DE4447388A1

DE4447388A1 - DNA-Sequenzen, die die Synthese linearer alpha-1,4-Glukane in Pflanzen, Pilzen und Mikroorganismen ermöglichen

Info

Publication number: DE4447388A1
Application number: DE19944447388
Authority: DE
Inventors: Jens Dr Kosmann; Volker Dr Buettcher; Thomas Welsh
Original assignee: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Current assignee: Bayer Bioscience GmbH
Priority date: 1994-12-22
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 1996-06-27

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft gentechnologische Verfahren zur Herstellung von Pflanzen und Mikroorganismen, die in der Lage sind, intra- oder extrazellulär ein Protein zu exprimieren, das eine Amylosucrase-Aktivität aufweist und die Synthese linearer α- 1,4-Glukane aus Saccharose katalysiert.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue DNA-Sequenzen und Plasmide, enthaltend diese DNA-Sequenzen, die nach Einführung in das Genom einer Pflanze oder nach Transformation in Mikroorganismen, insbesondere Bakterien oder Pilze, zur Expression eines Enzyms führen, das die Synthese von linearen α- 1,4-Glukanen aus Saccharose katalysiert, sowie die transgenen Organismen (i.e. Pflanzen, Pilze und Mikroorganismen), die die obengenannten DNA-Sequenzen enthalten.

Beschreibung

Lineare α-1, 4-Glukane sind Polysaccharide, die aus Glukosemonomeren aufgebaut sind. Dabei sind die Glukosemonomere ausschließlich über α-1,4-glykosidische Bindungen miteinander verbunden. Das am häufigsten in der Natur vorkommende α-1,4- Glukan ist die Amylose, ein Bestandteil der pflanzlichen Stärke. Der Verwendung linearer α-1,4-Glukane im industriellen Bereich kommt in letzter Zeit immer größere Bedeutung zu. Amylose kann aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften für die Herstellung selbsttragender Filme verwendet werden. Diese Filme sind farblos, geruch- und geschmacklos, nicht toxisch und biologisch abbaubar. Sie finden bereits heute eine ganze Reihe von Anwendungsmöglichkeiten, so z . B. in der Lebensmittelindustrie, der Textilindustrie, der Glasfaserindustrie und bei der Papierherstellung.

Weiterhin ist es gelungen, aus Amylose Fasern herzustellen, die in ihrem Verhalten der natürlichen Zellulosefaser ähnlich sind, und einen Teil- bzw. Vollaustausch für diese in der Papierherstellung ermöglichen.

Amylose als wichtigster Vertreter der linearen α-1,4-Glukane findet darüber hinaus Anwendung insbesondere als Bindemittel zur Tablettenherstellung, als Eindicker von Pudding und Cremes, als Gelatineersatz, als Binder bei der Herstellung schalldämmender Wandplatten und zur Verbesserung der Fließeigenschaften von paraffinhaltigen Ölen.

Eine weitere Eigenschaft der linearen α-1,4-Glukane, die in jüngster Zeit immer mehr Interesse findet, ist die Fähigkeit dieser Moleküle, aufgrund ihrer helikalen Struktur Einschlußverbindungen mit organischen Komplexanden einzugehen. Dieses ermöglicht eine Anwendung auf den verschiedensten Gebieten. Diskutiert wird die Verwendung zur molekularen Verkapselung von Vitaminen, Arzneistoffen und Aromastoffen, sowie die Verwendung zur chromatographischen Auftrennung von Substanzgemischen an immobilisierten linearen α-1,4-Glukanen.

Amylose dient ferner als Ausgangsstoff für die Herstellung von sogenannten Cyclodextrinen (auch Cycloamylosen, Cyclomaltosen), die ihrerseits breite Anwendung insbesondere in der Pharmaindustrie, Lebensmitteltechnologie, Kosmetik und analytischen Trenntechnik finden. Bei diesen handelt es sich um cyclische Maltooligosaccharide aus 6-8 Monosaccharideinheiten, die gut wasserlöslich sind, aber einen hydrophoben Hohlraum besitzen, der für die Bildung von Einschlußkomplexen genutzt werden kann.

Die Gewinnung linearer α-1,4-Glukane erfolgt heutzutage in Form von Amylose aus Stärke. Stärke selber ist aber aus zwei Komponenten aufgebaut. Eine Komponente bildet die Amylose als unverzweigte Kette aus α-1,4-verknüpften Glukoseeinheiten. Die andere Komponente bildet das Amylopektin, ein hochverzweigtes Polymer aus Glukoseeinheiten, bei dem neben den α-1,4- Verbindungen noch Verzweigungen der Glukoseketten über α-1,6- Verbindungen auftreten. Aufgrund der unterschiedlichen Struktur dieser beiden Komponenten und den daraus resultierenden physikalisch-chemischen Eigenschaften finden die beiden Komponenten auch weitgehend unterschiedliche Verwendungsmöglichkeiten. Um sich die Eigenschaften der einzelnen Komponenten direkt zu Nutze machen zu können, ist es erforderlich, diese in reiner Form zu gewinnen. Beide Komponenten können aus Stärke gewonnen werden, was jedoch eine Reihe von Reinigungsschritten erfordert und zeit- und kostenintensiv ist.

Es besteht daher ein dringender Bedarf, Möglichkeiten zu finden, die beiden Komponenten der Stärke bereits in einheitlicher Form gewinnen zu können. Um dieses zu erreichen, ging man bisher den Weg, stärkeproduzierende Pflanzen durch Züchtung oder gentechnische Manipulation dahingehend zu verändern, daß sie Stärke mit verändertem Amylose/Amylopektin-Verhältnis produzieren. Während der normale Amylopektinanteil bei Maisstärke z. B. bei ca. 70% liegt, gelang es, durch Züchtung eine Maissorte (waxy maize) zu etablieren, deren Stärke zu nahezu 100% aus Amylopektin besteht (Akatsuka and Nelson, 1966, J. Biol. Chem. 241: 2280-2285).

Des weiteren wurden verschiedene Maislinien mit einem erhöhten Amylosegehalt (60-70%) mittels züchterischer Maßnahmen erstellt, z. B. die Sorten amylose extender und dull (Wolf et al., 1955, J. Am. Chem. Soc. 77: 1654-1659; Boyer et al., 1976, Die Stärke: 28: 405-410). Auch in anderen Pflanzenspezies wurden Linien erstellt, die einheitliche Stärken in Form von Amylopektin synthetisieren, z. B. bei Reis (Sano, 1984, Theor. Appl. Genet. 68: 467-473) und Gerste (Shannon and Garwood, 1984, in: Whistler, Bemiller, Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, Orlando, 2nd Edition: 25-86) oder die hochgradig amylosehaltige Stärke synthetisieren (z. B. bei der Erbse).

Neben diesen auf klassisch-züchterischen Verfahren beruhenden Ansätzen besteht eine weitere Möglichkeit für die Herstellung von Pflanzen, die eine hochgradig amylosehaltige Stärke produzieren, in dem Transfer und der kontrollierten Expression von Genen homologen oder heterologen Ursprungs, die an der Stärkebiosynthese, dem Stärkeabbau oder der Stärkemodifikation beteiligt sind, in Pflanzen. Von Interesse ist dabei sowohl die Inhibition der Expression endogener Enzyme durch antisense- Konstrukte, als auch die Expression von Enzymen, deren Aktivität in Pflanzen nicht nachweisbar ist und die nicht den Regelmechanismen unterliegen, die auf die endogen in der Pflanze vorkommenden, an der Stärkebiosynthese, dem Stärkeabbau oder der Stärkemodifikation beteiligten Enzymen ausgeübten werden.

So ist aus Visser et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 225: 289-296) bekannt, daß durch antisense-Inhibition des Gens für die Stärkekorn-gebundene Stärkesynthese in Kartoffel Sorten erzeugt werden können, die weitgehend reine Amylopektinstärke bilden.

Aus der WO 92/14827 ist ein Verzweigungsenzym der Kartoffel bekannt, das als Q-Enzym bezeichnet wird. Dieses führt die α-1,6- Verbindungen ein und ist somit für die Bildung der Amylopektinstärke verantwortlich. Mit Hilfe der DNA-Sequenzen, die die Information für dieses Enzym aus Solanum tuberosum enthalten, können durch antisense-Konstrukte transgene Kartoffelpflanzen hergestellt werden, bei denen die Expression dieses Enzyms stark inhibiert ist. Dies bewirkt, daß in diesen Pflanzen das Amylose/Amylopektin-Verhältnis der Stärke zugunsten eines erhöhten Amyloseanteils verändert ist. Eine hochgradig amylosehaltige Stärke wird von den in der WO 92/14827 beschriebenen Pflanzen jedoch nicht gebildet.

Trotz zahlreicher Bemühungen und verschiedenartiger Ansätze ist die Herstellung von Pflanzen, die eine reine Amylosestärke produzieren, bisher noch nicht gelungen.

Auch ist bisher keine Möglichkeit beschrieben worden, Mikroorganismen zur Synthese von hochgradig reiner Amylose bzw. reiner linearer α-1,4-Glukane zu verwenden.

