DE19902917C2

DE19902917C2 - Wasserunlösliche lineare Polysaccharide zur Filtration

Info

Publication number: DE19902917C2
Application number: DE19902917A
Authority: DE
Inventors: Holger Bengs; Gitte Boehm; Juergen Grande; Silke Schuth
Original assignee: Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Current assignee: Suedzucker AG
Priority date: 1999-01-26
Filing date: 1999-01-26
Publication date: 2001-03-29
Anticipated expiration: 2019-01-27
Also published as: DE19902917A1; EP1154851A1; AU1387700A; US20020074283A1; WO2000044492A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung wasserunlöslicher linearer Polysaccharide als Filtermittel.

Filterverfahren zur Trennung von Feststoffteilchen oder von gelösten Stoffen aus Flüssigkeiten oder Gasen spielen auf vielen technischen Gebieten, beispielsweise der Abwasserreinigung eine große Rolle. Von besonderer Bedeutung ist die Trennung gelöster, kolloidaler oder suspendierter Teilchen aus Flüssigkeiten insbesondere auf den Gebieten der analytischen Chemie, der Biotechnologie und der Molekularbiologie, beispielsweise zum Ernten von Mikroorganismen oder zur Isolierung von Nukleinsäuren und Proteinen.

Als Filtermittel werden in der Regel poröse Medien eingesetzt, die von der die abzutrennenden Stoffe enthaltenden flüssigen oder gasförmigen Phase durchströmt werden. Abhängig von der Art des Filtermittels passieren Gas-, Flüssigkeits- oder Lösungsmittelmoleküle durch die Poren des Filtermittels, während dispergierte oder gelöste Teilchen an der Oberfläche des porösen Mediums oder in seinem Inneren zurückgehalten werden.

Filtermittel, wie sie bei üblichen Trennverfahren verwendet werden, sind beispielsweise Papier, Gewebe oder Vliese aus Metall-, Natur-, Kunst- und Glasfasern, Membranen, beispielsweise aus Celluloseacetat, oder gesintertes Glas oder Porzellan.

Für Anwendungen in der analytischen Chemie oder der Molekularbiologie werden häufig besonders feinporige oder mikroporöse Filtermittel benötigt, beispielsweise für Mikrofiltrationen.

In den für solche Zwecke bekannten Filtervorrichtungen kommen in erster Linie vorkonfektionierte Filtermittel zum Einsatz, die beispielsweise aus synthetischen oder halbsynthetischen Polymeren bestehen. Häufig handelt es sich bei den Materialien um Gewebe aus synthetischen oder natürlichen Fasern, die zusätzlich mit einem Bindemittel verklebt sein können. Im allgemeinen werden aus dem Gewebe Scheiben geschnitten und beispielsweise in einem Probenröhrchen positioniert.

Auch die Verwendung von chemisch modifizierten Polysacchariden, beispielsweise von Cellulosederivaten wie Nitrocellulose oder Celluloseacetat oder von chemisch vernetzter Amylose, als Filtermittel ist bekannt.

Die EP-A-826 412 und die WO 98/08594 Verfahren zur Herstellung von Filterelementen, bei denen Substanzen wie Mikropartikel, beispielsweise in Suspensionen oder in Hydrokolloiden, schwammartig zu mikroporösen Elementen verfestigt werden. Geeignete Mikropartikel bestehen u. a. aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Glas, Graphit, Calciumphosphat oder Zinkpolyphosphat oder aus organischen Materialien wie hochvernetzten Polysaccharide, wie sie beispielsweise unter dem Handelsnamen SUPERDEX® erhältlich sind.

Die JP-A-57,063,302 beschreibt Mikropartikel aus Amylose mit einem Quellungsgrad von < 5 zur Verwendung bei der Gelfiltration. Zur Herstellung der Mikropartikel wird die Amylose zunächst aus Stärke isoliert. Anschließend werden wässrige alkalische Lösungen der Amylose zur Bildung der Mikropartikel in Medien, in denen sich die Amylose nicht oder nur schlecht löst, suspendiert, und anschließend werden die Partikel durch chemische Vernetzung, beispielsweise mit Epichlorhydrin, wasserunlöslich gemacht. In ähnlicher Weise beschreibt auch die RO-A-61,524 die Verwendung von mit Epichlorhydrin vernetzter Amylose zur Gelfiltration.

Die US-A-3,350,221 beschreibt die Verwendung von Stärke mit hohem Amylosegehalt zusammen mit einem Melamin/Formaldehyd-Harz zur Bildung von Filterfolien. Dabei vernetzt das Melaminharz offensichtlich mit den Hydroxylgruppen der Stärke und ergibt dadurch eine wasserstabile Filterfolie. Die JP-A-06,329,561 beschreibt Mittel zur Trennung optischer aktiver Verbindungen. Dabei werden Polysaccharide wie Cellulose oder Dextran chemisch an Silicagel gebunden. Die Trennung optischer Isomere mit Amylose-beschichtetem Silicagel wird in der JP-A- 0,346,950 beschrieben.

Die US-A-5,155,144 beschreibt ein mikroporöses Filter, das aus einer polymeren Matrix besteht, in der ein flüssiges, unlösliches, aktiviertes Polysaccharid dispergiert ist, sowie den Gebrauch dieses Filters in der Affinitäts- und Ionenaustauschchromatographie, als biochemischer Reaktor und zur Trennung der Elektroden in einer Speicherbatterie.

Die GB-A-2 247 242 beschreibt Mikropartikel aus Amylose, die durch Einwirkung einer Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase aus Cyclodextrin oder Stärke erhalten werden. Diese wasserlöslichen Mikropartikel können in Lebensmitteln, Pharmazeutika und in Kosmetikartikeln Verwendung finden.

Zur Verwendung als Filtermittel müssen die nach dem Stand der Technik eingesetzten Polysaccharide jedoch chemisch modifiziert oder vernetzt werden, um den Anforderungen als Trennmaterial zu entsprechen. Dies kann zu verbleibenden Chemikalien und dadurch zu unerwünschten Nebeneffekten führen. Die chemische Modifikation oder Vernetzung führt außerdem zu einer Quellung der Partikel, die häufig unerwünscht ist.

