PT759993E - ''sequências de dna que codificam para enzimas capazes de facilitar a síntese de alfa-1,4-glucanos lineares em plantas, fungos e microrganismos'' - Google Patents

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DESCRIÇÃO "SEQUÊNCIAS DE DNA QUE CODIFICAM PARA ENZIMAS CAPAZES DE FACILITAR A SÍNTESE DE ALFA-1,4-GLUCANOS LINEARES EM PLANTAS, FUNGOS E MICRORGANISMOS" A presente invenção refere-se a técnicas de DNA recombinante para produzir plantas e microrganismos capazes de expressar, intracelular ou extracelularmente, uma proteína que exibe actividade de amilossucrase e catalisar a síntese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose. A presente invenção também se refere a novas sequências de DNA e plasmideos que contêm as referidas sequências de DNA que, após integração num genoma de uma planta ou após transformação em microrganismos, particularmente bactérias ou fungos, resultam na expressão de uma enzima que catalisa a sintese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose, bem como a organismos transgénicos (isto é, plantas, fungos e microrganismos) que contêm as sequências de DNA acima mencionadas.

Os a-1,4-glucanos lineares são polissacáridos que consistem em monómeros de glucose, em que os últimos estão exclusivamente ligados entre si por ligações a-1,4-glicosidicas. O a-1,4-glucano natural de ocorrência mais frequente é a amilose, um componente do amido vegetal. Recentemente, a utilização comercial de a-1,4-glucanos lineares tem sido cada vez mais importante. Devido às suas propriedades físico-químicas, a amilose pode ser utilizada para produzir filmes que são incolores, inodoros e insípidos, não tóxicos e biologicamente degradáveis. 2

Presentemente, já há várias possibilidades de aplicação, por exemplo, na indústria alimentar, na indústria têxtil, na indústria de fibras de vidro e na produção de papel.

Também foi possível produzir fibras a partir de amilose cujas propriedades são semelhantes às das fibras de celulose natural e que permitem substitui-las, parcialmente ou mesmo completamente, na produção de papel.

Sendo o elemento representativo mais importante dos a-1,4-glucanos lineares, a amilose é particularmente utilizada como aglutinante para a produção de pastilhas, como espessante de pudins e cremes, como substituto da gelatina, como aglutinante na produção de painéis de parede à prova de som e para melhorar as propriedades de fluxo de óleos cerosos.

Outra propriedade dos a-1,4-glucanos que recentemente ganhou atenção crescente é a capacidade destas moléculas para formarem compostos de inclusão com agentes complexantes orgânicos, devido à sua estrutura helicoidal. Esta propriedade permite utilizar os a-1,4-glucanos numa grande variedade de aplicações. Considerações actuais referem-se à sua utilização para a encapsulação molecular de vitaminas, compostos farmacêuticos e substâncias aromáticas, bem como à sua utilização para a separação cromatográfica de misturas de substâncias em a-1,4-glucanos lineares imobilizados. A amilose também é um material de partida para a produção das denominadas ciclodextrinas (também referidas como cicloamiloses, ciclomaltoses) que, por sua vez, são 3 amplamente utilizadas na indústria farmacêutica, tecnologia de processamento de alimentos, indústria cosmética e tecnologia de separação analítica. Estas ciclodextrinas são malto-oligossacáridos cíclicos com 6-8 unidades monossacarídicas, que são livremente solúveis em água mas têm uma cavidade hidrófoba que pode ser utilizada para formar compostos de inclusão.

Hoje em dia, os a-1,4-glucanos lineares são obtidos na forma de amilose de amido. 0 próprio amido consiste em dois componentes. Um componente forma a amilose como uma cadeia não ramificada de unidades de glucose com ligação a-1,4. 0 outro componente forma a amilopectina, um polímero altamente ramificado de unidades de glucose no qual, para além das ligações a-1,4, as cadeias de glucose também podem estar ramificadas via ligações a-1,6. Devido à sua diferente estrutura e às propriedades físico-químicas resultantes, os dois componentes também são utilizados em diferentes áreas de aplicação. Para conseguir utilizar directamente as propriedades dos componentes individuais é necessário obtê-los em forma pura. Ambos os componentes podem ser obtidos a partir de amido; no entanto, o processo requer vários passos de purificação e envolve tempo e dinheiro consideráveis.

Em consequência, há uma necessidade urgente de descobrir possibilidades de obter ambos os componentes do amido de uma maneira uniforme. Para esta finalidade, até à data, plantas produtoras de amido têm sido alteradas, por criação ou por manipulação genética, para produzirem amido com uma proporção alterada de amilose/amilopectina. A percentagem normal de amilopectina do amido de milho é, por exemplo, 4 70%, mas foi possível criar uma variedade de milho (milho ceroso) cujo amido consiste em quase 100% de amilopectina (Akatsuka e Nelson, 1966, J. Biol. Chem. 241: 2280-2285). Além disso, foram criadas diversas variedades de milho com teor acrescido de amilose (60-70%), por exemplo, as variedades amilose extender e dull (Wolf et al., 1955, J. Am. Chem. Soc. TJ_: 1654-1659; Boyer et al.r 1976, Die Starke 2_8: 405-410). Utilizaram-se outras espécies de plantas para obter variedades que sintetizam amidos uniformes na forma de amilopectina, por exemplo, arroz (Sano, 1984, Theor. Appl. Genet. 68: 467-473) e cevada (Shannon e Garwood, 1984, em: Whistler, Bemiller, Paschall, "Starch: Chemistry and Technology", Academic Press, Orlando, 2a Edição: 25-86) ou que sintetizam amido com elevado teor de amilose (por exemplo, ervilhas).

Para além das abordagens acima de criação clássica, foram relatas abordagens baseadas na manipulação genética de plantas produtoras de amido.

Por exemplo, Visser et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 255: 289-296) descrevem que se podem obter variedades de batata que sintetizam amido substancialmente puro em amilopectina por inibição anti-sentido do gene que codifica para a amido sintetase acoplada ao grânulo de amido. A patente WO 92/14827 revela a produção de plantas de batata que, devido à inibição anti-sentido da expressão da enzima de ramificação, produzem um amido com uma proporção aumentada de amilose/amilopectina. No entanto, as plantas descritas em WO 92/14827 não produzem um amido com elevado teor de amilose. 5

Apesar de numerosas tentativas e abordagens variadas, até à data não se conseguiram obter plantas que produzam um amido puro em amilose.

Até agora também não foi descrita nenhuma possibilidade de produzir amilose altamente pura ou a-1,4-glucanos lineares puros utilizando outros processos, por exemplo, microrganismos geneticamente manipulados.

Além disso, até à data também não foram descobertas sequências de DNA que codifiquem enzimas que sejam capazes de catalisar a síntese de a-1,4-glucanos lineares em plantas, fungos, microrganismos ou in vitro.

Em consequência, o objectivo da presente invenção consiste em proporcionar sequências de DNA e processos que permitam a produção de plantas, fungos e microrganismos capazes de sintetizar a-1,4-glucanos lineares. 0 objectivo da presente invenção é atingido pelas especificações caracterizadas pelas reivindicações da patente.

Assim, a invenção refere-se a uma sequência de DNA que codifica para uma proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase que catalisa a síntese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose, seleccionada do grupo que consiste em: (a) sequências de DNA que codificam para uma proteína com a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado pela região codificadora que codifica para uma amilossucrase de Neisseria polysaccharea 6 contida na inserção de DNA do plasmideo pNB2 (DSM 9196); (b) a sequência de DNA com a sequência de nucleótidos da região codificadora que codifica para uma amilossucrase de Neisseria polysaccharea contida na inserção de DNA do plasmideo pNB2 (DSM 9196); (c) sequências de DNA que hibridizam para qualquer uma das sequências de (a) ou (b); (d) sequências de DNA que são pelo menos 40% idênticas à sequência de DNA definida em (b), e (e) sequências de DNA que são degeneradas, devido ao código genético, em comparação com as sequências mencionadas em (a), (b), (c) ou (d).

Particularmente, refere-se a sequências de DNA que codificam para uma proteína com a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado pela região codificadora que codifica para uma amilossucrase de Neisseria polysaccharea contida na inserção de DNA do plasmideo pNB2 (DSM 9196) e à sequência de DNA com a sequência de nucleótidos da região codificadora que codifica para uma amilossucrase de Neisseria polysaccharea contida na inserção de DNA de pNB2 (DSM 9196). A presente invenção também se refere a sequências de DNA que hibridizam para as sequências acima mencionadas da invenção e que codificam para uma proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase, bem como a sequências de DNA que, devido ao código genético, são degeneradas em comparação com as sequências de DNA acima mencionadas da invenção.

Neste contexto, o termo "hibridização" significa hibridização em condições convencionais de hibridização, preferivelmente em condições restritas como as descritas, 7 por exemplo, por Sambrook et al. (1989, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI).

Sequências de DNA de acordo com a invenção que codificam para uma proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase podem ser obtidas por um processo que compreende os passos seguintes: (a) preparar uma biblioteca genómica ou de cDNA com base no DNA genómico ou no mRNA de células de um organismo; (b) transformar um hospedeiro adequado com a biblioteca construída no passo (a); (c) submeter as células transformadas a vapores de iodo; (d) identificar as células coradas de azul; (e) isolar e cultivar as células identificadas no passo (d), e (f) isolar a inserção de DNA genómico ou a inserção de cDNA das células transformadas.

Um hospedeiro adequado como mencionado no passo (b) é, por exemplo, E. coli.

Numa especificação preferida, a invenção refere-se a sequências de DNA que codificam para uma amilossucrase de microrganismos, particularmente microrganismos gram-negativos, preferivelmente de bactérias da espécie Neisseria e, particularmente preferido, de Neisseria polysaccharea.

Também é possível modificar as sequências de DNA da invenção por mutação ou por uma alteração de sequências por 8 inserção, deleção, substituição ou recombinação, de modo a alterar certas propriedades da proteína a ser expressa. Uma destas modificações consiste, inter alia, na deleção da sequência de sinal que assegura a secreção da enzima, e as inserções de outras sequências de sinal ou sequências de DNA que codificam para péptidos de trânsito e, desse modo, influenciando a localização da proteína expressa.

As sequências de DNA da invenção, em particular a sequência de DNA da invenção indicada na ID SEQ NO: 1, ou partes desta, podem ser utilizadas para determinar se sequências de DNA homólogas estão presentes em certos organismos ou são expressas por estes. Para consegui-lo, amostras de DNA ou mRNA do organismo individual são hibridizadas para uma sequência de DNA da invenção, em condições de hibridização apropriadas, de acordo com métodos convencionais.

Também é possível isolar do genoma de vários organismos, de acordo com técnicas comuns, sequências homólogas que também codificam amilossucrases, ou enzimas com propriedades semelhantes, utilizando uma sequência de DNA da invenção. Neste contexto, homologia significa uma identidade de sequências de pelo menos 40% até 60%, preferivelmente superior a 60%, particularmente superior a 80%, ainda mais preferivelmente uma identidade de sequências superior a 95%. Homologia também significa que as respectivas sequências de DNA ou sequências de aminoácidos codificadas são funcional e/ou estruturalmente equivalentes. As sequências homólogas às sequências da invenção e que se desviam da sequência de DNA ou sequência de aminoácidos codificada da invenção numa ou mais posições são, normalmente, variações dessa sequência que representam modificações possuindo a mesma função. Podem ser variações 9 de ocorrência natural, organismos, ou mutações, naturalmente ou podem especifica. Além disso, sequências produzidas de sequências de DNA estão invenção. como sequências de outros Estas mutações podem ocorrer ser obtidas por mutagénese estas variações podem ser forma sintética. Todas estas igualmente compreendidas na

As proteinas codificadas pelas diversas variantes da sequência de DNA da invenção partilham caracteristicas comuns especificas, como actividade enzimática, reactividade imunológica, conformação, etc., bem como propriedades fisicas, como mobilidade electroforética, comportamento cromatográfico, coeficiente de sedimentação, solubilidade, propriedades espectroscópicas, estabilidade, etc.