Aus dem Mikroorganismus Neisseria polysaccharea ist ein Enzym bekannt, die Amylosucrase (auch Sucrose: 1,4-α-D-Glucan 4-α- Glucosyltransferase, E.C. 2.4.1.4.), für das der folgende Reaktionsmechanismus vorgeschlagen wird:

Saccharose + (α-1,4-D-Glykosyl) _n → D-Fruktose + (α-1,4-D-Glykosyl) _n+1

Es handelt sich dabei um eine Transglykosylierung. Die Produkte dieser Reaktion sind unlösliche lineare α-1,4-Glukane und Fruktose. Cofaktoren werden nicht benötigt. Amylosucraseaktivität wurde bisher nur in wenigen Bakterienarten gefunden, darunter hauptsächlich Neisseria Spezies (MacKenzie et al., 1978, Can. J. Microbiol. 24: 357-362) und das Enzym ist bisher lediglich in seiner enzymatischen Aktivität untersucht worden. Das partiell aufgereinigte Enzym aus Neisseria perflava führt nach Zugabe von Saccharose zur Synthese glykogenartiger Polysaccharide, die zu einem geringen Ausmaß Verzweigungen aufweisen (Okada et al., 1974, J. Biol. Chem., 249: 126-135). Ebenso zeigen auch die intra- bzw. extrazellulär synthetisierten Glukane von Neisseria perflava bzw. Neisseria polysaccharea einen gewissen Verzweigungsgrad (Riou et al., 1986, Can. J. Microbiol. 32: 909-911). Ob diese Verzweigungen durch die Amylosucrase eingeführt werden oder durch ein anderes Enzym, das in aufgereinigten Amylosucrase- Präparationen als Kontamination auftritt, konnte bisher nicht geklärt werden. Da der Nachweis eines Enzyms, das Verzweigungen einführt, bisher nicht gelungen ist, wurde vermutet, daß sowohl die Polymerisierungs- als auch die Verzweigungsreaktionen von Amylosucrase katalysiert werden (Okada et al., 1974, J. Biol. Chem., 249: 126-135).

Das Enzym, das in Neisseria konstitutiv exprimiert wird, ist extrem stabil, bindet sehr fest an die Polymerisationsprodukte und wird kompetitiv durch das Produkt Fruktose inhibiert (MacKenzie et al., 1977, Can. J. Microbiol. 23: 1303-1307). Bei der Neisseria Spezies Neisseria polysaccharea wird die Amylosucrase sekretiert (Riou et al., 1986, Can. J. Microbiol. 32: 909-911), wohingegen sie bei den anderen Neisseria Arten in der Zelle verbleibt.

Enzyme mit einer Amylosucrase-Aktivität konnten bisher nur in Mikroorganismen nachgewiesen werden. Aus Pflanzen sind Amylosucrasen nicht bekannt.

Ebenso wurden bisher keine DNA-Sequenzen, die für eine Amylosucrase kodieren, beschrieben.

Die vorliegende Erfindung stellt nun DNA-Sequenzen und Verfahren zur Verfügung, die es ermöglichen, Pflanzen herzustellen, die in der Lage sind, reine Amylosestärke zu produzieren, sowie stärkeproduzierende Pflanzen dahingehend zu verändern, daß sie insgesamt höhere Stärkeerträge mit gleichzeitig erhöhtem Amylose/Amylopektin-Verhältnis liefern. Weiterhin können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen dazu verwendet werden, Mikroorganismen und Pilze, insbesondere Hefen, herzustellen, die in der Lage sind, ein Enzym zu produzieren, das die Synthese linearer α-1,4-Glukane aus Saccharose katalysiert.

Ferner ist es mit Hilfe der besagten DNA-Sequenzen bzw. der Proteine, für die sie kodieren, möglich, kostengünstig reinen Fruktosesirup herzustellen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase kodieren, insbesondere DNA-Sequenzen aus Mikroorganismen, vorzugsweise aus gram-negativen Mikroorganismen, speziell aus Mikroorganismen der Gattung Neisseria und besonders bevorzugt aus Neisseria polysaccharea.

Die Erfindung betrifft insbesondere DNA-Sequenzen, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase kodieren, die durch ein Verfahren isoliert werden können, daß folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellung einer genomischen oder einer cDNA-Bibliothek ausgehend von der genomischen DNA oder der mRNA eines Organismus,
b) Transformation eines geeigneten Wirtes mit der in Schritt a) konstruierten Bibliothek,
c) Bedampfung transformierter Zellen mit Ioddampf,
d) Identifizierung von Zellen, die eine Blaufärbung aufweisen,
e) Isolierung und Kultivierung der besagten Zellen, und
f) Isolierung der genomischen DNA-Insertion oder der cDNA- Insertion aus den transformierten Zellen.

Die Erfindung betrifft insbesondere DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase kodieren, wobei die Proteine in SDS-Gelelektrophoresen ein Molekulargewicht von 63 ± 20 kDa aufweisen, vorzugsweise von 63 ± 15 kDa und insbesondere von 63 ± 10 kDa. Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase kodieren, wobei die Proteine die unter Seq ID No. 1 angegebene Aminosäuresequenz oder Teile davon oder Aminosäuresequenzen, die mit dieser im wesentlichen identisch sind, aufweisen.

Die Erfindung umfaßt ferner DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase kodieren und die im wesentlichen die unter Seq ID No. 1 angegebene DNA-Sequenz aufweisen, d. h. DNA-Sequenzen, die einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen. Damit ist eine Homologie von mindestens 40% bis 60%, vorzugsweise über 60%, insbesondere über 80% und im speziellen eine Homologie von mehr als 95% gemeint. Die Erfindung betrifft daher ebenfalls Derivate der unter Seq ID No. 1 dargestellten DNA-Sequenz, die an einer oder mehreren Positionen von der besagten DNA-Sequenz abweichen, insbesondere Derivate, die durch Insertion, Deletion, Rekombination oder Substitution erhalten wurden und die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase kodieren.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere DNA-Sequenzen, die die unter Seq ID No. 1 angegebene Nukleotidabfolge besitzen oder deren reverses Komplement. Diese DNA-Sequenz ist neu und kodiert für ein Enzym mit Amylosucrase-Aktivität aus Neisseria polysaccharea.

Bei den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen handelt es sich in allen Fällen vorzugsweise um isolierte und gereinigte DNA-Sequenzen bzw. um isolierte und gereinigte DNA-Moleküle, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthalten.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls im wesentlichen reine Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase, insbesondere solche aus Mikroorganismen, vorzugsweise aus gram negativen Mikroorganismen, speziell aus Mikroorganismen der Gattung Neisseria, und besonders bevorzugt aus Neisseria polysaccharea. Gegenstand der Erfindung sind ferner im wesentlichen reine Amylosucrasen, die in SDS-Gelelektrophoresen ein Molekulargewicht von 63 ± 20 kDa besitzen, vorzugsweise von 63 ± 15 kDa und besonders bevorzugt von 63 ± 10 kDa.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase, die im wesentlichen die unter Seq ID No. 1 dargestellte Aminosäuresequenz aufweisen. Die Erfindung betrifft ferner Proteine, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die mit der in Seq ID No. 1 dargestellten Aminosäuresequenz im wesentlichen identisch sind und von dieser an einer oder mehreren Positionen abweichen, wobei es sich bei den Abweichungen vorzugsweise um konservative Aminosäureaustausche handelt und das Protein die enzymatische Aktivität einer Amylosucrase besitzt. Somit betrifft die Erfindung ebenfalls Amylosucrasen, deren Aminosäuresequenz zu der in Seq ID No. 1 angegebenen Aminosäuresequenz eine hohe Homologie aufweist, insbesondere eine Homologie von mindestens 70%, vorzugsweise von über 80%, besonders bevorzugt von über 90% und insbesondere eine Homologie von mindestens 99%.

Insbesondere betrifft die Erfindung im wesentlichen reine Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase, die die unter Seq ID No. 1 angegebene Aminosäuresequenz aufweisen.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können in Pflanzen, Pilze oder Mikroorganismen eingeführt und exprimiert werden. Die Expression der DNA-Sequenzen führt zur Bildung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase, das bei Anwesenheit von Saccharose die Synthese linearer α-1,4-Glukane, die physikalische Eigenschaften vergleichbar der Amylose-Stärke aufweisen, katalysiert.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und von DNA- Molekülen, insbesondere Plasmiden, die diese DNA-Sequenzen enthalten, zur Transformation pro- oder eukaryontischer Zellen, sowie zur Expression einer Amylosucrase in pro- oder eukaryontischen Zellen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzenzellen, die in der Lage sind, lineare α-1,4-Glukane zu synthetisieren, dadurch gekennzeichnet, daß in die Pflanzenzellen eine DNA-Sequenz eingeführt und exprimiert wird, die eine für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase kodierende Region umfaßt.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzenzellen und Pflanzen, die in der Lage sind, lineare α-1,4-Glukane zu synthetisieren, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Verfahrensschritte umfaßt:

a) Herstellung einer Expressionskassette mit folgenden Teilsequenzen:
- i) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA in dem vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
- ii) mindestens einer DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase kodiert und in sense-Orientierung an den Promotor fusioniert ist,
- iii) einem in Pflanzen funktionalen Signal für die Transkriptionstermination und Polyadenylierung eines RNA- Moleküls,
b) Transfer der Expressionskassette in pflanzliche Zellen und
c) Regeneration von intakten ganzen Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.