Bei der Vielzahl von möglichen Anwendungen, insbesondere auf den Gebieten der analytischen Chemie und der Biotechnologie besteht daher ein großer Bedarf an neuen Filtermaterialien, mit denen alternative Möglichkeiten zur Abtrennung und Reinigung von Stoffen zur Verfügung gestellt werden, damit jederzeit und unter möglichst vielen Bedingungen eine optimale und schonende Trennung und Reinigung des Materials gewährleistet werden kann.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, Filtermittel bereitzustellen, die gegebenenfalls auch ohne chemische Modifikation des Ausgangsmaterials zur effizienten Auftrennung von Stoffgemischen geeignet sind, die beständig sind, und die sich vielseitig und vorteilhaft, beispielsweise in der analytischen und präparativen Chemie, Biochemie und Molekularbiologie und insbesondere für Mikrofiltrationen einsetzen lassen.

Diese Aufgabe wurde mit Hilfe wasserunlöslicher linearer Polysaccharide als Filtermittel gelöst.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Filtermittel, die wenigstens ein wasserunlösliches lineares Polysaccharid umfassen.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Filtermitteln, umfassend die Schritte:

a) Lösen oder Suspendieren wenigstens eines wasserunlöslichen linearen Polysaccharids in einem geeigneten Lösungs- bzw. Suspensionsmittel; und
b) Verfestigen der Lösung oder Suspension unter Bildung des Filtermittels.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Filtervorrichtungen, die ein Filtermittel enthalten, das wenigstens ein wasserunlösliches lineares Polysaccharid umfaßt.

Unter Filtermitteln werden poröse Medien verstanden, die von einer Flüssigkeit oder einem Gas durchströmt werden können, wobei in der Flüssigkeit oder dem Gas dispergierte, emulgierte, suspendierte oder gelöste Teilchen aufgrund von beispielsweise Sieb-, Affinitäts- und/oder Adsorptionseffekten an der Oberfläche des porösen Mediums oder in seinem Inneren zurückgehalten werden.

Unter Filtervorrichtungen (oder Filtern) werden Vorrichtungen mit wenigstens einem Filtermittel verstanden, die zur Abtrennung von Stoffen aus Flüssigkeiten oder Gasen verwendet werden können.

Unter Polysacchariden werden makromolekulare Kohlenhydrate verstanden, deren Moleküle aus glykosidisch miteinander verknüpften Monosaccharid-Molekülen bestehen.

Unter wasserunlöslichen Polysacchariden werden Polysaccharide verstanden, die nach der Definition des Deutschen Arzneimittelbuches (DAB, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Govi-Verlag GmbH, Frankfurt, 9. Auflage, 1987) entsprechend den Klassen 4-7 unter die Kategorien "wenig löslich", "schwer löslich", "sehr schwer löslich" und "praktisch unlöslich" fallen.

Die Wasserunlöslichkeit der erfindungsgemäß eingesetzten Polysaccharide ist zweckmäßig derart, daß wenigstens 98%, insbesondere wenigstens 99,5%, der eingesetzten Polysaccharide unter Normalbedingungen (T = 25°C +/- 20%; p = 101 325 Pascal +/- 20%) in Wasser unlöslich sind (entsprechend mindestens den Klassen 4 und 5 nach DAB).

Vorteilhaft entspricht die Wasserunlöslichkeit der eingesetzten Polysaccharide den Klassen 6 oder 7 nach DAB.

Unter linearen Polysacchariden werden Polysaccharide verstanden, deren Verzweigungsgrad maximal 8%, beträgt, d. h. deren Hauptkette maximal 8 Seitenketten auf 100 Monosaccharideinheiten aufweist.

Der Verzweigungsgrad der wasserunlöslichen linearen Polysaccharide beträgt vorzugsweise maximal 4%, insbesondere maximal 1,5%. Bei den erfindungsgemäß bevorzugt verwendeten α-1,4-D-Glucanen und β-1,3-D-Glucanen ist der Verzweigungsgrad in 6-Position maximal 4%, vorzugsweise maximal 2% und insbesondere maximal 0,5%, und der Verzweigungsgrad in den anderen nicht an den Verknüpfungen der Hauptkette beteiligten Positionen, z. B. der 2- bzw. 3- Position im Fall des besonders bevorzugten α-1,4-D-Glucans, ist vorzugsweise jeweils maximal 2% und insbesondere maximal 1%.

Die Präfixe "α", "β" und "D" beziehen sich hier auf die Verknüpfungen der Hauptkette der erfindungsgemäß verwendeten Polysaccharide.

Zur Herstellung von Filtermitteln geeignet sind sowohl wasserunlösliche lineare Homopolysaccharide als auch Heteropolysaccharide.

Geeignete wasserunlösliche lineare Polysaccharide sind beispielsweise wasserunlösliche lineare Mannane, Pektine, Galactane, Xylane, Fructane, Pullulane, Cellulosen und Amylosen. Dabei kann eine Wasserunlöslichkeit auch durch neuartige Reaktionswege erreicht werden. Insbesondere eignen sich bio- und gentechnische Verfahren, in allgemeinem Verständnis, dazu, unlösliche Strukturen zu erzeugen. Dies erfolgt beispielsweise durch die Herstellung von besonderen Qualitäten, z. B. besonderer Reinheit, und/oder durch die Herstellung besonderer kristalliner Strukturen, die nach bekannten Verfahren nicht erhalten werden können.

Bevorzugte wasserunlösliche lineare Polysaccharide sind wasserunlösliche lineare α-D-Glucane und β-D-Glucane. Besonders bevorzugt sind wasserunlösliche lineare α-1,4-D-Glucane, beispeilsweise Amylose, und β-1,3-D-Glucane, wobei α-1,4-D- Glucane, ganz besonders bevorzugt sind.

Die erfindungsgemäß verwendeten Polysaccharide sind im wesentlichen nicht quellbar oder weisen allenfalls ein geringes Quellvermögen auf. Zweckmäßig ist der Quellungsgrad der eingesetzten Polysaccharide kleiner als 1,0, vorzugsweise kleiner als 0,8 und besonders bevorzugt kleiner als 0,3, wobei der Quellungsgrad des Polysaccharids definiert ist als dasjenige Volumen (in ml), das 1 g trockenes Polysaccharid nach 4stündiger Quellung in Wasser einnimmt.

Besonders bevorzugt sind wasserunlösliche lineare Polysaccharide, beispielsweise α-D-Glucane wie α-1,4-D-Glucane, die keine Verzweigungen aufweisen bzw. deren Verzweigungsgrad so minimal ist, daß er mit herkömmlichen Methoden nicht mehr nachweisbar ist.