Para determinar sequências de DNA relacionadas devem obter-se bibliotecas de genes do organismo a ser examinado que sejam representativas do conteúdo dos genes do organismo ou da expressão de genes no organismo ou de um certo tecido do organismo. 0 primeiro tipo mencionado são bibliotecas genómicas, o último bibliotecas de cDNA.

Procede-se à identificação e isolamento de sequências de DNA homólogas dessas bibliotecas por hibridização de acordo com técnicas comuns (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI) .

Como sondas de hibridização podem utilizar-se moléculas de DNA que exibam exactamente ou substancialmente a sequência 10 de DNA indicada como ID SEQ NO: 1, ou parte dessa sequência. Os fragmentos de DNA utilizados como sondas de hibridização também podem ser fragmentos de DNA sintéticos que foram preparados de acordo com métodos convencionais de síntese de DNA e que são substancialmente idênticos a uma sequência da invenção. Depois de terem sido identificados e isolados os genes que hibridizam para uma sequência de DNA da invenção, é necessário determinar a sequência e analisar as propriedades das proteínas codificadas por essa sequência. A amilossucrase (também referida como sucrose:1, 4-a-glucano-4-a-glucosiltransferase, E.C. 2.4.1.4.) é uma enzima para a qual é sugerido o seguinte esquema reaccional: sucrose + (a-1,4-D-glucosil)n---> D-frutose + (a-1, 4-D-glucosil)n+i

Esta reacção é uma transglucosilação. Os produtos desta reacção são a-1,4-glucanos lineares e frutose. Não são necessários cofactores. Até à data, a actividade de amilossucrase só foi encontrada nalgumas espécies de bactérias, entre elas particularmente a espécie Neisseria (MacKenzie et ai., 1978, Can. J. Microbiol. 2_4: 357-362), e a enzima só foi examinada quanto à sua actividade enzimática. De acordo com Okada et al., a enzima parcialmente purificada de Neisseria perflava, por adição de sucrose, resulta na síntese de polissacáridos do tipo glicogénio que são ramificados em pequena extensão (Okada et al., 1974, J. Biol. Chem. 249: 126-135). Do mesmo modo, os glucanos sintetizados intracelular ou extracelularmente 11 de Neisseria perflava e Neisseria polysaccharea exibem um certo grau de ramificação (Riou et al., 1986, Can. J. Microbiol. 32_: 909-911). Até agora não foi elucidado se estas ramificações são introduzidas pela amilossucrase ou via outra enzima que esteja presente nas preparações de amilossucrase purificada como contaminantes. Uma vez que ainda não foi descoberta, até à data, uma enzima que introduza ramificações, presume-se que as reacções de polimerização e ramificação sejam catalisadas pela amilossucrase (Okada et al., 1974, J. Biol. Chem. 249: 126-135) . A enzima que é expressa de uma forma constitutiva em Neisseria é extremamente estável, liga-se muito fortemente aos produtos de polimerização e é inibida de modo competitivo pelo produto frutose (MacKenzie et al., 1977, Can. J. Microbiol. 23_: 1303-1307). A espécie de Neisseria Neisseria polysaccharea segrega a amilossucrase (Riou et al., 1986, Can. j. Microbiol. 32: 909-911), ao passo que na outra espécie de Neisseria permanece na célula. Só foi possível detectar enzimas com actividade de amilossucrase em microrganismos. Não se conhecem plantas que tenham amilossucrases.

De acordo com a invenção, foi possível mostrar que o produto da reacção catalisada por amilossucrase consiste em a-1,4-glucanos lineares que não são ramificados, como foi presumido até à data (ver acima).

Pode detectar-se a actividade enzimática da amilossucrase detectando os glucanos sintetizados, como descrito no Exemplo 3 abaixo. A detecção é habitualmente feita 12 utilizando uma coloração com iodo. É possivel identificar colónias bacterianas que expressam amilossucrase, por exemplo, por tratamento com vapores de iodo. As colónias que sintetizam os a-1,4-glucanos lineares ficam coradas de azul.

Pode detectar-se a actividade enzimática da enzima purificada, por exemplo, em placas de agarose contendo sucrose. Se a proteina for aplicada nessa placa e for incubada durante cerca de 1 hora ou mais a 37°C, difunde-se para a agarose e catalisa a síntese de glucanos lineares. Os últimos podem ser detectados por tratamento com vapores de iodo. Além disso, a proteína pode ser detectada em géis de poliacrilamida nativa. Após uma electroforese em gel de poliacrilamida nativa, o gel é equilibrado em tampão de citrato de sódio (50 mM, pH 6,5) e é incubado durante a noite numa solução de sucrose (5% em tampão de citrato de sódio). Se o gel for subsequentemente corado com solução de Lugol, as áreas onde estão localizadas proteínas com actividade de amilossucrase são coradas de azul devido à síntese de a-1,4-glucanos lineares.

Com o auxílio das sequências de DNA da invenção é possível produzir plantas capazes de produzir amido puro em amilose, isto é, a-1,4-glucanos lineares, e modificar plantas produtoras de amido de modo a terem rendimentos de amido mais elevados e uma proporção simultaneamente aumentada de amilose/amilopectina. As sequências de DNA da invenção podem ser utilizadas para produzir microrganismos e fungos, particularmente leveduras, capazes de produzir uma enzima que catalisa a síntese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose. 13

Também é possível produzir, com baixos custos de produção, xarope de frutose pura com o auxílio das sequências de DNA da invenção ou das proteínas codificadas por aquelas.

Noutra especificação, a invenção refere-se a moléculas de DNA recombinantes, como vectores, particularmente plasmídeos, contendo as sequências de DNA da invenção ou partes destas, por exemplo, o plasmídeo pNB2 que foi depositado como DSM N° 9196. A invenção refere-se particularmente a moléculas de DNA recombinantes nas quais uma sequência de DNA da invenção está ligada a sequências que asseguram a expressão de uma proteína com actividade de amilossucrase que catalisa a síntese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose em microrganismos, fungos ou plantas, por exemplo, plasmídeos que contêm as seguintes sequências de DNA: (a) um promotor apropriado activo em microrganismos que assegura que a sequência codificadora a jusante é transcrita em microrganismos, e (b) uma sequência de DNA que codifica para um polipéptido exibindo actividade de amilossucrase que catalisa a síntese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose e que está ligada ao promotor de modo a permitir a formação de um RNA apto a ser traduzido num polipéptido, ou plasmídeos que contêm as seguintes sequências de DNA: (a) um promotor apropriado activo em plantas que assegura que a sequência codificadora a jusante é transcrita na altura apropriada ou numa fase 14 apropriada do desenvolvimento de uma planta transgénica ou em certos tecidos de uma planta transgénica, e (b) uma sequência de DNA que codifica para um polipéptido exibindo actividade de amilossucrase que catalisa a síntese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose e que está ligada ao promotor de modo a permitir a formação de um RNA apto a ser traduzido num polipéptido.

Outro objectivo da invenção consiste em microrganismos, fungos e plantas que contêm as moléculas de DNA recombinantes da invenção.

Ainda outro objectivo da invenção consiste em proteínas com a actividade enzimática de uma amilossucrase que catalisam a síntese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose e que são codificadas por uma das sequências de DNA da invenção, particularmente as derivadas de microrganismos, preferivelmente de microrganismos gram negativos, especificamente de microrganismos do género Neisseria e, particularmente preferido, de Neisseria polysaccharea. Um objectivo da invenção também consiste em amilossucrases com um peso molecular de 63 ± 20 kDa em electroforese em gel, preferivelmente de 63 ± 15 kDa e muito preferivelmente de 63 ± 10 kDa.

Outro objectivo da invenção consiste, particularmente, em proteínas com a actividade enzimática de amilossucrase que exibem a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado pela região codificadora que codifica para uma amilossucrase de Neisseria polysaccharea contida na 15 inserção de DNA do plasmídeo pNB2 (DSN 9196). A invenção também se refere a proteínas exibindo sequências de aminoácidos que são substancialmente idênticas a essa sequência de aminoácidos ou que se desviam dessa sequência numa ou mais posições. Preferivelmente, os desvios são alterações conservativas de aminoácidos, e a proteína tem a actividade enzimática de uma amilossucrase. Assim, a invenção também se refere a amilossucrases cuja sequência de aminoácidos exibe uma homoloqia elevada com a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado pela região codificadora que codifica para uma amilossucrase de Neisseria polysaccharea contida na inserção de DNA do plasmídeo pNB2 (DSN 9196), em particular uma homologia de pelo menos 70%, preferivelmente superior a 80%, sendo mais preferido superior a 90% e, particularmente preferido, uma homologia de pelo menos 99%.

Noutra especificação, a invenção refere-se à utilização das sequências de DNA da invenção e de moléculas de DNA, particularmente de plasmídeos, que contêm essas sequências de DNA para a transformação de células procarióticas ou eucarióticas, bem como para a expressão de uma amilossucrase em células procarióticas ou eucarióticas, e também a um processo para a produção das proteínas da invenção por cultura de um microrganismo contendo uma molécula de DNA recombinante da invenção num nutriente apropriado.

Especificamente, o objectivo da presente invenção consiste num processo para a produção de plantas capazes de sintetizar a-1,4-glucanos lineares, caracterizado por se introduzir em células das plantas uma sequência de DNA da invenção que compreende uma região codificadora para uma 16 proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase ligada a sequências de DNA que asseguram a expressão em células vegetais e regeneração de plantas completas a partir das células transformadas.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se a um processo para a produção de células vegetais e de plantas capazes de sintetizar a-1,4-glucanos lineares, que compreende os passos seguintes: (a) produzir uma cassete de expressão com as seguintes sequências parciais: (i) um promotor activo em plantas e que assegura a formação de um RNA no respectivo tecido alvo ou células-alvo; (ii) pelo menos uma sequência de DNA de acordo com a invenção que codifica para uma proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase e que está fundida ao promotor na orientação sentido; (iii) um sinal funcional em plantas para a terminação da transcrição e poliadenilação de uma molécula de RNA; (b) transferir a cassete de expressão para células vegetais, e (c) regenerar plantas completas intactas a partir das células vegetais transformadas.

Promotores úteis são aqueles promotores que asseguram uma expressão constitutiva do gene em todos os tecidos das 17 plantas, tais como o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMVj, bem como aqueles que asseguram expressão apenas em certos órgãos ou em certas alturas do desenvolvimento da planta. Conhecem-se promotores que asseguram uma expressão específica nos tubérculos de plantas de batata, como o promotor B33 (Liu et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 223: 401-406), ou aqueles que permitem uma expressão específica nas raízes da beterraba de açúcar. Também são descritas sequências de DNA que permitem uma expressão dependente da luz e específica para tecidos de sequências de DNA a jusante em folhas (Orozco e Ogren, 1993, Plant Mol. Biol. 23: 1129-1138). A sequência de DNA mencionada no passo (a) (ii) do processo pode ser basicamente qualquer sequência de DNA de acordo com a invenção compreendendo uma região codificadora que codifica para uma proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase. Sequências de DNA úteis são, particularmente, sequências de DNA derivadas de microrganismos, preferivelmente de microrganismos gram negativos, especificamente do género Neisseria e particularmente de Neisseria polysaccharea.