Als Promotoren kommen sowohl solche in Frage, die eine konstitutive Expression des Gens in allen Geweben der Pflanze gewährleisten, wie zum Beispiel der 35S-Promotor des Cauliflower- Mosaik-Virus (CaMV), als auch solche, die eine Expression nur in bestimmten Organen oder zu bestimmten Zeitpunkten in der Entwicklung der Pflanze sicherstellen. Bekannt sind Promotoren, die eine spezifische Expression in den Knollen der Kartoffelpflanze gewährleisten, wie z. B. der B33-Promotor (Liu et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 223: 401-406) oder solche, mit deren Hilfe eine spezifische Expression in den Rüben der Zuckerrübe erreicht werden kann. Weiterhin sind auch DNA-Sequenzen beschrieben, die eine lichtabhängige und gewebespezifische Expression von nachgeschalteten Genen in den Blättern erlauben (Orozco and Ogren, 1993, Plant Mol. Biol. 23: 1129-1138).

Bei der im Verfahrensschritt a) ii) aufgeführte DNA-Sequenz kann es sich prinzipiell um jede beliebige DNA-Sequenz handeln, die eine kodierende Region umfaßt, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase kodiert. Geeignet sind insbesondere DNA-Sequenzen aus Mikroorganismen, vorzugsweise aus gram-negativen Mikroorganismen, speziell der Gattung Neisseria, und insbesondere aus Neisseria polysaccharea.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht die Verwendung von DNA-Sequenzen vor, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase kodieren, wobei das Protein die unter Seq ID No. 1 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen mit dieser identisch ist, aufweist.

Bevorzugt werden DNA-Sequenzen verwendet, die einen hohen Grad an Homologie zu der unter Seq ID No. 1 angegebenen DNA-Sequenz aufweisen, und für eine Amylosucrase kodieren. Ferner können DNA- Sequenzen verwendet werden, die sich aus dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion ableiten lassen, sofern die enzymatische Aktivität dadurch nicht beeinträchtigt wird.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens sieht die Verwendung einer DNA-Sequenz vor, die die unter Seq ID No. 1 aufgeführte Nukleotidsequenz oder Teile davon aufweist, wobei diese Teile lang genug sind, um für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase zu kodieren.

Die DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase kodiert, ist erfindungsgemäß in sense-Orientierung an den Promotor gekoppelt (3′-Ende des Promotors zum 5′-Ende der kodierenden Sequenz). Diese Sequenz kann jedoch auch vor oder nach Verknüpfung mit den die Transkription steuernden Elementen (Promotor und Terminationssignal) modifiziert werden, um gegebenenfalls Eigenschaften des Polypeptids oder seine Lokalisation zu variieren, wie unten ausführlicher beschrieben wird. Die unter Seq ID No. 1 dargestellte DNA-Sequenz kodiert beispielsweise für eine extrazelluläre Amylosucrase. Die Sekretion wird gewährleistet durch eine Signalsequenz, die die 16 N-terminalen Aminosäurereste umfaßt, kodiert durch die Nukleotide 939 bis 986 der unter Seq ID No. 1 dargestellten Sequenz. Da derartige prokaryontische Signalsequenzen in der Regel auch in pflanzlichen Zellen zu einer Sekretion des Proteins führen, wird bei der Verwendung der unter Seq ID No. 1 angegebenen DNA-Sequenz das exprimierte Protein in den Apoplasten der Pflanzen transportiert. Um das Enzym im Cytosol der pflanzlichen Zellen zu exprimieren, muß die Signalsequenz, die die Sekretion bewirkt, entfernt werden. Soll das zu exprimierende Enzym in bestimmte subzelluläre Kompartimente wie Chloroplasten, Amyloplasten, Mitochondrien oder die Vakuole dirigiert werden, dann muß an die Stelle der die Sekretion bewirkenden Signalsequenz eine Signalsequenz oder eine ein Transitpeptid kodierende Sequenz eingesetzt werden, die den Transport des exprimierten Proteins in das jeweilige Kompartiment gewährleistet. Derartige Sequenzen sind bekannt. Für den Transport in die Plastiden kommen z. B. die Transitpeptide der Vorläuferproteine der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphat-Carboxylase (RUBISCO) aus Kartoffel (Wolter et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 846-850) oder des Acyl Carrier Proteins (ACP) in Betracht. Für den Transport in die Vakuole kann die Signalsequenz des Patatins verwendet werden (Sonnewald et al., 1991, Plant J. 1: 95-106). Die verwendeten Sequenzen müssen jeweils im selben Leserahmen wie die das Enzym kodierende DNA-Sequenz sein.

Der Transfer der in Verfahrensschritt a) konstruierten Expressionskassette in pflanzliche Zellen erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von Plasmiden, beispielsweise binären Plasmiden. Es werden dabei bevorzugt Techniken verwendet, die gewährleisten, daß die Expressionskassette stabil in das Genom der transformierten Pflanzenzelle integriert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann prinzipiell auf alle Pflanzenspezies angewendet werde. Von Interesse sind sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Für verschiedene monokotyle und dikotyle Pflanzenspezies sind bereits Transformationstechniken beschrieben worden.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen ist es möglich, Pflanzen dahingehend zu verändern, daß sie Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase exprimieren. Dies ermöglicht die Synthese linearer α-1,4-Glukane in den Pflanzen. Da lineare α-1,4-Glukane ihrem chemischen Aufbau nach mit der in Pflanzen synthetisierten Amylose identisch sind, ist es somit möglich, Pflanzen herzustellen, die reine Amylose synthetisieren, sowie stärkeproduzierende Pflanzen dahingehend zu verändern, daß sie eine Stärke mit einem erhöhten Amyloseanteil synthetisieren.

Bei den meisten Pflanzen werden die im Verlaufe der Photosynthese gebildeten Photoassimilate innerhalb einer Pflanze in Form von Zuckern und zwar vorwiegend in Form der Saccharose zu den jeweiligen Zielorganen transportiert. Da das Substrat für die Polymerisationsreaktion der Amylosucrase Saccharose ist, können daher mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens im Prinzip alle Pflanzen, sowohl dikotyle als auch monokotyle, im Hinblick auf eine Amylosucrase-Expression verändert werden. Bevorzugt sind Nutzpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Gerste, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Tabak oder Kartoffel, aber auch Obst- und Gemüsearten wie Apfel, Pflaume, Karotte, Tomate oder Maniok.

Die Expression einer Amylosucraseaktivität in Pflanzen kann u. a. dazu verwendet werden, um durch die Synthese von Amylose eine Viskositätsänderung von gegebenenfalls aus den Pflanzen gewonnenen Extrakten zu erreichen. Hier ist beispielsweise die Tomate von Interesse. Durch Expression einer Amylosucrase in der Tomatenfrucht, kommt es zur Synthese von Amylose und folglich zu einer Erhöhung der Viskosität von Extrakten, die aus den Früchten gewonnen werden.

Eine Expression der Amylosucrase ist ferner insbesondere in solchen Organen der Pflanzen von Vorteil, die große Mengen an Saccharose speichern. Solche Organe sind z. B. die Rübe der Zuckerrübe oder der Stamm des Zuckerrohrs. Da diese Pflanzen normalerweise keine nennenswerten Mengen an Stärke synthetisieren, ließen sich aus diesen Pflanzen die durch die Amylosucrase synthetisierten linearen α-1,4-Glukanen in reiner Form isolieren.

Der Ort der Biosynthese der Saccharose in pflanzlichen Zellen ist das Cytosol. Der Ort der Speicherung hingegen ist die Vakuole. Beim Transport in das Speichergewebe der Zuckerrübe bzw. der Kartoffel oder beim Transport in das Endosperm von Samen muß die Saccharose den Interzellularraum durchqueren. Für die Expression der Amylosucrase zur Synthese von linearen Glukanen kommen also alle drei Kompartimente in Betracht, d. h. Cytosol, Vakuole und Interzellularraum.

Bei stärkeproduzierenden Pflanzen wie der Kartoffel oder Mais, bei denen die Stärkesynthese und Stärkespeicherung normalerweise in den Amyloplasten erfolgt, würde eine Expression der Amylosucrase im Interzellularraum, im Cytosol oder in der Vakuole zu einer zusätzlichen Synthese von Glukanen in diesen Kompartimenten führen, was insgesamt eine erhebliche Steigerung des Ertrages bedeuten kann.

Da es bei der Kartoffel möglich ist, die in den Amyloplasten synthetisierte Stärke von den im Interzellularraum, im Cytosol oder in der Vakuole mit Hilfe der Amylosucrase synthetisierten linearen α-1,4-Glukanen bei der Stärkegewinnung zu trennen, ließe sich in diesem Fall dieselbe Pflanze zur Gewinnung von Stärke und von linearen α-1,4-Glukanen verwenden.

Weiterhin sind transgene Kartoffelpflanzen sowie Maispflanzen bekannt, bei denen es infolge der Inhibierung der ADP-Glucose- Pyrophosphorylase durch ein antisense-Konstrukt zur völligen Inhibierung der Stärkesynthese in den Knollen bzw. in den Körnern kommt. Statt dessen tritt z. B. bei Kartoffeln eine Akkumulation von löslichen Zuckern, insbesondere Saccharose und Glukose in den Knollen auf (Müller-Röber et al., 1992, EMBO J. 11: 1229-1238; EP 0 455 316). Durch die Expression einer Amylosucrase im Cytosol, der Vakuole oder dem Apoplasten dieser Pflanzen, also in Kompartimenten, in denen keine Verzweigungsenzyme vorhanden sind, kann somit die Synthese hochgradig amylosehaltiger Stärke, d. h. Stärke, die überwiegend aus linearen α-1,4-Glukanen besteht, in diesen Pflanzen erreicht werden.

