DE60022313T3

DE60022313T3 - Alternansucrase-kodierende nukleinsäure moleküle

Info

Publication number: DE60022313T3
Application number: DE60022313.2T
Authority: DE
Inventors: Jens Kossmann; Thomas Welsh; Martin Quanz; Karola Knuth
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Bayer CropScience AG
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Bayer CropScience AG
Priority date: 1999-02-08
Filing date: 2000-02-07
Publication date: 2014-02-27
Anticipated expiration: 2020-02-08
Also published as: AU3278700A; EP1151085B8; ES2246227T3; EP1151085B1; JP4554083B2; US7666632B2; CA2352492A1; CN1341148A; DK1151085T3; DE60022313T2; ZA200106474B; ATE303435T1; EP1151085A2; US7402420B2; US6570065B1; WO2000047727A2; US20100009413A1; AU776021B2; DK1151085T4; JP2003522520A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die eine Alternansucrase codieren. Weiterhin betrifft diese Erfindung Vektoren, Wirtszellen sowie mit den beschriebenen Nucleinsäuremolekülen transformierte Pflanzenzellen und diese Zellen enthaltende Pflanzen. Ferner werden Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen beschrieben, die aufgrund der Einführung von DNA-Molekülen, die eine Alternansucrase codieren, das Kohlenhydrat Alternan synthetisieren. Ferner werden Verfahren zur Herstellung von Alternan beschrieben.
Nachfolgend werden Dokumente aus dem Stand der Technik zitiert, deren Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten ist.
Alternan ist ein aus Glucoseeinheiten aufgebautes Polysaccharid. Die Glucoseeinheiten sind durch α-1,3 und α-1,6-glycosidische Bindungen miteinander verknüpft, wobei diese beiden Bindungstypen vorwiegend alternierend auftreten. Alternan ist jedoch kein lineares Polysaccharid, sondern kann Verzweigungen enthalten (Seymour et al., Carbohydrate Research 74, (1979), 41–62). Aufgrund seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften wurden Anwendungsmöglichkeiten für Alternan sowohl in der Pharmaindustrie, z. B. als Träger von Arzneimittelwirkstoffen, sowie als Zusatzstoff in der Textil-, Kosmetik- und Nahrungsmittelindustrie diskutiert (Lopez-Munguia et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993), 77–85; Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18, (1997), 278–283). Darüber hinaus kann man es als Ersatzstoff für Gummiarabikum einsetzen (Coté, Carbohydate Polymers 19, (1992), 249–252).
Das Interesse der Industrie an biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von Oligo- und Polysacchariden, insbesondere von Alternan, das mit klassischer organischer Synthese nur sehr schwer oder überhaupt nicht zugänglich ist, ist groß.
Gegenüber dem klassischen Weg der organischen Synthesechemie bieten biotechnologische Verfahren Vorteile. So verlaufen zum Beispiel enzymatisch katalysierte Reaktionen in der Regel mit viel höheren Spezifitäten (Regiospezifität, Stereospezifität), mit höheren Reaktionsgeschwindigkeiten, unter milderen Reaktionsbedingungen und führen zu höheren Ausbeuten. Diese Faktoren sind bei der Herstellung neuer Oligo- und Polysaccharide von herausragender Bedeutung. Die Herstellung von Alternan erfolgt enzymatisch unter Verwendung von Enzymen mit der biologischen Aktivität von Alternansucrasen. Alternansucrasen gehören zur Gruppe der Glucosyltransferasen, die ausgehend von Saccharose die Bildung von Alternan und Fructose katalysieren können. Alternansucrasen konnten bisher nur im Bakterium Streptococcus mutans (Mukasa et al., (J. Gen. Microbiol. 135 (1989), 2055–2063); Tsumori et al. (J. Gen. Microbiol. 131 (1985) 3347–3353)) und in bestimmten Stämmen des Gram-positiven Bakteriums Leuconostoc mesenteroides nachgewiesen werden, wo sie in der Regel in Verbindung mit anderen Polysaccharid bildenen Enzymen, wie z. B. Dextran bildenden Dextransucrasen, oder mit Polysaccharid abbauenden Enzymen, wie z. B. Alternanasen, vorliegen. Die natürlicherweise auftretenden Stämme produzieren daher neben Alternan auch Dextran.
Die Herstellung von Alternan erfolgte bisher im zellfreien System unter Verwendung partiell aufgereinigten Proteins oder fermentativ unter Verwendung Alternansucrase-produzierender Stämme von Leuconostoc mesenteroides.
Verschiedene Reinigungsverfahren für die Aufreinigung von Alternansucrasen sind beschrieben worden (Lopez-Munguia et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993), 77–85; Lopez-Munguia et al., Annals New York Academy of Sciences 613, (1990), 717–722; Coté und Robyt, Carbohydrate Research 101, (1982), 57–74). Es handelt sich dabei um komplexe Verfahren, die relativ kostenintensiv sind und in der Regel zu geringen Ausbeuten an Protein führen (Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18, (1997), 278–283). Durch keines dieser Verfahren ist es möglich, hochreines Alternansucraseprotein zu erzeugen, so dass eine Sequenzierung des Proteins und die Isolierung der entsprechenden DNA-Sequenzen bisher nicht erfolgreich gewesen sind. Verwendet man das nach diesen Verfahren aufgereinigte Alternansucraseprotein zur in-vitro-Herstellung von Alternan, so verursachen die in der Alternansucrasepräparation enthaltenen Reste von Dextransucraseprotein Verunreinigungen des erzeugten Alternans durch Dextran. Die Trennung von Alternan und Dextran ist relativ zeitaufwendig und kostenintensiv (Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18, (1997), 278–283). Ein weiterer Nachteil der in der Enzympräparation von Alternansucraseprotein enthaltenen Verunreinigungen mit Dexransucraseprotein ist, dass ein Teil des Substrats Saccharose in Dextran statt in Alternan umgesetzt wird, was eine Verringerung der Ausbeute an Alternan zur Folge hat.
Auch die fermentative Herstellung mittels Leuconostoc führt zur Bildung von Produktgemischen aus Alternan und Dextran. Um die Menge an Alternansucrase aus Leuconostoc-Stämmen zu erhöhen, wurden Mutanten isoliert, wie z. B. die Mutante NRRL B-21138, die Alternansucrase sekretieren und die zu einem größeren Verhältnis der Menge an gebildeter Alternansucrase zu Dextransucrase führen. Fermentiert man jedoch solche Mutanten mit Saccharose, so weist das erhaltene Alternan weiterhin Verunreinigungen mit Dextran auf (Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18, (1997), 278–283).
Wie aus dem oben diskutierten Stand der Technik ersichtlich, ist es bisher nicht gelungen, hochreines Alternansucraseprotein zur Verfügung zu stellen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die eine zeit- und kostengünstige Herstellung von Alternan ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül, das ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Alternansucrase codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) Nucleinsäuremolekülen, die mindestens die reife Form eines Proteins codieren, das die unter SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz oder die Aminosäuresequenz, die von der im Plasmid DSM 12666 enthaltenen cDNA codiert wird, umfasst;
(b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID NO: 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder die Nucleotidsequenz der im Plasmid DSM 12666 enthaltenen cDNA oder eine entsprechende Ribonucleotidsequenz umfassen;
(c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, dessen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 40% zu der unter SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist;
(d) Nucleinsäuremolekülen, von denen ein Strang mit den unter (a) oder (b) definierten Nucleinsäuremolekülen hybridisiert;
(e) Nucleinsäuremolekülen, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die ein biologisch aktives Fragment des Proteins codieren, das von einem der unter (a), (b), (c) oder (d) genannten Nucleinsäuremoleküle codiert ist; und
(f) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetisches Codes von der Sequenz der unter (a), (b), (c), (d) oder (e) genannten Nucleinsäuremoleküle abweicht.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher Nucleinsäuremoleküle, die Proteine mit der biologischen Aktivität einer Alternansucrase codieren, wobei derartige Moleküle vorzugsweise Proteine codieren, die die unter SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz umfassen.
Unter einem Enzym mit der enzymatischen oder biologischen Aktivität einer Alternansucrase (E. C. 2.4.1.140) wird ein Enzym verstanden, das die Umsetzung von Saccharose in Alternan und Fructose katalysieren kann. Diese Umsetzung kann dabei sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit externer Akzeptoren (z. B. Maltose, Isomaltose, Isomaltotriose etc.) erfolgen. In Abwesenheit externer Akzeptoren katalysieren Alternansucrasen ausgehend von Saccharose die Freisetzung von Fructose und hochmolekularem Alternan, einem aus Glucoseeinheiten aufgebauten Polysaccharid, dessen Rückgrat aus Glucoseeinheiten besteht, die vorwiegend in alternierender Weise durch α-1,3- und α-1,6-glycosidische Bindungen miteinander verknüpft sind. Bezüglich des Prozentsatzes an α-1,3- und α-1,6-verknüpften Gluscoseeinheiten sind in der Literatur verschiedene Werte angegeben. Gemäß Mukasa et al. (J. Gen. Microbiol. 135 (1989), 2055–2063), besteht Alternan aus 76 Mol-% α-1,3-verknüpfter Glucose und 24 Mol-% α-1,6-verknüpfter Glucose. Tsumori et al. (J. Gen. Microbiol. 131 (1985), 3347–3353) beschreiben Alternan als Polyglucan, das 49,1 Mol-% α-1,6-verknüpfter Glucose und 33,9 Mol-% α-1,3-verknüpfter Glucose mit 13,6 Mol-% endständiger Glucose und 3,3 Mol% α-1,3,6-verzweigter Glucose enthält. In Anwesenheit externer Akzeptoren, wie z. B. Maltose, Isomaltose, Isomaltotriose und Methyl-α-D-Glucan, kann die Alternansucrase an diesen Polysaccharidakzeptoren die Synthese von α-D-Glucanketten, in denen die Glucosereste vorwiegend alternierend α-1,6- und α-1,3-glycosidisch verbunden sind, und von Fructose katalysieren. Je nach eingesetztem Akzeptor weisen die entstehenden Produkte verschiedene Strukturen auf. Die enzymatische Aktivität einer Alternansucrase kann z. B. nachgewiesen werden, wie bei Lopez-Munguia (Annals New York Academy of Sciences 613 (1990), 717–722) oder wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschrieben.
Insbesondere betrifft die Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die die unter SEQ ID NO: 1 angegebene Nucleotidsequenz oder einen Teil davon enthalten, bevorzugt Moleküle, die die in SEQ ID NO: 1 angegebene codierende Region umfassen bzw. entsprechende Ribonucleotidsequenzen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die eine Alternansucrase codieren und von denen ein Strang mit einem der oben beschriebenen Moleküle hybridisiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, die ein Protein codieren, das eine Homologie, d. h. Identität, von mindestens 40%, vorzugsweise von mindestens 60%, bevorzugt von mindestens 70%, besonders bevorzugt von mindestents 80% und insbesondere von mindestens 90% zu der gesamten unter SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist, wobei das Protein die biologische Aktivität einer Alternansucrase besitzt.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nucleinsäuremoleküle, die eine Alternansucrase codieren und deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von den Nucleotidsequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle abweicht.
Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, die eine Sequenz aufweisen, die zu der gesamten oder einem Teil einer der obengenannten Sequenzen komplementär ist.
Die unter SEQ ID NO: 1 angegebene Nucleinsäuresequenz codiert beispielsweise eine extrazelluläre Alternansucrase. Die Sekretion wird gewährleistet durch eine Signalsequenz, die die ersten ca. 39 N-terminalen Aminosäurereste der SEQ ID NO: 2 umfasst. Unter bestimmten Umständen ist es wünschenswert, dass lediglich das reife Protein ohne natürlicherweise vorkommende Signalsequenzen und/oder mit anderen Signalsequenzen exprimiert wird. Daher codieren die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle mindestens die reife Form eines Proteins mit der biologischen Aktivität einer Alternansucrase.

Der Begriff ”Hybridisierung” bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben sind. Besonders bevorzugt bedeutet ”Hybridisierung”, dass eine Hybridisierung unter den folgenden Bedingungen auftritt:

Hybridisierungspuffer:	2 × SSC; 10 × Denhardt-Lösung (Fikoll 400 + PEG + BSA; Verhältnis 1:1:1); 0,1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na₂HPO₄; 250 μg/ml Heringssperma-DNA; 50 μg/ml tRNA; oder 0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2; 1 mM EDTA 7% SDS
Hybridisierungstemperatur T =	60°C
Waschpuffer:	2 × SSC; 0,1% SDS
Waschtemperatur T =	60°C.

Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, können prinzipiell Alternansucrasen aus jedem beliebigen Organismus codieren, der derartige Proteine exprimiert.
Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können z. B. aus genomischen Bibliotheken von Mikroorganismen isoliert werden. Alternativ können sie durch gentechnische Verfahren oder durch chemische Synthese hergestellt sein.
Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Moleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Als Hybridisierungssonden können z. B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im Wesentlichen die unter SEQ ID NO: 1 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile dieser Sequenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungssonden verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt werden und deren Sequenz im Wesentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt.
Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, die eine Alternansucrase codieren. Unter Fragmenten werden dabei Teile der Nucleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um eines der beschriebenen Proteine zu codieren und bevorzugterweise die biologische Aktivität einer Alternansucrase zeigen. Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können dabei durch Deletion, Substitution, Insertion und/oder Rekombination entstanden sein.
Vorzugsweise wird der Grad an Homologie bestimmt, indem man entsprechende Sequenzen mit der Nucleotidsequenz der codierenden Region von SEQ ID NO: 1 vergleicht. Wenn die verglichenen Sequenzen nicht dieselbe Länge aufweisen, bezieht sich der Grad an Homologie vorzugsweise auf den Prozentsatz von Nucleotidresten in der kürzeren Sequenz, die identisch sind mit den Nucleotidresten in der längeren Sequenz. Der Grad an Homologie kann konventionell besimmt werden, indem man bekannte Computerprogramme wie zum Beispiel das ClustalW Programm (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673–4680), vertrieben von Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) und Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE) beim European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Deutschland) verwendet. ClustalW kann auch von verschiedenen Websites heruntergeladen werden, einschließlich IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, B. P. 163, 67404 Illkirch Cedex, Frankreich; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) und EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) und allen Sites, die dem EBI entsprechen (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK). Bei der Verwendung der Version 1.8 des ClustalW Programms zur Bestimmung, ob eine bestimmte Sequenz zum Beispiel zu 90% identisch ist zu einer Referenzsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, werden die folgenden Bedingungen für die DNA-Sequenzalignments geschaffen: KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: nicht berücksichtigt.
Für das Proteinsequenzalignment unter Verwendung des ClustalW Programms, Version 1.8 sind die Bedinungen wie folgt: KTUPLE=1, TOPDIAG=5, WINDOW=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0,05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP.
Außerdem bedeutet Homologie vorzugsweise, dass das codierte Protein eine Sequenzidentität von mindestens 40%, mehr bevorzugt von mindestens 60%, noch mehr bevorzugt von mindestens 80%, im Besonderen von mindestens 90% und besonders bevorzugt von mindestens 95% zu der Aminosäuresequenz zeigt, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt.
Homologie bedeutet ferner, dass eine funktionelle und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremolekülen oder den durch sie codierten Proteinen besteht. Bei den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschriebenen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Mikroorganismen, oder um Mutationen, wobei sich diese Mutationen auf natürliche Weise gebildet haben können oder durch gezielte Mutagenese gebildet wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff ”Derivat” ein Nucleinsäuremolekül, das ein Protein codiert, das mindestens ein, mehr bevorzugt mindestens drei und noch mehr bevorzugt mindestens fünf, insbesondere mindestens zehn und besonders bevorzugt mindestens 20 der Peptidmotive umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus

a) MKQQE (SEQ ID NO: 22),
b) KKVPV (SEQ ID NO: 23),
c) KDDEN (SEQ ID NO: 24)
d) IDGNL (SEQ ID NO: 25)
e) YVADS (SEQ ID NO: 26)
f) HLRKN (SEQ ID NO: 27)
g) NENTP (SEQ ID NO: 28)
h) NVDGY (SEQ ID NO: 29)
l) NPDLK (SEQ ID NO: 30)
j) SNDSG (SEQ ID NO: 31)
k) NTFVK (SEQ ID NO: 32)
l) ISGYL (SEQ ID NO: 33)
m) SNAAL (SEQ ID NO: 34)
n) RQYTD (SEQ ID NO: 35)
o) QLYRA (SEQ ID NO: 36)
p) DDKAP (SEQ ID NO: 37)
q) TRQYT (SEQ ID NO: 38)
r) ITFAG (SEQ ID NO: 39)
s) NQYKG (SEQ ID NO: 40)
t) LFLNA (SEQ ID NO: 41)
u) QVSDT (SEQ ID NO: 42)
v) LITLN (SEQ ID NO: 43)
w) GRYVH (SEQ ID NO: 44)
x) TAPYG (SEQ ID NO: 45)
y) VVDYQ (SEQ ID NO: 46)
z) LSGQE (SEQ ID NO: 47).

Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf. Dazu gehören z. B. Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation, etc. sowie physikalische Eigenschaften, wie z. B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität; pH-Optimum, Temperatur-Optimum etc.
Die Alternansucrase (E. C. 2.4.1.140) ist ein Enzym, das zur Gruppe der Glucosyltransferasen gehört. Alternansucraseaktivität konnte bisher nicht in Pflanzen, sondern nur in dem Bakterium Streptococcus mutans (Mukasa et al. (J. Gen. Microbiol. 135 (1989), 2055–2063); Tsumori et al. (J. Gen. Microbiol. 131 (1985), 3347–3353)) und für bestimmte Stämme des Bakteriums Leuconostoc mesenteroides, wie z. B. NRRL B-1355, NRRL B-1498 und NRRL B-1501, nachgewiesen werden. Diese Stämme enthalten in der Regel verschiedene Glucosyltransferasen und sekretieren, wenn man sie auf saccharosehaltigen Medien wachsen lässt, neben Alternansucrasen auch Dextransucrasen. Diese beiden Sucrasen weisen in der Regel eine hohe Bindungsaffinität zu den von ihnen synthetisierten Polysacchariden auf (Lopez-Munguia et al., Annals New York Academy of Sciences 613, (1990), 717–722), mit dem Ergebnis, dass bei einer Aufreinigung der Enzyme aus auf saccharosehaltigem Medium gewachsenen Stämmen von Leuconostoc mesenteroides diese Polysaccharide vom Protein getrennt werden müssen (Lopez-Munguia et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993), 77–85; Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18, (1997), 278–283).
In Abwesenheit externer Akzeptoren katalysieren Alternansucrasen, ausgehend von Saccharose, die Freisetzung von Fructose und hochmolekularem Alternan, einem aus Glucoseeinheiten aufgebauten Polysaccharid, wobei das Rückgrat aus Glucoseeinheiten besteht, die vorwiegend in alternierender Weise durch α-1,3- und α-1,6-glycosidische Bindungen miteinander verknüpft sind, und das nach Daten von Lichtstreuungsmessungen ein Molekulargewicht von > 10⁷ aufweisen soll (Coté, Carbohydrate Polymer 19, (1992), 249–252). Bisher gab es keinen Bericht über Alternan, das einen endständigen Fructoserest besitzt. Nichtsdestotrotz kann die Existenz einer endständigen Fructoseeinheit bei Alternan nicht ausgeschlossen werden. Lopez-Munguia et al. (Enzyme Microb. Technol. 15, (1993), 77–85) beschreiben, dass Alternan resistent gegenüber dem Abbau durch Dextranasen ist. Es lässt sich jedoch durch sogenannte Alternanasen abbauen, wodurch ringförmige Oligomere von Alternan unterschiedlichen Polymerisationsgrades erzeugt werden können (Biely et al., Eur. J. Biochem. 226, (1994), 633–639). Durch Behandlung von hochmolekularem Alternan mit Ultraschall kann das Molekulargewicht des Alternans auf < 10⁶ erniedrigt werden (Coté, Carbohydate Polymers 19, (1992), 249–252). Stellt man von diesem mit Ultraschall behandelten Alternan wässrige Lösungen her, so zeigen diese Lösungen rheologische Eigenschaften, die mit wässrigen Lösungen von Gummiarabikum vergleichbar sind. Sogenanntes ”Limit Alternan” mit einem Molekulargewicht von ca. 3500 kann durch enzymatischen Abbau durch eine Isomaltodextranase aus Arthrobacter globiformis (NRRL B-4425) erzeugt werden (Coté, Carbohydrate Polymers 19, (1992), 249–252).
In Anwesenheit externer Akzeptoren, wie z. B. Maltose, Isomaltose, Isomaltotriose und Methyl-α-D-Glucan, katalysiert die Alternansucrase an diesen Saccharidakzeptoren die Synthese von α-D-Glucanketten, in denen die Glucosereste vorwiegend alternierend α-1,6- und α-1,3-glycosidisch verbunden sind, und von Fructose. Je nach eingesetztem Akzeptor weisen die entstehenden Produkte verschiedene Strukturen und ein im Vergleich zu hochmolekularem Alternan veringertes Molekulargewicht und einen Polymerisationsgrad von < 15 auf. Wegen des Polymerisationsgrades werden diese Produkte oft auch als Oligoalternane bezeichnet (Pelenc et al., Sciences Des Aliments 11, (1991), 465–476). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sollen jedoch auch diese niedermolekularen Produkte, die in Gegenwart von externen Akzeptoren hergestellt werden können, als Alternan bezeichnet werden.
Bei der Herstellung von Oligoalternanen mit Hilfe von partiell aufgereinigtem Alternansucraseprotein ist Maltose ein Akzeptor (Lopez-Munguia et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993), 77–85), der zu hohen Ausbeuten an Oligoalternan führt. Panose (Polymerisationsgrad (d. p) von 3) ist das erste Akzeptorprodukt, das ausgehend von Maltose durch die Bildung einer α-1,6-glycosidischen Bindung gebildet wird.
Im Gegensatz hierzu ist Isomaltose ein weniger effektiver Akzeptor, der zu geringeren Ausbeuten an Oligoalternan führt (Lopez-Munguia et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993), 77–85).
Die Alternansucrase ist relativ stabil und weist bei 40°C in 50 mM Acetatpuffer, pH 5.4, eine Halbwertszeit von 2 Tagen auf (Lopez-Munguia et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993), 77–85). Maximale Aktivität zeigt das Enzym bei einer Temperatur von 40°C und bei einem pH-Wert von 5.6 (Lopez-Munguia et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993), 77–85).
In der Abwesenheit des Substrats Saccharose katalysiert die Alternansucrase Disproportionierungsreaktionen, die zu einem (teilweisen) Umbau von Alternan führen. Insbesondere bei Verwendung partiell aufgereinigter Alternansucrasepräparationen, die Kontaminationen mit Dextransucrase enthalten, zur Herstellung von Oligoalternanen konnten hohe Disproportionierungsraten beobachtet werden, die zu einem kompletten Umbau von Oligoalternan führten (Lopez-Munguia et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993), 77–85).
Für die Größe des Molekulargewichts der Alternansucrase nach SDS-PAGE-Bestimmung sind unterschiedliche Zahlenangaben von 135 kDa, 145 kDa, 173 kDa bzw. 196 kDa zu finden (Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18, (1997), 278–283; Kim & Robyt, Enzyme Microb. Technol. 16, (1994) 659–664; Zhanley & Smith, Applied and Environmental Microbiology 61 (3), (1995), 1120–1123.)
Die enzymatische Aktivität einer Alternansucrase kann z. B. nachgewiesen werden, wie bei Lopez-Munguia et al. (Annals New York Academy of Sciences 613, (1990), 717–722) oder wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschrieben. Eine Aktivitätseinheit (1 u) kann dabei definiert werden als die Enzymmenge, die innerhalb von einer Minute zu einer Freisetzung von 1 μmol Fructose führt.
Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen kann es sich um DNA-Moleküle handeln, insbesondere um genomische Moleküle. Ferner können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle RNA-Moleküle sein. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können z. B. aus natürlichen Quellen gewonnen sein, oder synthetisch oder durch rekombinante Techniken hergestellt sein.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ist es nun möglich, Wirtszellen herzustellen, die rekombinantes Alternansucraseprotein von hoher Reinheit und/oder in ausreichenden Mengen produzieren, sowie gentechnisch veränderte Pflanzen herzustellen, die eine Aktivität dieser Enzyme aufweisen, wodurch es in planta zur Bildung von Alternan kommt. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff ”hohe Reinheit”, dass das Protein gemäß der Erfindung einen Reinheitsgrad von mindestens 80%, vorzugsweise von mindestens 90% und noch mehr bevorzugt von mindestens 95% hat. Darüber hinaus werden Mittel und Verfahren bereitgestellt, die zur Herstellung von Alternan unter Verwendung von Wirtszellen und/oder zur Herstellung von rekombinantem Alternansucraseprotein genutzt werden können. Somit wird durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle die Herstellung von Alternan von hoher Reinheit mit Hilfe von relativ zeit- und kostengünstigen Verfahren möglich.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die erfindungsmäßen Nucleinsäuremoleküle aus Mikroorganismen, bevorzugt aus Bakterien, stärker bevorzugt aus Gram-positiven Bakterien und besonders bevorzugt aus Bakterien der Gattung Leuconostoc. Insbesondere bevorzugt sind Nucleinsäuremoleküle aus Bakterien der Spezies Leuconostoc mesenteroides.
Gegenstand der Erfindung sind auch Oligonucleotide, die spezifisch mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül hybridisieren. Derartige Oligonucleotide haben vorzugsweise eine Länge von mindestens 10, insbesondere von mindestens 15 und besonders bevorzugt von mindestens 50 Nucleotiden. Sie sind dadurch gekennzeichnet, dass sie spezifisch mit erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, d. h. nicht oder nur in sehr geringem Ausmaß mit Nucleinsäuresequenzen, die andere Proteine, insbesondere andere Glucosyltransferasen, codieren. Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können beispielsweise als Primer für Amplifikationstechniken wie PCR-Reaktion verwendet werden oder als Hybridisierungssonde für die Isolierung verwandter Gene.
Ferner betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Vektoren zur Transformation von pilzlichen Zellen oder von Zellen von Mikroorganismen geeignet. Vorzugsweise sind derartige Vektoren zur Transformation pflanzlicher Zellen geeignet. Besonders bevorzugt erlauben diese Vektoren die Integration der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, gegebenenfalls zusammen mit flankierenden regulatorischen Regionen, in das Genom der Pflanzenzelle. Beispiele hierfür sind binäre Vektoren, die bei dem Agrobakterium-vermittelten Gentransfer eingesetzt werden können und die zum Teil bereits kommerziell erhältlich sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nucleinsäuremoleküle mit regulatorischen Elementen verknüpft, die die Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.
Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in prokaryontischen oder eukaryotischen Zellen, beispielsweise in Escherichia coli, ist insofern interessant, da dadurch eine genauere Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten der Enzyme, die vom diesen Molekülen codiert werden, ermöglicht wird. Darüberhinaus ist es möglich, diese Enzyme in solchen prokaryontischen oder eukaryotischen Zellen zu exprimieren, die frei von störenden Enzymen sind, wie z. B. Dextransucrasen oder andere Polysaccharide bildende oder abbauende Enzymen. Darüberhinaus ist es möglich, mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) verschiedenartige Mutationen in die Nucleinsäuremoleküle einzuführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletionen vom 5'- oder vom 3'-Ende der codierenden DNA-Sequenz Nucleinsäuremoleküle erzeugt werden, die zur Synthese entsprechend verkürzter Proteine führen. Durch derartige Deletionen am 5'-Ende der Nucleotidsequenz ist es beispielsweise möglich, Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die für die Sekretion des Enzyms in Mikroorganismen verantwortlich sind (Transitpeptide).
Dies erlaubt es, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Entfernen der entsprechenden Sequenzen nicht mehr sekretiert werden, sondern innerhalb der Zelle des betreffenden Wirtsorganismus verbleiben oder aufgrund der Addition von anderen Signalsequenzen in anderen Kompartimenten, wie z. B. den Plastiden, den Mitochondrien, der Vakuole, lokalisiert sind.
Andererseits ist auch die Einführung von Punktmutationen an Positionen denkbar, bei denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluss beispielweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z. B. Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Stereo- und Regioselektivität oder einen veränderten K_m-Wert besitzen oder nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorliegenden Regulationsmechanismen, die über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung wirken, unterliegen. Des Weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen. Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-Temperatur-Profil aufweisen.
Durch das Einführen von Mutationen in die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ist es darüber hinaus möglich bei Expression in Pflanzen die Genexpressionsrate und/oder die Aktivität der durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine zu erhöhen.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben.
Mit Hilfe von Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung stellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, ”Primerreparatur”, Restriktion oder Ligierung verwendet werden. Als Analysemethode werden im Allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemischmolekularbiologische Verfahren durchgeführt.
Ferner betrifft die Erfindung das Plasmid pAlsu-pSK (siehe und Beispiel 2), das bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig unter der Hinterlegungs-Nummer DSM 12666 am 4. Februar 1999 hinterlegt wurde, sowie die in der Insertion des Plasmids DSM 12666 enthaltenen Nucleinsäuremoleküle, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Alternansucrase codieren. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch Nucleinsäuremoleküle, die mit der Insertion des Plasmids DSM 12666 hybridisieren. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung auch Nucleinsäuremoleküle, deren Nucleotidsequenz im Vergleich zu den Nucleinsäuremolekülen der Insertion des Plasmids DSM 12666 aufgrund der Degeneration des genetischen Codes abweicht. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle mit einer Homologie, d. h. eine Sequenzidentiät von mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 60%, mehr bevorzugt von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von mindestens 90% und am meisten bevorzugt von mindestens 95% zur Insertionssequenz des Plasmids DSM 12666.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische Zellen, die mit einem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind, sowie Zellen, die von derart transformierten Zellen abstammen und ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Wirtszellen Zellen von Mikroorganismen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff ”Mikroorganismus” Bakterien und alle Protisten (z. B. Pilze, insbesondere Hefen, Algen), wie in Schlegel ”Allgemeine Mikrobiologie” (Georg Thieme Verlag, 1985, 1–2) definiert. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Zellen von Algen und Wirtszellen der Gattungen Aspergillus, Bacillus, Saccharomyces oder Pichia (Rodriguez, Journal of Biotechnology 33 (1994), 135–146, Romanos, Vaccine, Bd. 9 (1991), 901ff). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung E. coli-Zellen. Besonders bevorzugt wird die Alternansucrase von der Wirtszelle sekretiert. Die Herstellung derartiger Wirtszellen zur Produktion einer rekombinanten Alternansucrase kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die erfindungsgemäßen Wirtszellen keine störenden Enzymaktivitäten, wie z. B. von Polysaccharid bildenden und/oder abbauenden Enzymen auf. Eine Übersicht über verschiedene Expressionssysteme findet man z. B. in Methods in Enzymology 153 (1987), 385–516, in Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516–544), sowie bei Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1–9), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500–4), Hockney (Trends in Biotechnology 12, (1994), 456–463), Griffiths et al., Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427–440). Eine Übersicht über Hefe-Expressionssysteme ist beispielsweise zu finden bei Hensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261–279), Bussineau et al. (Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13–19), Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79–93), Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486–496), Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742–745) und Buckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1067–1072).
Expressionsvektoren sind in großem Umfang in der Literatur beschrieben. Sie enthalten neben einem Selektionsmarkergen und einem die Replikation in dem gewählten Wirt sicherstellenden Replikationsursprung in der Regel auch einen bakteriellen oder viralen Promotor sowie meist ein Terminationssignal für die Transkription. Zwischen Promotor und Terminationssignal befindet sich mindestens eine Restriktionsschnittstelle oder ein Polylinker, die/der die Insertion einer codierenden DNA-Sequenz ermöglicht. Als Promotorsequenz kann, sofern sie in dem gewählten Wirtsorganismus aktiv ist, die natürlicherweise die Transkription des entsprechenden Gens steuernde DNA-Sequenz verwendet werden. Diese Sequenz kann aber auch gegen andere Promotorsequenzen ausgetauscht werden. Es können sowohl Promotoren verwendet werden, die eine konstitutive Expression des Gens bewirken, als auch induzierbare Promotoren, die eine gezielte Regulation der Expression des nachgeschalteten Gens erlauben. Bakterielle und virale Promotorsequenzen mit diesen Eigenschaften sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Regulatorische Sequenzen zur Expression in Mikroorganismen (z. B. E. coli, S. cerevisiae) sind ausreichend in der Literatur beschrieben. Promotoren, die eine besonders starke Expression des nachgeschalteten Gens erlauben, sind z. B. der T7-Promotor (Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60–89), lacUV5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., in Rodriguez and Chamberlin (Hrsg.), Promotors, Structure and Function; Praeger, New York, (1982), 462–481; DeBoer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21–25), Ip1, rac (Boros et al., Gene 42 (1986), 97–100). In der Regel erreichen die Proteinmengen von der Mitte bis gegen Ende der logarithmischen Phase des Wachstumszyklus der Mikroorganismen ihren Höhepunkt. Zur Synthese von Proteinen werden daher bevorzugt induzierbare Promotoren verwendet. Diese Promotoren führen oft zu höheren Ausbeuten an Protein als konstitutive Promotoren. Die Verwendung stark konstitutiver Promotoren führt über die ständige Transkription und Translation eines clonierten Gens oft dazu, dass Energie für andere wesentliche Zellfunktionen verloren geht und dadurch das Zellwachstum verlangsamt wird (Bernard R. Glick/Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie (1995), Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, Oxford, S. 342). Um ein Optimum an Proteinmenge zu erreichen, wird daher oft ein zweistufiges Verfahren angewendet. Zuerst werden die Wirtszellen unter optimalen Bedingungen bis zu einer relativ hohen Zelldichte kultiviert. Im zweiten Schritt wird dann die Transkription je nach Art des eingesetzten Promotors induziert. Besonders geeignet ist in diesem Zusammenhang ein durch Lactose- oder IPTG (= Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induzierbarer tac-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21–25). Terminationssignale für die Transkription sind ebenfalls in der Literatur beschrieben.