De acordo com a invenção, a sequência de DNA que codifica para uma amilossucrase está ligada, na orientação sentido, ao promotor (extremidade 3' do promotor ligada à extremidade 5' da sequência codificadora). Esta sequência pode ser modificada antes ou após a ligação aos elementos de controlo da transcrição (promotor e sinal de terminação) para variar, se necessário, as propriedades do polipéptido ou a sua localização, como é descrito infra em mais pormenor. 18

Para expressar a enzima no citosol das células vegetais, a sequência de sinal que procede à secreção deve ser removida. Se a enzima a ser expressa se destinar a ser dirigida para certos compartimentos subcelulares, como cloroplastos, amiloplastos, mitocôndrias ou o vacúolo, a sequência de sinal que procede à secreção deve ser substituída por uma sequência de sinal ou uma sequência que codifica para um péptido de trânsito, que assegura o transporte da proteína expressa para o compartimento respectivo. Essas sequências são conhecidas. Para o transporte para os plastídeos, por exemplo, são úteis os péptidos de trânsito das proteínas precursoras da subunidade pequena da ribulose bifosfato carboxilase (RUBISCO) de batatas (Wolter et al.f 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. _85_: 846-850) ou da proteína transportadora de acilos (ACP). Para o transporte para o vacúolo, por exemplo, pode utilizar-se a sequência de sinal de patatina (Sonnewald et al., 1991, Plant J. _1: 95-106). As sequências utilizadas devem ser fundidas na estrutura à sequência de DNA que codifica para a enzima. A transferência da cassete de expressão construída no passo (a) do processo em células vegetais é preferivelmente realizada utilizando plasmídeos, por exemplo, plasmídeos binários . É preferido utilizar técnicas que assegurem que a cassete de expressão é integrada de forma estável no genoma da célula vegetal transformada. O processo da invenção pode ser basicamente aplicado a qualquer espécie de planta. São interessantes plantas monocotiledóneas e dicotiledóneas. Já foram descritas 19 técnicas de transformação para várias espécies de plantas monocotiledóneas e dicotiledóneas.

As sequências de dna da invenção permitem modificar plantas de modo a expressarem proteínas com a actividade enzimática de uma amilossucrase, desse modo permitindo a síntese de a-1,4-glucanos lineares em plantas. Uma vez que os a-1,4-glucanos lineares são idênticos à amilose sintetizada em plantas em termos da sua estrutura química, é consequentemente possível produzir plantas que sintetizam a amilose pura e modificar plantas produtoras de amido de modo a sintetizarem um amido com uma proporção aumentada de amilose.

Na maior parte das plantas, os fotoassimilados formados durante a fotossíntese são transportados na planta na forma de açúcares, de forma mais específica maioritariamente na forma de sucrose, para os respectivos órgãos-alvo. Uma vez que o substrato para a reacção de polimerização da amilossucrase é sucrose, o processo descrito acima permite basicamente modificar todas as plantas, dicotiledóneas e monocotiledóneas, relativamente a uma expressão de amilossucrase. São preferidas plantas de cultura tais como milho, arroz, trigo, cevada, beterraba de açúcar, cana-de-açúcar, tabaco, batatas ou mandioca, mas também espécies de frutos e vegetais, como maçãs, ameixas, cenouras ou tomates. A expressão de uma actividade de amilossucrase em plantas pode ser utilizada, inter alia, para alterar a viscosidade de extractos obtidos das plantas por síntese de a-1,4-glucanos lineares. Neste contexto, o tomate é interessante. Por expressão de uma amilossucrase no tomate são 20 sintetizados α-l, 4-glucanos lineares, desse modo conduzindo a uma viscosidade acrescida dos extractos obtidos destes frutos. A expressão de amilossucrase também é particularmente vantajosa nos órgãos das plantas que armazenam grandes guantidades de sucrose. Esses órgãos são, por exemplo, a raiz da beterraba de açúcar ou o caule da cana-de-açúcar. Uma vez que estas plantas normalmente não sintetizam quantidades apreciáveis de amido, os α-l,4-glucanos lineares sintetizados por amilossucrase podem ser isolados destas plantas em forma pura. O local da biossintese de sucrose em células vegetais é o citosol. No entanto, o local de armazenamento é o vacúolo. Durante o transporte para o tecido de armazenamento da beterraba de açúcar ou da batata ou durante o transporte para o endospérmio de sementes, a sucrose tem de passar pelo apoplasto. Em consequência, os três compartimentos, isto é, citosol, vacúolo e apoplasto, podem ser considerados para a expressão da amilossucrase para a síntese de glucanos lineares.

Em plantas produtoras de amido, como batatas ou milho, nas quais a síntese de amido e armazenamento de amido normalmente ocorrem nos amiloplastos, uma expressão da amilossucrase no apoplasto, no citosol ou no vacúolo conduzirá à síntese adicional de glucanos nestes compartimentos, o que significa um aumento considerável do rendimento. 21

Uma vez que as batatas permitem separar o amido sintetizado nos amiloplastos dos a-1,4-glucanos lineares sintetizados pela amilossucrase no apoplasto, no citosol ou no vacúolo durante o isolamento de amido, a mesma planta pode ser utilizada para obter amido e a-1,4-glucanos lineares.

Também se conhecem plantas de batata e plantas de milho transgénicas nas quais, devido a uma inibição da ADP-glucose pirofosforilase por uma construção anti-sentido, a síntese de amido nos tubérculos e grãos, respectivamente, é completamente inibida. Ao invés, por exemplo, em batatas, açúcares solúveis, particularmente sucrose e glucose, acumulam-se nos tubérculos (Muller-Rõber et al., 1992, EMBO J. jLL: 1229-1238; EP-A-0 455 316) . Por expressão de uma amilossucrase no citosol, no vacúolo ou no apoplasto destas plantas, isto é, em compartimentos onde não estão presentes enzimas de ramificação, pode obter-se a síntese de amido com elevado teor de amilose, isto é, amido que consiste maioritariamente em a-1,4-glucanos lineares. 0 mecanismo reaccional que é catalisado pela amilossucrase caracteriza-se por um resíduo de glucose ser directamente transferido de sucrose para um glucano linear. Na biossíntese de glucanos lineares a partir de sucrose em plantas, a sucrose é primeiramente separada em glucose e frutose, as quais, por sua vez, são convertidas na forma intermediária activada ADP-glucose. A partir da ADP-glucose, o resíduo de glucose é transferido, pela enzima amido sintase, para um glucano já existente, desse modo libertando ADP. A conversão de sucrose em duas moléculas de ADP-glucose requer várias reacções que consomem energia. 22

Em consequência, o equilíbrio energético da reacção catalisada pela amilossucrase, em comparação com o equilíbrio energético da síntese de amilose em sucrose em células vegetais, é substancialmente melhor, conduzindo a um rendimento acrescido de glucanos sintetizados em plantas que expressam actividade de amilossucrase. Há muitos vectores de clonagem disponíveis contendo um sinal de replicação para E. coli e um gene marcador para a selecção de células bacterianas transformadas que podem ser utilizados para preparar a introdução de genes estranhos em plantas superiores. Exemplos desses vectores são pBR322, série pUC, série Ml3mp,pACYC184, etc. A sequência desejada pode ser introduzida no vector num sítio de restrição apropriado. 0 plasmídeo obtido é utilizado para transformar células de E. coli. Células de E. coli transformadas são cultivadas num meio apropriado e depois são recolhidas e submetidas a lise. Recupera-se o plasmídeo. Métodos de análise geralmente utilizados para caracterizar o DNA plasmídico obtido são análises de restrição, electroforese em gel, reacções de sequenciação e outros métodos conhecidos na bioquímica e biologia molecular. Após cada manipulação, o DNA plasmídico pode ser clivado e ligado a outras sequências de DNA. Cada sequência de DNA plasmídico pode ser clonada no mesmo ou noutros plasmídeos.

Estão disponíveis muitas técnicas para introduzir DNA numa célula-hospedeiro de planta. Estas técnicas compreendem a transformação de células vegetais com T-DNA utilizando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como agentes de transformação, a fusão de protoplastos, injecção, electroporação de DNA, introdução de DNA pelo método biobalístico, bem como outras técnicas possíveis. 23

Dependendo do método de introdução dos genes desejados nas células vegetais, poderão ser necessárias outras sequências de DNA. Por exemplo, se o plasmídeo Ti ou Ri for utilizado para a transformação da célula vegetal, pelo menos a sequência de fronteira direita, mas muitas vezes as sequências de fronteira direita e esquerda do T-DNA plasmidico Ti e Ri, como áreas flanqueadoras, devem ser ligadas aos genes a serem introduzidos.

Se forem utilizadas Agrobacteria para a transformação, o DNA a ser introduzido deve ser clonado em plasmídeos especiais, num vector intermediário ou num vector binário. Os vectores intermediários podem ser integrados, por recombinação homóloga, no plasmídeo Ti ou Ri de Agrobacteria devido a sequências que são homólogas a sequências presentes no T-DNA. Esse plasmídeo contém a região vir necessária para a transferência do T-DNA. Vectores intermediários não conseguem replicar-se em Agrobacteria. 0 vector intermediário pode ser transferido para Agrobacterium tumefaciens utilizando um plasmídeo auxiliador (conjugação). Vectores binários conseguem replicar-se em E. coli e em Agrobacteria. Contêm um gene marcador de selecção e um agente de ligação ou poli-ligação ("polylinker") flanqueados pelas regiões de fronteira do T-DNA direita e esquerda. Podem ser directamente transformados em Agrobacteria (Holsters et al., 1978, Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). A Agrobacterium que serve de célula-hospedeiro deve conter um plasmídeo com uma região vir. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA para a célula vegetal. Pode estar presente T-DNA adicional. A Agrobacterium transformada deste modo é utilizada para transformar células vegetais. 24 A utilização de T-DNA para a transformação de células vegetais tem sido extensamente examinada e está suficientemente descrita em EP 120516; Hoekema, Em: "The Binary Plant Vector System", Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 1985, Capitulo V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sei. 4: 1-46, e An et al., 1985, EMBO J. 4: 277-287.

Para a transferência do DNA para as células vegetais, explantes vegetais podem ser convenientemente co-cultivados com Agrobacteríum tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. A partir do material vegetal infectado (por exemplo, pedaços de folhas, segmentos de caules, raizes, mas também protoplastos ou células vegetais cultivadas em suspensão) podem regenerar-se plantas completas num meio apropriado, que pode conter antibióticos ou biocidas para a selecção de células transformadas. As plantas obtidas deste modo podem ser rastreadas quanto à presença do DNA introduzido. Não há requisitos específicos para os plasmideos utilizados para a injecção e electroporação de DNA em células vegetais. Podem utilizar-se plasmideos simples, como derivados pUC. No entanto, se for pretendido regenerar plantas completas a partir das células transformadas desse modo, é necessária a presença de um marcador seleccionável.

Depois do DNA introduzido estar integrado no genoma da célula vegetal, geralmente permanece ai de forma estável e também pode ser encontrado no sucessor da célula originalmente transformada. Normalmente contém um marcador de selecção que confere às células vegetais transformadas resistência a um biocida ou a um antibiótico, como canamicina, G 418, bleomicina, higromicina ou glufosinato, etc. Em consequência, o marcador seleccionado 25 individualmente deve permitir a selecção de células transformadas relativamente a células sem o DNA introduzido.