Der Reaktionsmechanismus, den die Amylosucrase katalysiert, zeichnet sich dadurch aus, daß ein Glukoserest direkt von Saccharose auf ein lineares Glukan übertragen wird. Dagegen wird bei der Biosynthese von linearen Glukanen aus Saccharose in Pflanzen die Saccharose erst wieder in Glukose und Fruktose gespalten, die dann jeweils in die aktivierte Zwischenstufe ADP- Glukose umgewandelt werden. Von der ADP-Glukose wird der Glukoserest durch das Enzym Stärkesynthase auf ein bereits vorhandenes Glukan übertragen, wobei ADP freigesetzt wird. Die Umwandlung der Saccharose in zwei Moleküle ADP-Glukose erfordert dabei mehrere energieverbrauchende Reaktionen.

Daher ist die Energiebilanz der durch die Amylosucrase katalysierten Reaktion im Vergleich zu der Energiebilanz der Synthese von Amylose aus Saccharose in pflanzlichen Zellen wesentlich günstiger, was zu einer erhöhten Ausbeute an synthetisierten Glukanen in Pflanzen, die eine Amylosucraseaktivität exprimieren, führt.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen, Sequenzierungsreaktionen und weitere biochemisch molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Je nach Einführungsmethode der gewünschten Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation) . Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., 1978, Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al., 1985, EMBO J. 4: 277-287 beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen- Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC- Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Glufosinate u. a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Zelle in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., 1986, Plant Cell Reports 5: 81-84). Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bilden die aus den genannten erfindungsgemäßen Verfahren resultierenden veränderten Pflanzenzellen und Pflanzen. Diese sind dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Protein mit enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase exprimieren, wodurch es in den Zellen bzw. den Pflanzen zur Synthese linearer α-1,4-Glukane kommt. Die transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen sind ferner dadurch charakterisiert, daß sie in ihrem Genom stabil integriert ein rekombinantes DNA-Molekül enthalten, daß eine Expressionskassette umfaßt, wobei diese Expressionskassette eine DNA-Sequenz enthält, die für eine Amylosucrase kodiert.

Die mit Hilfe der Amylosucrase in den transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen gebildeten linearen α-1,4-Glukane können in gleicher Weise wie die normalerweise gebildete Stärke aus transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen isoliert werden. Sie stellen ebenfalls einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teile davon für die Expression eines Polypeptides mit Amylosucrase-Aktivität in Mikroorganismen, vorzugsweise in Mikroorganismen, die keine endogene Amylosucrase-Aktivität aufweisen.

Unter Mikroorganismen werden in dieser Anmeldung alle Protisten verstanden, so wie sie z. B. in Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag, 1985, Seite 1-2) definiert sind.

Die biotechnologische Forschung verwendet heutzutage in großem Umfang Mikroorganismen zur Synthese und Verarbeitung verschiedenster Stoffe. Ermöglicht wird dies durch die Bereitstellung einer Vielzahl verschiedener Systeme für die effiziente Expression von prokaryontischen als auch eukaryontischen Genen in Mikroorganismen (für eine Übersicht siehe z. B. Methods in Enzymology 153: 385-516). Vielfach verwendet werden z. B. Stämme der Bakterienspezies Escherichia coli und Bacillus subtilis. Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, insbesondere der unter Seq ID No. 1 dargestellten DNA-Sequenz, ist es nun möglich, ein Protein mit Amylosucrase- Aktivität in Mikroorganismen, für die geeignete Expressionssysteme zur Verfügung stehen, zu exprimieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen, die intra- oder extrazellulär ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase exprimieren, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellung einer Expressionskassette mit folgenden Teilsequenzen:
- i) einem Promotor, der in dem gewählten Mikroorganismus aktiv ist und die Transkription des nachgeschalteten DNA- Abschnitts sicherstellt,
- ii) einer DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase kodiert und in sense-Orientierung an den Promotor fusioniert ist,
- iii) einem in Mikroorganismen funktionalen Signal für die Transkriptionstermination und
b) Transformation eines geeigneten Mikroorganismus mit der in Schritt a) konstruierten Expressionskassette,
c) Kultivierung des transformierten Mikroorganismus unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids erlauben.

Expressionsvektoren sind in großem Umfang in der Literatur beschrieben. Sie enthalten neben einem Selektionsmarker-Gen und einem die Replikation in dem gewählten Wirt sicherstellenden Replikationsursprung in der Regel einen bakteriellen oder viralen Promotor, sowie ein Terminationssignal für die Transkription. Zwischen Promotor und Terminationssignal befindet sich mindestens eine Restriktionsschnittstelle oder ein Polylinker, die die Insertion einer kodierenden DNA-Sequenz ermöglichen. Als Promotorsequenz kann, sofern sie in dem gewählten Organismus aktiv ist, die natürlicherweise die Transkription des entsprechenden Gens steuernde DNA-Sequenz verwendet werden. Diese Sequenz kann aber auch gegen andere Promotor-Sequenzen ausgetauscht werden. Es können sowohl Promotoren verwendet werden, die eine konstitutive Expression des Gens bewirken, als auch induzierbare Promotoren, die eine gezielte Regulation der Expression des nachgeschalteten Gens erlauben. Bakterielle und virale Promotorsequenzen mit diesen Eigenschaften sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Promotoren, die eine besonders starke Expression des nachgeschalteten Gens erlauben, sind z. B. der T7-Promotor (Studier et al., 1990, in Methods in Enzymology 185: 60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al, in Rodriguez, R.L. and Chamberlin, M.J., (Eds.), Promotors, Structure and Function; Praeger, New York, 1982, pp. 462-481; DeBoer et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25), 1p₁, rac (Boros et al., 1986, Gen 42: 97-100) oder ompF.

Bei der im Verfahrensschritt a) aufgeführte DNA-Sequenz kann es sich wiederum um jede beliebige DNA-Sequenz handeln, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase kodiert. Vorzugsweise werden DNA-Sequenzen aus Mikroorganismen, insbesondere gram-negativen Bakterien, bevorzugt der Gattung Neisseria und insbesondere aus Neisseria polysaccharea verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die DNA- Sequenz die unter Seq ID No. 1 aufgeführte Nukleotidsequenz auf, wobei diese in sense-Orientierung an den Promotor gekoppelt ist (3′-Ende des Promotors zum 5′-Ende der kodierenden Sequenz).

Die verwendete Sequenz kann vor oder nach Integration in den Expressionsvektor modifiziert werden, um gegebenenfalls Eigenschaften des Polypeptids oder seine Lokalisation zu variieren, wie unten ausführlicher beschrieben wird.

Anstatt der unter Seq ID No. 1 angegebenen Sequenz können auch DNA-Sequenzen verwendet werden, die sich aus dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion ableiten lassen, sofern die enzymatische Aktivität dadurch nicht beeinträchtigt wird.

Die Transformation der Mikroorganismen in Schritt b) kann in der Regel nach Standardmethoden durchgeführt werden, wie beschrieben in Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press).

Die Kultivierung des transformierten Mikroorganismus erfolgt in Medien, die den Bedürfnissen des jeweils verwendeten Wirts entsprechen müssen, insbesondere unter Berücksichtigung von pH- Wert, Temperatur, Belüftung, etc.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls die aus dem beschriebenen Verfahren resultierenden Mikroorganismen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase kodiert, enthalten, wobei diese Bestandteil eines rekombinanten DNA-Moleküls ist. Dieses rekombinante DNA-Molekül kann je nach der verwendeten Transformationsmethode entweder außerhalb des Genoms in den Zellen vorliegen oder stabil in das Genom der Zellen des verwendeten Mikroorganismus integriert sein.

Die von Neisseria polysaccharea exprimierte Amylosucrase ist ein extrazelluläres Enzym, das außerhalb der Zellen lineare α-1,4- Glukane ausgehend von Saccharose synthetisiert. Dazu werden weder aktivierte Glukosederivate noch Kofaktoren benötigt, wie bei den meisten Synthesewegen für Polysaccharide, die innerhalb der Zellen ablaufen. Die Energie, die für die Bildung der α-1,4- glykosidischen Bindung zwischen den kondensierten Glukoseresten benötigt wird, wird direkt aus der Hydrolyse der Bindung zwischen der Glukose- und der Fruktoseeinheit im Saccharosemolekül gewonnen.

Es besteht daher die Möglichkeit, Amylosucrase sekretierende Mikroorganismen, die mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahrensschritte hergestellt wurden, in saccharosehaltigem Medium zu kultivieren, wobei die sekretierte Amylosucrase im Medium zu einer Synthese linearer α-1,4-Glukane aus Saccharose führt. Diese können aus dem Kulturmedium isoliert werden.

Ferner besteht die Möglichkeit, α-1,4-Glukane in vitro mit Hilfe einer zellfreien Enzympräparation zu synthetisieren.

In diesem Fall werden Amylosucrase sekretierende Mikroorganismen in einem saccharosefreiem Medium, das die Expression der Amylosucrase erlaubt, bis zum Erreichen der stationären Wachstumsphase kultiviert. Nach Abzentrifugieren der Zellen aus dem Wachstumsmedium, kann das sekretierte Enzym aus dem Überstand gewonnen werden. Das Enzym kann dann saccharosehaltigen Lösungen zur Synthese linearer α-1,4-Glukane zugesetzt werden. Im Vergleich zu der Synthese linearer α-1,4-Glukane direkt in einem saccharosehaltigen Wachstumsmedium bietet dieses Verfahren den Vorteil, daß sich die Reaktionsbedingungen besser kontrollieren lassen und die Reaktionsprodukte wesentlich reiner sind und sich einfacher weiter aufreinigen lassen.