Bevorzugt werden chemisch und/oder physikalisch unmodifizierte wasserunlösliche lineare Polysaccharide eingesetzt. Unter chemischen und/oder physikalischen Modifizierungen werden hierbei insbesondere Derivatisierungen der Polysaccharide durch Einführung spezieller Gruppen, kovalente Fixierungen auf einem Trägermaterial, sowie nachträgliche Vernetzungen verstanden.

Für bestimmte Anwendungen können jedoch auch wasserunlösliche lineare Polysaccharide verwendet werden, deren Eigenschaften, beispielsweise Adsorptionseigenschaften, beispielsweise durch Veresterung und/oder Veretherung in einer oder mehreren der nicht an der Bildung der Hauptkette beteiligten Positionen in an sich bekannter Weise chemisch modifiziert sind. Im Falle der bevorzugten α-1,4-D-Glucane kann eine solche Modifizierung beispielsweise in 2-, 3- und/oder 6-Position erfolgen.

Die Größe der erfindungsgemäß eingesetzten wasserunlöslichen linearen Polysaccharide kann in einem weiten Bereich schwanken. Zweckmäßig liegt das gewichtsmittlere Molekulargewicht M_w (bestimmt mittels Gelpermeationschromatographie im Vergleich zu einer Eichung mit Pullulanstandard) der Polysaccharide zwischen 10³ g/mol und 10⁷ g/mol. Bevorzugt liegt das Molekulargewicht M_w in einem Bereich von 10⁴ g/mol bis 10⁵ g/mol und besonders bevorzugt von 2 × 10⁴ g/mol bis 5 × 10⁴ g/mol. Ein weiterer vorteilhafter Bereich liegt zwischen 2 × 10³ g/mol und 8 × 10³ g/mol.

Die Polydispersität M_w/M_n der verwendeten wasserunlöslichen linearen Polysaccharide kann innerhalb weiter Bereiche variieren. Bevorzugte Werte für die Polydispersität liegen im Bereich von 1,01 bis 50, insbesondere von 1,5 bis 15. Die Verwendung von Polysacchariden mit niedrigerer Polydispersität ist wegen der besseren Reproduzierbarkeit der Produkteigenschaften bevorzugt.

Die wasserunlöslichen linearen Polysaccharide können allein oder in Mischung mit anderen zur Herstellung von Filtermitteln geeigneten Polysacchariden eingesetzt werden. Bevorzugt werden Polysaccharide eines einzigen Typs eingesetzt, insbesondere α-1,4-D-Glucane.

Die erfindungsgemäß verwendeten wasserunlöslichen linearen Polysaccharide können beliebigen Ursprungs sein.

Beispielsweise können die wasserunlöslichen linearen Polysaccharide aus natürlichen pflanzlichen und tierischen Quellen, die solche Polysaccharide enthalten, durch konventionelle Isolierung und Aufreinigung erhalten werden.

Da die meisten natürlichen Quellen die gewünschten wasserunlöslichen linearen Polysaccharide aber nicht in den gewünschten Mengen oder in der notwendigen Reinheit enthalten, werden diese Polysaccharide vorteilhaft auf biotechnischem Wege gewonnen. Beispielsweise können die natürlichen Produzenten wasserunlöslicher linearer Polysaccharide gentechnisch derart manipuliert werden, daß sie im Vergleich mit dem unmanipulierten Organismus einen höheren Anteil an nicht oder nur geringfügig verzweigten Polysacchariden enthalten oder einen höheren Reinheitsgrad enthalten.

Die gewünschten wasserunlöslichen linearen Polysaccharide können auch aus hochverzweigten Polysacchariden durch chemische oder enzymatische Entzweigung, beispielsweise mit Entzweigungsenzymen wie Pullulanasen, iso- Amylasen und Gluconohydrolasen, erhalten werden.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäß eingesetzten Polysaccharide durch Biotransformation oder biokatalytisch hergestellt.

Unter Biotransformation oder biokatalytischer Herstellung wird hier verstanden, daß die wasserunlöslichen linearen Polysaccharide wie die α-1,4-D-Glucane in vitro durch katalytische Polymerisation von Glucosemolekülen, ebenfalls in Form von Saccharose oder Glucosederivate, unter Einwirkung eines geeigneten Enzyms, insbesondere eines Enzyms mit Amylosucrase-Aktivität, unter geeigneten Bedingungen hergestellt wird.

Ein vorteilhaftes Verfahren zur Gewinnung wasserunlöslicher linearer α-1,4-D- Glucane wird in der WO 95/31553 beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt ausdrücklich Bezug genommen wird. Nach dem Verfahren der WO 95/31553 wird das α-1,4-D-Glucan mittels eines biokatalytischen Verfahrens aus Saccharose unter Einwirkung eines Enzyms mit Amylosucrase-Aktivität, insbesondere mit einer Amylosucrase aus Bakterien der Spezies Neisseria polysaccharea, hergestellt. Diese Enzyme katalysieren die Bildung von α-1,4-glykosidisch verknüpften Glucanen, indem sie unter Freisetzung von D-Fructose den Glucosylrest des Saccharosemoleküls gemäß dem folgenden Reaktionsschema

Saccharose + (α-1,4-D-Glucosyl)_n → D-Fructose + (α-1,4-D-Glucosyl)_n+1

auf die wachsende Polymerkette übertragen.

Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung wasserunlöslicher linearer α-1,4-D-Glucane auf Grundlage des obigen Reaktionsschemas wird in der älteren, nicht vorveröffentlichten deutschen Patentanmeldung 198 27 978.1-42 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt hier ausdrücklich zum Gegenstand der vorliegenden Beschreibung gemacht wird. Hierbei werden die wasserunlöslichen linearen α-1,4-D-Glucane aus Saccharose mittels Enzymen mit Amylosucrase- Aktivität, bevorzugt aus Neisseria polysaccharea, in wässrigen, pufferfreien Systemen synthetisiert. Die Reaktion kann auch in Gegenwart eines wasserlöslichen linearen oder verzweigten α-1,4-D-Glucans, beispielsweise eines wasserlöslichen Dextrins oder einer wasserlöslichen Amylose durchgeführt, da solche Glucane als Glucosylgruppenakzeptoren wirken, an denen das Enzym eine α-1,4-Glucankettenverlängerung katalysiert.