As células transformadas crescem na célula como habitual (ver, por exemplo, McCormick et al., 1986, Plant Cell Reports _5: 81-84) . Estas plantas podem crescer de modo usual e podem ser cruzadas com plantas possuindo o mesmo material genético transformado ou outros materiais genéticos. Os indivíduos híbridos resultantes têm as propriedades fenotípicas correspondentes.

Devem cultivar-se duas ou mais gerações para assegurar que as características fenotípicas são retidas e herdadas de forma estável. Suplementarmente, devem recolher-se sementes para assegurar a retenção do fenótipo correspondente ou de outras características.

Outro objectivo da invenção consiste nas células vegetais e plantas modificadas resultantes do processo acima mencionado da invenção, particularmente células vegetais e plantas que contêm uma sequência de DNA da invenção em combinação com sequências de DNA que permitem a expressão da sequência de DNA da invenção em células vegetais. Essas células vegetais caracterizam-se por expressarem uma proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase, desse modo resultando na síntese de a-1,4-glucanos lineares nas células ou nas plantas. As células vegetais e plantas transgénicas também se caracterizam por conterem uma molécula de DNA recombinante integrada de forma estável no seu genoma que compreende uma cassete de expressão, cuja cassete de expressão contém uma sequência de DNA que codifica para uma amilossucrase. 26

Os α-1,4-glucanos lineares formados nas células vegetais e plantas transgénicas com o auxílio da amilossucrase podem ser isolados de células vegetais e plantas transgénicas da mesma forma que o amido que normalmente se forma. A invenção também se refere à utilização das sequências de DNA da invenção, ou partes destas, para a expressão de um polipéptido com actividade de amilossucrase, preferivelmente em microrganismos sem actividade própria de amilossucrase.

Nesta aplicação, microrganismos devem ser entendidos como bactérias, bem como todos os protistas, como definidos, por exemplo, por Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag, 1985, páginas 1-2).

Hoje em dia, a investigação biotecnológica utiliza, em grande extensão, microrganismos para sintetizar e processar as substâncias mais variadas. Isto tornou-se possível pela disponibilidade de um grande número de vários sistemas para a expressão eficiente de genes procarióticos e eucarióticos em microrganismos (para uma revisão ver, por exemplo, Methods in Enzymology 153: 385-516). Por exemplo, são amplamente utilizadas as estirpes das espécies bacterianas Escherichia coli e Bacillus subtilis. Ao proporcionar as sequências de DNA da invenção é agora possível expressar uma proteína com actividade de amilossucrase em microrganismos para os quais estão disponíveis os sistemas de expressão apropriados. A presente invenção refere-se particularmente a um processo para produzir microrganismos capazes de sintetizar, 27 intracelular ou extracelularmente, a-1,4-glucanos lineares, no qual uma sequência de DNA da invenção é introduzida e expressa no microrganismo. Esse processo pode compreender, de forma exemplificativa, os passos seguintes: (a) produzir uma cassete de expressão com as seguintes sequências parciais: (i) um promotor activo no microrganismo seleccionado e que assegura a transcrição da sequência de DNA a jusante; (ii) uma sequência de DNA de acordo com a invenção que codifica para uma amilossucrase e que está fundida ao promotor na orientação sentido; (iii) um sinal de terminação da transcrição funcional em microrganismos; (b) transformar um microrganismo apropriado com a cassete de expressão construída no passo (a).

Vectores de expressão foram extensamente descritos na área. Para além de um gene marcador de selecção e de uma origem da replicação, que permite a replicação no hospedeiro seleccionado, normalmente contêm um promotor bacteriano ou virai e um sinal de terminação da transcrição. Entre o promotor e o sinal de terminação encontra-se pelo menos um sítio de restrição ou um agente de poli-ligação que permite a inserção de uma sequência de DNA codificadora. Como sequência promotora pode utilizar-se a sequência de DNA que normalmente controla a transcrição do gene correspondente, desde que seja activa no organismo seleccionado. Esta sequência pode ser substituída por outras sequências promotoras. Podem utilizar-se promotores que procedam à expressão constitutiva do gene ou promotores indutíveis que 28 permitam uma regulação selectiva da expressão do gene a jusante. Sequências promotoras bacterianas e virais com estas propriedades foram extensamente descritas na área. Promotores que permitem uma expressão particularmente forte do gene a jusante são, por exemplo, o promotor de T7 (Studier et al., 1990, em Methods in Enzymology 185: 60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., em Rodriguez, R. L., e Chamberlin, M. J. (Editores) "Promoters, Structure and Function", Praeger, Nova Iorque, 1982, páginas 462-481; DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. _80: 21-25), lpi, rac (Boros et al., 1986, Gene 42: 97-100) ou o promotor ompF. A sequência de DNA mencionada do passo (a) (ii) do processo pode ser qualquer sequência de DNA que codifica para uma proteina com a actividade enzimática de uma amilossucrase. Preferivelmente utilizam-se sequências de DNA derivadas de microrganismos, particularmente bactérias gram negativas, preferivelmente do género Neisseria e, particularmente preferido, de Neisseria polysaccharea. A sequência utilizada pode ser modificada antes ou após a integração no vector de expressão para alterar, se necessário, as propriedades do polipéptido ou a sua localização, como descrito infra em mais pormenor.

Em vez da sequência que codifica para uma amilossucrase de Neisseria polysaccharea contida no plasmideo pNB2 (DSN 9196), podem utilizar-se sequências de DNA que podem ser derivadas dessa sequência por substituição, inserção ou deleção, desde que a actividade enzimática da proteina codificada não seja enfraquecida. 29 A transformação dos microrganismos no passo (b) pode ser habitualmente realizada por técnicas comuns, como descrito em Maniatis et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1982, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press). O microrganismo transformado é cultivado em meio que deverá ser apropriado para as necessidades do hospedeiro individual utilizado. Deve prestar-se atenção especifica ao valor do pH, temperatura, ventilação, etc.

Outro objectivo da invenção consiste nos microrganismos resultantes do processo descrito acima, que se caracterizam por conterem uma sequência de DNA que codifica para uma amilossucrase, cuja sequência faz parte de uma molécula de DNA recombinante. Essa molécula de DNA recombinante dependendo do método de transformação utilizado - pode estar presente nas células fora do genoma ou pode estar integrada de forma estável no genoma das células do microrganismo utilizado. A amilossucrase expressa por Neisseria polysaccharea é uma enzima extracelular que sintetiza a-1,4-glucanos lineares fora das células com base em sucrose. Ao contrário do que acontece na maior parte das vias de síntese para polissacáridos que decorrem no interior da célula, não são necessários derivados de glucose activados nem cofactores. A energia necessária para a formação da ligação a-1,4-glucosídica entre os resíduos de glucose condensados é directamente obtida da hidrólise da ligação entre a glucose e a unidade de frutose na molécula de sucrose. 30

Em consequência, é possível cultivar microrganismos que segregam amilossucrase, que foram obtidos pelos passos processuais descritos acima, num meio contendo sucrose, em que a amilossucrase segregada conduz à síntese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose presente no meio. Estes glucanos podem ser isolados do meio de cultura.

Também é possível sintetizar a-1,4-glucanos in vitro com o auxílio de uma preparação enzimática sem células.

Neste caso, os microrganismos que segregam amilossucrase são cultivados num meio sem sucrose que permite a expressão da amilossucrase até se atingir a fase estacionária do crescimento. Após remoção das células do meio de crescimento por centrifugação, a enzima segregada pode ser obtida do sobrenadante. A enzima pode então ser adicionada a soluções contendo sucrose para sintetizar a-1,4-glucanos lineares. Em comparação com a síntese de a-1,4-glucanos lineares directamente num meio de crescimento contendo sucrose, este método é vantajoso pelo facto das condições reaccionais poderem ser melhor controladas e dos produtos da reacção serem substancialmente mais puros e também poderem ser mais facilmente purificados. A enzima pode ser purificada do meio de cultura por técnicas convencionais de purificação, como precipitação, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade, filtração em gel, cromatografia HPLC de fase reversa, etc.

Também é possível expressar um polipéptido por modificação da sequência de DNA inserida no vector de expressão, 31 conduzindo a um polipéptido que pode ser mais facilmente isolado do meio de cultura devido a certas propriedades. É possível expressar a enzima na forma de uma proteína de fusão juntamente com outra sequência polipeptídica cujas propriedades de ligação especifica permitirão isolar a proteína de fusão via cromatografia de afinidade. Técnicas conhecidas são, por exemplo, expressão na forma de proteina de fusão juntamente com glutationa-S-transferase e purificação subsequente via cromatografia de afinidade numa coluna de glutationa, aproveitando a afinidade da glutationa-S-transferase para a glutationa (Smith e Johnson, 1988, Gene 6_7: 31-40) . Outra técnica conhecida é a expressão na forma de proteina de fusão juntamente com a proteina de ligação a maltose (MBP) e purificação subsequente numa coluna de amilose (Guan et ai., 1988, Gene 67: 21-30; Maina et al.r 1988, Gene 7_4: 365-373).

Para além da possibilidade de adicionar directamente a enzima purificada a uma solução contendo sucrose para sintetizar a-1,4-glucanos lineares, há a alternativa de imobilizar a enzima num material transportador. Essa imobilização oferece a vantagem da enzima, como catalisador de sintese, poder ser facilmente recuperada e poder ser utilizada várias vezes. Uma vez que a purificação de enzimas é, habitualmente, muito demorada e dispendiosa, a imobilização e reutilização da enzima contribui para uma redução considerável dos custos. Outra vantagem é o elevado grau de pureza dos produtos reaccionais que, inter alia, se deve ao facto das condições reaccionais poderem ser melhor controladas quando se utilizam enzimas imobilizadas. Os glucanos lineares insolúveis obtidos como produtos 32 reaccionais podem então ser fácil e suplementarmente purificados. Há muitos materiais transportadores disponíveis para a imobilização de proteínas que podem ser acopladas ao material transportador por ligações covalentes ou não covalentes (para uma revisão ver Methods in Enzymology Volumes 135, 136 e 137). Materiais transportadores amplamente utilizados são, por exemplo, agarose, celulose, poliacrilamida, sílica ou nylon.

Analogamente à enzima purificada, microrganismos que expressam o polipéptido desejado ou que segregam um metabolito específico também podem ser imobilizados. A imobilização é geralmente feita por inclusão das células num material apropriado, tal como, por exemplo, alginato, poliacrilamida, gelatina, celulose ou quitosano. No entanto, também é possível adsorver ou ligar covalentemente as células a um material transportador (Brodelius e Mosbach, em Methods in Enzymology, Volume 135: 173-175). Uma vantagem da imobilização de células é o facto de se poderem obter densidades celulares consideravelmente mais elevadas do que por cultura numa cultura líquida, o que resulta numa produtividade mais elevada. Também os custos de agitação e ventilação da cultura, bem como das medidas necessárias para manter a esterilidade, são reduzidos. Um aspecto importante é o facto da imobilização permitir uma produção contínua, de modo que longas fases improdutivas, que habitualmente ocorrem em processos de fermentação, podem ser evitadas ou, pelo menos, podem ser consideravelmente reduzidas. 33

Tal como em microrganismos, as sequências de DNA da invenção também podem ser utilizadas para a expressão de uma actividade de amilossucrase em fungos, particularmente em leveduras, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae. Foram descritos vectores para a expressão de genes heterólogos em leveduras (por exemplo, Bitter et ai., 1987, Methods in Enzymology 153: 516-544). Estes vectores, para além de um gene marcador de selecção e de uma origem da replicação para a propagação em bactérias, contêm pelo menos mais um gene marcador de selecção que permite a identificação de células de levedura transformadas, uma sequência de DNA que permite a replicação em leveduras e um agente de poli-ligação para a inserção da cassete de expressão desejada. A cassete de expressão é construída a partir de promotor, sequência de DNA a ser expressa e uma sequência de DNA que permite a terminação da transcrição e poliadenilação do transcrito. Promotores e sinais de terminação da transcrição de Saccharomyces também foram descritos e estão disponíveis. Pode introduzir-se um vector de expressão em células de levedura por transformação de acordo com técnicas comuns ("Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990) . Células contendo o vector são seleccionadas e propagadas em meio de selecção apropriado. As leveduras também permitem integrar a cassete de expressão via recombinação homóloga no genoma de uma célula utilizando um vector apropriado, conduzindo a uma hereditariedade estável da caracteristica.