Die Transformation der Wirtszelle mit der eine Alternansucrase codierenden DNA kann in der Regel nach Standardverfahren durchgeführt werden, wie z. B. beschrieben in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Course Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Press, New York; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). Die Kultivierung der Wirtszelle erfolgt in Nährmedien, die den Bedürfnissen der jeweils verwendeten, besonderen Wirtszelle entsprechen, insbesondere unter Berücksichtigung von pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration, Belüftung, Antibiotika, Vitaminen, Spurenelementen usw.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Verfahren zur Herstellung von Proteinen und biologisch aktiven Fragmenten davon, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, wobei eine erfindungsgemäße Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die die Synthese des Proteins erlauben, und anschließend das Protein aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.
Die mit diesem Verfahren hergestellte Alternansucrase ist ein rekombinant hergestelltes Protein. Darunter wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Protein verstanden, das dadurch hergestellt wurde, dass eine das Protein codierende DNA-Sequenz in eine Wirtszelle eingebracht und dort zur Expression gebracht wird. Das Protein kann dann anschließend aus der Wirtszelle und/oder aus dem Kulturmedium gewonnen werden.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ist es nun möglich, Wirtszellen herzustellen, die rekombinantes Alternansucraseprotein von hoher Reinheit und/oder in ausreichenden Mengen produzieren. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff ”hohe Reinheit”, dass das Protein gemäß der Erfindung einen Reinheitsgrad von mindestens 80%, vorzugsweise von mindestens 90% und noch mehr bevorzugt von mindestens 95% hat. Die bereits oben erwähnten zeitaufwendigen- und kostenintensiven Verfahren, wobei das Alternansucraseprotein, das bisher ausschließlich aus bestimmten Leuconostoc-Stämmen gewonnen werden kann, von anderen Bestandteilen, wie z. B. Dextransucrasen, Polysacchariden gereinigt werden kann, entfallen, weil die Alternansucrase in solchen Wirtszellen produziert werden kann, die keine störenden Polysaccharid synthetisierenden Aktivitäten aufweisen. Darüber hinaus können auch solche Wirtszellen und Vektoren verwendet werden, die eine Produktion des Alternansucraseproteins in Abwesenheit von Saccharose erlauben, so dass eine zusätzliche Trennung des Alternansucraseproteins von Polysacchariden nicht mehr erforderlich ist. Durch die Wahl geeigneter Wirtszellen und Vektoren ist es ferner möglich, Alternansucraseprotein in ausreichenden Mengen zur Verfügung zu stellen, was mit Hilfe der bisher beschriebenen Systeme nicht möglich gewesen ist. Die Reinigung der von den Wirtszellen produzierten Alternansucrase kann nach herkömmlichen Reinigungsverfahren, wie Fällung, Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Gelfiltration, HPLC-Umkehrphasenchromatographie, usw., erfolgen.
Durch Modifikation der in den Wirtszellen exprimierten, eine Alternansucrase codierenden erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle lässt sich in der Wirtszelle ein Polypeptid herstellen, das aufgrund bestimmter Eigenschaften leichter aus dem Kulturmedium isoliert werden kann. So besteht die Möglichkeit, das zu exprimierende Protein als Fusionsprotein mit einer weiteren Polypeptidsequenz zu exprimieren, deren spezifische Bindungseigenschaften die Isolierung des Fusionsproteins über Affinitätschromatographie ermöglichen (z. B. Hopp et al., Bio/Technology 6 (1988), 1204–1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88–93).
Beschrieben sind Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Alternansucrase, insbesondere solche aus Mikroorganismen, vorzugsweise aus Gram-positiven Mikroorganismen, speziell aus Mikroorganismen der Gattung Leuconostoc und besonders bevorzugt aus Leuconostoc mesenteroides. Das berechnete Molekulargewicht des in SEQ ID No. 2 angegebenen Proteins beträgt 228.96 kDa. Die Alternansucrasen, die von einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül codiert werden, besitzen ein Molekulargewicht von 229 kDa ± 120 kDa, vorzugsweise von 229 kDa ± 50 kDa und besonders bevorzugt von 230 kDa ± 25 kDa. Das berechnete Molekulargewicht des reifen Proteins beträgt 224.77 KDa.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ist es zum ersten Mal möglich, mit Hilfe gentechnischer Verfahren Alternansucrase-exprimierende Pflanzenzellen zu erzeugen, was bisher nicht möglich war, weil auf klassisch züchterischem Wege bakterielle und pilzliche Gene in Pflanzen nicht zur Expression gebracht werden können.
Die Erfindung betrifft daher auch transgene Pflanzenzellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert wurden oder die von solchen Zellen abstammen, wobei das Nucleinsäuremolekül, das das Protein mit der biologischen Aktivität einer Alternansucrase codiert, unter der Kontrolle regulatorischer Elemente steht, die die Transkription einer translatierbaren mRNA in pflanzlichen Zellen erlauben.
Durch das Einbringen der Aktivität der beschriebenen Proteine, beispielsweise durch Expression entsprechender Nucleinsäuremoleküle, besteht die Möglichkeit der Produktion von Alternan in entsprechend gentechnisch veränderten Pflanzenzellen. Möglich ist somit die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in pflanzlichen Zellen, wodurch eine zusätzliche, im Wildtyp nicht vorhandene Aktivität der entsprechenden Alternansucrase eingebracht werden kann. Ferner ist es möglich, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle nach dem Fachmann bekannten Verfahren zu modifizieren, um Alternansucrasen zu erhalten, die beispielsweise veränderte Temperaturabhängigkeiten oder Substrat- bzw. Produktspezifitäten aufweisen. Solche Verfahren wurden bereits oben in anderem Zusammenhang näher beschrieben.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobakterium tumefaciens oder Agrobakterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung der DNA mittels des biolistischen Ansatzes sowie weitere Möglichkeiten.
Die Verwendung der Agrobakterium-vermittelten Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516 ; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Kapitel V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4 (1993), 1–46 und An et al. EMBO J. 4, (1985), 277–287 beschrieben worden. Für die Transformation von Kartoffel, siehe z. B. Rocha-Sosa et al. (EMBO J. 8, (1989), 29–33).
Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agrobakterium basierender Vektoren wurde beschrieben (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491–506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271–282; Deng et al, Science in China 33, (1990), 28–34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11, (1992), 76–80; May et al., Bio/Technology 13, (1995), 486–492; Conner und Dormisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550–555; Ritchie et al., Transgenic Res. 2, (1993), 252–265). Ein alternatives System zur Transformation von monokotylen Pflanzen ist die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37–48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553–1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317–325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625–631), die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wurde in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128 , EP 0513849 , EP 0465875 , EP 292435 ; Fromm et al., Biotechnology 8, (1990), 833–844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, (1990), 603–618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194–200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721–726).
Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, z. B. für Gerste (Wan und Lemaux, s. o.; Ritala et al., s. o.; Krens et al., Nature 296, (1982), 72–74) und für Weizen (Nehra et al., Plant J. 5, (1994), 285–297). Generell kommt für die Expression der Nucleinsäuremoleküle in Pflanzenzellen jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Der Promotor kann dabei so gewählt sein, dass die Expression in den erfindungsgemäßen Pflanzen konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse bestimmten Zeitpunkt. In Bezug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein.
Sinnvolle Promotoren sind z. B. der Promotor der 35S-RNA des Blumenkohlmosaik-Virus (siehe beispielsweise US-A-5,352,605 ) und der Ubiquitin-Promotor (siehe beispielsweise US-A-5,614,399 ) für eine konstitutive Expression, der Patatingen-Promotor 633 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23–29) für eine knollenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z. B. der ST-LS1-Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943–7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445–2451), der Ca/b-Promotor (s. beispielsweise US-A-5,656,496 , US-A-5,639,952 , Bansal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, (1992), 3654–3658) und der Rubisco SSU-Promotor (s. beispielsweise US-A-5,034,322 ; US-A-4,962,028 ) oder für eine Endosperm-spezifische Expression der Glutelin-Promotor aus Weizen (HMW-Promotor) (Anderson, Theoretical and Applied Genetics 96, (1998), 568–576, Thomas, Plant Cell 2 (12), (1990), 1171–1180), der Glutelinpromotor aus Reis (Takaiwa, Plant Mol. Biol. 30 (6) (1996), 1207–1221, Yoshihara, FEBS Lett. 383 (1996), 213–218, Yoshihara, Plant and Cell Physiology 37 (1996), 107–111), der Shrunkenpromotor aus Mais (Maas, EMBO J. 8 (11) (1990), 3447–3452, Werr, Mol. Gen. Genet. 202 (3) (1986), 471–475, Werr, Mol. Gen. Genet. 212 (2) (1988), 342–350), der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor (Sengupta-Gopalan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 3320–3324, Bustos, Plant Cell 1 (9) (1989), 839–853) oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais (Pedersen et al., Cell 29, (1982), 1015–1026; Quatroccio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81–93). Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse bestimmten Zeitpunkt aktiviert werden (siehe beispielsweise WO 93/07279 ). Von besonderem Interesse können hierbei Promotoren von Hitzeschock-Proteinen sein, die eine einfache Induktion erlauben. Ferner können samenspezifische Promotoren verwendet werden, wie z. B. der USP-Promoter aus Vicia faba, der eine samenspezifische Expression in Vicia faba und anderen Pflanzen gewährleistet (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 669–679; Bäumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225, (1991), 459–467). Ferner können auch fruchtspezifische Promotoren eingesetzt werden, wie z. B. in WO 91/01373 beschrieben.
Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript dient, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. z. B. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23–29) und sind beliebig austauschbar. Derartige Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen unter anderem dadurch unterscheiden, dass sie ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt. Ferner lassen sich derartige erfindungsgemäße transgene Pflanzenzellen von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, dass sie mindestens eine Kopie des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls stabil in ihr Genom integriert enthalten.
Weiterhin lassen sich die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen vorzugsweise durch mindestens eines der folgenden Merkmale unterscheiden: ist das eingeführte erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül heterolog in Bezug auf die Pflanzenzelle, so weisen die transgenen Pflanzenzellen Transkripte der eingeführten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle auf. Diese lassen sich z. B. durch Northern-Blot-Analyse nachweisen. Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen ein Protein, das durch ein eingeführtes erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül codiert wird. Dies kann z. B. durch immunologische Verfahren, insbesondere durch eine Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden.
Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden.
Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ferner sind Pflanzen Gegenstand der Erfindung, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten.
Bei den meisten Pflanzen werden die im Verlaufe der Photosynthese innerhalb einer Pflanze in Form von Zuckern gebildeten Photoassimilate, und zwar vorwiegend in der Form der Saccharose, zu den jeweiligen Zielorganen transportiert. Da das Substrat für die Polymerisationsreaktion der Alternansucrase Saccharose ist, können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls im Prinzip alle Pflanzen, sowohl monokotyle als auch dikotyle, im Hinblick auf die Alternansucrase-Expression verändert werden.
Die Expression in Pflanzen der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Alternansucrase codieren, kann beispielsweise verwendet werden, um eine Viskositätsänderung von gegebenenfalls aus den Pflanzen gewonnenen Extrakten zu erreichen, wobei die Änderung durch die Synthese von Alternan erreicht wird. In diesem Zusammenhang ist beispielsweise die Tomate von Interesse. Durch Expression einer Alternansucrase in der Tomatenfrucht kommt es zur Synthese von Alternan und zu einer Änderung der Viskosität von Extrakten, die aus diesen Früchten gewonnen werden, z. B. zur Herstellung von Tomatenmark oder Tomatenketchup.
Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ist insbesondere in solchen Organen der Pflanze von Vorteil, die einen höheren Gehalt an Saccharose aufweisen oder Saccharose speichern. Solche Organe sind z. B. die Rübe der Zuckerrübe oder der Stamm des Zuckerrohrs. Da diese Pflanzen normalerweise keine nennenswerten Mengen an Stärke speichern, ließen sich aus diesen Pflanzen die durch die Alternansucrase synthetisierten Alternane in reiner Form isolieren. Der Ort der Biosynthese der Saccharose in pflanzlichen Zellen ist das Cytosol. Der Ort der Speicherung hingegen ist die Vakuole. Beim Transport in das Speichergewebe der Zuckerrübe bzw. der Kartoffel oder beim Transport in das Endosperm von Samen muss die Saccharose den Apoplasten durchqueren. Für die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle zur Synthese von Alternan kommen somit alle drei Kompartimente in Betracht, d. h. das Cytosol, die Vakuole, der Apoplast. Darüber hinaus kommen auch die Plastiden in Betracht, wie z. B. durch die amyloplastidäre Expression bakterieller Fructosyltransferasen gezeigt werden konnte. Diese Fructosyltransferasen, die ebenfalls das Substrat Saccharose benötigen, konnten die Bildung von ”Amylofructan” in Amyloplasten vermitteln (Smeekens, Trends in Plant Science Bd. 2, Nr. 8, (1997), 286–288).
Bei Stärke produzierenden Pflanzen, wie z. B. Kartoffel und Mais, bei denen die Stärkebiosynthese und Stärkespeicherung normalerweise in den Amyloplasten erfolgt, würde eine Expression der Alternansucrase im Apoplasten, im Cytosol oder in der Vakuole zu einer zusätzlichen Synthese von Oligo- und/oder Polysacchariden in diesen Kompartimenten führen, was insgesamt eine Steigerung des Ertrags bedeuten kann.
Da es bei der Kartoffel möglich ist, die in den Amyloplasten synthetisierte Stärke von dem im Apoplasten, im Cytosol oder in der Vakuole synthetisiertem Alternan zu trennen, kann dieselbe Pflanze zur Gewinnung von Stärke und von Alternan verwendet werden.
Weiterhin sind transgene Kartoffel- und Maispflanzen bekannt, bei denen es infolge der inhibierung der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase durch ein Antisense-Konstrukt zur völligen inhibierung der Stärkesynthese in den Knollen bzw. in den Körnern kommt. Statt dessen tritt bei Kartoffeln eine Akkumulation von löslichen Zuckern, insbesondere Saccharose und Glucose, z. B. in den Knollen auf (Müller-Röber et al., EMBO J. 11, (1992), 1229–1238). Durch die Expression einer Alternansucrase, die die Saccharose als Substrat verwendet, kann im Cytosol, der Vakuole oder im Apoplasten dieser Pflanzen Alternan hergestellt werden.
Deshalb sind die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen in einer anderen Ausführungsform der Erfindung, verglichen mit entsprechenden Zellen von Wildtyp-Pflanzen, außerdem durch eine reduzierte ADP-Glucosepyrophosphorylase-(AGPase)-Aktivität gekennzeichnet.
DNA-Moleküle, die AGPase codieren, sind dem Fachmann gut bekannt und zum Beispiel in Müller-Röber et al. (Mol. Gen. Genet. 224 (1) (1990), 136–146) beschrieben. Durch die Verwendung von AGPase codierenden DNA-Molekülen ist es möglich, Pflanzen mit rekombinanten DNA-Techniken (z. B. durch einen Antisense-, einen Ribozym- oder einen Cosuppresionsansatz) herzustellen, die eine verminderte AGPase-Aktivität aufweisen. Außerdem sind dem Fachmann AGPase-Mutanten, z. B. aus Mais (brittle-2 und shrunken-2), mit verminderter AGPase-Aktivität bekannt.
Der Begriff ”reduziert oder vermindert” bedeutet vorzugsweise eine Reduktion der AGPase-Aktivität von mindestens 10%, mehr bevorzugt von mindestens 50% und noch mehr bevorzugt von mindestens 80% verglichen mit den entsprechenden Wildtyp-Zellen.
Die Aktivität einer AGPase kann gemäß Müller-Röber et al. (Mol. Gen. Genet. 224 (1) (1990) 136–146) oder gemäß dem Fachmann bekannter Verfahren bestimmt werden.
Die Reaktion, die durch Alternansucrase katalysiert wird, zeichnet sich dadurch aus, dass ein Glucoserest direkt von Saccharose auf einen bestehenden Kohlenhydratakzeptor übertragen wird. Dagegen wird in Pflanzen bei der Biosynthese von linearen Glucanen aus Saccharose, die Saccharose erst in Glucose und Fructose gespalten, die dann jeweils in die aktivierte Zwischenstufe ADP-Glucose umgewandelt werden. Von der ADP-Glucose wird der Glucoserest durch das Enzym Stärkesynthase auf ein bereits vorhandenes Glucan übertragen, wobei ADP freigesetzt wird. Die Umwandlung der Saccharose in zwei ADP-Glucose-Moleküle erfordert dabei mehrere energieverbrauchende Reaktionen. Daher ist der Energieverbrauch der durch die Alternansucrase katalysierten Reaktion im Vergleich zum Energieverbrauch der Synthese von Polysacchariden aus Saccharose in pflanzlichen Zellen wesentlich geringer, was zu einer erhöhten Ausbeute an synthetisiertem Oligo- und/oder Polysaccharid in Pflanzen, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten, führen kann.