Bei einer solchen Kettenverlängerung entstehen auch aus verzweigten Polysacchariden wasserunlösliche lineare Polysaccharide im Sinne der vorliegenden Erfindung, da der Verzweigungsgrad des Glucosylgruppenakzeptors mit zunehmender Kettenverlängerung, also zunehmendem Polymerisationsgrad stark abnimmt. Zu diesem Zweck wird die Saccharose in großem molaren Überschuß zum Akzeptor eingesetzt. Auf diese Weise lassen sich α-1,4-D-Glukane mit einem Molekulargewicht im Bereich von 0,75 × 10² g/mol bis 10⁷ g/mol herstellen. Die linearen oligomeren oder polymeren Akzeptoren können dabei entweder von außen zugesetzt werden, sie können jedoch auch durch die Amylosucrase selbst aus Saccharose erzeugt werden.

In einer besonderen Ausführungsform werden die wasserunlöslichen linearen Polysaccharide in Form von Mikropartikeln verwendet, wobei die Mikropartikel ganz oder teilweise aus diesen Polysacchariden bestehen können.

Die Form der Mikropartikel ist nicht sehr kritisch, zweckmäßig werden die Mikropartikel jedoch in sphärischer Form eingesetzt. Unter sphärischen Mikropartikeln werden hierbei annähernd kugelförmige Mikropartikel verstanden, deren Abweichung in den Achsenlängen vom Idealzustand einer Kugel, die durch von einem gemeinsamen Ursprung ausgehende, in den Raum gerichtete Achsen gleicher Länge, die den Radius der Kugel in allen Raumrichtungen definieren, beschrieben wird, nicht mehr als 40% beträgt. Bevorzugt werden sphärische Mikropartikel mit Abweichungen von nicht mehr als 25%, besonders bevorzugt nicht mehr als 15% verwendet.

Der mittlere Durchmesser (Zahlenmittelwert) der Mikropartikel liegt zweckmäßig in einem Bereich von 1 nm bis 100 µm, bevorzugt von 100 nm bis 10 µm und besonders bevorzugt von 1 µm bis 5 µm.

Die spezifische Oberfläche der Mikropartikel liegt zweckmäßig in einem Bereich von 1 m²/g bis 100 m²/g, bevorzugt von 1,5 m²/g bis 20 m²/g und besonders bevorzugt von 3 m²/g bis 10 m²/g.

Die Dispersität D = d_w/d_n der Mikropartikel, worin d_w den Gewichtsmittelwert des Durchmessers und d_n den Zahlenmittelwert des Durchmessers der Mikropartikel bedeutet, liegt zweckmäßig in einem Bereich von 1 bis 10, vorzugsweise von 1,5 bis 5 und bevorzugt von 2 bis 3. Die Mittelwerte d_w und d_n sind definiert als

d_n = Σn_i × d_i/Σn_i; und

d_w = Σn_i × d_i ²/Σn_i × d_i

worin
d_i den Durchmesser der Partikel der Spezies i bedeutet;
n_i die Anzahl der Partikel i mit dem Durchmesser d_i; und
i einen fortlaufenden Parameter bedeutet.

Der Begriff Gewicht steht in diesem Zusammenhang nicht für Masse sondern für ein gewichtetes Mittel, wodurch die größeren Durchmesser einen höheren Stellenwert erhalten. Durch den Exponenten 2 werden Durchmesser größerer Partikel stärker gewichtet.

Vorteilhafte Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Mikropartikel werden in den älteren deutschen Patentanmeldungen 197 37 481.6, 198 39 214.1-44, 198 39 216.8-44 und 198 39 212.5-43 beschrieben, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird und deren Offenbarung ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Beschreibung bildet.

Zweckmäßig sind die bevorzugt sphärischen Mikropartikel erhältlich durch Lösen der wasserunlöslichen linearen Polysaccharide in einem geeigneten Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Formamid, Acetamid, oder N,N-Dimethylformamid, Einbringen der Lösung in ein Fällmittel, vorzugsweise Wasser, Kühlen des dabei entstehenden Gemisches auf vorzugsweise 10°C bis -10°C und Abtrennen der gebildeten Mikropartikel.

Struktur und Oberfläche der Mikropartikel können durch die Art des Fällmittels, beispielsweise durch ganz oder teilweisen Ersatz von Wasser durch Dichlormethan, gesteuert werden. Durch die Mitverwendung geeigneter Zusatzstoffe, beispielsweise anionische, kationische oder nichtionische oberflächenaktive Substanzen wie Natriumdodecylsulfat, N-Methylgluconamid, Polysorbate wie sie unter dem Handelsnamen Tween® erhältlich sind, Fettsäureglycolester, Alkylpolyglycolether, Alkylpolyglycolethersulfate, Ethylenoxid-Propylenoxid-Blockpolymere wie Pluronic®, Alkylsulfate und Zucker wie Fructose, Saccharose und Glucose, kann ebenfalls Einfluß auf Struktur, Größe und Oberfläche der Partikel genommen werden.

Die Konzentration des Polysaccharids in der Lösung kann in einem weiten Bereich variieren und beträgt vorzugsweise zwischen 0,1 g Polysaccharid pro ml Lösungsmittel.

Mikropartikel mit besonders glatter Oberfläche lassen sich erhalten, wenn dem Fällungsmittel wasserlösliche Cellulosederivate, beispielsweise Celluloseester oder Celluloseether wie Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Celluloseacetat, Cellulosebutyrat oder Cellulosenitrat zugesetzt werden.

Mikropartikel mit einer mittleren Größe von 0,1 µm bis 3 µm lassen sich bei diesem Verfahren vorteilhaft erhalten, wenn man dem Fällmittel ein heißwasserlösliches α- D-Glucan zusetzt.

Die Porosität der Mikropartikel läßt sich auch durch die Wahl des wasserunlöslichen linearen Polysaccharids oder des Verfahrens zu seiner Herstellung steuern. So kann beispielsweise der Zusatz von Hilfsstoffen bei der biotechnologischen Herstellung der Polysaccharide die Porosität der aus solchen Polysacchariden erhaltenen Mikropartikel beeinflussen. Insbesondere wurde gefunden, daß die Porosität von Mikropartikeln, die ganz oder teilweise aus wasserunlöslichen linearen α-1,4-Glucanen bestehen, erhöht werden kann, wenn die Herstellung des Glucans aus Saccharose mittels Amylosucrase in Gegenwart eines Glucosylgruppenakzeptors, beispielsweise Dextrin oder Glykogen, erfolgt. Dabei werden die Mikropartikel umso poröser, je höher die Konzentration des Glucosylgruppenakzeptors bei der Biotransformation ist.