Estirpes de levedura que expressam amilossucrase podem ser utilizadas analogamente aos microrganismos para obter uma amilossucrase segregada. Métodos de cultura para leveduras foram suficientemente descritos ("Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual", Cold Spring Harbor 34

Laboratory Press, 1990). A imobilização das leveduras também é possível e já é utilizada na produção comercial de etanol (Nagashima et al., em Methods in Enzymology, Volume 136: 394-405; Nojima e Yamada, em Methods in Enzymology, Volume 136: 380-394).

No entanto, a utilização de leveduras que segregam amilossucrase para a síntese de a-1,4-glucanos lineares em meio contendo sucrose não é facilmente possível, pois as leveduras segregam uma invertase que hidrolisa a sucrose extracelular. As leveduras importam as hexoses resultantes via um transportador de hexoses. Todavia, Gozalbo e Hohmann (1990, Current Genetics YJ_, 77-79) descrevem uma estirpe de levedura que tem um gene suc2 defeituoso e que, em consequência, não consegue segregar invertase. Estas células de levedura também não têm um sistema de transporte para importar sucrose para as células. Se essa estirpe for modificada com a sequência de DNA da invenção de modo a segregar uma amilossucrase para o meio de cultura, a-1,4-glucanos lineares são sintetizados pela amilossucrase se o meio de cultura contiver sucrose. A frutose formada como produto reaccional pode ser subsequentemente importada pelas leveduras.

Em consequência, a presente invenção também se refere a um processo para a produção de células de fungos capazes de sintetizar, intracelular ou extracelularmente, a-1,4-glucanos lineares, no qual uma sequência de DNA de acordo com a invenção é introduzida em células de fungos e é expressa. Esse processo pode compreender, de forma exemplificativa, os passos seguintes: 35 (a) produzir uma cassete de expressão com as seguintes sequências parciais: (i) um promotor activo em células do fungo seleccionado e que assegura a transcrição da sequência de dna a jusante, (ii) uma sequência de DNA de acordo com a invenção que codifica para uma amilossucrase e que está fundida ao referido promotor na orientação sentido, (iii) um sinal de terminação da transcrição funcional nessas células de fungos, e (b) transformar células de fungos com a cassete de expressão construída no passo (a).

Outro aspecto da presente invenção é a possibilidade de produzir, de um modo económico, xarope de frutose pura utilizando as sequências de DNA da invenção. Métodos convencionais para a produção de frutose contemplam a hidrólise enzimática de sucrose utilizando uma invertase ou a degradação de amido em unidades de glucose, muitas vezes por acidólise, e conversão enzimática subsequente da glucose em frutose por glucose isomerase. Ambos os métodos dão origem a misturas de glucose e frutose. Os dois componentes têm de ser separados um do outro por processos cromatográficos. A produção de frutose pura ou de xarope de frutose pura utilizando uma proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase é preferivelmente efectuada num sistema sem células utilizando a enzima purificada. A última pode ser imobilizada num material transportador apropriado ou pode estar presente em forma solúvel. A presença de sucrose resulta na síntese de glucanos lineares e na libertação de 36 frutose. Pode separar-se o substrato dos produtos reaccionais ou separar os dois produtos reaccionais, por exemplo, utilizando membranas que permitem a permeação de frutose mas não de sucrose nem de glucanos. Se a frutose for continuamente removida via essa membrana, a sucrose será convertida, mais ou menos completamente, em frutose e glucanos lineares. A amilossucrase também pode ser preferivelmente imobilizada num material transportador localizado entre duas membranas, uma das quais permite a permeação de frutose mas não de sucrose nem glucanos, e a outra permite a permeação de sucrose mas não de glucanos. 0 substrato é proporcionado pela membrana que permite a permeação de sucrose. Os glucanos sintetizados permanecem no espaço entre as duas membranas e a frutose libertada pode ser continuamente removida do equilíbrio reaccional através da membrana que permite apenas a permeação de frutose. Essa montagem permite separar eficientemente os produtos da reacção e assim, inter alia, permite produzir frutose pura. A utilização de amilossucrases para a produção de frutose pura oferece a vantagem do substrato de sucrose comparativamente económico poder ser utilizado como material de partida e, além disso, da frutose poder ser isolada da mistura reaccional de um modo simples sem processos cromatográficos.

Em consequência, a invenção também se refere à utilização de proteínas com a actividade enzimática de amilossucrase para a produção de frutose. 37

Outra possibilidade de utilização de proteínas com actividade de amilossucrase consiste em utilizá-las para a produção de ciclodextrinas. As ciclodextrinas são produzidas pela degradação de amido efectuada pela enzima ciclodextrina transglicosilase (EC 2.4.1.19), que é obtida da bactéria Bacíllus macerans. Devido à ramificação do amido, apenas cerca de 40% das unidades de glucose podem ser convertidas em ciclodextrinas utilizando este sistema. Ao proporcionar proteinas substancialmente puras com actividade de amilossucrase é possível sintetizar ciclodextrinas com base na sucrose sob a acção simultânea de amilossucrase e ciclodextrina transglicosilase, em que a amilossucrase catalisa a síntese de glucanos lineares a partir de sucrose e a ciclodextrina transglicosilase catalisa a conversão destes glucanos em ciclodextrinas. O plasmídeo pNB2 da invenção foi depositado na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Braunschweig, Alemanha, em 6 de Maio de 1994, de acordo com as regulamentações do Tratado de Budapeste, com o n° de depósito DSM 9196.

Abreviaturas utilizadas iptg isopropil-p-D-tiogalactopiranósido

Meio e soluções utilizados

Meio YT 8 g de bacto-triptona 5 g de extracto de levedura 5 g de NaCl até 1000 ml com ddH20

Placas YT meio YT com 15 g de bacto-agar/1000 ml 38

Solução de Lugol 12 g de Kl 6 g de I2 até 1,8 1 com ddH20 Descrição das Figuras A Fig. 1 mostra o plasmídeo pNB2 (DSM 9196) . A linha fina corresponde à sequência do vector de clonagem pBluescript SK(-). A linha grossa representa a inserção de aproximadamente 4,2 kb de comprimento de DNA genómico de Neisseria polysaccharea. A região codificadora para amilossucrase está representada na forma de uma seta por baixo da inserção.

Acima da inserção está representada a região sequenciada.

Todos os valores numéricos referem-se a esta região de 2883 pares de bases de comprimento. A Fig. 2 mostra a expressão de uma actividade de amilossucrase em células de E. coli transformadas sujeitando-as a vapores de iodo. Células de E. coli que foram transformadas com o plasmídeo pBluescript II SK (A) e células de E. coli que foram transformadas com o plasmídeo pNB2 (B) foram plaqueadas em placas YT (agar 1,5%; 100 μg/ml de ampicilina; sucrose 5%; IPTG 0,2 mM) e foram incubadas durante a noite a 37°C. Em seguida, as placas foram submetidas a vapores de iodo. As colónias das células que foram transformadas com o plasmídeo pNB2 exibiram uma coroa azul distinta.

Os exemplos servem para ilustrar a invenção. 39

Exemplo 1

Isolamento de uma sequência de DNA genómico que codifica para uma actividade de amilossucrase de Neisseria polysaccharea

Para isolar uma sequência de DNA que codifica para uma actividade de amilossucrase de Neisseria polysaccharea estabeleceu-se primeiramente uma biblioteca de DNA genómico. As células de Neisseria polysaccharea foram cultivadas em Agar Sangue Columbia (Difco) durante 2 dias a 37°C. Recolheram-se das placas as colónias resultantes. DNA genómico foi isolado de acordo com o método de Ausubel et al. (em: "Current Protocols in Molecular Biology" (1987) J. Wiley & Sons, NI) e foi processado. 0 DNA obtido deste modo foi parcialmente digerido com a endonuclease de restrição Sau3A. Os fragmentos de DNA resultantes foram ligados no vector pBluescript SK(-) digerido com BamHI. Os produtos da ligação foram transformados em células de E. coli XLl-Blue. Para a sua selecção, as células foram plaqueadas em placas YT com ampicilina como marcador de selecção. 0 meio de selecção continha adicionalmente sucrose 5% e IPTG 1 mM. Após incubação durante a noite a 37°C, as colónias bacterianas que se tinham formado foram coradas com iodo, colocando iodo cristalino na tampa de uma placa de Petri e colocando as placas de cultura com as colónias de bactérias, durante 10 minutos cada, inversamente na placa de Petri. O iodo que evaporou à temperatura ambiente corou de azul algumas regiões das placas de cultura que continham glucanos do tipo amilose. De colónias de bactérias que exibiram uma coroa azul isolou-se DNA plasmidico de acordo com o método de Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acids Res. 1513-1523) . Esse DNA foi novamente transformado em células de E. coli SURE. As células transformadas foram 40 plaqueadas em placas YT com ampicilina como marcador de selecção. Isolaram-se clones positivos.

Exemplo 2

Análise de sequência da inserção de DNA qenómico do plasmídeo pNB2

De um clone de E. coli obtido de acordo com o exemplo de trabalho 1 isolou-se um plasmídeo recombinante. As análises de restrição mostraram que esse plasmídeo era um produto de ligação que consistia em duas moléculas vectoriais e num fragmento genómico de aproximadamente 4,2 kb de comprimento. O plasmídeo foi digerido com a endonuclease de restrição PstI e o fragmento genómico foi isolado (GeneClean, BiolOl). O fragmento assim obtido foi ligado num vector pBluescript II SK linearizado com PstI, o que resultou numa duplicação dos sítios de restrição PstI e Smal. O produto da ligação foi transformado em células de E. coli e as últimas foram plaqueadas em placas de ampicilina para selecção. Isolaram-se clones positivos. A partir de um destes clones isolou-se o plasmídeo pNB2 (Fig. 1) e determinou-se parte da sequência da sua inserção de DNA genómico por técnicas comuns utilizando o método didesoxi (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 7_4; 5463-5467). A inserção completa tem aproximadamente 4,2 milhares de pares de bases de comprimento.