Die Reinigung des Enzyms aus dem Kulturmedium kann nach herkömmlichen Reinigungsmethoden wie Fällung, Ionenaustausch- Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Gelfiltration, HPLC Reverse Phase Chromatographie etc. erfolgen.

Weiterhin ist es aber auch möglich, durch Modifikation der in den Expressionsvektor inserierten DNA-Sequenz ein Polypeptid zu exprimieren, das sich aufgrund bestimmter Eigenschaften leichter aus dem Kulturmedium isolieren läßt. So besteht die Möglichkeit, das zu exprimierende Enzym als Fusionsprotein mit einer weiteren Polypeptidsequenz zu exprimieren, deren spezifische Bindungseigenschaften die Isolierung des Fusionsproteins über Affinitätschromatographie ermöglichen.

Bekannt sind z. B. die Expression als Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase und die anschließende Reinigung über Affinitätschromatographie an Glutathion-Säulen. Dabei wird die Bindung der Gluthation-S-Transferase an Glutathion ausgenutzt (Smith and Johnson, 1988, Gene 67: 31-40). Weiterhin bekannt ist die Expression als Fusionsprotein mit dem Maltose Binding Protein (MBP) und anschließende Reinigung über eine Amylosesäule (Guan et al., 1988, Gene 67: 21-30; Maina et al., 1988, Gene 74: 365-373).

Neben der Möglichkeit, das gereinigte Enzym einer saccharosehaltigen Lösung zur Synthese linearer α-1,4-Glukane direkt zuzusetzen, besteht auch die Alternative, das Enzym an einem Trägermaterial zu immobilisieren. Eine derartige Immobilisierung bietet den Vorteil, daß das Enzym als Katalysator der Synthesereaktion auf einfache Weise aus dem Reaktionsgemisch wiedergewonnen und mehrfach verwendet werden kann. Da die Aufreinigung von Enzymen in der Regel zeit- und kostenintensiv ist, ermöglicht eine Immobilisierung und Wiederverwendung des Enzyms eine erhebliche Kosteneinsparung. Ein weiterer Vorteil ist der hohe Reinheitsgrad der Reaktionsprodukte, der unter anderem darauf beruht, daß sich bei der Verwendung immobilisierter Enzyme die Reaktionsbedingungen gut kontrollieren lassen. Die als Reaktionsprodukte auftretenden unlöslichen linearen Glukane lassen sich dann auf einfache Weise weiter aufreinigen.

Für die Immobilisierung von Proteinen stehen eine Vielzahl von Trägermaterialien zur Verfügung, wobei die Kopplung an das Trägermaterial über kovalente oder nicht-kovalente Bindung erfolgen kann (für eine Übersicht siehe: Methods in Enzymology Vol. 135, 136 und 137). Weite Verbreitung als Trägermaterialien haben z. B. Agarose, Zellulose, Polyacrylamid, Silica oder Nylon.

Ebenso wie das gereinigte Enzym lassen sich auch Mikroorganismen, die das gewünschtes Polypeptid exprimieren oder ein bestimmtes Stoffwechselprodukt ausscheiden, immobilisieren. Die Immobilisierung erfolgt hierbei in der Regel durch Einschluß der Zellen in ein geeignetes Material wie z. B. Alginat, Polyacrylamid, Gelatine, Celulose oder Chitosan. Möglich ist aber auch die Adsorption oder die kovalente Bindung der Zellen an ein Trägermaterial (Brodelius and Mosbach, in Methods in Enzymology, Vol. 135: 173-175). Ein Vorteil der Immobilisierung von Zellen ist, daß dadurch wesentlich höhere Zelldichten erreicht werden können, als bei einer Kultivierung in Flüssigkultur. Daraus resultiert eine höhere Produktivität. Weiterhin verringern sich die Kosten für Agitation und Belüftung der Kultur, sowie für Maßnahmen zur Aufrechterhaltung der Sterilität. Ein wichtiger Gesichtspunkt ist auch, daß eine kontinuierliche Produktion möglich ist, so daß lange unproduktive Phasen, die regelmäßig bei Fermentationsprozessen auftreten, vermieden oder zumindest stark reduziert werden können.

Ebenso wie in Mikroorganismen lassen sich die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch für die Expression einer Amylosucrase- Aktivität in Pilzen, insbesondere Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, verwenden. Vektoren für die Expression heterologer Gene in Hefen sind beschrieben (z. B. Bitter et al., 1987, Methods in Enzymology 153: 516-544). Diese Vektoren enthalten neben einem Selektionsmarker-Gen und einem Replikationsursprung für die Vermehrung in Bakterien mindestens ein weiteres Selektionsmarker- Gen, das die Identifizierung transformierter Hefezellen erlaubt, eine die Replikation in Hefen gewährleistende DNA-Sequenz und einen Polylinker für die Insertion der gewünschten Expressionskassette. Die Expressionskassette wird konstruiert aus Promotor, zu exprimierender DNA-Sequenz und einer DNA-Sequenz, die die Transkriptionstermination und die Polyadenylierung des Transkriptes gewährleistet. Promotoren und Transkriptionsterminationssignale aus Saccharomyces sind ebenfalls beschrieben und verfügbar. Ein Expressionsvektor kann in Hefezellen nach Standardmethoden durch Transformation eingeführt werden (Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1990). Zellen, die den Vektor enthalten, werden auf geeignetem Selektionsmedien selektiert und propagiert. In Hefen besteht darüber hinaus die Möglichkeit, die Expressionskassette unter Verwendung eines geeigneten Vektors über homologe Rekombination in das Genom einer Zelle zu integrieren. Das führt zu einer stabilen Vererbung des Merkmals.

Amylosucrase exprimierende Hefe-Stämme lassen sich analog zu Mikroorganismen für die Gewinnung einer sekretierten Amylosucrase verwenden. Kultivierungsmethoden für Hefen sind ausreichend beschrieben (Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1990). Auch die Immobilisierung von Hefezellen ist möglich und wird bereits bei der industriellen Ethanolherstellung angewendet (Nagashima et al., in Methods in Enzymology, Vol. 136: 394-405; Nojima and Yamada, in Methods in Enzymology Vol. 136: 380-394).

Die Verwendung von Amylosucrase-sekretierenden Hefen für die Synthese linearer α-1,4-Glukane in saccharosehaltigem Medium ist dagegen nicht ohne weiteres möglich, da Hefen eine Invertase sezernieren, die extrazelluläre Saccharose spaltet. Die Hefen nehmen die entstehenden Hexosen über einen Hexosetransporter auf. In Riesmeier et al. (1992, EMBO J. 11: 4705-4713) wird jedoch ein Hefestamm beschrieben, der ein defektes suc2-Gen trägt und daher keine Invertase sezernieren kann. Darüber hinaus enthalten diese Hefezellen auch kein Transportsystem, das Saccharose in die Zellen importieren kann. Wird ein derartiger Stamm mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz dahingehend verändert, daß er eine Amylosucrase ins Kulturmedium sezerniert, so erfolgt in einem saccharosehaltigem Kulturmedium die Synthese linearer α-1,4- Glukane durch die Amylosucrase. Die dabei als Reaktionsprodukt entstehende Fruktose kann anschließend von den Hefen aufgenommen werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Möglichkeit, mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auf kostengünstige Art und Weise reinen Fruktosesirup herzustellen. Herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Fruktose sehen zum einen die enzymatische Spaltung von Saccharose mit Hilfe der Invertase vor oder die Spaltung von Stärke in Glukoseeinheiten, meist durch Säurehydrolyse, und anschließende enzymatische Umwandlung der Glukose in Fruktose durch Glukoseisomerase. Beide Verfahren führen jedoch zu Gemischen aus Glukose und Fruktose. Die beiden Komponenten müssen anschließend durch chromatographische Verfahren voneinander getrennt werden.

Die Herstellung reiner Fruktose bzw. reinen Fruktosesirups mit Hilfe eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase erfolgt vorzugsweise im zellfreien System unter Verwendung des gereinigten Enzyms. Dieses kann dabei an einem geeigneten Trägermaterial immobilisiert sein oder frei in Lösung vorliegen. In Anwesenheit von Saccharose kommt es zum einem zur Synthese linearer Glukane und zum anderen zur Freisetzung von Fruktose. Die Trennung des Substrates von den Reaktionsprodukten, bzw. die Trennung der beiden Reaktionsprodukte kann beispielsweise durch Verwendung von Membranen erreicht werden, die den Durchtritt von Fruktose, aber nicht von Saccharose oder von Glukanen erlauben. Wird für das kontinuierliche Entfernen der Fruktose über eine derartige Membran gesorgt, kommt es zu einer mehr oder weniger vollständigen Umsetzung der Saccharose.