Die Mikropartikel können chemisch vernetzt oder unvernetzt sein. Um den Einfluß störender Fremdchemikalien, die bei der Vernetzung eingeschleppt werden können, zu vermeiden, werden unvernetzte Mikropartikel bevorzugt.

Die erfindungsgemäßen Filtermittel können ganz oder teilweise aus wasserunlöslichen linearen Polysacchariden bestehen. In einer vorteilhaften einfachen Ausführungsform besteht das Filtermittel vollständig aus wasserunlöslichen linearen Polysacchariden und gegebenenfalls weiteren Hilfs- und Zusatzstoffen.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Filtermittel aus den wasserunlöslichen linearen Polysacchariden kann in an sich bekannter Weise durch Bildung von losen oder verfestigten Schichten verschiedener Dicke erfolgen, die ganz oder teilweise aus wasserunlöslichen linearen Polysacchariden bestehen.

Verfestigte Schichten lassen sich beispielsweise durch Pressen der Polysaccharide herstellen.

Verfahren zur Herstellung von verfestigten Filtermitteln und von Filtervorrichtungen sind auch in der EP-A-826 412 und der WO 98/08594 beschrieben, auf deren Offenbarung hier ausdrücklich Bezug genommen wird.

In einer einfachen und zweckmäßigen Ausführungsform erfolgt die Herstellung der erfindungsgemäßen Filtermittel dadurch, daß man die wasserunlöslichen linearen Polysaccharide zunächst in einem geeigneten Lösungsmittel oder Suspensionsmittel löst bzw. suspendiert und anschließend in einer für das Filtermittel oder die Filtervorrichtung geeigneten porösen Form verfestigt.

Geeignete Lösungsmittel sind solche, wie sie auch bei der Herstellung der Mikropartikel verwendet werden, also DMSO, Formamid, Acetamid, oder N,N-Dimethylformamid. Die Verfestigung aus solchen Lösung kann beispielsweise durch Entfernen des Lösungsmittels erfolgen, beispielsweise durch Verdampfen des Lösungsmittel durch Erwärmen oder im Vakuum, oder die Polysaccharide werden durch Zugabe eines Fällmittels, das sich vorzugsweise anschließend ebenfalls leicht entfernen läßt, beispielsweise Wasser, präzipitiert.

Bevorzugt liegen die erfindungsgemäß eingesetzten Polysaccharide, gegebenenfalls in Form von Mikropartikeln, in Suspension vor.

Als Suspensionsmittel sind beispielsweise Wasser und Alkohole geeignet. Die Verfestigung kann wiederum durch Verdampfen des Suspensionsmittels, beispielsweise durch Erwärmen oder im Vakuum erfolgen.

Geeignete Lösungs- und Suspensionsmittel können auch Hydrokolloide und Polymerlösungen einschließlich Harzlösungen sein, die zusammen mit den erfindungsgemäßen Polysacchariden verfestigt werden und diese in einer Matrix einbetten. Geeignete Polymere sind beispielsweise Vinylester, Polyamide und Poly(meth)acrylate. Bei der Verfestigung ist insbesondere darauf zu achten, daß eine poröse Schicht gebildet wird und die die Filtereigenschaften tragenden wasserunlöslichen linearen Polysaccharide oder die Mikropartikel daraus für die abzutrennenden Stoffe zugänglich sind. Derartige Verfahren sind in der EP-A-826 412 und der WO 98/08594 ausführlich beschrieben.

Neben den wasserunlöslichen linearen Polysacchariden können die erfindungsgemäßen Filtermittel auch noch andere Materialien enthalten, die die Eigenschaften des Filtermittels verändern, beispielsweise Mikropartikel aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Glas, Graphit, Calciumphosphat oder Zinkpolyphosphat, oder andere Hilfs- und Zusatzstoffe. Vorzugsweise werden solche Substanzen verwendet, die mit den Polysacchariden keine chemische Reaktion und keine kovalente Bindung eingehen.

Die erfindungsgemäßen Filtermittel können in Filtervorrichtungen verschiedenster Art zur Abtrennung von Stoffen aus Flüssigkeiten oder Gasen verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Filtermittel in den Filtervorrichtungen zusammen mit wenigstens einem weiteren porösen Element verwendet, das in Flußrichtung der zu behandelnden Flüssigkeit oder des zu behandelnden Gases unter und/oder über dem erfindungsgemäßen Filtermittel liegen kann und auf diese Weise beispielsweise als Stütz-, Träger-, Fixier oder Deckschicht für das erfindungsgemäße Filtermittel dienen kann oder auch als zusätzliches Filtermittel fungiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Filtermittel zwischen zwei solchen Elementen in der Filtervorrichtung fixiert.

Das Filtermittel steht mit dem wenigstens einen porösen Element zweckmäßig in direktem Kontakt und kann an dieses kovalent oder nicht-kovalent gebunden sein.

Die porösen, vorzugsweise mikroporösen Elemente können beispielsweise in Form von Scheiben, Platten, Gittern oder Netzen, beispielsweise Fritten, vorliegen. Sie können aus den verschiedensten Materialien gebildet sein und beispielsweise aus festen miteinander verbundenen Teilchen bestehen. Geeignete Materialien, aus denen solche porösen Elemente bestehen können, sind beispielsweise Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylacetat, Polyester, Polyamide, Polystyrol und Polycarbonat, Glas, Keramik und Quarz oder Mischungen aus verschiedenen Materialien. Ebenso können die Elemente aus Geweben von natürlichen oder synthetischen und halbsynthetischen Fasern oder aus Metallnetzen bestehen. Besonders bevorzugte sind mikroporöse Elemente wie Glasfilter und mikroporöse Membranen, wie sie beispielsweise aus Celluloseacetat oder anderen Cellulosederivaten, Polyamiden, Polyvinylchlorid, Polysulfonen und Teflon für Mikrofiltrationen hergestellt werden können. Derartige Elemente sind ebenfalls in der EP-A-826 412 und der WO 98/08594 beschrieben. Auch eine einfache Schicht aus Glaswolle kann zusammen mit dem Filtermittel verwendet werden.

Sofern die erfindungsgemäßen Filtermittel zusammen mit einem weiteren porösen Element als Träger- oder Fixierschicht verwendet werden, kann die Verfestigung des Filtermittels direkt auf diesem Element erfolgen.