Exemplo 3

Expressão de uma actividade de amilossucrase extracelular em células de E. coli transformadas 41

(a) Detecção de uma actividade de amilossucrase durante o crescimento em placas YT

Para a expressão de uma actividade de amilossucrase extracelular, células de E. coli foram transformadas com o vector pNB2 de acordo com técnicas comuns. Uma colónia da estirpe transformada foi incubada em placas YT (agar 1,5%; 100 μρ/ηιΐ de ampicilina; sucrose 5%; IPTG 0,2 mM) durante a noite a 37°C. Detectou-se a actividade de amilossucrase submetendo as colónias a vapores de iodo (Fig. 2) . As colónias que expressaram amilossucrase exibiram uma coroa azul. Foi possivel observar actividade de amilossucrase mesmo sem IPTG presente, provavelmente devido à actividade dos promotores de amilossucrase endógena. (b) Detecção de uma actividade de amilossucrase durante

o crescimento em meio YT

Para a expressão de uma actividade de amilossucrase extracelular, E. coli foram transformadas com o vector pNB2 de acordo com técnicas comuns. Inoculou-se meio YT (100 μρ/ιηΐ de ampicilina; sucrose 5%) com uma colónia da estirpe transformada. As células foram incubadas durante a noite a 37°C com agitação constante (misturador rotativo; 150 - 200 rpm) . Detectaram-se os produtos da reacção catalisada por amilossucrase adicionando ao sobrenadante da cultura solução de Lugol, o que conduziu a uma coloração azul. (c) Detecção da actividade de amilossucrase nos sobrenadantes de cultura de células de E. coli transformadas que foram cultivadas sem sucrose 42

Para a expressão de uma actividade de amilossucrase extracelular, células de E. coli foram transformadas com o vector pNB2 de acordo com técnicas comuns. Inoculou-se meio YT (100 μg/ml de ampicilina) com uma colónia da estirpe transformada. As células foram incubadas durante a noite a 37°C com agitação constante (misturador rotativo; 150 - 200 rpm). Em seguida, removeram-se as células por centrifugação (30 minutos, 4°C, 5500 rpm, rotor Beckmann JA10). Filtrou-se o sobrenadante num filtro de 0,2 μπι (Schleicher & Schuell) em condições esterilizadas.

Detectou-se uma actividade de amilossucrase por um dos modos seguintes. (i) Incubação do sobrenadante numa placa de agar contendo sucrose. Colocaram-se 40 μΐ do sobrenadante num orifício puncionado numa placa de agar (sucrose 5% em tampão de citrato de sódio 50 mM pH 6,5) e incubou-se o sistema durante pelo menos uma hora a 37°C. Detectaram-se os produtos da reacção catalisada por amilossucrase por coloração com vapores de iodo. A presença dos produtos reaccionais produz uma coloração azul. (ii) Separação electroforética em gel das proteínas do sobrenadante num gel nativo e detecção dos produtos reaccionais no gel após incubação com sucrose. Separaram-se 40 - 80 μΐ do sobrenadante por electroforese em gel num gel de poliacrilamida nativo 8% (Tris 0,375 M pH 8,8) a uma voltagem de 100 V. Em seguida, o gel foi equilibrado duas vezes durante 15 minutos com aproximadamente 100 ml de tampão de citrato de sódio 50 mM (pH 6,5) e foi 43 incubado durante a noite a 37°C em tampão de citrato de sódio pH 6,5/sucrose 5%. Para tornar visível o produto reaccional da reacção catalisada por amilossucrase, o gel foi enxaguado com solução de Lugol. As bandas com actividade de amilossucrase ficaram coradas de azul.

Exemplo 4

Produção de glucanos in vitro com amilossucrase parcialmente purificada

Para a expressão de uma actividade de amilossucrase extracelular, células de E. coli foram transformadas com o vector pNB2 de acordo com técnicas comuns. Inoculou-se meio YT (100 pg/ml de ampicilina) com uma colónia da estirpe transformada. As células foram incubadas durante a noite a 37°C com agitação constante (misturador rotativo; 150 - 200 rpm). Em seguida, removeram-se as células por centrifugação (30 minutos, 4°C, 5500 rpm, rotor Beckmann JA10). Filtrou-se o sobrenadante num filtro de 0,2 μιη (Schleicher & Schuell) em condições esterilizadas.

Em seguida, o sobrenadante foi concentrado 200 vezes utilizando uma câmara Amicon (membrana YM30 com um tamanho de exclusão de 30 kDa, empresa Amicon) sob pressão (p = 3 bar) . Adicionou-se o sobrenadante concentrado a 50 ml de uma solução de sucrose (sucrose 5% em tampão de citrato de sódio 50 mM pH 6,5). Incubou-se a totalidade da solução a 37°C. Formaram-se polissacáridos insolúveis esbranquiçados.

Exemplo 5 44

Caracterização dos produtos reaccionais sintetizados por amilossucrase do Exemplo 4

Os produtos reaccionais insolúveis descritos no Exemplo 4 são solúveis em NaOH 1 M. caracterizaram-se os produtos reaccionais medindo o máximo da absorção. Aproximadamente 100 mg dos produtos reaccionais isolados (peso liquido) foram dissolvidos em 200 μΐ de NaOH 1 M e diluídos com H20 1:10. A 100 μΐ desta diluição adicionaram-se 900 μΐ de NaOH 0,1 M e 1 ml de solução de Lugol. Mediu-se o espectro de absorção entre 400 e 700 nm. O máximo é 605 nm (máximo da absorção de amilose: aproximadamente 614 nm). A análise por HPLC da mistura reaccional do Exemplo 4 numa coluna CARBOPAC PAl (DIONEX) mostrou que, para além dos produtos insolúveis, também se formaram produtos solúveis. Estes produtos solúveis são polissacáridos de cadeia curta. O comprimento da cadeia situou-se entre aproximadamente 5 e aproximadamente 60 unidades de glucose. Todavia, em menor extensão, também foi possível detectar moléculas ainda mais pequenas ou maiores.

Com os métodos analíticos disponíveis não foi possível detectar a existência de ramificações nos produtos da síntese.

Exemplo 6

Expressão de uma actividade de amilossucrase intracelular em células de E. coli transformadas

Utilizando uma reacção em cadeia de polimerase (PCR) amplificou-se um fragmento do plasmídeo pNB2 que compreende os nucleótidos 981 até 2871 da sequência representada na ID 45 SEQ NO: 1. Utilizaram-se como "primers" os seguintes oligonucleótidos: TPN2 5' - CTC ACC ATG GGC ATC TTG GAC ATC - 3' (ID SEQ NO: 3) TPC1 5' - CTG CCA TGG TTC AGA CGG CAT TTG G - 3' (ID SEQ NO: 4) O fragmento resultante contém a região codificadora para amilossucrase exceptuando os nucleótidos que codificam para os 16 aminoácidos N-terminais. Estes aminoácidos compreendem as sequências que são necessárias para a secreção da enzima a partir da célula. Além disso, este fragmento de PCR contém 88 pares de bases da região 3' não traduzida. Através dos "primers" utilizados introduziram-se sitios de restrição Ncol em ambas as extremidades do fragmento.

Após digestão com a endonuclease de restrição Ncol, o fragmento resultante foi ligado no vector de expressão pMex 7 digerido com Ncol. Os produtos da ligação foram transformados em células de E. coli e seleccionaram-se os clones transformados. Os clones positivos foram incubados durante a noite a 37°C em placas YT (agar 1,5%; 100 μg/ml de ampicilina; sucrose 5%; IPTG 0,2 mM). Depois de submeter as placas a vapores de iodo, não foi possível observar coloração azul na área em redor das colónias de bactérias, mas foi possível detectar a produção intracelular de glicogénio (coloração castanha de células transformadas, em contraste com ausência de coloração em células XLl-Blue não transformadas). Para examinar a funcionalidade da proteína, células transformadas cultivadas em meio YT foram 46 desagregadas por ultra-sons e o extracto em bruto obtido foi pipetado para placas de agar contendo sucrose. Depois de submeter as placas a vapores de iodo pôde observar-se uma coloração azul. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÕES GERAIS: (i) CANDIDATO: (A) NOME: Institut fuer Genbiologische Forschung

Berlin GmbH (B) RUA: Ihnestrasse 63 (C) CIDADE: Berlim

(E) PAÍS: DE (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 14195 (G) TELEFONE: +49 30 8300070 (H) TELEFAX:+49 30 8300073 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Sequências de DNA que codificam enzimas capazes de facilitar a síntese de alfa-1,4-glucanos lineares em plantas, fungos e microrganismos (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 4 (iv) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) "SOFTWARE": Patentln Tiragem #1.0, Versão #1.30 (EPO) (vi) DADOS DE CANDIDATURAS ANTERIORES: (A) NÚMERO DA CANDIDATURA: DE P 44 17 879.4 (B) : DATA DO REGISTO: 18-MAIO-1994 47 (vi) DADOS DE CANDIDATURAS ANTERIORES: (A) NÚMERO DA CANDIDATURA: DE P 44 47 388.5 (B) : DATA DO REGISTO: 22-DEZEMBRO-1994 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2883 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: desconhecida (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Neisseria polysaccharea (vii) FONTE IMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: biblioteca genómica em pBluescriptII SK (B) CLONE: pNB2 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 939..2780 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 1 48 GAGTTTTGCG TTCCCGAACC GAACGTGATG CTTGAGCCGA ACACCTGTCG GCMGCGCTG 60 ACCGCCTTTT GCCCCATCGA CATCGTAACA ATCGGTTTGG TGGCAAGCTC TTTCGCTTTG 120 AGCGTGGCAG AAAGCAAAGT CAGCACGTCT TCCGGCCTTT CGGCATCACC GCAATTTTGC 180 AGATGTCCGC GCCGCAGTCC TCCATCTGTT TCAGACC-GCA TACGATTTCT TCTTGCGGCG 240 GCGTGCGGTG AAACTCATGA TTGCAGAGCA GGGCGATGCC GTTTTTTTGA GCATGCCACG 300 GCGCCGGAGC GGTTTCGCCG GAAAAAAGCT CGATATCGAT AAT5TCGGGC AGGCGGCTTT 300 CAATCAGCGA GTC6AGCAGT TCAAAATAAT AATCGTCCGA ACACGGSAAC GAGCCGCCTT 420 CGCCATGCCG TCTGAAÇGTA AACAGCASCG GCTTGTCGOG CAGCGCGTCG CGGACGGTCT 480 GCGTGTGGCG CAATACTTCG CCGATGCTGC CCGCGCATTC CAAMAATCG GCGCGGAACT £40 CGACGATATC GAAGGGCAGG TTTTTGATTT GGTCAAGTAC GGCGGAAAGT ACGGCGGCAT 600 CGCGGGCGAC AAGCGGCACG GCGATTTTGG TGCGTCCGCT TCCGATAACG GTGTTTTTGA 660 CGGTCAGGGC TGGTGTGCAT GGCGGTTGTT GCGGCTGAAA GGAAC3GTAA AGACGCAÂTT 720 ATAGCAAAGG CACAGGCAAT GTTTCAGACG GCATTTCTG? GCGQCCGGCT TGATATGAAT 700 CAAGCAGCAT ÇCGCATATCG GAÂTGCAGAC TTGGCACAAG CCTGTCTTTT CTAGTCAGTC 840 CGCAGTTCTT OCAGTATGAT TGCACSACAC CCCCTACACG GCATTTGCAG GATACGGCGG 300 CAGACCGCGT CGGAAACTTC AGAATCGGAG CAGGCATC ATG TTG ACC CCC ACG 9S3

Kec Leu Thr Pro Thr 1 5 CAG CAA GTC GGT TTG ATT TTA CAG TAC CTC AAA ACA CGC ATC TTG GAC 1001

Gin Gin Vai Gly Leu Ile Leu Gin Tyr Leu Lys Thr Arg Xle Leu Asp 10 IS 20 ATC TAC ACG CCC GAA CAG CGC GCC GGC ATC GAA AAA TCC GAA GAC TGG 1043

