖의 농도가 되도록 넣고, 여기에 100 ㎕의 DPPH 시약을 첨가하였다. 이때, 대조군으로서는 0.1, 1 또는 5 ㎎/㎖의 아스코르브산 또는 AA2G(ascorbic acid 2-glucoside, HAYASHIBARA, 일본)를 첨가하여 사용하였다. 이를 상온에서 30분 동안 반응시킨 뒤, 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 값으로부터 DPPH 라디칼 스캐빈저 활성은 샘플을 첨가하지 않은 대조군의 값을 기준으로 표준화하여 계산하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 배양액 및 균체 추출물은 우수한 DPPH 라디칼 스캐빈저 활성을 나타내었다.
실험예 3. dr0862 ( crtB ) 및 dr1475 ( dxs ) 유전자가 모두 도입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 항염증 활성 확인
dr0862 ( crtB ) 및 dr1475 ( dxs ) 유전자가 모두 도입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 항염증 활성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, Raw264.7 세포주를 상술한 바와 같이 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 48-웰 플레이트에 웰 당 2x105개가 되도록 분주하고, 이를 하룻밤 동안 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양된 세포에 0.05, 0.5 또는 5 ㎎/㎖의 농도가 되도록 실험예 1-1에서 준비한 배양액 또는 균체 추출물 샘플을 첨가하였다. 이때, 대조군으로서는 DMSO만을 첨가한 세포를, 양성 대조군으로는 60 μM의 인도메타신(indomethacin)을 첨가한 세포를 사용하였다. 샘플이 첨가된 세포를 1시간 동안 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 더 배양한 뒤, 1 ㎍/㎖의 LPS를 첨가하고 이를 24시간 동안 더 배양하였다. 배양이 끝난 뒤, 100 ㎕의 배양액을 96-웰 플레이트에 넣고, 그리스 시약 A(griess agent A) 및 그리스 시약 B(griess agent B)를 1:1의 부피비로 혼합한 시약을 동량 첨가하였다. 이때, 그리스 시약 A는 5%(v/v, 95% 증류수)의 인산 용액에 1%(w/v)의 술파닐아미드(sulfanilamide)를 포함하고, 그리스 시약 B는 증류수에 0.1%(w/v) 나프틸에틸렌디아민(naphthylethylenediamine)을 포함한다. 그리스 시약이 포함된 샘플을 20분 동안 실온에서 반응시키고, 540 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 500 μM의 NaNO2를 이용하여 그린 표준 곡선을 사용하여, 측정된 결과로부터 생성된 산화질소의 양을 계산하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 배양액 및 균체 추출물은 우수한 산화질소 생성 억제 효과를 나타내었다(도 8).
실험예 4. dr0862 ( crtB ) 및 dr1475 ( dxs ) 유전자가 모두 도입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 멜라닌 합성 억제 효과 확인
dr0862 ( crtB ) 및 dr1475 ( dxs ) 유전자가 모두 도입된 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 멜라닌 합성 억제 효과를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, B16F10 세포주를 상술한 바와 같이 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 24-웰 플레이트에 웰 당 3x104개가 되도록 분주하고, 이를 하룻밤 동안 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양된 세포에 0.02, 0.2 또는 2 ㎎/㎖의 농도가 되도록 실험예 1-1에서 준비한 균체 추출물 샘플을 처리하거나, 0.05, 0.5 또는 5 ㎎/㎖의 농도가 되도록 실험예 1-1에서 준비한 배양액 샘플을 200 nM의 α-MSH와 함께 첨가하였다. 이때, 양성 대조군으로는 250 ㎍/㎖의 알부틴(arbutin)을 사용하였다. 샘플이 첨가된 세포를 3일 동안 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 더 배양하였다. 배양이 끝난 뒤, 100 ㎕의 배양액을 96-웰 플레이트에 넣었다. 한편, 세포를 PBS로 세척하고, 1N NaOH를 첨가하여 세포 내 존재하는 멜라닌을 수득하고, 이를 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 이를 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하고, α-MSH를 첨가하지 않은 것을 기준으로 값을 표준화하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 데이노코쿠스 라디오두란스 균주의 배양액 및 균체 추출물은 멜라닌 합성 저해능이 우수하였다(도 9).