Zur Herstellung der Filtervorrichtungen kann das Filtermittel nach seiner Herstellung in ein geeignetes Behältnis eingebracht und dort fixiert werden oder das Filtermittel kann direkt in dem Behältnis an der gewünschten Position gebildet werden. Das Behältnis ist so ausgestaltet, daß es den Durchfluß oder die Passage der Flüssigkeiten oder Gase, die die abzutrennenden Stoffe enthalten, erlaubt.

Filtervorrichtungen, die das erfindungsgemäße Filtermittel enthalten, können beispielsweise Rundfilter sein, die auf eine Spritze aufgesteckt werden können, mit deren Hilfe dann die Flüssigkeit, die das abzutrennende Material enthält, durch den Filter gedrückt wird. In einer solchen Vorrichtung ist das Filtermittel zweckmäßig auf einer porösen Membran, beispielsweise aus Celluloseacetat, aufgebracht und/oder zwischen zwei porösen Membranen fixiert.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform befindet sich das erfindungsgemäße Filtermittel in einem geeigneten Hohlkörper, insbesondere einem zylindrischen Hohlkörper. Ein solcher Hohlkörper kann beispielsweise ein Spritzenkörper sein. Vorteilhaft läßt sich die Filtervorrichtung mit einem Proben- oder Zentrifugenröhrchen verbinden, so daß das Filtrat direkt in einem geeigneten Behälter aufgefangen werden kann.

In einer besonders einfachen und daher vorteilhaften Ausführungsform zur Herstellung erfindungsgemäßer Filtervorrichtungen werden die wasserunlöslichen linearen Polysaccharide oder Mikropartikel daraus in Wasser suspendiert, zweckmäßig in einer Menge, daß eine streichfähige Masse entsteht. Diese Masse wird auf ein poröses Element, vorzugsweise eine mikroporöse Membran, aufgebracht und gleichmäßig verteilt. Nach Trocknen und Verfestigung können gewünschte Filter ausgestanzt und beispielsweise in ein Zentrifugenröhrchen eingebracht und dort in geeigneter Weise, beispielsweise durch Verkleben oder Verschmelzen befestigt werden.

In einer weiteren Ausführungsform kann die Herstellung des Filtermittels auf einem poröse Element erfolgen, das bereits in einer Filtervorrichtung vorgeformt ist, beispielsweise auf einer in einem Zentrifugenröhrchen befindlichen mikroporösen Membran. Solche Zentrifugenröhrchen werden beispielsweise von der Fa. Schleicher & Schuell unter der Bezeichnung Centrex® vertrieben.

Die Herstellung loser Feststoffschichten erfolgt zweckmäßig durch Aufschütten des trockenen, pulverförmigen oder partikulären Polysaccharids, beispielsweise, durch Aufbringen auf ein poröses Trägerelement oder durch Einschließen des Materials zwischen zwei porösen Fixierelementen.

Die Abtrennung von gelösten, kolloidalen, suspendierten oder gelösten Stoffen aus Flüssigkeiten oder Gasen kann durch Sieb-, Affinitäts- und/oder Adsorptionseffekte des erfindungsgemäßen Filtermittels bzw. der darin verwendeten wasserunlöslichen linearen Polysaccharide erfolgen.

Die erfindungsgemäßen Filtervorrichtungen und Filtermittel eignen sich durch diese Eigenschaften sowohl zur Reinigung von Flüssigkeiten oder Gasen von unerwünschten Stoffen als auch zur Abtrennung, Reinigung und Isolierung der in den Flüssigkeiten oder Gasen vorhandenen Stoffe.

Zweckmäßig erfolgt die Abtrennung von Stoffen aus Flüssigkeiten oder Gasen dadurch, daß man die Flüssigkeiten oder Gase unter Bedingungen, unter denen die abzutrennenden Stoffe von dem Filtermittel zurückgehalten werden, durch das Filtermittel strömen läßt.

Der Strom der Flüssigkeiten durch das Filtermittel wird zweckmäßig erleichtert, indem man beispielsweise einen Über- oder Unterdruck an die Filtervorrichtung anlegt. Die Passage durch das Filtermittel kann aber auch durch einen Zentrifugationsschritt erleichtert werden.

Sofern gewünscht können die abgetrennten, vom Filtermittel zurückgehaltenen Stoffe zurückgewonnen werden, entweder mechanisch, wenn sich die abgetrennten Stoffe auf der äußeren Oberfläche des Filtermittels befinden, oder durch einen Elutionsschritt unter Bedingungen, unter denen die abgetrennten Stoffe vom Filtermittel gelöst werden.

So können die erfindungsgemäßen Filtermittel beispielsweise zur Abtrennung und Reinigung von biologischem Material, beispielsweise von Nukleinsäuren, verwendet werden, indem man eine das biologische Material enthaltende Probe unter Bedingungen, unter denen das biologische Material vom Filtermittel zurückgehalten wird, beispielsweise in einem geeigneten Puffer, durch das Filtermittel passieren läßt und dieses Material anschließend, gegebenenfalls nach weiteren Waschschritten, vom Filtermittel eluiert.

Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Filtermittel liegt darin, daß sie zur Abtrennung und gegebenenfalls Reinigung einer Vielzahl von Stoffen geeignet sind. Hierzu gehören Wirkstoffe aller Art wie Farbstoffe, Aromen und Duftstoffe, Giftstoffe, beispielsweise im Zigarettenrauch, natürliche und synthetische Polymere und biologisches Material, beispielsweise Nukleinsäuren wie einzel- und doppelsträngige lineare DNA, Plasmid-DNA und RNA, Proteine wie Enzyme und Antikörper oder Komplexe von Nukleinsäuren und Proteinen, beispielsweise mit Nukleinsäure- oder Protein-bindenden Substanzen.

Die erfindungsgemäßen Filtervorrichtungen und Filtermittel eignen sich sowohl für präparative und analytische Mikrofiltrationen im Labormaßstab, wobei sich auch aus kleinen Probenvolumina geringe Mengen wertvoller Substanzen weitgehend ohne Verluste und ohne Verunreinigungen gewinnen lassen, als auch für Fest-Flüssig- Trennungen in größerem Maßstab, beispielsweise zum Klären von Flüssigkeiten, zum Ernten von Zellen oder zur Abtrennung von Zelltrümmern. Die Filtermittel lassen sich ferner einfach und schnell handhaben, sind gegen eine Vielzahl von Lösungsmitteln beständig und sind wegen ihrer biologischen Abbaubarkeit auch umweltverträglich zu entsorgen.