Ila Tyr Thr ?ro Glu Gin Arg Ala Gly He Glu Lys Ser Glu Asp Trp

25 30 3S CGG CAG TTT TCG CGC CGC ATG GAT ACG CAT TTC CCC AAA CTG ATG AAC 1097

Arg Gin The Ser Arg Arg Mefc Asp Thr His The Pro Lys Leu Mefc Asn 40 45 50

GAA CTC GAC AGC GTG TAC GGC AAC AAC GAA GCC CTG CTG CCT ATG CTG

Glu Leu Asp Ser Vai Tyr Gly Asn Asn Glu Ala Leu Leu Pro Met Leu 114$ 49 GAA ATG CTG CTG GCG CAG GCA TGG CAA AGC TAT TCC CAA CGC AAC TCA 1.193 Glu Met Leu Leu Ala Gin Ala Trp Gin Ser Tyr Ser Gin Arg Asn Ser 70 75 80 85 TCC TTA AAA GAT ATC GAT ATC GCG CGC GAA AAC AAC CCC GAT TGG ATT 1241 Ser Leu Lys Asp Ile ASp Ue Ala Arg Glu AsíS Asri Pro Asp Trp Ile 50 95 100 TTG TCC AAC AAA CAA GTC GGC GGC GTG TGC TAC GTT GAT TTG TTT GCC 12SS Leu Asíi Lys Gin Vai Gly Gly Vai Cys Tyr Val ASp Leu Pha Ala 105 110 115 GGC GAT TTG AAG GGC TTG AAA GAT AAA ATT CCT TAT CAA GAG CTT 1337 Gly a&p Leu Lys Gly Leu Lys ASp Lys Ue Pro Tyr Phe Gin Glu Leu 130 125 130 GGT TTG ACT TAT CTG CAC CTG ATG CCG CTG TTT AAA TGC CCT GAA GGC 1385 Gl y L&U Thr Tyr Leu His Lau Met Pro Leu Phe Lys» Cys Pro Glu Gly 135 140 145 P^PJk AGC GAC GGC GGl TAT GCG ^ i AGC ACG TAC CGC GAT GTC AAT CCG 1433 Lys Ser Asp Gly Gly Tvr- Ala vai Ser Thr Tyr Arg ASp Val Asn Prô 150 155 160 165 GCA CTG ACA ATA GGC GAC TTG CGC GAA GTC ATT GCT GCG CTG CAC 1481 Ala Leu Qly Thr Ils Gly Asp Leu Arg Glu val Ile Ala Ala Leu Hlfi 170 175 ISO GAA TCG CAT TTC CGC CGT CGT CGA ITT TAT CTT CAA CCA CAC CTC CAA 1529 Glu Ser His Phe Arg Arg Arg Arg Phe Tyr Leu Gin Pro His Leu Gin 185 190 155 CGA ACA CGA ATG GCG CAA CGC TGC CCC GGC GAC CCG CTT TTC GAC AAT 1577 Arg Thr Arg Met Ala G.ln Arg Cys Ala Gly Asp Pro Leu Phe Asp As n 200 205 210 TTC TAC TAT AT? TTC ccc GAC CGC CGG ATG ccc GAC CAA TAC GAC CGC 1625 Phe Tyr Tyr Ue Phe Pro Asp Arg Arg Met Pro Asp Gin Tyr Asp Arg 215 220 323 ACC CTG CGC GAA ATC TTC CCC GAC CAG CAC CCG GGC GGC TTC TCG CAA 1Í73 Thr Leu Arg Glu Ue Phe Pro Asp Gin His Pro Gly Gly Phe Ser Gin 230 235 240 245 CTG ΙλΑΑ GAC GGA CGC TGG GTG TGG ACG ACC rrc AAT TCC TTC CAA TGG 1721 Leu Giu Asp Gly Arg Trp Vai Trp Thr Thr Phe Asn Ser Phe Gin Trp 2S0 253 280 GAC TTG AAT TAC AGC AAC CCG TGG GTA TTC GCG CAA TGG CGG GCG AAA 1769 Asp Leu Asn Tyr Ser ASn Pro Trp val Phe Ala Gin Trp Arg Ala Lys 205 270 275 TGC TGT TCC TTG CCA ACT TGG GCG TTG ACA TCC TGC GTA TGG ATG CGG 1817 Cys Cys Ser Leu Pro Thr Trp Ala Leu Thr Ser Cys Val Trp Met Arg 280 285 250 50 TTG CCT TTA ITT GGA AAC AAA TGG GGA CAA GCT GCG AAA ACC 7GC GCA Leu Pro Leu Phe Gly Asn Lvs Trp Gly Gin Ala Ala Lys Thr Cvs Ala 2SS 3oo 30S GCG CAC GCC CTC A7C CGC GCG TTC AAT GCC GTT ATG CGT ATT GCC GCG Ala His Aia Leu Ile Arg Ala Phe Asn Ala Vai «et Arg Ile Aia Ala 3ιδ 315 320 325 CCC GCC GTG TTC TTC AAA TCC GAA GCC ATC GTC CAC CCC' GAC CAA GTC Pro Ala Vai Phe Phe Lys Ser Glu Ala Ile Vai His Pro Asp Gin Vai 330 335 340 186! 191! i9s: GTC CAA TAC ATC GGG CAG GAC GAA TGC CAA ATC GGT TAC ÃAC CCC CTG Vai Gin Tyr Ile Gly Gin Asp Glu Cys Gin lie Gly Tyr Asn Pro Leu 345 350 355 CAA ATG GCA TTG TTG TGG AAC ACC CTT GCC ACG CGC GAA GTC AAC CTG Gin Met Ala Leu Leu Trp Asn Thr Leu Ala Thr Arg Glu Vai Asn Leu 360 35S 370 2005 2057 CTC CAT CAG GCG CTG ACC TAC CGC CAC AAC CTG CCC GAG CAT ACC GCC Leu Mis Gin Ala Leu Thr Tyr Arg His Asn Leu Pro Glu His Thr Ala 375 380 335

21GS TGG GTC AAC TAC CTC CGC ACC CAC GAC GAC ATC GGC TGG ACG TTT GCC Trp Vai Asn Tyr Vai Arg Ssr His Asp Asp Ile Gly Trp Thr Phe Ala 330 335 4Q0 405 SAT GAA GAC GCG GCA TAT CTG GGC ATA AGC GGC TAC GAC CAC CGC CAA Asp Glu Asp Ala Ala Tyr Leu Gly Ile Ser Gly Tyr Asp His Arg Gin 410 415 420 TTC CTC AAC CGC TTC TTC GTC AAC CGT TTC GAC GGC ACG TTC GCT CGT Phe Leu Asn Arg Phe Phe Vai Asn Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Arg 425 430 435 GGC GTA CCG TTC CAA TAC AAC CCÃ AGC ACA GGC GAC TGC CGT GTC AGT Gly Vai Pro Phe Gin Tyr Asn Pro Ser Thr Gly Asp Cys Arg Vai Ser 440 445 4S0 GGT ACA GCC GCG GCA TTG GTC GGC TTG GCG CAA GAC GAT CCC CAC GCC Gly Thr Ala Ala Ala Leu vai Gly Leu Ala Gin Asp Asp Pro His Ala 455 460 465 2153 2201 2249 2297 2345 GTT GAC CGC ATC AAA CTC TTG TAC AGC ATT GCT TTG AGT ACC GGC GGT Vai Asp Arg lie Lys Leu Leu Tyr Ser lis Ala Leu Ser Thr Gly Gly 470 475 480 48S CTG CCG CTG ATT TAC CTA GGC GAC GAA GTG GGT ACG CTC ΑΆ7 GAC GAC Leu Pro Leu Ile Tyr Leu Gly Asp Glu Vai Gly Thr Leu Asn Asp Asp 490 * 495 500 GAC TGG TGC CAA GCA GCA ATA AGA GCG ACG ACA GCC GTT GGG CCA CCG Asp Trp Cys Gin Ala Ala Ile Arg Ala Thr Thr Ala vai Gly Pro Pro 505 SiC 515 2393 2441 2483 51 TCC SCO CTA CAA CGA AGC CCT GTA CGC GCA ACC S.AA CGA TCC ΠΤ," Utv GAC 253 7 Ser Ala Leu Gin Arg Ser Pro Vai Arg Ala Thr Glu Arg Ser Val Asp 520 525 530 CGC AGC CGG CAA ATC TAT CAG GGC TTG CGC CAT ATG ATT GCC GTC CGC 2535 Arg Ser Arg Gin ru ?yr Gin Gly Leu Arg ivsec ile AÍ a Val Are 535 540 545 CAA A3C AAT CCG CGC TTC GAC GGC GGC AGG CTG GTT ACA TTC AAC ACC 2633 Gin Ssr Asn Pro Arg Phe Asp Gly Gly Arg Lsu val Thr Phe Asn Thr 550 S55 560 565 AAC AAC AAG CAC A?C ATC GGC TAC ATC GCA ACA ATG CGC TGG CAT 2631 Asn Asn Lys Kis Ile Ile Gly Tyr Ile Ala Thr Met Arg Phe Trp Kis 570 575 580 TCG GTA AC? ΤΓ.Ά GCG ΛΛ i ATC CGC AAA CCG TxA CCG CGC ATA ccc TGC 2729 Ser Vai Thr Ala ÂSfci Ile Arg Lys Pro Leu ?ro Arg Ile Pro Cys 585 590 595 AAG CCA TGC CCT TCA AGG CGC ACG ACC TCA TCG GTG GCA AAA CTG TCA 277? Lys Pro Cys Pro Ser Arg Axg Thr Thr Ser Ser val Ala Lys Leu Ser 600 605 610 GCC TGAATCAGGA TTTGACGCTT CAGCCCTATC AGGTCATGTG GCTCGAAATC 2830

Ala GCCTGACGCA CGCTTCCCAA ATGCCGTCTG AACCGTTTCA GACGGCATTT GC5 2383 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 614 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 2 52

Met Leu Thr Pro Thr Gin Gin Vai Gly Leu Ile Leu Gin Tyr Leu Lys 1 s 10 15 Thr Arg Ile Leu Asp Ile Tyr Thr Pro Glu Gin Arg Ala Gly Ile Glu 20 2S 30 Lys Ser Gl u Asp Trp Arg Gin Phe Ser Arg Arg Met Asp Thr His Phe 35 40 45 Pro lys Leu Mefc Asn Glu Leu Asp Ser vai Tyr Gly Asn Asn Glu Ala 50 55 60 Leu Leu Pro Met Leu G.lu Mât Leu Leu Ala Gin AXa Trp Gin Ser Tyr 6S 70 75 st Ser Gin Arg Asn ser Ser Leu Lys Asp Ile Asp Ila Ala Arg Glu Asn 85 90 95 Asn Pro Asp ?rp lie Leu Ser Asn Lys Gin Vai Gly Gly Vai Cys Tyr 100 105 110 val Asp Leu Phs Ala Gly Asp Leu Lys Gly Leu Lys Asp Lys Ile Pro US 120 125 Tyr Phe Gin Glu Leu Gly Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Phe 13 0 135 140 Lys Cys Pro Glu Ory Lys Sfir ÂSp Gly Gly Tyr Ala vai Ser Thr Tyr 14 S 150 15 S 160 Arg Asp Vai Asn Pro Alá Leu Gly Thr He Gly Asp Leu Arg Glu Val 1S5 170 175 He Ala AÍ5 Leu His Glu Ser His Phe Arg Arg Arg Arg Phe Tyr Leu 280 185 190 Qi t\ Pro His Leu Gin Arg Thr Arg Met Ala Gin Arg CVS Ala. Gly Asp 1?5 2 0Q: 205 p.ro Leu Phs Asp Asn Phs Tyr Tyr Xle Phe Pro Asp Arg Arg Met Pro 210· 215 220 Asp Gin Tyr Asp Arg Thr Leu .Arg Glu lie Phe Pro Asp Gin HiS Pro 22 S 230 225 240 Gly Gly Phe Ser Gin Leu Glu Asp Gly Arg Trp Vai Trp Thr Thr Phe 24 5 250 255 Asn Ser Phe Gin Trp Asp Leu Asn Tyr Ser Asn Pro Trp Val Phe Ala 260 265 .270 53