Bei der Expression der Nucleinsäuremoleküle in Pflanzen besteht grundsätzlich die Möglichkeit, dass das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle (z. B. Cytosol, Plastiden, Vakuole, Mitochondrien) oder der Pflanze (z. B. Apoplast) lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, muss die codierende Region gegebenenfalls mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Die verwendeten Signalsequenzen müssen jeweils im selben Leserahmen wie die das Enzym codierende DNA-Sequenz angeordnet sein.
Um die Lokalisation in den Plastiden zu gewährleisten, ist es denkbar, eines der folgenden Transitpeptide zu verwenden: die plastidische Ferredoxin:NADP+-Oxidoreductase (FNR) von Spinat, die in Jansen et al. (Current Genetics 13 (1988), 517–522) mit eingeschlossen ist. Insbesondere kann die dort offenbarte Sequenz, die von den Nucleotiden –171 bis 165 der cDNA-Sequenz reicht, verwendet werden, die die nicht-translatierte 5'-Region und die das Transitpeptid codierende Sequenz umfasst. Ein weiteres Beispiel ist das Transitpeptid Wachsprotein von Mais, einschließlich der ersten 34 Aminosäurereste des reifen Wachsproteins (Klösgen et al., Mol. Gen. Genet. 217 (1989), 155–161). Es ist auch möglich dieses Transitprotein ohne die ersten 34 Aminosäuren des reifen Proteins zu verwenden. Außerdem können die Signalpeptide der kleineren Untereinheit Ribulosebisphosphatcarboxylase (Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846–850; Nawrath et al., Proc. Natl. Acad. Aci. USA 91 (1994), 12760–12764), der NADP-Malatdehydrogenase (Gallardo et al., Planta 197 (1995), 324–332), der Glutathionreduktase (Creissen et al., Plant J. 8 (1995), 167–175) oder des R1-Proteins (Lorberth et al., Nature Biotechnology 16 (1998), 473–477) verwendet werden.
Um die Lokalisation in der Vakuole zu gewährleisten ist es denkbar, eines der folgenden Transitpeptide zu verwenden: die N-terminale Sequenz (146 Aminosäuren) des Patatinproteins (Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95–106) oder die Signalsequenzen, die in Matsuoka und Neuhaus, Journal of Experimental Botany 50 (1999), 165–174; Chrispeels und Raikhel, Cell 68 (1992), 613–616; Matsuoka und Nakamura, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 834–838; Bednarek und Raikhel, Plant Cell 3 (1991), 1195–1206; Nakamura und Matsuoka; Plant Phys. 101 (1993), 1–5 beschrieben sind.
Um die Lokalisation im Mitochondrium zu gewährleisten ist es beispielsweise denkbar, das Transitpeptid zu verwenden, das von Braun et al. (EMBO J. 11, (1992), 3219–3227) beschrieben wird.
Um die Lokalisation im Apoplast zu gewährleisten ist es denkbar, eines der folgenden Transitpeptide zu verwenden: Signalsequenz des Proteinase-Inhibitor-II-Gens (Keil et al., Nucleic Acid Res. 14 (1986), 5641–5650; von Schaewen et al., EMBO J. 9 (1990), 30–33), des Lävansucrasegens von Erwinia amylovora (Geier and Geider, Phys. Mol. Plant Pathol. 42 (1993), 387–404), eines Fragments des Patatingens 633 aus Solanum tuberosum, das die ersten 33 Aminosäuren codiert (Rosahl et al., Mol Gen. Genet. 203 (1986), 214–220), oder des von Oshima et al. (Nucleic Acid Res. 18 (1990), 181) beschriebenen.
Die unter SEQ ID NO: 1 angegebene Nucleinsäuresequenz codiert für eine extrazelluläre Alternansucrase. Die Sekretion wird gewährleistet durch eine Signalsequenz, die die ersten ca. 39 N-terminalen Aminosäurereste der SEQ ID NO: 2 umfasst.
Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, d. h. Pflanzen, die vom Menschen kultiviert werden für Zwecke der Ernährung oder für technische, insbesondere industrielle Zwecke. Vorzugsweise sind dies stärkespeichernde Pflanzen, wie z. B. Getreidearten (Roggen, Gerste, Hafer, Weizen, Hirse, Sago etc.), Reis, Erbse, Markerbse, Maniok und Kartoffel, Tomate, Raps, Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse oder Arrowroot, faserbildende Pflanzen (z. B. Flachs, Hanf, Baumwolle), ölspeichernde Pflanzen (z. B. Raps, Sonnenblume, Sojabohne) und proteinspeichernde Pflanzen (z. B. Leguminosen, Getreide, Sojabohne). Die Erfindung betrifft auch Obstbäume und Palmen. Ferner betrifft die Erfindung Futterpflanzen (z. B. Futter- und Weidegräser, wie z. B. Alfalfa, Klee, Raigras) und Gemüsepflanzen (z. B. Tomate, Salat, Chicoree) und Zierpflanzen (z. B. Tulpen, Hyazinthen). Bevorzugt sind zuckerspeichernde und/oder stärkespeichernde Pflanzen. Besonders bevorzugt sind Zuckerrohr und Zuckerrübe sowie Kartoffelpflanzen, Mais, Reis, Weizen und Tomatenpflanzen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen und transgenen Pflanzen, die verglichen mit den nicht-transformierten Wildtypzellen/nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzen Alternan synthetisieren. Bei diesem Verfahren ist die Expression und/oder die Aktivität der Proteine, die von den Nucleinsäuremolekülen der Erfindung codiert werden, im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Zellen/Wildtyp-Pflanzen, die keinerlei Alternansucrase-Expression und/oder -aktivität aufweisen, erhöht. Insbesondere umfasst ein solches Verfahren die Expression eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls in Pflanzenzellen. Das Nucleinsäuremolekül der Erfindung ist vorzugsweise an einen Promotor gekoppelt, der die Expression in Pflanzenzellen gewährleistet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren das Einbringen eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls in eine Pflanzenzelle und die Regeneration einer Pflanze aus dieser Zelle.
Eine solche Zunahme der Expression kann z. B. mittels Northern-Blot-Analyse nachgewiesen werden. Die Zunahme der Aktivität kann nachgewiesen werden, indem man Proteinextrakte auf ihre von Pflanzenzellen abgeleitete Alternansucraseaktivität hin testet. Die enzymatische Aktivität einer Alternansucrase kann, z. B. wie in Lopez-Munguia et al. (Annals New York Academy of Sciences 613, (1990), 717–722) beschrieben oder wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschrieben, gemessen werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Pflanzen. Der Begriff ”Vermehrungsmaterial” umfasst dabei jene Bestandteile der Pflanze, die zur Erzeugung von Nachkommen auf vegetativem oder generativem Weg geeignet sind. Für die vegetative Vermehrung eignen sich beispielsweise Stecklinge, Calluskulturen, Rhizome oder Knollen. Anderes Vermehrungsmaterial umfasst beispielsweise Früchte, Samen, Sämlinge, Protoplasten, Zellkulturen etc. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vermehrungsmaterial um Knollen und Samen. Die Erfindung betrifft auch erfindungsgemäße Pflanzenteile, die geerntet werden können, wie zum Beispiel Früchte, Samen, Knollen oder Wurzelstöcke.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Alternan, umfassend den Schritt der Extraktion und der Isolierung des Alternans aus einer erfindungsgemäßen Pflanze.
Die Extraktion und Isolierung des Alternans aus einer erfindungsgemäßen Pflanze kann mittels Standardverfahren, wie z. B. Fällung, Extraktion und chromatographische Verfahren, erfolgen.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Alternan, erhältlich aus einer erfindungsgemäßen Pflanze oder aus erfindungsgemäßen Vermehrungsmaterial.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Alternan und/oder Fructose, wobei eine erfindungsgemäße Wirtszelle eine Alternansucrase in ein Saccharose enthaltendes Kulturmedium sekretiert und aus dem Kulturmedium Alternan und/oder Fructose isoliert wird/werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Alternansucrase verwendet, die rekombinant hergestellt ist und von der Wirtszelle in das Nährmedium sekretiert wurde, so dass kein Aufschluss von Zellen und keine weitere Aufreinigung des Proteins erforderlich ist, weil das sekretierte Protein aus dem Überstand gewonnen werden kann. Zur Entfernung von Restbestandteilen des Kulturmediums können in der Verfahrenstechnik gängige Verfahren, wie z. B. Dialyse, reverse Osmose, chromatographische Verfahren, etc., eingesetzt werden. Gleiches gilt auch für die Aufkonzentrierung des in das Kulturmedium sekretierten Proteins. Die Sekretion von Proteinen durch Mikroorganismen wird normalerweise durch N-terminale Signalpeptide (Signalsequenz, Leader-Peptid, Transitpeptid) vermittelt. Proteine mit dieser Signalsequenz können die Zellmembran des Mikroorganismus durchdringen. Eine Sekretion von Proteinen kann dadurch erreicht werden, dass die DNA-Sequenz, die dieses Signalpeptid codiert, an die entsprechende, die Alternansucrase codierende Region angefügt wird.
Bevorzugt ist das natürliche Signalpeptid der exprimierten Alternansucrase, besonders bevorzugt das der Alternansucrase aus Leuconostoc mesenteroides NRRL B 1355 (s. die ersten ca. 25–45 N-terminalen Aminosäurereste der SEQ ID NO: 2).
Ganz besonders bevorzugt ist das Signalpeptid der α-CGTase aus Klebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler et al., J. Mol. Biol. 256 (1996), 279–291) oder ein Signalpeptid, wie es von den Nucleotiden 11529–11618 der unter der Zugriffsnummer X86014 in der GenBank zugänglichen Sequenz codiert wird.
Zur Herstellung von Alternan und/oder Fructose werden weder aktivierte Glucosederivate noch Cofaktoren benötigt, wie bei den meisten Synthesewegen für Polysaccharide, die innerhalb der Zelle ablaufen. Es besteht daher die Möglichkeit, Alternansucrase sekretierende Mikroorganismen in saccharosehaltigem Medium zu kultivieren, wobei die sekretierte Alternansucrase im Kulturmedium zu einer Synthese von Alternan und Fructose führt.
Im Gegensatz zu Wirtszellen aus Leuconostoc mesenteroides, die natürlicherweise Alternansucrase sekretieren, weisen die verwendeten erfindungsgemäßen Wirtszellen den Vorteil auf, dass sie keine Proteine mit störenden Polysaccharid synthetisierenden Nebenaktivitäten, wie z. B. von Dextransucrase, sekretieren, so dass außerhalb der Wirtszelle, abgesehen vom Alternan, keine anderen Polysaccharide, die in der Regel nur durch kosten- und zeitintensive Verfahren vom Alternan zu trennen sind, gebildet werden können. Darüber hinaus weisen die erfindungsgemäßen Wirtszellen in einer bevorzugten Ausführungsform keine störenden Polysaccharid abbauenden Nebenaktivitäten auf, die sonst zu Ausbeuteverlusten an produziertem Alternan führen könnten.
Neben Alternan entsteht bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Fructose. Diese kann zur kostengünstigen Isolierung von sogenannten ”high-fructose-containing-syrups” (Sirupe mit einem hohen Fructoseanteil) (HFCS) verwendet werden. Herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Fructose sehen zum einen die enzymatische Spaltung von Saccharose mit Hilfe einer Invertase vor oder die Spaltung von Stärke in Glucoseeinheiten, meist durch Säurehydrolyse, und anschließende enzymatische Umwandlung der Glucose in Fructose durch Glucoseisomerasen. Beide Verfahren führen jedoch zu Gemischen aus Glucose und Fructose. Die beiden Komponenten müssen anschließend durch chromatographische Verfahren voneinander getrennt werden.
Die Trennung der beiden Reaktionsprodukte des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. die Trennung der Reaktionsprodukte vom Substrat Saccharose kann beispielsweise durch Verwendung von Membranen erreicht werden, die den Durchtritt von Fructose, aber nicht von Saccharose und/oder von Alternanen erlauben. Wird für das kontinuierliche Entfernen der Fructose über eine derartige Membran gesorgt, kommt es zu einer mehr oder weniger vollständigen Umsetzung der Saccharose.
Die Isolierung von Alternan und Fructose erfolgt mittels Standardverfahren oder kann beispielsweise, wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben, durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform des Verfahrens stammen die Wirtszellen von Mikroorganismen, bevorzugt von Escherichia coli.
In einer weiteren Ausführungsform werden im erfindungsgemäßen Verfahren pilzliche Wirtszellen, insbesondere Zellen von Hefen, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae, verwendet. Die Verwendung von Hefezellen, die aufgrund der enzymatischen Aktivität einer Alternansucrase in saccharosehaltigem Medium Alternan produzieren, ist nicht ohne weiteres möglich, da Hefen eine Invertase sezernieren, die extrazelluläre Saccharose spaltet. Die Hefen nehmen die entstehenden Hexosen über einen Hexosetransporter auf. Es wurde jedoch ein Hefestamm beschrieben (Riesmeier et al., EMBO J. 11 (1992), 4705–4713), der ein defektes suc2-Gen trägt und daher keine Invertase sezernieren kann. Darüber hinaus enthalten diese Hefezellen auch kein Transportsystem, das Saccharose in die Zellen importieren kann. Wird ein derartiger Stamm mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle dahingehend verändert, dass er eine Alternansucrase in das Kulturmedium sezerniert, so erfolgt in einem saccharosehaltigem Kulturmedium die Synthese von Fructose und Alternan. Die entstehende Fructose kann anschließend von den Hefezellen aufgenommen werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens liegt die erfindungsgemäße Wirtszelle immobilisiert vor.
Die Immobilisierung von Wirtszellen erfolgt in der Regel durch Einschluss der Zellen in ein geeignetes Material, wie z. B. Alginat, Polyacrylamid, Gelatine, Cellulose oder Chitosan. Möglich ist aber auch die Adsorption oder die kovalente Bindung der Zellen an ein Trägermaterial (Brodelius and Mosbach, Methods in Enzymology Bd. 135, (1987), 222–230). Ein Vorteil der Immobilisierung von Zellen ist, dass dadurch wesentlich höhere Zeltdichten erreicht werden können als bei einer Kultivierung in Flüssigkultur. Daraus resultiert eine erhöhte Produktiviät. Weiterhin verringern sich die Kosten für Agitation und Belüftung der Kultur, sowie für Maßnahmen zur Aufrechterhaltung der Sterilität. Ein anderer wichtiger Gesichtspunkt ist, dass eine kontinuierliche Produktion von Alternan möglich ist, so dass unproduktive Phasen, die regelmäßig bei Fermentationsprozessen auftreten, vermieden oder zumindest stark reduziert werden können.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Kosmetikprodukten oder Nahrungsmitteln, umfassend eine der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Alternan-Herstellungsverfahren und die Formulierung des so gewonnenen Alternans in eine Form, die für eine der vorgenannten Anwendungen des entsprechenden Produkts geeignet ist.
Diese und andere Ausführungsformen sind offenbart und dem Fachmann offensichtlich und durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung umfasst. Weiterführende Literatur zu einer der oben angeführten Verfahren, Mittel und Verwendungen, die im Sinne der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, kann dem Stand der Technik entnommen werden, z. B. aus öffentlichen Bibliotheken unter z. B. der Benutzung elektronischer Hilfsmittel. Zu diesem Zweck bieten sich unter anderem öffentliche Datenbanken, wie die ”Medline” an, die über Internet zur Verfügung steht, z. B. unter der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Weitere Datenbanken und Adressen sind dem Fachmann geläufig und können aus dem Internet entnommen werden, z. B. unter der Adresse http://www.lycos.com. Eine Übersicht über Quellen und Informationen zu Patenten bzw. Patentanmeldungen in der Biotechnologie ist in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352–364 gegeben.
Beschreibung der Abbildungen:
: Lineare Karte des gesamten Sequenzbereichs, der nach Durchmustern einer genomischen Bibliothek von Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355 durch die entsprechend überlappenden Fragmente der Clone AS-19B1, AS-19B2, AS-28B und AS-29Ba cloniert wurde.
: Plasmidkarte pAlsu-pSK
: HPLC-Chromatogramm: Herstellung von Oligoalternan in Gegenwart von Maltose (Beispiel 2).
: Plasmidkarte pAlsu-pET24a
: SDS-PAGE mit anschließendem Nachweis der Sucrase-Aktivität (s. Beispiel 6). Folgende Proteinextrakte werden verwendet:
1 + 2) E. coli BL21(DE3), enthaltend pAlsu-pET24a-3
3 + 4) E. coli BL21(DE3), enthaltend pAlsu-pET24a-7
5 + 6) E. coli BL21(DE3), enthaltend pAlsu-pET24a-21
7 + 8) E. coli BL21(DE3), enthaltend pET24a
1, 3, 5, 7) Kultur vor der Induktion mit IPTG
2, 4, 6, 8) Kultur am Ende der Kultivierung
: HPLC-Chromatogramm von Dextran T10
: HPLC-Chromatogramm von Dextran T 10 nach Dextranase-Verdau
: HPLC-Chromatogramm von Oligoalternan
: HPLC-Chromatogramm von Oligoalternan nach Dextranase-Verdau
: Karte der Expressionkassette einschließlich des Polylinkers des Plasmids pBinAR-N.
: Plasmidkarte pat-Alsu-Hyg.
: Plasmidkarte fnr-Alsu-Hyg.
Beispiele
In den Beispielen verwendete Vektoren:
1. pBinAR-N
Mit den üblichen Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Auflage; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)) wurden verschiedene Polylinker (cf. ) zwischen dem 35S-Promotor und dem OCS-Terminator in das Plasmid pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221–230) eingeführt. Das resultierende Plasmid wurde pBinAR-N genannt.
2. pBinAR-Hyg-N
Mit Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Auflage; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)) wurde ein EcoRI/HindIII-Fragment aus pBinAR-N isoliert, das den 35S-Promotor, den Polylinker und den OCS-Terminator enthielt. Dieses Fragment wurde dann in die gleichen Restriktionsstellen des Plasmids pBIB-Hyg (Becker, Nucleic Acids Research 18 (1990), 203) ligiert. Das resultierende Plasmid wurde pBinAR-Hyg-N genannt.
3. pBinAR-pat-Hyg
Durch Verwendung der Oligonucleotide Sp-pat-5' und Sp-pat-3' (cf. SEQ ID NO: 48 und SEQ ID NO: 49) wurden DNA-Moleküle, die das Leaderpeptid des Patatinproteins aus Kartoffel codieren, (cf. SEQ ID NO: 50, die sich von der von Sonnewald et al. Plant J. 1 (1991), 95–106 verwendeten Sequenz unterscheidet) mit dem PCR-Ansatz unter Verwendung des Plasmids pgT5 (Rosahl et al., Mol. Gen. Genet. 203 (1986), 214–220; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95–106) als Matrize amplifiziert. Die resultierenden PCR-Produkte wurden von den Restriktionsenzymen XbaI und SalI geschnitten und dann in das Plasmid pBinAR-Hyg-N ligiert, das vorher durch die Verwendung der Restriktionsenzyme SpeI und SalI linearisiert wurde. Das resultierende Plasmid wurde pBinAR-pat-Hyg genannt. PCR-Bedingungen: Puffer und Polymerase von Boehringer Mannheim (Pwo-Polymerase No. 1644947)