<110> University of seoul Industry Cooperation Foundation <120> MUTANT STRAIN HAVING INCREASED CAROTINOID BIOSYNTHESIS ABILITY AND MANUFACTURING METHOD OF SAME <130> 2017P-10-021 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dr0862 F <400> 1 aagtactagt atgaggtcta gggccggtt 29 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR0862 R <400> 2 ctatgcggcc gctcagccgt ggaccgcgcc ca 32 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR1475(speI)F <400> 3 ctagactagt gtgaacgaac ttcccggcac 30 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR1475(notI)R <400> 4 taacgcggcc gcctacacct caatcggcac gt 32 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dr1475 F <400> 5 taacgcggcc gctcggcttg gaagcacgta tt 32 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dr1475 R <400> 6 gttaggatcc ctacacctca atcggcacgt 30 <210> 7 <211> 978 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans <400> 7 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<400> 10 catggagacc gagggccctt gacattgaga atgattctca atatggtgca gggagcttcg 60 ggcctcttgc cgcgcagcag agccagcgag gcgaaggaga g 101 <210> 11 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spac promoter <400> 11 agcacaagag cggaaagatg ttttgttcta catccagaac aacctctgct aaaattcctg 60 aaaaattttg caaaaagttg ttgactttat ctacaaggtg tggcataatg tgtggaattg 120 tgagcgctca caattaagct tgaattcccg ggcggccgcg gaatccacta gttctagagc 180 cgctcgatcc tgcgtaagac cggcccgatc tacgaagttc agagcacgtt ccgtttccgg 240 gggtcagctt cccagacctc cgccgaatcc gcccccactg ctgcgccgag cgcgccccag 300 gagcacatat gctcgagttc gcga 324 <210> 12 <211> 605 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr1124 gene promoter <400> 12 ggggcattcc tttgaaaacg cggcgcgcgg gcgaggtctg ggtcgtgcgc tggccggaga 60 agacgtaaag acatgtggac aatctggtct gacgttccgt acgcctctgc tgcagccggc 120 gtgaggagtg gaacgctagg cgagtgcatc ttacacatgc tactcaaggt gtgtctagcg 180 tcctgcacgc tgtgtacctg ttaaaggaaa cggtcaactg gtcaggtctc ggtgagtgtc 240 agagaaaaca ggggcctgtc gtcttgtctc cgtctggtct agaaacgctg gcgaagagcc 300 tcacattaaa atcctcatga gactagaaaa taagattgtc gtcttctatc tcatgagatg 360 gtggattggg caggctctga tgggagaaaa cgcttcacat aagaaagtct atattcatca 420 ttaaaaccac atgatgtgtt ctaactgctc ttttctgacg agccctcctc cagtgaatac 480 tcacggaaaa gacaattttc acagaatgct catggaggct gtctaccgta gtgaaaggag 540 ctgatagagg ttcagaactt ctcttgcctt tttcagccgc ttaaggagaa ccccatgcga 600 aagac 605 <210> 13 <211> 343 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dr2577 gene promoter <400> 13 taagacggac tcgctgcggc cttttcggcg tcacttaaac ggtcaaagtt gaaaatgaga 60 agaaaatctg atggtcaact gacggagaag gggcgaaaac agtttatttg acggtattta 120 gctcgctctt agggttgacc cgcccatctt catgcttgta tcatctgcac gatctgccct 180 cttctgtagc cacaggctgc gaagggtggg ttgcgcgaag aaggcggagt aaggcccaac 240 ttctcctggg agaggaaaca tggcaactcg ccccatcaac atcctgcgtg ctggaaacgc 300 tgctcgacgc gcactgagat tgggggttcc ctatgaagaa aag 343

Claims (11)

  1. DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DR0862(crtB) 유전자가 서열번호 7로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DR1475(dxs) 유전자가 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 데이노코쿠스 속 변이 균주가 증대된 카로티노이드 생산능을 갖는, 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 발현 벡터가 프로모터를 포함하는, 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  6. 제5항에 있어서, 상기 프로모터가 groE, katE, spac, dr1124 유전자의 프로모터 및 dr2577 유전자의 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프로모터인, 데이노코쿠스 속 변이 균주.
  7. DR0862(crtB) 및 DR1475(dxs) 유전자를 포함하는 발현 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 데이노코쿠스 속 변이 균주의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 데이노코쿠스 속 변이 균주가 카로티노이드 생산능을 갖는, 데이노코쿠스 속 변이 균주 균주의 제조 방법.
  9. 제1항의 데이노코쿠스 속 변이 균주 또는 상기 균주의 배양액을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 항산화, 항노화, 멜라닌 생성 억제 또는 항염증 활성을 나타내는, 화장료 조성물.
  11. 제1항의 데이노코쿠스 속 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 카로티노이드 생산 방법.
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