Cys val 7rp Met Arg Leu Pro Leu Phe Gly Asn Lys Trp Gly Gin Ala 290 2S5 300 Ala Lys Thr Cys Ala Ala His Ala Leu lie Arg Ala Phe Asn Ala Vai 3QS 310 315 320 Mar Arg Ile Alá Ala Pro Ala vai Phe Phe Lys Ser Glu Ala Ile Vai 325 330 335 His Pro Asp Gin Vai Vai Gin Tyr lie Gly Gin Asp Glu Cys Gin Ile 34Ô 345 350 Gly Tyr Asn Pro Leu Gin Mfât Ala Leu Leu Trp Asn Thr Leu Ala Thr 3S5 360 365 Arg Glu vai Asn Leu Leu HÍS GXn Ala Leu Th? Tyr Arg HÍS Asn Leu 370 375 380 Pro Glu His Thr Ala Trp Vai Asn Tyr Vai Arg Ser His Asp Asp Ile 385 330 3 95 400 Giy Trp Thr Phe Ala Asp Glu Asp Ala Ala Tyr Leu Gly Ile $er Gly 405 410 415 Tyr Asp His Arg Gin she Leu Asn Arg Phe Phe Va 1 Asn Arg Phe ASp 420' 425 430 Gly Thr Phe Ala Arg Gly Vai Pro Phe Gin Tyr Asn Pro Ser Thr Gly 43 5 440 445 Asp Cys Arg Vai Ser Gly Thr Ala Alã Ala Leu Vai Gly Leu Ala Gin 450 455 460 Asp ASp Pro His Ala Vai Asp Arg Ile Lys Leu Leu Tyr Ser Ile Ala 465 470 475 480 Leu Ser Thr Gly Gly Leu Pro Leu. Ile Tyr Leu Gly Asp Glu Vai Gly 43S 490 495 Thr Leu Asn ASp Asp ASp Trp Cys Gin Ala Ala Ile Arg Ala Thr Thr 500 505 510 Ala Vai Giy pro Pr© Ser Ala Leu Gin Arg Ser Pro Vai Arg Ala Thr 515 520 525 Glu Arg Ser Vai Asp Arg Ser Arg Gin Ile Tyr Gin Gly Leu Arg His 530 53 S 540 Het Ha Ala Vai Aig Glft Ser Asn Pro Arg Phe Asp Gly Giy Arg Leu S45 S5Q 5S5 560 54

Vai Thr Phe Asn Thr Asn Asn Lys HiS XI* Ile Qiy Tyr ile Ala Thr SS 5 S?0 575 Met Axg Phe Trp His Ser Vai Thr Ser Asn Ile Arg Lys Pro Leu 580 585 580 Pro Arg Ile Pro Cys Lys Pro Cys Pro Ssr Arg Arg Thr Thr Ser Ser 895 600 SOS Vai Ala Lys Leu Ser Ala 6X0 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleótido" (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Neisseria polysaccharea (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 3 CTCACCATGG GCAICTTGGA CATC 24 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico 55 (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleótido" (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Neisseria polysaccharea (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 4

CTGCCATGOT TCAGACGGCA TTTGG

Lisboa, 27 de Julho de 2007

Claims (34)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Sequência de DNA que codifica para uma proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase que catalisa a sintese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose, seleccionada do grupo que consiste em: (a) sequências de DNA que codificam para uma proteína com a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado pela região codificadora que codifica para uma amilossucrase de Neisseria polysaccharea contida na inserção de DNA do plasmídeo pNB2 (DSM 9196); (b) sequência de DNA com a sequência de nucleótidos da região codificadora que codifica para uma amilossucrase de Neisseria polysaccharea contida na inserção de DNA do plasmídeo pNB2 (DSM 9196); (c) sequências de DNA que hibridizam para qualquer uma das sequências de (a) ou (b); (d) sequências de DNA que são pelo menos 40% idênticas à sequência de DNA definida em (b), e (e) sequências de DNA que são degeneradas, devido ao código genético, em comparação com as sequências mencionadas em (a), (b), (c) ou (d).

2. Sequência de DNA da Reivindicação 1(d), em que a identidade de sequências é pelo menos 60%.

3. Sequência de DNA da Reivindicação 1(d), em que a identidade de sequências é pelo menos 80%.

4. Sequência de DNA da Reivindicação l(d), em que a identidade de sequências é pelo menos 95%. 2

5. Sequência de DNA da Reivindicação l(c), em que as condições de hibridização são condições de hibridização restritas.

6. Molécula de DNA recombinante que contém uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 5.

7. Molécula de DNA recombinante de acordo com a Reivindicação 6, em que a sequência de DNA que codifica para uma proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase que catalisa a síntese de a-1,4- -glucanos lineares a partir de sucrose está ligada a sequências de DNA que permitem a transcrição em células procarióticas ou eucarióticas.

8. Plasmideo pNB2, depositado como DSM 9196.

9. Microrganismo que contém uma molécula de DNA recombinante de acordo com qualquer uma das Reivindicações 6 até 8.

10. Fungo que contém uma molécula de DNA recombinante de acordo com qualquer uma das Reivindicações 6 até 8.

11. Processo para a produção de uma proteína com actividade de amilossucrase que catalisa a síntese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose, que compreende cultivar um microrganismo de acordo com a Reivindicação 9 ou um fungo de acordo com a Reivindicação 10 num meio de cultura adequado. 3

12. Proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase que catalisa a síntese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose e que é codificada por uma sequência de DNA de qualquer uma das Reivindicações 1 até 5.

13. Processo para a produção de plantas capazes de sintetizar a-1,4-glucanos lineares, caracterizado por uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 5, ligada a sequências de DNA que asseguram a expressão da referida sequência de DNA, ser introduzida em células vegetais e plantas completas serem regeneradas a partir das referidas células vegetais.

14. Processo de acordo com a Reivindicação 13, que compreende os seguintes passos processuais: (a) produzir uma cassete de expressão com as seguintes sequências parciais: (i) um promotor activo em plantas e que assegura a formação de um RNA no respectivo tecido alvo ou células-alvo; (ii) pelo menos uma sequência de DNA como indicada na Reivindicação 13 que codifica para uma proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase que catalisa a síntese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose e que está fundida ao promotor na orientação sentido; (iii) um sinal funcional em plantas para a terminação da transcrição e poliadenilação de uma molécula de RNA; (b) transferir a cassete de expressão para células vegetais, e 4 (c) regenerar plantas completas intactas a partir das células vegetais transformadas.

15. Processo para a produção de microrganismos capazes de sintetizar a-1,4-glucanos lineares, em que uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 5 é introduzida no microrganismo e é expressa.

16. Processo de acordo com a Reivindicação 15, que compreende os seguintes passos processuais: (a) produzir uma cassete de expressão com as seguintes sequências parciais: (i) um promotor activo no microrganismo seleccionado e que assegura a transcrição da sequência de DNA a jusante; (ii) uma sequência de DNA que codifica para uma amilossucrase que catalisa a sintese de a-1,4- glucanos lineares a partir de sucrose e que está fundida ao promotor na orientação sentido; (iii) um sinal de terminação da transcrição funcional em microrganismos, e (b) transformar um microrganismo apropriado com a cassete de expressão construída no passo (a).

17. Processo para a produção de células de fungos capazes de sintetizar a-1,4-glucanos lineares, em que uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 5 é introduzida em células de fungos e é expressa.

18. Processo de acordo com a Reivindicação 17, que compreende os passos seguintes: 5 (a) produzir uma cassete de expressão com as seguintes sequências parciais: (i) um promotor activo em células do fungo seleccionado e que assegura a transcrição da sequência de dna a jusante, (ii) uma sequência de DNA que codifica para uma amilossucrase que catalisa a sintese de a-1,4- glucanos lineares a partir de sucrose e que está fundida ao referido promotor na orientação sentido, (iii) um sinal de terminação da transcrição funcional nessas células de fungos, e (b) transformar células de fungos com a cassete de expressão construída no passo (a).

19. Células vegetais que contêm uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 5 em combinação com sequências de DNA que permitem a expressão da sequência de DNA em células vegetais.

20. Planta compreendendo células vegetais de acordo com a Reivindicação 19.

21. Planta de acordo com a Reivindicação 20, que é uma planta de cultura.

22. Planta de acordo com qualquer uma das Reivindicações 20 ou 21, que é uma planta de milho, arroz, trigo, cevada, beterraba de açúcar, cana-de-açúcar, tabaco, tomate ou batata.

23. Processo para a produção de a-1,4-glucanos lineares, que compreende os passos de cultivar o microrganismo da Reivindicação 9 ou um fungo da Reivindicação 10 num meio de 6 cultura que compreende sucrose e recuperar da cultura os glucanos produzidos.

24. Processo para a produção in vitro de a-1,4-glucanos lineares, que compreende os passos de contactar a proteína da Reivindicação 12 com uma solução contendo sucrose e recuperar da solução os a-1,4-glucanos produzidos.

25. Processo para a produção de frutose, que compreende os passos de contactar a proteína da Reivindicação 12 com uma solução contendo sucrose e recuperar da solução a frutose produzida.

26. Processo da Reivindicação 24 ou 25, em que a proteína está imobilizada.

27. Processo para a produção de ciclodextrina, que compreende os passos de contactar uma solução contendo sucrose com a proteína da Reivindicação 12 e uma ciclodextrina transglicosilase.

28. Utilização de uma sequência de DNA de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 5 ou de uma molécula sonda dela derivada para o isolamento de sequências homólogas de DNA ou RNA.

29. Utilização de proteínas de acordo com a Reivindicação 12 para a produção de a-1,4-glucanos lineares.

30. Utilização de proteínas de acordo com a Reivindicação 12 para a produção de frutose. 7

31. Processo para a produção de a-1,4-glucanos lineares, que compreende os passos do processo da Reivindicação 13 ou 14 e também compreende o passo de isolar das plantas os a-1,4-glucanos lineares sintetizados nas plantas.

32. Processo da Reivindicação 31, em que a cassete de expressão contém uma sequência que codifica um péptido de trânsito que assegura o transporte da proteína amilossucrase para o vacúolo ou para o apoplasto.

33. Processo da Reivindicação 31, em que a sequência de dna indicada em (ii), que codifica para uma proteína com a actividade enzimática de uma amilossucrase que catalisa a síntese de a-1,4-glucanos lineares a partir de sucrose, não contém a sequência de sinal que procede à secreção para o apoplasto.

34. Processo da Reivindicação 31, em que o promotor definido em (i) assegura a expressão de amilossucrase em órgãos da planta que armazenam sucrose. Lisboa, 27 de Julho de 2007