DNA 0.2 ng

10 × Puffer + MgSO₄ 5 μl

dNTPs (each 10 mM) 1 μl

Primer Sp-pat-5' 120 nM

Primer Sp-pat-3' 120 nM

Pwo-Polymerase 1.0 Einheiten

destilliertes Wasser ad 50 μl

Reaktionsbedingungen:

Schritt 1 95°C 2:30 min

Schritt 2 95°C 0:30 min

Schritt 3 64°C 0:30 min

Schritt 4 72°C 0:30 min

(plus 1 sek. pro Zyklus)

Schritt 5 72°C 5:00 min

Die Schritte 2 bis 4 wurden 35-mal zyklisch wiederholt.
4. pBinAR-FNR-Hyg

Durch Verwendung der Oligonucleotide Sp-fnr-5' und Sp-fnr-3 (cf. SEQ ID NO: 51 und 52) wurden die DNA-Moleküle, die das Transitpeptid FNR-Protein von Spinat codieren, mit dem PCR-Ansatz unter Verwendung des Plasmids p6SocFNR-15 (Jansen et al., Current Genetics 13, (1988), 517–522) als Matrize amplifiziert. Die resultierenden PCR-Produkte wurden mit XbaI und SalI geschnitten und dann in das SpeI/SalI-geöffnete pBinAR-Hyg-N cloniert. Das resultierende Plasmid wurde pBinAR-fnr-Hyg genannt. PCR-Bedingungen: Puffer und Polymerase von Gibco BRL (Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Nr. 1304-011)

DNA	0.2 ng
10 × Puffer	5 μl
MgSO₄	2.0 μl
dNTPs (per 10 mM)	1 μl
Primer Sp-fnr-5'	150 nM
Primer Sp-fnr-3'	150 nM
Taq Platinum Hifi Polymerase	1,5 Einheiten
destilliertes Wasser	ad 50 μl

Reaktionsbedingungen:

Schritt 1	95°C	2:30 min
Schritt 2	95°C	0:30 min
Schritt 3	58°C	0:30 min
Schritt 4	68°C	0:20 min
	(plus 1 sek. pro Zyklus)
Schritt 5	68°C	3:00 min

Die Schritte 2 bis 4 wurden 35-mal zyklisch wiederholt.

Beispiel 1: Clonierung der Alternansucrase aus Leuconostoc mesenteroides NRRL-B1355
Isolierung und Sequenzierung der Alternansucrase
Der Stamm Leuconostoc mesenteroides NRRL-B1355 wurde in 1 Liter Lactobacilli MRS Broth (Difco), komplementiert mit 5% Saccharose, zwei Tage bei 28°C kultiviert. Nach anschließender Zentrifugation der Kultur bei 20.000 × g für 30 Minuten wurde der Überstand mit gleichem Volumen 10%iger Trichloressigsäure versetzt und bei 4°C für 16 Stunden gerührt. Es folgte eine Zentrifugation dieser Lösung bei 10.000 × g für 30 Minuten. Das dadurch erhaltene Präzipitat wurde in 4,5 ml 40 mM Tris-HCl pH 8,8 gelöst und anschließend mit (ca. 0,5 ml) 2 M Tris-Base neutralisiert. Diese Proteinlösung wurde der Firma Toplab Gesellschaft für angewandte Biotechnologie mbH, Martinsried, Deutschland, zur Proteinsequenzierung übergeben. Dort wurde die Proteinlösung elektrophoretisch im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, das Gel mit Coomassie-Blue gefärbt und anschließend mit 10% Essigsäure entfärbt. Zum enzymatischen Verdau des Proteins wurden die Proteinbande aus dem Gel ausgeschnitten, durch ein Sieb gedrückt und zerkleinert (Poren 30 μm × 100 μm). Das zerquetschte Gel wurde dann mit halb konzentriertem Inkubationspuffer (12,5 mM Tris, 0,5 mM EDTA pH 8,5) 2 min gewaschen. Anschließend wurde abzentrifugiert, der Puffer entfernt und 1 h in der ”Speedvac” angetrocknet (ca. 5% Restwasser, gummiartig). Danach wurde eine Lösung aus Endoproteinase LysC in 400 μl 12,5 mM Tris/HCl, pH 8,5 (Enzym:Protein = 1:10) und 0,1% Laurylmaltosit hergestellt. 200 μl dieser Lösung wurden zur Probe gegeben und über Nacht bei 37°C im Heizblockschüttler inkubiert.
Zur Elution der Peptidfragmente wurde für zweimal eine Stunde mit 1% TFA inkubiert, abzentrifugiert und anschließend für 3 h mit 10% Ameisensäure, 20% Isopropanol, 60% Acetonitril eluiert. Die erhaltenen Peptidfragmente wurden dann über HPLC voneinander getrennt (Säule: Superspher 60 RP select B (Merck, Darmstadt), 2 mm × 125 mm; Puffer A 0,1% Trifluoressigsäure, Puffer B: 0,085% TFA in Acetonitril; Flußrate: 0,2 ml/min; Gradient: 5–60% in 60 min; Detektion bei 206 nm. Die erhaltenen Peptidfragmente wurden anschließend in einem automatischen Sequenziergerät Procise 492 (Applied Biosystems, PE) sequenziert, und zwar nach dem Verfahren des schrittweisen Edman-Abbaus in einer Modifikation nach Hunkapiller (Hunkapiller et al., Meth. Enzymol. 91, (1983), 399–413).
Es wurden sechs verschiedene Peptidsequenzen (s. SEQ ID NO: 5 bis 9, SEQ ID NO: 21) identifiziert, die als lysC-66, lysC-67, lysC-82, lysC-83, lysC-88 und ”N-Terminus” bezeichnet wurden.
Herstellung einer genomischen DNA-Bibliothek aus Leuconostoc mesenteroides NRRL-B1355
Leuconostoc mesenteroides NRRL-B1355 (bezogen von der ATCC) wurde in 100 ml YT-Medium (Sambrook et al, a. a. O.), zusätzlich enthaltend 2% (Gew./Vol.) Glucose und 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 für 36 h bei 28°C kultiviert. Nach Ernte der Zellen durch Zentrifugation folgte die Isolierung genomischer DNA nach Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, Greene and John Wiley & Sons (1994), USA).
100 μg genomischer DNA aus Leuconostoc mesenteroides NRRL-B1355 wurden für 30 min mit 0,001 Einheiten des Restriktionsenzyms Sau3A partiell verdaut, anschließend mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. 2,5 μg der erhaltenen, partiell verdauten DNA aus Leuconostoc mesenteroides NRRL-B1355 wurden mit 1 μg des BamHI geschnittenen und dephosphorylierten Vektors pBKCMVBamHI (Stratagene) mit T4 DNA Ligase unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen (Stratagene, pBK Phagemid Vectors Instructions Manual & T4-DNA-Ligase-Ligierungskit) ligiert. 2 μl des Ligierungsansatzes wurden mit Gigapack III Gold (Stratagene) nach den Angaben des Herstellers verpackt und nach Ermittlung der Menge an enthaltenen Phagen gelagert.
Herstellung der Sonde zur Isolierung des Alternansucrase-Gens
Aus den nach tryptischem Verdau des gereinigten Alternansucrase-Proteins (siehe oben) erhaltenen Peptidsequenzen lysC-66 (SEQ ID NO: 5), lysC-67 (SEQ ID NO: 6), lysC-82 (SEQ ID NO: 7), lysC-83 (SEQ ID NO: 8) und lysC-88 (SEQ ID NO: 9) wurden die Peptide lysC-82 und lysC-83 nach reverser Translation für die Synthese von degenerierten Oligonucleotiden (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11) ausgewählt. Diese Oligonucleotide dienten als Primer in einer PCR-Reaktion bei genomischer DNA von NRRL-B1355. Bei der Primersynthese wurden alle als N dargestellten Positionen in Oligonucleotiden durch Inosin ersetzt.
Reaktionsbedingungen der PCR