Ferner kann die Amylosucrase vorzugsweise an einem Trägermaterial immobilisiert zwischen zwei Membranen lokalisiert sein, von denen die eine den Durchtritt von Fruktose, aber nicht von Saccharose oder Glukanen erlaubt, und die andere den Durchtritt von Saccharose, aber nicht von Glukanen erlaubt. Die Versorgung mit Substrat erfolgt durch die Membran, die den Durchtritt von Saccharose erlaubt. Die synthetisierten Glukane verbleiben in dem Raum zwischen den beiden Membranen, und die freigesetzte Fruktose kann durch die Membran, die lediglich den Durchtritt von Fruktose erlaubt, kontinuierlich aus dem Reaktionsgleichgewicht abgezogen werden. Durch eine derartige Anordnung ist eine effiziente Trennung der Reaktionsprodukte und somit u. a. die Herstellung reiner Fruktose möglich.

Die Verwendung von Amylosucrasen zur Herstellung von reiner Fruktose besitzt daher zum einen den Vorteil, daß das vergleichsweise preisgünstige Substrat Saccharose als Ausgangssubstanz verwendet werden kann, und zum anderen kann die Fruktose auf einfache Art und Weise, ohne chromatographische Verfahren aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden.

Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung von Proteinen mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase zur Herstellung von Fruktose.

Eine weitere Möglichkeit der Verwendung von Proteinen mit Amylosucrase-Aktivität besteht in der Verwendung zur Herstellung von Cyclodextrinen. Cyclodextrine werden hergestellt durch den Abbau von Stärke mittels des Enzyms Cyclodextrin-Transglykosylase (EC 2.4.1.19), das aus dem Bakterium Bacillus macerans gewonnen wird. Durch die Bereitstellung von weitgehend reinen Proteinen mit Amylosucrase-Aktivität ist es möglich, Cyclodextrine ausgehend von Saccharose zu synthetisieren durch gleichzeitige Einwirkung von Amylosucrase und Cyclodextrin-Transglykosylase, wobei die Amylosucrase die Synthese linearer Glukane aus Saccharose katalysiert und die Cyclodextrin-Transglykosylase die Umwandlung dieser Glukane in Cyclodextrine.

Neben den bisher erläuterten Anwendungsmöglichkeiten ist es ferner möglich, die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen durch Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Insertion, Deletion, Substitution oder Rekombination modifizieren, um bestimmte Eigenschaften des zu exprimierenden Proteins zu verändern. Darunter fallen z. B. auch die Deletion der Signalsequenz, die die Sekretion des Enzyms gewährleisten, sowie die Insertionen anderer Signalsequenzen oder DNA-Sequenzen, die für Transitpeptide kodieren, und dadurch die Lokalisation des exprimierten Proteins beeinflussen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der unter Seq ID No. 1 angeführten erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder Teile davon, um zu bestimmen, ob in bestimmten Organismen homologe DNA-Sequenzen vorhanden sind oder exprimiert werden. Dazu werden DNA- bzw. mRNA-Proben des jeweiligen Organismus mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen nach bekannten Standardmethoden hybridisiert.

Weiterhin ist es möglich mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen nach Standardverfahren aus dem Genom verschiedener Organismen homologe Sequenzen zu isolieren, die ebenfalls Amylosucrasen oder Enzyme mit ähnlichen Eigenschaften kodieren. Homologie bedeutet in diesem Zusammenhang eine Sequenzidentität von mindestens 40% bis 60%, vorzugsweise über 60%, insbesondere über 80% im speziellen ein Sequenzidentität von über 95%. Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen den betreffenden DNA-Sequenzen oder Aminosäuresequenzen besteht. Bei den Sequenzen, die homolog zu den erfindungsgemäßen Sequenzen sind und von der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz bzw. Aminosäuresequenz an einer oder mehreren Positionen abweichen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Sequenz, die Modifikationen darstellen, die dieselbe Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln.

Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen DNA- Sequenz kodierten Proteine weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf. Dazu können z. B. Enzymaktivität, immunologische Reaktivität, Komformation etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z. B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität etc.

Mit DNA-Sequenzen, die zu den erfindungsgemäßen Sequenzen homolog sind, können wiederum Konstrukte zur Transformation von Pflanzen, Hefen oder Mikroorganismen hergestellt werden.

Um verwandte DNA-Sequenzen zu bestimmen, müssen zunächst Genbanken des jeweils zu untersuchenden Organismus angelegt werden, die repräsentativ für den Gehalt der Gene des Organismus oder für die Expression von Genen in dem Organismus oder einem bestimmten Gewebe des Organismus sind. Erstere sind genomische, letztere sind cDNA-Banken.

Die Identifizierung und Isolierung homologer DNA-Sequenzen aus derartigen Bibliotheken erfolgt dabei mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY).

Als Hybridisierungsprobe können DNA-Moleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter Seq ID No. 1 angegebene DNA-Sequenz oder Teil dieser Sequenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten DNA-Fragmente kann es sich auch um synthetische DNA-Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen DNA-Synthesetechniken hergestellt wurden und im wesentlichen mit der erfindungsgemäß Sequenz übereinstimmen. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz kodierten Proteine erforderlich.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch DNA-Sequenzen, die zu den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen homolog sind, mit diesen hybridisieren und die für ein Protein kodieren, das die enzymatische Aktivität einer Amylosucrase besitzt. Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet in diesem Zusammenhang eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY) beschrieben sind.

Gegenstand der Erfindung sind auch Vektoren, insbesondere Plasmide, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teile dieser Sequenzen enthalten, z. B. das Plasmid pNB2, das unter der DSM-Nr. 9196 hinterlegt wurde. Die Erfindung betrifft insbesondere Plasmide, die die Expression eines Proteins mit Amylosucrase-Aktivität in Mikroorganismen, Pilzen oder Pflanzen gewährleisten, z. B. Plasmide, die folgende DNA-Sequenzen enthalten:

a) einen geeigneten in Mikroorganismen aktiven Promotor, der sicherstellt, daß die nachgeschaltete kodierende Sequenz in Mikroorganismen abgelesen wird, und
b) eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das Amylosucrase-Aktivität aufweist, und die so an den Promotor gekoppelt ist, daß die Bildung einer in ein Polypeptid translatierbaren RNA erlaubt wird,

oder Plasmide, die folgende DNA-Sequenzen enthalten:

a) einen geeigneten in Pflanzen aktiven Promotor, der sicherstellt, daß die nachgeschaltete kodierende Sequenz zum geeigneten Zeitpunkt bzw. in einem geeigneten Entwicklungszustand in einer transgenen Pflanze oder in bestimmten Geweben einer transgenen Pflanze abgelesen wird, und
b) eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das Amylosucrase-Aktivität aufweist, und die so an den Promotor gekoppelt ist, daß die Bildung einer in ein Polypeptid translatierbaren RNA erlaubt wird.

Der Nachweis der enzymatischen Aktivität der Amylosucrase kann durch den Nachweis der synthetisierten Glukane erfolgen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Dieser wird in der Regel mit Hilfe einer Jodfärbung durchgeführt. Die Identifizierung von Bakterienkolonien, die eine Amylosucrase exprimieren ist beispielsweise durch Behandlung mit Ioddampf möglich. Kolonien, die lineare α-1,4-Glukane synthetisieren, werden dabei blau angefärbt.

Der Nachweis der Enzymaktivität des gereinigten Enzyms ist beispielsweise auf Saccharose-haltigen Agaroseplatten möglich. Wird das Protein auf eine derartige Platte aufgebracht und für ca. 1 h bei 37°C inkubiert, diffundiert es in die Agarose und führt zur Synthese linearer Glukane. Diese lassen sich wiederum durch Behandlung mit Ioddampf nachweisen. Ferner kann das Protein in nativen Polyacrylamidgelen nachgewiesen werden. Dazu wird nach einer nativen Polyacrylamidgelelektrophorese das Gel in Natriumcitrat-Puffer (50 mM, pH 6,5) äquilibriert und über Nacht in einer Saccharoselösung (5% in Natriumcitrat-Puffer) inkubiert. Anschließende Färbung mit Lugolscher Lösung führt in Bereichen, in denen Proteine mit einer Amylosucrase-Aktivität lokalisiert sind, zu einer Blaufärbung.

Hinterlegung

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellten und verwendeten Plasmide wurden bei der als internationale Hinterlegungsstelle anerkannten Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrages für die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke der Patentierung hinterlegt.

Am 06.05.1994 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgendes Plasmid hinterlegt (Hinterlegungsnummer):

Plasmid pNB2 (DSM 9196)

Verwendete Abkürzungen

IPTG
Isopropyl β-D-Thiogalacto-Pyranosid

Verwendete Medien und Lösungen

YT-Medium
8 g Bacto-Trypton
5 g Yeast Extract
5 g NaCl
ad 1000 ml mit ddH₂O

Yt-Platten
YT-Medium mit 15 g Bacto-Agar/1000 ml

Lugolsche Lösung
12 g KI
6 g I₂
ad 1,8 l mit ddH₂O

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt das Plasmid pNB2 (DSM 9196).

Die fein gezogene Linie entspricht der Sequenz des Klonierungsvektors pBluescript SK(-). Die starke Linie repräsentiert die ca. 4.2 kb lange Insertion genomische DNA aus Neisseria polysaccharea. Die kodierende Region für Amylosucrase ist als Pfeil unterhalb der Insertion dargestellt.

Oberhalb der Insertion ist der sequenzierte Bereich dargestellt. Alle Zahlenangaben beziehen sich auf diesen 2883 bp langen Bereich.

Fig. 2 zeigt den Nachweis der Expression einer Amylosucrase- Aktivität in transformierten E.coli-Zellen durch Jodbedampfung.