Die erfindungsgemäß verwendeten wasserunlöslichen linearen Polysaccharide besitzen ein hohes Adsorptions- und Retentionsvermögen, das im wesentlichen unabhängig von der Größe und der chemischen und biologischen Struktur der abzufiltrierenden Substanz ist. Die Filtermittel können einfach und rasch hergestellt werden. Insbesondere kann die Herstellung durch den Benutzer entsprechend den jeweiligen Anforderungen selbst und in kleinen Mengen erfolgen, so daß nicht auf vorkonfektionierte Filter zurückgegriffen werden muß. Die Eigenschaften der Filtermittel lassen sich außerdem in einem weiten Bereich variieren und auf individuelle Bedürfnisse abstellen, beispielsweise durch Veränderung der Porosität der Filtermittel, beispielsweise durch Variation der verwendeten Polysaccharid- Mikropartikel, oder durch Zusatz weiterer Stoffe. Dies ist vor allem in der wissenschaftlichen Forschung von großer Bedeutung.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Abbildungen und Beispielen näher erläutert.

Fig. 1 zeigt eine besondere Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Filtervorrichtung;

Fig. 2 zeigt die Analyse (Detektion mit Ethidiumbromid 0,5 pg/ml bei 256 nm gemäß Beispiel 9, beachte Legende) einer Plasmid- DNA enthaltenden Flüssigkeit nach Passage durch ein erfindungsgemäßes Filter auf einem Agarosegel; und

Fig. 3 zeigt die Analyse (Detektion mit Ethidiumbromid 0,5 pg/ml bei 256 nm gemäß Beispiel 9, beachte Legende) der Eluate der gebundenen Plasmid-DNA von den erfindungsgemäße Filtern mit einem geeigneten Puffer auf einem Agarosegel.

Eine mögliche Ausführungsform für eine erfindungsgemäße Filtervorrichtung wird nachfolgend unter Bezug auf Fig. 1 beschrieben.

Fig. 1 zeigt eine Filtervorrichtung 1, die ein Behältnis 2 in Form eines zylindrischen Hohlkörpers aufweist, der das Filtermittel 3 enthält, beispielsweise in Form von Mikropartikeln. Das Filtermittel ist zwischen zwei porösen Elementen 4 und 5 fixiert.

Die Vorrichtung weist außerdem eine Einlaßöffnung 6 zur Aufgabe von Flüssigkeit und einen Auslauf 7 für das Filtrat auf.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung von wasserunlöslichen linearen α-1,4-D-Glucanen

a) 15 l einer 20%igen Saccharose-Lösung wurden in ein steriles 25 l-Gefäß gegeben. Hierzu wurden 120 ml eines Amylosucrase enthaltenden Enzymextrakts aus einem mit dem Gen für Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea transformierten Produktionsstamm gegeben. Die Enzymaktivität betrug 20 Units (1 Unit = 1 µmol Saccharose × min^-1 × mg Enzym). Die Biotransformation wurde in Abwesenheit von Glucosylgruppenakzeptoren durchgeführt.
Die Apparatur wurde mit einem sterilen KPG-Rührer versehen und verschlossen und es wurde bei 39°C gerührt. Bereits nach wenigen Stunden hatte sich ein weißer Niederschlag gebildet. Die Reaktion war nach 59 Stunden beendet. Der Niederschlag wurde abfiltriert und zur Abtrennung niedermolekularer Zucker zweimal mit Wasser gewaschen. Der im Filter verbliebene Rückstand wurde bei 38°C im Trockenschrank unter Vakuum getrocknet Die erhaltene Masse an α-1,4-D- Glucan betrug 893 g, entsprechend einer Ausbeute von 59% Das Molekulargewicht (gemessen mittels Gelpermeationschromatographie (GPC), Lösungsmittel DMSO; Eichung mit Pullulanstandards) betrug M_w = 9000 g/mol; M_n = 4400 g/mol; M_w/M_n = 2,05 (Glucan 1a).
b) Die Biotransformation wurde wie unter Beispiel 1a beschrieben durchgeführt, es wurden jedoch 0,1% Dextrin (w/v) als Glucosylgruppenakzeptor zugefügt (Glucan 1b).

Beispiel 2 Herstellung von Mikropartikeln aus α-1,4-D-Glucanen

a) 200 g des nach Beispiel 1a) erhaltenen α-1,4-D-Glucans (Glucan 1a) wurden in 1 l Dimethylsulfoxid (DMSO; Riedel-de-Haen) bei 50°C gelöst. Anschließend wurde die Lösung langsam in 8 l bidestilliertes Wasser getropft. Der Ansatz wurde über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Es bildete sich eine feine Suspension von Mikropartikeln, die durch Dekantieren abgetrennt wurde. Der Bodensatz wurde aufgeschlämmt und 5 min bei 5000 UpM in einer Ultrazentrifuge (Typ RC5C) zentrifugiert. Der feste Rückstand wurde dreimal mit bidestilliertem Wasser aufgeschlämmt und erneut zentrifugiert. Die Feststoffe wurden gesammelt und die noch feuchte Suspension gefriergetrocknet (Christ Delta 1-24 KD). Es wurden 176 g weißer Feststoff isoliert (Ausbeute 88%). Die so erhaltenen Mikropartikel sind sphärischer Gestalt und die Partikeldurchmesser liegen mehrheitlich zwischen 2 und 3 µm, wie bestimmt durch Rasterelektronenmikroskopie (REM; Camscan S-4).
Die spezifische Oberfläche wurde mit einem Sorptomatic 1990 (Fisons Instruments) unter Verwendung der "default method sorptomatic"-Einstellung bestimmt. Für die Untersuchung wurden die Proben bei 80°C im Vakuum über Nacht getrocknet, wobei das erhaltene α-1,4-D-Glucan zuvor mit einer handelsüblichen Mühle (Waring®) gemahlen wurde, so daß die durchschnittliche Größe der Partikel weniger als 200 µm betrug. Die spezifische Oberfläche betrug 4,5 m²/g (Mikropartikel 2a).
b) Die Herstellung der Mikropartikel wurde wie in Beispiel a) durchgeführt, jedoch wurde das nach Beispiel 1b) erhaltene α-1,4-D-Glucan (Glucan 1b) eingesetzt. Die spezifische Oberfläche betrug 2,9 m²/g (Mikropartikel 2b).