Der Reaktionsansatz wurde mit den zur Taq-Polymerase gelieferten Puffern durchgeführt (Firma Gibco BRL). Reaktionsansatz: Taq-Polymerase (Gibco)

DNA	100 ng (genomisch, NRRL-B1355)
DNTPs	2,5 mM je Nucleotid
Primer	10 μl aus einer Lösung, enthaltend 0,2 μMol
10-fach Puffer	5 μl
Magnesiumchlorid	2 mM
Polymerase	1 Einheit
Wasser	ad 50 μl

Schritt	95°C	3'
Schritt	95°C	1'
Schritt	58°C	2'
Schritt	72°C	2'
Schritt	72°C	10'

40 Wiederholungen der Schritte 2 bis 4.

Ein aus dieser PCR-Reaktion resultierendes Fragment von 837 bp Länge (SEQ. ID NO: 2) wurde nach dem Glätten der Enden mit Hilfe von T4-DNA-Polymerase in den SmaI-geschnittenen pBlueSkript Vektor (Stratagene) cloniert. Das resultierende Plasmid wurde als pAlsu-PCR-lysc82/83 bezeichnet. Nach Sequenzierung des Inserts und computergestützter Translation in die korrespondierenden Proteinsequenzen wurde ein Datenbankvergleich in der Swiss Prot-Datenbank durchgeführt. Dieser Vergleich ergab Homologien zu bekannten Glycosyltransferasen (P49331, P11001, P68987, P13470, P27470, P29336).
Ca. 5.000 Phagen der genomischen DNA-Bibliothek aus Leuconostoc mesenteroides NRRL-B1355 wurden unter Verwendung der vom Hersteller (Stratagene) angegebenen Bakterienstämme und Nährlösungen ausplattiert und nach Inkubation bei 37°C für 12 Stunden auf Nitrocellulosefilter übertragen. Anschließend folgten die Denaturierung der Phagen durch Eintauchen der Nitrozellulosefilter in 1,5 M Natriumchlorid, 0,5 M Natronlauge für 2 Minuten und die Neutralisierung der Filter durch Eintauchen in 1,5 M Natriumchlorid, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 für 5 Min. Nach Spülen der Filter in 0,2 M Tris-HCl, 2 × SSC erfolgte die Bindung der Phagen-DNA an die Membranen durch UV-Quervernetzung (Stratalinker der Firma Stratagene, 120.000 μJ für 30 sec). Die Filter wurden für 6 h in Prähybridsierungslösung (5 × SSC, 0,5% BSA, 5 × Denhardt, 1% SDS, 40 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, 100 mg/l Heringssperma-DNA, 25% Formamid) bei 42°C inkubiert. 30 ng des isolierten Inserts aus dem Plasmid pAlsu-PCR-lysc82/83 wurde mit Hilfe eines Multiprime-Kits (Boehringer Mannheim) unter Einsatz von α-³²P-dCTP (ICN Biomedicals) radioaktiv markiert. Diese radioaktive Sonde wurde zu dem Prähybridisierungsgemisch gegeben und die Filter wurden in diesem Hybridisierungsgemisch über Nacht bei 42°C inkubiert. Nach Entfernen des Hybridisierungsgemischs wurden die Filter je dreimal in Waschlösung (0,1 × SSC, 0,5% SDS) bei 55°C für 15 Min gewaschen. Anschließend wurde ein Röntgenfilm (Kodak) für 18 h auf die Filter aufgelegt. Phagenkolonien, die Hybridisierungssignale erzeugten, wurden identifiziert, isoliert, in SM-Medium resuspendiert und anschließend nochmals in solch einer Verdünnung ausplattiert, dass sie als singulär vorliegende Plaques zu erkennen waren. Nach Transfer dieser Phagen auf Nitrocellulosefilter und weiterer Behandlung und Hybridisierung unter wie oben bereits beschriebenen Bedingungen wurden mit Hilfe der verwendeten radioaktiven Gensonde hybridisierende Phagen als Einzelisolate erhalten. Nach in vivo-Excision der isolierten Phagen nach Herstellerangaben (Stratagene) konnten die Clone AS-19B1 und AS-19B2 als Plasmid isoliert werden. Nach der vollständigen Sequenzierung beider Clone (Agowa) (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14) zeigte sich eine Überlappung dieser beiden Sequenzen von 1008 bp. Durch Aneinanderfügen der SEQ ID NO: 13 und 14 konnte nach computergestützter Translation aller möglichen Leserahmen ein durchgehender Leserahmen, beginnend mit dem Codon ATG (entspricht in SEQ ID NO: 1 den Basen 678 bis 680), identifiziert werden. Da in diesem zusammengesetzten Leserahmen kein Stop-Codon zu finden war, wurden, um die codierende Sequenz der Alternansucrase vollständig zu erhalten, weitere Clone isoliert.
Daher wurden nochmals, wie bereits oben beschrieben, ca. 5.000 Phagen der genomischen DNA-Bibliothek aus L. mesenteroides NRRL-B1355 auf Hybridisierung mit einem mittels Multiprime-Kit (Boehringer Mannheim) radioaktiv markierten Subfragment des Clons AS-19B2 hin untersucht. Für die Herstellung der Hybridisierungssonde wurde das HindIII (Schnittstelle im Insert von AS-19B2)/SalI(schneidet im Polylinker des Phagmidvektors pBKCMV)-Fragment aus AS-19B2 eingesetzt. Dieses Fragment enthält 372 Basen des 3'-Endes der für den oben beschriebenen Leserahmen codierenden Sequenzen. Die Durchmusterung der Phagenbibliothek, die Vereinzelung sowie die Überführung der Phagen in Plasmide erfolgte unter den oben beschriebenen Bedingungen. Nach vollständiger Sequenzanalyse der so isolierten Clone AS-28B (s. SEQ ID NO: 15) und AS-29Ba (SEQ ID NO: 16) konnte zwischen den Clonen AS-19B2 (SEQ ID NO: 14) und AS-28B eine Überlappung von 960 identischen Basen (entspricht in SEQ ID NO: 1 den Basen 4863 bis 5823) und zwischen den Clonen AS-19B2 und AS-29Ba (SEQ ID NO: 16) von 567 identische Basen (entspricht in SEQ ID NO: 1 den Basen 5256 bis 5823) identifiziert werden. Die Clone AS-28B und AS-29Ba weisen 1523 identische Basen (entspricht in SEQ ID NO: 1 den Basen 5256 bis 6779) auf. Nach computergestütztem Zusammenfügen der Clone AS-19B1, AS19-B2 und AS-28B zeigte sich ein durchgehender Leserahmen, beginnend mit dem Codon ATG (Basen 678 bis 680 der kompletten Sequenz). Dieser Leserahmen enthält ebenfalls kein Stop-Codon. Nach Zusammenfügen der Clone AS-19B1, AS-19B2, AS-28B und AS-29Ba konnte ein mit dem Codon ”ATG” (entspricht in SEQ ID NO: 1 den Basen 678 bis 680) beginnender und mit ”TAA” (entspricht in SEQ ID NO: 1 den Basen 6849 bis 6851) endender Leserahmen, codierend für 2057 Aminosäuren, identifiziert werden. Zusätzlich zu der codierenden Region enthält die gesamte isolierte und identifizierte DNA-Sequenz der zusammengesetzten Clone (SEQ ID No. 13–16) 677 Basen im 5'-Bereich und 2469 Basen im 3'-Bereich, die nicht für Alternansucrase codierende Sequenzen darstellen (s. ).
Beispiel 2: Konstruktion des Plasmids pAlsu-pSK zur Transformation von E. coli und Test der Proteinextrakte auf enzymatische Aktivität
Die Plasmide AS-19B1, AS-19B2, AS-28B und AS-29Ba (s. Beispiel 1) wurden in folgender Weise zusammengefügt: es wurde ein NotI-(Restriktionsschnittstelle im Polylinker des Vektors pBK CMV, Firma Novagen)/ClaI-Fragment des Clons AS-19B1 in den Vektor pBluescript SK (Firma Stratagene) in gleiche Schnittstellen eingefügt (= erster Clonierungsschritt). Durch aufeinanderfolgende Insertion des ClaI/XhoI-Fragments aus AS-19B2, des XhoI/MluI-Fragments aus AS-28B und des MluI/BsaB1(BsaBI-geschnittenes Fragment in die geglätteten Enden der ApaI-Schnittstelle des Vektors cloniert)-Fragments aus AS-28B in den aus dem ersten Clonierungsschritt erhaltenen Clon wurde das Plasmid pAlsu-pSK (s. ) erzeugt. Dieses Plasmid enthält die gesamte codierende Sequenz der Alternansucrase aus Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355 sowie im 5'-Bereich 677 bp (Promotorbereich) und im 3'-Bereich 539 bp nicht codierende Sequenzen (SEQ ID NO: 17).
Anschließend wurde das Plasmid pAlsu-pSK in E. coli (DH5α Firma Fermentas) transformiert: die Bakterien wurden dann für 2 Tage bei 27°C in 50 ml ”Teriffic broth” (Zusammensetzung beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (ergänzt mit 0,5% Glucose)) oder in einem Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung kultiviert: KH₂PO₄ 1,5 g/l, (NH₄)₂SO₄ 5,0 g/l, NaCl 0,5 g/l, Na-Citrat 1,0 g/l, Fe²⁺SO₄ × 7H₂O 0,075 g/l, Hefeextrakt 0,5 g/l, Trypton 1,0 g/l, Glucose 15,0 g/l, MgSO₄ × 7H₂O 0,3 g/l, CaCl₂ × 2H₂O 0,014 g/l, Mineralsalze 10 ml/l, H₃BO₃ 2,5 g/l, CoCl₂ × 6H₂O 0,7 g/l, CuSO₄ × 5H₂O 0,25 g/l, MnCl₂ × 4H₂O 1,6 g/l, ZnSO₄ × 7H₂O 0,3 g/l, Na₂MoO₄ × 2H₂O 0,15 g/l, Vitamin B1 (Thiamin) 0,005 g/l.
Alle Kulturen enthielten 100 mg/l Ampicillin. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in 2 ml 50 mM Na-Phosphatpuffer pH 7,2 resuspendiert und mit Hilfe einer French-Press aufgeschlossen. Durch anschließende erneute Zentrifugation wurden feste Bestandteile der aufgeschlossenen Zellen abgetrennt, und der Überstand (im Folgenden als (Protein-)Extrakt bezeichnet), nach Sterilfiltration (Sterivex GV 0,2 μm, Millipore) für weitere Analysen verwendet.
In vitro-Herstellung von Alternan mittels Proteinextrakten
Je 200 μl der erhaltenen Extrakte wurden zur in-vitro-Herstellung von Alternan in jeweils 2 ml 100 mM Na-Citrat-Puffer pH 6,5 und 20% (Gew./Vol.) Saccharose in An- bzw. in Abwesenheit von 100 μl 10 mM Maltose auf Aktivität hin untersucht. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei 37°C inkubiert. Bei anschließender Fällung mit einem gleichen Volumen Ethanol konnte in Abwesenheit von Maltose kein präzipitierbares Polymer nachgewiesen werden. In dem Ansatz, der Maltose enthielt, konnte mittels HPLC-Chromatographie (Dione-PA-100-Säule, Laufpuffer 150 mM NaOH, Elutionspuffer 150 mM NaOH + 3 M-Natriumacetat-Puffer-Gradient) die Bildung von Oligomeren (s. ) nachgewiesen werden.
Aktivitätsgel
Je 20 ml der einzelnen Proteinextrakte wurden auf ein 6%iges SDS-PAA-Gel aufgetragen und bei einer Stromstärke von 20 mA je Gel aufgetrennt. (Vor dem Beladen der Gele wurden die Extrakte nicht bei 95°C inkubiert). Anschließend wurden die Extrakte nach der Methode von Miller und Robyt (Analytical Biochemistry 156, (1986), 357–363) auf Sucrase-Aktivität hin untersucht.
Die Kontrolle (Dextransucrase NRRL-B-512F, Herstellung siehe Beispiel 3) zeigte polymerisierende Aktivität. Die Proteinextrakte der oben beschriebenen E. coli-Zellen, die das Plasmid pAlsu-pSK enthalten, zeigten keine polymerbildende Aktivität.
Beispiel 3: Clonierung und Expression der Dextransucrase aus Leuconostoc mesenteroides NRRL-B512F
Isolierung genomischer DNA
Leuconostoc mesenteroides NRRL-B512F (bezogen von ATCC) wurde in VT-Medium (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Course Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Press, New York), enthaltend zusätzlich 1% Saccharose und 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0, bei 28°C für 48 h kultiviert. Nach Ernte der Zellen durch Zentrifugation wurde genomische DNA nach Ausubel et al. (Current Protocols In Molecular Biology, Band 1, Greene and John Wiley & Sons (1994), USA) isoliert.
PCR-Amplifikation des Dextransucrase-Gens und Clonierung in pET24a
Für die rekombinante Expression der Dextransucrase in E. coli wurde das die Dextransucrase codierende Gen nach Amplifikation mittels PCR in den Expressionsvektor pET24a (Novagen) cloniert. Dazu wurde mit den verwendeten PCR Primern (5'b512-1: 5'-ACTgCggCCgCATgCCATTTACAgAAAAAg-3'; SEQ ID NO: 3 und 3'b512: 5'-ACTgCTCgAgTTATgCTgACACAgCATTTC-3'; SEQ ID NO: 4), abgeleitet von der Sequenz aus WO 89/12386 am 5'-Ende der für die Dextransucrase codierenden Sequenzen eine EagI-Restriktionsschnittstelle und am 3'-Ende eine XhoI-Restriktionsschnittstelle eingeführt. Die anschließende Clonierung erfolgte in entsprechende Restriktionsschnittstellen des Polylinkers von pET24a. Das resultierende Plasmid wurde mit UL5-20 bezeichnet.
Reaktionsbedingungen der PCR
Es wurden Puffer und Polymerase der Firma Gibco BRL verwendet:

DNA: 100 ng (genomisch, NRRL-B512F)

10-fach Puffer 5 μl

MgCl2 4 mM

5'-Primer 50 ng

3'-Primer 50 ng

dNTP 1 mM eines jeden Nucleotids

Pfu-Polymerase 0,5 Einheiten

Wasser ad 50 μl

Schritt 1 95°C 4 Min.