E.coli-Zellen, die mit dem pBluescript II SK-Plasmid transformiert worden waren (A) und E.coli-Zellen, die mit dem Plasmid pNB2 transformiert worden waren (B), wurden auf YT- Platten (1.5% Agar; 100 µg/ml Ampicillin; 5% Saccharose; 0.2 mM IPTG) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten mit Jod bedampft. Kolonien der Zellen, die mit dem Plasmid pNB2 transformiert waren, wiesen einen deutlichen blauen Hof auf.

Beispiele Beispiel 1 Isolierung einer genomischen DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase-Aktivität kodiert, aus Neisseria polysaccharea

Für die Isolierung einer DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase- Aktivität kodiert, aus Neisseria polysaccharea, wurde zunächst eine genomische DNA-Bibliothek angelegt. Hierzu wurden Neisseria polysaccharea-Zellen auf "Columbia blood agar"-Platten (Difco) für 2 Tage bei 37°C angezogen. Die entstandenen Kolonien wurden von den Platten geerntet. Genomische DNA wurde nach der Methode von Ausubel et al. (in: Current Protocols in Molecular Biology (1987); J. Wiley, NY) isoliert und aufgearbeitet. Die so gewonnene DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease Sau3A partiell verdaut. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden in den mit BamHI geschnittenen Vektor pBluescriptSK(-) ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in E.coli XL1-Blue-Zellen transformiert. Die Zellen wurden zur Selektion auf YT-Platten mit Ampicillin als Selektionsmarker ausplattiert. Das Selektionsmedium enthielt zusätzlich 5% Saccharose und 1 mM IPTG. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die gewachsenen Bakterienkolonien einer Jodfärbung unterzogen. Dies erfolgte, indem kristallines Jod in den Deckel einer Petrischale gegeben wurde und die Kulturschalen mit den Bakterienkolonien jeweils 10 min kopfüber auf die Petrischale gelegt wurden. Durch das bei Raumtemperatur verdampfende Jod wurden Bereiche auf den Kulturschalen, die amyloseartige Glukane enthielten blau angefärbt. Aus Bakterienkolonien, die von einem blauen Hof umgeben waren, wurde nach der Methode von Birnboim (1979, Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523) Plasmid-DNA isoliert. Diese wurde retransformiert in E.coli SURE-Zellen. Die transformierten Zellen wurden auf YT- Platten mit Ampicillin als Selektionsmarker ausplattiert. Positive Klone wurden isoliert.

Beispiel 2 Sequenzanalyse der genomischen DNA-Insertion des Plasmids pNB2

Aus einem entsprechend Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen E.coli- Klon wurde ein rekombinantes Plasmid isoliert. Restriktionsanalysen ergaben, daß dieses Plasmid ein Ligationsprodukt aus zwei Vektormolekülen und einem ca. 4.2 kb großen genomischen Fragment war. Das Plasmid wurde mit der Restriktionsendonuklease Pst I geschnitten, und das genomische Fragment wurde isoliert (GeneClean, Bio101). Das so erhaltene Fragment wurde in einen mit Pst I linearisierten pBluescript II SK-Vektor ligiert. Dadurch erfolgte eine Verdoppelung der Pst I- und Sma I-Schnittstellen. Das Ligationsprodukt wurde in E.coli- Zellen transformiert, und diese wurden zur Selektion auf Ampicillin-Platten ausgestrichen. Positive Klone wurden isoliert. Aus einem dieser Klone wurde das Plasmid pNB2 (Fig. 1) isoliert und ein Teil der Sequenz seiner genomischen DNA-Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxymethode (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467) bestimmt. Die gesamte Insertion ist ca. 4.2 kbp lang. Die Nukleotidsequenz wurde von einer Teilsequenz mit einer Länge von 2883 bp bestimmt. Diese Nukleotidsequenz ist oben angegeben (Seq. ID No. 1). Die Lokalisation des sequenzierten Bereiches in der genomischen Insertion ist in Fig. 1 angegeben.

Beispiel 3 Expression einer extrazellulären Amylosucrase-Aktivität in transformierten E.coli-Zellen a) Nachweis einer Amylosucrase-Aktivität bei Wachstum auf YT- Platten

Für die Expression einer extrazellulären Amylosucrase-Aktivität wurden E.coli-Zellen nach Standardmethoden mit dem Vektor pNB2 transformiert. Eine Kolonie des transformierten Stammes wurde auf YT-Platten (1.5% Agar; 100 µg/ml Ampicillin; 5% Saccharose; 0.2 mM IPTG) über Nacht bei 37°C inkubiert. Der Nachweis der Amylosucrase-Aktivität erfolgte durch Bedampfung mit Jod (Fig. 2). Amylosucrase-exprimierende Kolonien weisen einen blauen Hof auf. Amylosucrase-Aktivität ist auch bei Abwesenheit von IPTG zu beobachten aufgrund der Aktivität des endogenen Amylosucrase- Promotors.

b) Nachweis einer Amylosucrase-Aktivität bei Wachstum in YT- Medium

Für die Expression einer extrazellulären Amylosucrase-Aktivität wurden E.coli-Zellen nach Standardmethoden mit dem Vektor pNB2 transformiert. YT-Medium (100 µg/ml Ampicillin; 5% Saccharose) wurde mit einer Kolonie des transformierten Stammes angeimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C unter ständiger Bewegung (Rotationsschüttler; 150-200 rpm) inkubiert. Der Nachweis der Produkte der durch Amylosucrase katalysierten Reaktion erfolgte durch Zugabe von Lugolscher Lösung zum Kulturüberstand.

c) Nachweis der Amylosucrase-Aktivität in den Kulturüberständen von transformierten E. coli-Zellen, die in Abwesenheit von Saccharose kultiviert wurden

Für die Expression einer extrazellulären Amylosucrase-Aktivität wurden E.coli-Zellen nach Standardmethoden mit dem Vektor pNB2 transformiert. YT-Medium (100 µg/ml Ampicillin) wurde mit einer Kolonie des transformierten Stammes angeimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C unter ständiger Bewegung (Rotationsschüttler; 150-200 rpm) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert (30 min, 4°C, 5500 rpm, JA10 Beckmann- Rotor). Der Überstand wurde durch einen 0.2 µm Filter (Schleicher) sterilfiltriert.

Der Nachweis einer Amylosucrase-Aktivität erfolgte

i) durch Inkubation des Überstandes auf einer saccharosehaltigen Agarplatte. Hierzu wurden 40 µl des Überstandes in ein ausgestanztes Loch auf einer Agarplatte (5% Saccharose in 50 mM Natriumcitrat-Puffer pH 6.5) gegeben und für mindestens eine Stunde bei 37°C inkubiert. Der Nachweis der Produkte der durch Amylosucrase katalysierten Reaktion erfolgte durch Anfärben mittels Iodbedampfung. Vorhandensein von Reaktionsprodukten ruft eine Blaufärbung hervor.
ii) oder durch gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine des Überstandes in einem nativen Gel und Nachweis der Reaktionsprodukte im Gel nach Inkubation mit Saccharose. Hierzu wurden 40-80 µl des Überstandes auf einem 8%igen nativen Polyacrylamidgel (0.375 M Tris pH 8.8) bei einer Spannung von 100 V gelelektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde anschließend zweimal 15 min mit ca. 100 ml 50 mM Natriumcitrat-Puffer (pH 6.5) äquilibriert und über Nacht bei 37°C in Natriumcitrat-Puffer pH 6.5/5% Saccharose inkubiert. Zur Sichtbarmachung der Reaktionsprodukte der durch Amylosucrase katalysierten Reaktion wurde das Gel in Lugolscher Lösung geschwenkt. Banden mit Amylosucrase- Aktivität weisen eine Blaufärbung auf.

Beispiel 4 In-vitro-Produktion von Glukanen mit partiell gereinigter Amylosucrase

Anschließend wurde der Überstand unter Verwendung einer Amicon- Kammer (YM30-Membran mit einer Ausschlußgröße von 30 kDa, Fa. Amicon) unter Druck (p=3 bar) 200fach aufkonzentriert. Dieser konzentrierte Überstand wurde zu 50 ml Saccharoselösung (5% Saccharose in 50 mM Natrium-Citrat-Puffer pH 6.5) hinzugegeben. Der gesamte Ansatz wurde bei 37°C inkubiert. Es kommt zur Bildung weißlicher unlöslicher Polysaccharide.

Beispiel 5 Charakterisierung der durch Amylosucrase synthetisierten Reaktionsprodukte aus Beispiel 4

Die in Beispiel 4 beschriebenen unlöslichen Reaktionsprodukte sind in 1 M NaOH löslich. Die Charakterisierung der Reaktionsprodukte erfolgte durch Messung des Absorptionsmaximums. Hierzu wurden ca. 100 mg der isolierten Reaktionsprodukte (Naßgewicht) in 200 µl 1 M NaOH gelöst und 1 : 10 mit H₂O verdünnt. Zu 100 µl dieser Verdünnung wurden 900 µl 0.1 M NaOH und 1 ml Lugolsche Lösung gegeben. Es wurde das Absorptionsspektrum zwischen 400 und 700 nm gemessen. Das Maximum liegt bei 605 nm (Absorptionsmaximum von Amylose: ca. 614 nm).

Eine HPLC-Analyse des Reaktionsansatzes von Beispiel 4 auf einer CARBOPAC PA1-Säule (DIONEX) zeigte, daß neben den unlöslichen Produkten auch lösliche Produkte entstehen. Es handelt sich hierbei um kurzkettige Polysaccharide. Die Kettenlänge lag in diesem Fall zwischen ca. 5 und ca. 50 Glukoseeinheiten. In geringem Maße waren jedoch auch kürzere und längere Moleküle nachweisbar.