Schritt 2 95°C 1 Min.

Schritt 3 55°C 1 Min.

Schritt 4 72°C 5 Min.

Schritt 5 72°C 10 Min.

Es wurden 40 Wiederholungen zwischen Schritt 2 und 4 durchgeführt.
Herstellung rekombinanter Dextransucrase
BL21(DE3)-E. coli-Zellen, enthaltend das Plasmid UL5-20, wurden in VT-Medium (s. o.) bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ = 0,8 kultiviert. Anschließend erfolgte die Induktion der Zellen mit 0,2 mM IPTG und weitere Kultivierung für 24 h bei 18°C.
Nach der Ernte der Zellen durch Zentrifugation und Resuspension in Natriumphosphatpuffer pH 5.2 folgte der Aufschluss der Zellen in einer French-Presse. Die erhaltene Lösung wurde durch Zentrifugation von unlöslichen Bestandteilen befreit und der Überstand, der die Dextransucrase enthält und im Folgenden als Extrakt bezeichnet wird, gewonnen.
Beispiel 4: PCR-Amplifikation der codierenden Region der Alternansucrase und Clonierung in pET24a
Die codierende Region der Alternansucrase wurde in einer PCR-Reaktion (Reaktionsbedingugen: siehe unten) mit genomischer DNA aus dem Leuconostoc mesenteroides-Stamm NRRL B-1355 als Matrize amplifiziert. Über die Primer A1-4 (SEQ ID NO: 18) wurde am 5'-Ende eine NheI-Restriktionsschnittstelle, über den Primer A1-5 (SEQ ID NO: 19) am 3'-Ende eine SalI-Restriktionsschnittstelle eingefügt. Es wurde ein ca. 6200 bp großes Fragment isoliert.
Reaktionsbedingungen der PCR (Kit der Firma Gibco BRL):

DNA 1 μl

10 × Puffer 5 μl

10 mM je dNTP 2 μl

50 mM MgSO₄ 2 μl

Primer je 1 μl

Platinum-DNA-Polymerase 0,2 μl

Dest. Wasser 37,8 μl

Schritt 1 95°C 2 Min.

Schritt 2 95°C 20 Sec.

Schritt 3 47°C 20 Sec.

Schritt 4 68°C 7 Min. (je Zyklus um 3 Sek. verlängert)

Schritt 5 68°C 15 Min.

Vor der Durchführung von Schritt 5 wurden die Schritte 2 bis 4 insgesamt 35-mal wiederholt.
Das erhaltene PCR-Fragment wurde nach Standardverfahren aufgereinigt, mit den Restriktionsendonukleasen NheI und SalI behandelt, in einen ebenfalls mit diesen Enzymen geschnittenen pET24a-Vektor (Firma Novagen) ligiert und das Ligierungsprodukt in E. coli transformiert. Nach Plasmidpräparation und Restriktionsverdau wurden drei positive Clone selektiert. Diese erhielten die Bezeichnungen pAlsu-pET24a-3, pAlsu-pET24a-7 bzw. pAlsu-pET24a-21 (s. ). Alle enthielten als Insertion die unter SEQ ID NO: 20 angegebene Sequenz.
Beispiel 5: Expression der rekombinanten Alternansucrase in E. coli in Schüttelkolbenkulturen und im Fermenter
Schüttelkolbenkultur
Die Plasmide pAlsu-pET24a-3, pAlsu-pET24a-7, pAlsu-pET24a-21 und pET24a wurden in E. coli BL21(DE3), Firma Novagen, transformiert und nach anfänglicher Anzucht in 3 ml VT-Medium (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) für 3 Stunden bei 37°C im Schüttelkolben jeweils in 2 Replika-Ansätzen in je 50 ml Davis-Minimalmedium (DIFCO Manual, Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiology, 10. Ausgabe, Detroit Michigan, USA (1984)), enthaltend 0,2% Glucose statt Dextrose als Kohlenstoffquelle, bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von ca. 0,8 kultiviert. Nach Zentrifugation und Resuspension folgte die Kultivierung einer der beiden Replikakulturen in Davis Minimal Medium (DMA), enthaltend 1% Lactose als Kohlenstoffquelle und Induktor, für weitere 16 h bei 27°C. Die Zellen der einzelnen Kulturen wurden nach Zentrifugation geerntet, in 50 mM Natriumacetatpuffer pH 5,3 resuspendiert und ein Proteinextrakt wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt.
Fermenter
Der Clon pAlsu-pET24a-21, transformiert in E. coli BL21(DE3), wurde in einem 2 l-Fermenter (Biostad B; B. Braun, Melsungen) unter folgenden Bedingungen kultiviert:
Medium:

Fermentationsmedium: KH₂PO₄ 1,5 g/l, (NH₄)₂SO₄ 5,0 g/l, NaCl 0,5 g/l, Na-Citrat 1,0 g/l, Fe²⁺SO₄ × 7H₂O 0,075 g/l, Hefeextrakt 0,5 g/l, Trypton 1,0 g/l, Glucose 15,0 g/l, MgSO₄ × 7H₂O 0,3 g/l, CaCl₂ × 2H₂O 0,014 g/l, Mineralsalze 10 ml/l, H₃BO₃ 2,5 g/l, CoCl₂ × 6H₂O 0,7 g/l, CuSO₄ × 5H₂O 0,25 g/l, MnCl₂ × 4H₂O 1,6 g/l, ZnSO₄ × 7H₂O 0,3 g/l, Na₂MoO₄ × 2H₂O 0,15 g/l, Vitamin B1 (Thiamin) 0,005 g/l
Kohlenstoffquelle: Glucose (1,5% (Gew./Vol.)) im Medium vorgelegt, 70% (Gew./Vol.) Glucoselösung wird zugefüttert.
Automatische pH-Kontrolle mit Ammoniak und Phosphorsäure bei pH 7,0 +/– 0,1

Über die Kontrolle des Rührers wird eine pO₂-Konzentration im Medium von 20% eingestellt.
Bedingungen:
1,5 l-Fermentationsmedium wurden mit 50 ml Vorkultur angeimpft. Die Zellen wurden zunächst bei 37°C kultiviert, bis die vorgelegte Glucose aufgebraucht war. Danach erfolgte Kultivierung bei gleicher Temperatur bei einer Fütterungsrate von 9 g Glucose × l^–1 × h^–1, bis eine OD₆₀₀ = 40 erreicht war. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Temperatur der Kulturbrühe auf 20°C und die Fütterungsmenge an Glucose auf 2 g × l^–1 × h^–1 gesenkt. Bei einer Temperatur von 20°C erfolgte in der Kultur die Induktion der Kultur mit 0,2 mM IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (Sigma)). Nach Kultivierung für weitere 18 h bei 20°C wurden die Zellen nach Zentrifugation geerntet, in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 5,3 resuspendiert und ein Extrakt wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt.
Beispiel 6: Nachweis der Aktivität der rekombinanten Alternansucrase mittels SDS-PAGE, Periodsäureoxidation und Färbung nach Schiff
Es wurden Proteinextrakte aus E. coli-Schüttelkolbenkulturen (Stamm BL21(DE3)), enthaltend die Plasmide pAlsu-pET24a-3, pAlsu-pET24a-7, pAlsu-pET24a-21 bzw. pET24a (Kontrolle), hergestellt. Von den mit den verschiedenen Extrakten transformierten Zellen wurden jeweils zwei verschiedene Extrakte präpariert, wobei der eine vor der Induktion mit IPTG und der andere nach der Induktion mit IPTG am Ende der Kultivierung hergestellt wurde. Die Aktivität dieser Extrakte aus Schüttelkolbenkulturen (s. Beispiel 5) wurde nach Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE, anschließendem Entfernen des SDS durch Waschen mit 50 mM Natriumacetatpuffer pH 5,3 und Inkubation der Gele in 50 mM Natriumacetat pH 5,3, 5% (Gew./Vol.) Saccharose für 16 h bei 37°C, gefolgt von einer Periodsäureoxidation des gebildeten Polymers und einer Anfärbung mittels saurem Schiff-Reagenz nachgewiesen (Miller und Robyt, Analytical Biochemistry 156, (1986), 357–363).
zeigt, dass in den beiden Extrakten (Herstellung des Extrakts vor bzw. nach IPTG-Induktion), die den Clonierungsvektor pET24a enthielten, keine Sucraseaktivität nachgewiesen wurde. Bei den Stämmen, die mit den Plasmiden pAlsu-pET24a-3, pAlsu-pET24a-7 bzw. pAlsu-pET24a-21 transformiert worden waren, zeigten alle Proteinextrakte am Ende der Induktionsphase Sucraseaktivität (konzentriert in einer Bande).
Vor der Induktion mit IPTG wurden solche Aktivitätsbanden nicht gefunden.
Da das im Gel gebildete Polymer mit den oben beschriebenen Methoden mittels saurem Schiff-Reagenz angefärbt werden kann, ist zu vermuten, dass das Polymer nicht aus reinen α-1,3-verknüpften Einheiten, die zu keiner Färbung führen würden, bestehen kann.
Da das in den Vektoren pAlsu-pET24a-3, pAlsu-pET24a-7 bzw. pAlsu-pET24a-21 enthaltene Gen aus dem Leuconostoc mesenteroides-Stamm NRRL B-1355 isoliert worden ist, der neben der Alternansucrase mindestens eine Dextransucrase exprimiert, konnte mit Hilfe dieser Färbemethode nicht eindeutig bestimmt werden, ob die im Plasmid enthaltene Nucleinsäuresequenz tatsächlich für eine Alternansucrase codiert. Sowohl Dextrane als auch Alternane sind mit dieser Methode nachweisbar, weil beide Polymere α-1,6-Verknüpfungen enthalten.
Beispiel 7: Untersuchungen zur enzymatischen Aktivität rekombinant hergestellter Alternansucrasen nach Wärmebehandlung und zur Spezifität der Alternansucrase
Um polymerisierende Aktivitäten nachzuweisen, wurden Extrakte aus Schüttelkolbenkulturen eingesetzt (vgl. Beispiel 5). 100 μl Extrakt wurden zu jeweils 2 ml Reaktionspuffer (50 mM Natriumacetat pH 5,3, 20% Saccharose) gegeben und bei 37°C für 24 h inkubiert. Zum Vergleich wurde ein durch Behandlung für 10 Min. bei 95°C inaktivierter Extrakt und ein Extrakt aus E. coli BL21(DE3), enthaltend den Vektor pET24a, verwendet. Polymerbildung konnte nur im nicht inaktivierten Ansatz beobachtet werden, wohingegen der für 10 Minuten bei 95°C behandelte Ansatz und der Ansatz mit Extrakt aus BL21(DE3), enthaltend pET24a, zu keiner Polymerbildung führte. Nach Zugabe des gleichen Volumens Ethanol abs. zu allen Ansätzen konnten nur im nicht inaktivierten Ansatz Polymere ausgefällt werden. Diese Beobachtung ist ein deutlicher Hinweis auf die Aktivität der Alternansucrase, da die in NRRL B-1355 vorhandene Dextransucrase durch Behandlung für 30 Min. bei 45°C inaktiviert wird, die Alternansucrase hingegen unter diesen Bedingungen aktiv bleibt. (Lopez-Munguia et al., Enzyme Microb. Technol. 15 (1993), 77–85). Durch enzymatische Bestimmung der freigesetzten Glucose und Fructose bzw. der noch im Reaktionsgemisch enthaltenen Saccharose nach 24 h mittels gekoppeltem enzymatischem Test konnte nur im nicht inaktivierten Extrakt Fructose nachgewiesen werden.
Zur Durchführung des enzymatischen Tests wird entweder aufgereinigtes Protein oder Proteinrohextrakt in unterschiedlichen Verdünnungen in 1 ml-Ansätzen, enthaltend 5% Saccharose und 50 mM Acetat pH 5,5 zugegeben und bei 37°C inkubiert. Nach 5 Min., 10 Min., 15 Min., 20 Min., 25 Min. und 30 Min. werden diesem Ansatz je 10 μl entnommen und durch sofortiges Erhitzen auf 95°C wird die enzymatische Aktivität der Alternansucrase beendet. Im gekoppelten photometrischen Test wird anschließend der Anteil der durch die Alternansucrase freigesetzten Fructose, Glucose bzw. der verbrauchten Saccharose bestimmt. Dazu werden 1 μl bis 10 μl der inaktivierten Probe in 1 ml 50 mM Imidazolpuffer pH 6,9, 2 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 0,4 mM NAD und 0,5 U/ml Hexokinase gegeben. Nach sequentieller Zugabe von ca. 1 U Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (aus Leuconostoc mesenteroides), ca. 1 U Phosphoglucose-Isomerase und ca. 5 U Invertase wird die Absorptionsänderung bei 340 nm gemessen. Anschließend wird mit Hilfe des Lambert-Beerschen-Gesetzes die Menge an freigesetzter Fructose, und Glucose bzw. an verbrauchter Saccharose berechnet.
In den Kontrollansätzen (Inaktivierung des Extraktes durch Behandlung mit 95°C und Extrakt aus E. coli, enthaltend pET24a) konnte keine signifikante Freisetzung von Fructose bzw. keine Abnahme der Saccharose im Reaktionsansatz nach 24 h nachgewiesen werden.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Spezifität der durch die Plasmide pAlsu-pET24a-3, pAlsu-pET24a-7 bzw. pAlsu-pET24a-21 codierten Sucrase die einer Glucosyltransferase ist. Die Spezifität einer Fructosyltransferase, deren Vorhandensein für einige Stämme der Gattung Leuconostoc beschrieben wurde, ist auszuschließen, weil sonst Glucose nachzuweisen sein müsste.
Beispiel 8: Produktion von Alternan mittels in E. coli hergestellter Alternansucrase
100 ml Extrakt, gewonnen aus einer Fermentation von E. coli BL21(DE3), enthaltend das Plasmid pAlsu-pET24a-3 (s. Beispiel 4), wurde zu 900 ml Reaktionspuffer (50 mM Natriumacetat pH 5,3, 20% Sacharose) gegeben und für 24 h bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe der gleichen Menge absoluten Ethanols zum Reaktionsgemisch wurde das gebildete Alternan ausgefällt. Nach zweimaligem Waschen des Niederschlags mit 50% Ethanol erfolgte die Trocknung durch Lyophilisieren. Die Ausbeute des getrockneten Polymers bezogen auf die Menge eingesetzter Saccharose in der Reaktion betrug 60%.
Beispiel 9: HPLC-Analyse von Alternan und Dextran nach Dextranase-Verdau
Sowohl 100 mg des wie in Beispiel 7 hergestellten Polymers als auch 100 mg Dextran T10 (Pharmacia) wurden in 1 ml Wasser gelöst. 40 μl dieser Lösungen wurden jeweils zu 700 μl Reaktionspuffer (50 mM Kaliumphosphat pH 5,7, 8 Einheiten Dextranase, ICN Biomedicals Inc. No. 190097) gegeben und 16 h bei 37°C inkubiert. 50 μl der nicht (s. ) mit Dextranase behandelten und 50 μl der mit Dextranase behandelten Polymerlösungen ( ) wurden mittels HPLC (Dionex, Säule PA-100, NaOH/NaOH-NaAc-Gradient) analysiert. Beim Dextran T10 ist deutlich die Spaltung des Polymers in verschiedene Moleküle mit kleineren Molekulargewichten zu erkennen. Das gesamte hochmolekulare Dextran wird durch Dextranase in kleinere Einheiten (hauptsächlich Isomaltose) überführt. Beim Alternan hingegen treten nach Dextranase-Inkubation nur geringe Mengen an kurzkettigen Oligosacchariden auf. Der überwiegende Anteil des Alternans ist nicht durch Dextranase verdaubar. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass es sich bei dem mittels rekombinanter Alternansucrase hergestellten Produktes nicht um Dextran, sondern um Alternan handelt, von dem bekannt ist, dass es einem enzymatischen Abbau durch Dextranase kaum zugänglich ist (Lopez-Munguia et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993), 77–85).
Beispiel 10: In vitro-Herstellung von Alternan in Anwesenheit von Dextranase
100 μl Extrakt aus Schüttelkolbenkulturen (vgl. Beispiel 5) wurden zu 2 ml Reaktionspuffer (50 mM Natriumacetat pH 5,3, 20% Saccharose) gegeben. Einem weiteren Ansatz wurden zusätzlich 50 Einheiten Dextranase (Biomedicals Inc. No. 190097) zugesetzt. Als Kontrolle dienten zwei entsprechende Ansätze, die anstelle des Enzymextraktes Dextransucrase aus Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F enthielten, wobei einem dieser beiden Ansätze zusätzlich Dextranase zugesetzt wurde.
Für den Reaktionsansatz mit Dextransucrase und Dextranase konnte nach Fällung mit Ethanol keine Polymerbildung beobachtet werden. Für alle anderen Ansätze konnte Polymerbindung beobachtet werden.
Beispiel 11: In vitro-Herstellung von Oligoalternan und HPLC-Analyse
Oligoalternan wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit Hilfe eines Proteinextrakts in Anwesenheit von Maltose hergestellt und anschließend mittels HPLC-Chromatographie (s. Beispiel 2) nachgewiesen (s. ). Zum Vergleich wurde einem Teil dieses Ansatzes nach Herstellung von Oligoalternan 50 Einheiten Dextranase (Biomedicals Inc. No. 190097) zugesetzt und anschließend ebenfalls über HPLC-Chromatographie aufgetrennt (s. ). Vergleicht man die beiden Chromatogramme, so stellt man fest, dass sowohl die Höhe der beiden Peaks, die dem Oligoalternan (α- und β-Anomer) zugeordnet werden können (Retentionszeit zwischen 15,87 und 16,61 Min.), als auch die Höhe aller anderen Peaks, die bereits im Ansatz ohne Dextranase zu erkennen sind, unverändert bleiben. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass mit Hilfe der rekombinant hergestellten Alternansucrase Oligoalternan hergestellt werden kann, ohne gleichzeitig Oligodextran zu produzieren. Oligodextran wäre einem Abbau durch Dextranase zugänglich, was sich durch eine Abnahme der Höhe von Peaks im HPLC-Chromatogramm zeigen müsste, wenn Oligodextran vorliegen würde.
Beispiel 12: Methylierungsanalyse von Alternan
Um das in vitro hergestellte Alternan weiter zu untersuchen, wurde eine Methylierungsanalyse durchgeführt:
Permethylierung:
Die Permethylierung wurde, wie von Ciucanu und Kerek (Carbohydr. Res. 131 (1984), 209–218) beschrieben unter Verwendung von NaOH/MeI in DMSO durchgeführt oder unter Verwendung eines abgewandelten Verfahrens nach Hakomori (Journal of Biochemistry 55 (1964 FEB), 205–208) durchgeführt, das auf der Verwendung von frisch hergestelltem Li-Dimsyl/MeI (Dimsyl = Methylsulfinylcarbanion) in DMSO bei Raumtemperatur beruht. Alle Reaktionen wurden in einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Die Permethylierungsprodukte wurden durch Extraktion des überschüssigen Methyliodids unter Verwendung von Dichlormethan isoliert. DMSO und Salze wurden am Schluss ausgewaschen.
Abbau in teilweise methylierte Sorbitacetate (Methylierungsanalyse)
Die permethylierten Glucane wurden bei 120°C 1 bis 3 Stunden mit 2 N Trifluoressigsäure hydrolisiert. Nach dem Abkühlen wurde die Säure durch Stickstoff entfernt. Dann wurden die resultierenden Glucane zusammen mit einer geringen Menge Toluol distilliert, danach mit NaBD₄ in 1 N Ammoniak reduziert und schließlich mit Pyridin/Acetanhyrid (3 Stunden, 90°C) acetyliert. Die Produkte wurden mit Dichlormethan extrahiert und mit NaHCO₃ gewaschen. Die Produkte in der organischen Phase wurden durch Gas-Chromatographie analysiert.
Analyse der acetylierten Produkte
Die acetylierten Produkte wurden mit Gas-Chromatographie analysiert, die mit einem Chromatographen vom Modell GC 6000 Vega der Firma Carlo-Erba durchgeführt wurde, der mit einem Kaltaufgabegerät, einem 25 m CPSol8CB und einem FID-Detektor ausgerüstet war. Als Trägergas wurde Wasserstoff (80 kPa) verwendet.
Die Identifizierung und Integration der Peaks wurde, wie von Sweet et al. (Carbohydr. Res. 40 (1975), 217) beschrieben, durchgeführt.
Ergebnisse
Die folgenden Hauptbestandteile wurden mit der Gas-Chromatographie identifiziert:

Sorbit acetyliert in Position Interpretation

1, 5 Endständige Glucopyranose

1, 3, 5 3-gebundene Glucopyranose

1, 5, 6 6-gebundene Glucopyranose

1, 3, 5, 6 3,6-gebundene Glucopyranose
Außerdem wurden auch kleine Mengen (relative Menge 0,2–0,4 Mol.-%) der folgenden Bestandteile gefunden: 1, 4, 5- und 1, 3, 4, 5-Sorbit und ein anderer Tetraacetylbestandteil (1, 5, x, y). Es wird angenommen, dass diese Bestandteile auf die nicht vollständig durchgeführte Methylierung zurückzuführen sind.

Die folgenden Mengen wurden für die obengenannten Bestandteile in verschiedenen Experimenten gefunden, die durchgeführt wurden, indem die Dauer der Hydrolyse verändert wurde (durch die Anzahl der Stunden in fetter Schrift angegeben) (MA = Methylierungsanalyse 1; MA-b = Methylierungsanalyse 2):

Werte in Mol.-%
Ac in Pos	MA (1 Std.)	MA (2 Std.)	MA (3 Std.)	MA-b (2 Std.)
1, 5	10,49	10,56	9,17	12,71
1, 3, 5	31,69	34,70	32,95	23,12
1, 4, 5	0,70	0,30	0,36	0,33
1, 5, 6	47,02	44,17	47,23	54,62
1, 3, 4, 5	0,27	0,22	0,25	0,31
1, 5, x, y	0,19	0,32	0,36	0,24
1, 3, 5, 6	9,64	9,73	9,68	8,67

Beispiel 13: Konstruktion einer Expressionskassette für Pflanzen: Vakuolen- und Plastidenexpression einer Alternansucrase.
Unter Verwendung des Plasmids Alsu-pET24a als Matrize und der PCR-Primer A1-5'-1.2 und A1-3'-2.2 (cf. SEQ ID NOs: 53 und 54) wurde die codierende Region der Alternansucrase aus Leuconostoc mesenteroides amplifiziert, die dann durch die Restriktionsenzyme SalI und PstI geschnitten wurde. Dann wurden die resultierenden Fragmente in SalI- und SdaI-verdaute Plasmide a) pBinAR-pat-Hyg und b) pBinAR-fnr-Hyg cloniert. Die resultierenden Plasmide wurden a) pat-Alsu-Hyg (cf. ) und b) fnr-Alsu-Hyg (cf. ) genannt. Anmerkung: Das bakterielle Sekretionssignalpeptid wurde durch die Auswahl der PCR-Primer aus der cds (coding sequence; codierende Sequenz) entfernt. PCR-Bedingungen: Puffer und Polymerase von Boehringer Mannheim (Pwo-Polymerase Nr. 1644947)

DNA 0,5 ng

10 × Puffer + MgSO₄ 5 μl

dNTPs (je 10 mM) 2 μl

Primer Sp-AS-5' 100 nM

Primer Sp-AS-3' 100 nM

Pwo-Polymerase 1,0 Einheit

Destilliertes Wasser ad 50 μl

Reaktionsbedingungen:

Schritt 1 95°C 2:30 Min.

Schritt 2 95°C 0:30 Min.

Schritt 3 47°C 0:30 Min.

Schritt 4 68°C 7:00 Min.

(je Zyklus um 3 Sek. verlängert)

Schritt 5 68°C 15:00 Min.

Die Schritte 2 bis 4 wurden insgesamt 35 mal zyklisch wiederholt.
Beispiel 14: Northern-Blot-Analyse zur Expression von Alternansucrase in transgenen Pflanzen
Blätter oder Knollen von Kartoffelpflanzen, die mit Agrobakterien mit den Plasmiden pat-Alsu-Hyg bzw. fnr-Alsu-Hyg transformiert wurden, wurden in einer Mühle, Typ MM 200, (Retsch GmbH & Co. KG, 42781 Haan, Deutschland) bei 30 Hz 50 Sek. pulverisiert. Die RNA wurde gemäß Logemann et al. (Anal. Biochem. 163 (1987), 16–20) extrahiert. Pro Probe wurden 50 μg RNA auf Formaldehyd enthaltende 1%-Agarosegele aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde die RNA auf Nylonmembranen (Hybond N. Amersham, UK) durch das Capillar-Transfer-Verfahren übertragen (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Ausgabe; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)). Die Fixierung der Nucleinsäuren auf der Membran wurde durch UV-Quervernetzung erreicht (Stratalinker von Stratagene).
Membranen wurden bei 42°C in einem Hybridisierungspuffer (25% (Vol./Vol.) Formamid, 250 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 250 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA, 7% (Gew./Vol.) SDS, 25% (Gew./Vol.) Polyethyleneglycol 6000, 0,25 mg/ml gescherte Lachssperma-DNA) 6 Stunden vorhybridisiert. Danach wurde über Nacht bei 42°C mit einem zusätzlich eine radioaktiv markierte Sonde enhaltenden Hybridisierungspuffer eine Hybridisierung durchgeführt. Die radioaktive Sonde wurde unter Verwendung des Random Primed DNA Labelling Kit (Boehringer Mannheim, 1004760) und des ungefähr 4 kb KpnI/XhoI-Fragments aus dem Plasmid p-Alsu-pSK gemäß dem Handbuch des Herstellers hergestellt. Membranen wurden einmal bei 50°C 20 Min. in 3 × SSC (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Ausgabe; Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)) gewaschen und danach einmal 20 Min. in 0,5 × SSC gewaschen, bevor die Membran über Nacht einem Röntgenfilm ausgesetzt wurde. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäuremolekül, das ein Protein codiert, das Alternansucraseaktivität aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Nucleinsäuremolekülen, die zumindest die reife Form eines Proteins codieren, das die in SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz oder die Aminosäuresequenz, die durch die in Plasmid DSM 12666 enthaltene cDNA codiert wird, umfasst; (b) Nucleinsäuremolekülen, die die in SEQ ID NO: 1 angegebene Nucleotidsequenz oder die Nucleotidsequenz der cDNA, die in Plasmid DSM 12666 enthalten ist, oder eine entsprechende Ribonucleotidsequenz umfassen; (c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, dessen Aminosäuresequenz eine Homologie von zumindest 40% mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist; (d) Nucleinsäuremolekülen, bei denen ein Strang mit einem der in (a) oder (b) definierten Nucleinsäuremolekülen hybridisiert; (e) Nucleinsäuremolekülen, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die ein biologisch aktives Fragment des Proteins, das durch eines der in (a), (b), (c) oder (d) definierten Nucleinsäuremoleküle codiert ist; und (f) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes von der Sequenz der in (a), (b), (c), (d) oder (e) definierten Nucleinsäuremoleküle abweicht.
Oligonucleotid oder Polynucleotid, das mit einem Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 spezifisch hybridisiert.
Vektor, enthaltend ein Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1.
Vektor gemäß Anspruch 3, wobei das Nucleinsäuremolekül in Sense-Orientierung mit regulatorischen Elementen verbunden ist, die die Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.
Plasmid pAlsu-pSK, hinterlegt unter der Zugangsnummer DSM 12666.
Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder einem Vektor gemäß Anspruch 3 oder 4 transformiert ist oder von einer solchen Zelle abstammt.
Wirtszelle nach Anspruch 6, die eine Zelle eines Mikroorganismus ist.
Wirtszelle nach Anspruch 6, die eine E. coli-Zelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder eines Fragments davon, wobei das Protein oder das Fragment davon Alternansucraseaktivität aufweist, wobei eine Wirtzelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 unter Bedingungen gezüchtet wird, die die Synthese des Proteins gestatten, und wobei das Protein aus den gezüchteten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.
Transgene Pflanzenzelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder einem Vektor gemäß Anspruch 3 oder 4 transformiert ist oder von einer solchen Zelle abstammt, wobei das Nucleinsäuremolkül, das das Protein mit Alternansucraseaktivität codiert, unter der Kontrolle regulatorischer Elemente steht, die die Transkription einer translatierbaren mRNA in Pflanzenzellen gestatten.
Pflanze, enthaltend Pflanzenzellen gemäß Anspruch 10.
Pflanze gemäß Anspruch 11, die eine Nutzpflanze ist.
Pflanze gemäß Anspruch 11 oder 12, die eine Zucker-speichernde oder eine Stärke-speichernde Pflanze ist.
Vermehrungsmaterial einer Pflanze gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Vermehrungsmaterial die Pflanzenzellen gemäß Anspruch 10 enthält.
Verfahren zur Herstellung von Alternan, umfassend die Schritte des Extrahierens und Isolierens von Alternan aus einer Pflanze gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13.
Verfahren zur Herstellung von Alternan und/oder Fructose, wobei (a) eine Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 eine Alternansucrase in ein Saccharose-enthaltendes Kulturmedium sezerniert; und (b) Alternan und/oder Fructose aus dem Kulturmedium isoliert wird/werden.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Wirtszelle immobilisiert ist.
Verfahren zur Herstellung kosmetischer Produkte oder von Nahrungsmittelprodukten, umfassend ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17 und das Formulieren des erhaltenen Alternan in einer Form, die für die Verwendung als kosmetisches Produkt oder Nahrungsmittelprodukt geeignet ist.