Mit den zur Verfügung stehenden Analysemethoden war es nicht möglich, Verzweigungen in den Syntheseprodukten nachzuweisen. Es ist aber nicht auszuschließen, daß in geringfügigem Maße Verzweigungen auftreten.

Beispiel 6 Expression einer intrazellulären Amylosucrase-Aktivität in transformierten E.coli-Zellen

Mit Hilfe einer "Polymerase Chain Reaction" (PCR) wurde aus dem Plasmid pNB2 ein Fragment amplifiziert, das die Nukleotide 981 bis 2871 der unter Seq ID No. 1 dargestellten Sequenz umfaßt. Als Primer wurden folgende Oligonukleotide verwendet:

Das resultierende Fragment enthält die kodierende Region für Amylosucrase mit Ausnahme der Nukleotide, die für die 16 N- terminalen Aminosäuren kodieren. Diese Aminosäuren umfassen die Sequenzen, die für eine Sekretion des Enzyms aus der Zelle notwendig sind. Darüber hinaus enthält dieses PCR-Fragment 88 bp des 3′ nichttranslatierten Bereiches. Durch die verwendeten Primer wurden an beiden Enden des Fragmentes Nco I-Schnittstellen eingeführt.

Nach Verdau mit der Restriktionsendonuklease Nco I wurde das resultierende Fragment in den mit Nco I geschnittenen Expressionsvektor pMex 7 ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in E.coli-Zellen transformiert und transformierte Klone selektiert. Positive Klone wurden auf YT-Platten (1.5% Agar; 100 µg/ml Ampicillin; 5% Saccharose; 0.2 mM IPTG) über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach Jodbedampfung wurde keine Blaufärbung im Bereich der Bakterienkolonien beobachtet. Um die Funktionalität des Proteins zu überprüfen, wurden in YT-Medium kultivierte transformierte Zellen mittels Ultraschall aufgeschlossen und der erhaltene Rohextrakt auf saccharosehaltige Agarplatten pipettiert. Nach Jodbedampfung war eine Blaufärbung zu beobachten.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Pflanzenzellen, die in der Lage sind, lineare α-1,4-Glukane zu synthetisieren, dadurch gekennzeichnet, daß in die Pflanzenzellen eine heterologe DNA-Sequenz eingeführt und exprimiert wird, die eine für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase kodierende Region umfaßt.

2. Verfahren zur Herstellung von Pflanzenzellen und Pflanzen, die in der Lage sind, lineare α-1,4-Glukane zu synthetisieren, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Verfahrensschritte umfaßt:

3. Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen, die intra- oder extrazellulär ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase exprimieren, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Verfahrensschritte umfaßt:

a) Herstellung einer Expressionskassette mit folgenden Teilsequenzen:
- i) einem Promotor, der in dem gewählten Mikroorganismus aktiv ist und die Transkription des nachgeschalteten DNA- Abschnitts sicherstellt,
- ii) einer DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase kodiert und in sense-Orientierung an den Promotor fusioniert ist,
- iii) einem in Mikroorganismen funktionalen Signal für die Transkriptionstermination und
b) Transformation eines geeigneten Mikroorganismus mit der in Schritt a) konstruierten Expressionskassette.

4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase kodiert, aus einem Mikroorganismus stammt.

5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase kodiert, aus einem gram-negativen Mikroorganismus stammt.

6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase kodiert, aus einem Mikroorganismus der Gattung Neisseria stammt.

7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase kodiert, aus Neisseria polysaccharea stammt.

8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein Protein mit der unter Seq ID No. 1 angegebenen Aminosäuresequenz oder einer im wesentlichen identischen Aminosäuresequenz kodiert oder für einen Teil dieser Sequenz, wobei dieser Teil lang genug ist, um Amylosucrase-Aktivität aufzuweisen.

9. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, worin die kodierende DNA-Sequenz die unter Seq ID No. 1 angegebene Nukleotidsequenz oder einen Teil davon aufweist oder Derivate davon, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Sequenz abgeleitet sind, wobei diese DNA-Sequenzen nach Expression zur Synthese eines Polypeptides führen, das Amylosucrase-Aktivität aufweist.

10. Isolierte und im wesentlichen reine DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase kodieren.

11. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch ein Verfahren isoliert werden können, das folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellung einer genomischen oder einer cDNA- Bibliothek ausgehend von der genomischen DNA oder der mRNA eines Organismus,
b) Transformation eines geeigneten Wirtes mit der in Schritt a) konstruierten Bibliothek,
c) Bedampfung transformierter Zellen mit Ioddampf,
d) Identifizierung von Zellen, die eine Blaufärbung aufweisen,
e) Isolierung und Kultivierung der besagten Zellen,und
f) Isolierung der genomischen DNA-Insertion oder der cDNA- Insertion aus den transformierten Zellen.

12. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Mikroorganismen stammen.

13. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus gram-negativen Mikroorganismen stammen.

14. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Mikroorganismen der Gattung Neisseria stammen.

15. DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Neisseria polysaccharea stammen.

16. DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sequenzen für ein Protein kodieren, das in einer SDS-Gelelektrophorese ein Molekulargewicht von 63 ± 20 kDa aufweist.

17. DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sequenzen für ein Protein kodieren, das in einer SDS-Gelelektrophorese ein Molekulargewicht von 63 ± 15 kDa aufweist.

18. DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sequenzen für ein Protein kodieren, das in einer SDS-Gelelektrophorese ein Molekulargewicht von 63 ± 10 kDa aufweist.

19. DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sequenzen für ein Protein kodieren, das die unter Seq ID No. 1 angegebene Aminosäuresequenz aufweist oder eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen mit dieser identisch ist.

20. DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sequenzen zu mindestens 40% homolog sind zu der unter Seq ID No. 1 angegebenen DNA- Sequenz.

21. DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sequenzen zu mindestens 60% homolog sind zu der unter Seq ID No. 1 angegebenen DNA- Sequenz.

22. DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sequenzen zu mindestens 80% homolog sind zu der unter Seq ID No. 1 angegebenen DNA- Sequenz.

23. DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sequenzen zu mindestens 95% homolog sind zu der unter Seq ID No. 1 angegebenen DNA- Sequenz.

24. DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sequenzen die unter Seq ID No. 1 angegebenen DNA-Sequenz oder Teile dieser DNA-Sequenz aufweisen.

25. Derivate von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß diese Derivate durch Austausch einzelner oder mehrerer Basen, Deletion, Insertion oder Rekombination erhalten werden und für ein Polypeptid kodieren, das Amylosucrase-Aktivität besitzt.

26. Ein im wesentlichen reines Protein, das die enzymatische Aktivität einer Amylosucrase aufweist.

27. Ein Protein gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Mikroorganismus stammt.

28. Ein Protein gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem gram-negativen Mikroorganismus stammt.

29. Ein Protein gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Mikroorganismus der Gattung Neisseria stammt.

30. Ein Protein gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Neisseria polysaccharea stammt.

31. Ein Protein gemäß den Ansprüchen 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer SDS-Gelelektrophorese ein Protein mit einem Molekulargewicht von 63 ± 20 kDa aufweist.

32. Ein Protein gemäß den Ansprüchen 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer SDS-Gelelektrophorese ein Protein mit einem Molekulargewicht von 63 ± 15 kDa aufweist.

33. Ein Protein gemäß den Ansprüchen 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer SDS-Gelelektrophorese ein Protein mit einem Molekulargewicht von 63 ± 10 kDa aufweist.

34. Ein Protein gemäß den Ansprüchen 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen die in Seq ID No. 1 angegebene Aminosäuresequenz aufweist.

35. Plasmide enthaltend DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 10 bis 25.

36. Plasmid pNB2, das unter der DSM-Nr. 9196 hinterlegt wurde.

37. Bakterien, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß den Ansprüchen 10 bis 25 als Bestandteil rekombinanter DNA.

38. Bakterien, enthaltend ein Plasmid gemäß den Ansprüchen 35 bis 36.

39. Pilze enthaltend ein Plasmid gemäß Anspruch 35.

40. Pilze enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß den Ansprüchen 10 bis 25 als Bestandteil rekombinanter DNA.

41. Verwendung der Plasmide gemäß den Ansprüchen 35 bis 36 oder Derivate oder Teile davon zur Transformation pro- und eukaryontischer Zellen.

42. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 10 bis 25 zur Herstellung von Bakterien, Pilzen oder Pflanzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase exprimieren.

43. Verwendung der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 24 zur Herstellung von Derivaten durch zielgerichtete oder nicht-zielgerichtete Mutagenese.

44. Verwendung der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 24 zur Isolierung homologer Sequenzen aus dem Genom von Organismen.

45. Verwendung von Proteinen mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase zur Herstellung von Fruktose.

46. Transgene Pflanzenzellen und Pflanzen, enthaltend eine DNA- Sequenz gemäß den Ansprüchen 10 bis 25.

47. Pflanze gemäß Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nutzpflanze ist.

48. Pflanze gemäß den Ansprüchen 46 oder 47, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Mais-, Reis-, Weizen-, Gersten-, Zuckerrüben-, Zuckerrohr-, Tabak-, Tomaten- oder Kartoffelpflanze ist.