Beispiel 3 Filtration eines Farbstoffs mit einem α-1,4-D-Glucan

200 mg der nach den Beispielen 2a und 2b erhaltenen Mikropartikel wurden in ein Zentrifugengefäß mit einer mikroporösen Membran (Schleicher & Schuell, Centrex MF-5,0, 0,45 µm, Deutschland) eingewogen. Anschließend wurden 3 ml einer 0,04%igen Brilliantblau-Lösung in entionisiertem Wasser hinzugefügt. Das Gefäß wurde verschlossen und dann wurden die Partikel geschüttelt und aufgeschlämmt. Die Suspension wurde für 1 Minute sich selbst überlassen. Anschließend wurde bei 3000 U/min zentrifugiert (Labofuge GL, Heraeus). Eine visuelle Auswertung ergab eine verminderte bis nicht mehr vorhandene Färbung. Die Mikropartikel waren deutlich blau gefärbt.

Die durchgespülte Flüssigkeit, das Filtrat, wurde in eine Quarzküvette gefüllt und am UV-Vis-Spektrometer (Fa. Beckmann, UV-DU 640, Deutschland) vermessen. Es wird beim Absorptionsmaximum von Brilliantblau gemessen (λ_max = 552 nm). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Beispiel 4 (Vergleichsbeispiel) Filtration eines Farbstoffs mit verschiedenen Stärken

Zum Vergleich mit den erfindungsgemäßen wasserunlöslichen α-1,4-D-Glucanen wurden die Versuche der Beispiele 2 und 3 mit verschiedenen im Handel erhältlichen natürlichen Stärken aus Kartoffel und Mais mit unterschiedlichen Verhältnissen von Amylose zu Amylopektin durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2

Die Ergebnisse zeigen die Überlegenheit der erfindungsgemäßen wasserunlöslichen linearen Polysacchariden im Vergleich mit wasserlöslichen und verzweigten Polysacchariden.

Beispiel 5 Herstellung von Filtern zur Filtration von Lebensmittelfarbstoffen

Zur Herstellung eines Filters zur Filtration von Lebensmittelfarbstoffen wurde ein Metallfilter (Fa. Millipore, Micro-Syringe 25 mm Filter Holder; USA) präpariert. Hierzu wurde ein 0,5 µm Filter (Millipore, Filter Type FH, FHLC 047 00; USA) auf einem Dichtungsring befestigt. Die Höhe des Dichtungsrings betrug ca. 2 mm. Die Mikropartikel (80 mg) wurden mit wenig Wasser so befeuchtet, daß gerade eine streichfähige Masse entstand. Die befeuchteten Mikropartikel wurden in den vorbereiteten Filterhalter gelegt. Darüber wurde ein feines Metallsieb gelegt. Diese Anordnung wurde mit dem oberen Teil des Metallfilters fest verschlossen. Der so präparierte Metallfilter wurde auf einer Einmalspritze (Fa. Beckton Dickinson) fixiert.

Dann wurden 4 ml einer 0,05%igen Lösung eines Lebensmittelfarbstoffs (Annatto W. S. 14% der Fa. ProAndina Rohstoffe GmbH) in entionisiertem Wasser in die Spritze gegeben und durch den Filter gedrückt. Die Partikel sind optisch erkennbar gefärbt. Der Farbstoff läßt sich mit frischem entionisiertem Wasser nicht aus den Partikeln herauswaschen. Die Lösung ist gelblich.

Beispiel 6 Bestimmung des Rückhaltevermögens von verschiedenen α-1,4-D-Glucanen

Zur Bestimmung des Rückhaltevermögens verschiedener α-1,4-D-Glucane für den Farbstoff Brilliantblau wurden die entsprechend den Beispielen 3 und 4 erhaltenen gefärbten Mikropartikel verschiedener Glucane wie in Beispiel 3 beschrieben in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und mit 3 ml entionisiertem Wasser versetzt. Die Suspensionen wurden 1 Minute stehengelassen. Anschließend wurde bei 3000 U/min zentrifugiert (Labofuge GL, Heraeus).

Das erhaltene Filtrat war klar.

Die Farbe der gewaschenen Mikropartikel wurde optisch beurteilt und das Filtrat spektroskopisch vermessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt

Die Mengenbilanzen der Filtrationen, das Rückhaltevermögen (%) und der irreversible Anteil (%) sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 3

Tabelle 4

Mengenbilanz der Filtrationen, prozentuales Rückhaltevermögen und irreversibler Anteil in Prozent

Beispiel 7 Filtration eines Farbstoffs mit α-1,4-D-Glucan und Vergleichssubstanzen in Abhängigkeit von der Zeit

Die Durchführung erfolgte wie in Beispiel 3 beschrieben mit Brilliantblau. Es wurde jedoch die Zeitabhängigkeit untersucht. Hierzu wurden die Mikropartikel- Suspensionen mit dem Farbstoff einmal 1 Minute und einmal 2 Minuten stehen gelassen, bevor die Lösung zentrifugiert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5

Zeitabhängigkeit der Filtration von Farbstoffen mit α-1,4-D-Glucanen

Beispiel 8 Herstellung der Filtervorrichtungen

Zur Abtrennung von biologischem Material (Nukleinsäuren u. a.) aus Flüssigkeiten wurden verschiedene Filtervorrichtungen entsprechend Fig. 1 hergestellt.

Als eine erste Ausführungsform wurde eine Filtervorrichtung 1 mit einem zylindrischen Hohlkörper 2 aus Polyethylen hergestellt, der einen Durchmesser von 1,5 cm aufwies. Der Auslauf 7 besaß einen Durchmesser von 2-3 mm. Am unteren Ende des Hohlkörpers 2 vor dem Auslauf 7 befand sich ein Glasfilter als poröses Element 5, auf das 580 mg eines wasserunlöslichen linearen α-1,4-D-Glucans (gemäß Beispielen 2a und 2b) als Filtermittel 3 aufgebracht waren. Das Filtermittel 3 wurde mit einem weiteren Glasfilter als porösem Element 4 abgedeckt. Auf diese Weise wurde Filter 1 (vgl. Fig. 1) erhalten.

Eine weitere Ausführungsform wurde wie Filter 1 ausgestaltet mit der Ausnahme, daß als poröses Element 5 ein Cellulosefilter und als poröses Element 4 eine Schicht Glaswolle verwendet wurde. Auf diese Weise wurde Filter 2 erhalten.

Beispiel 9 Verwendung des Filtermittels zur Abtrennung oder Rückhaltung von biologischem Material, insbesondere Nukleinsäure

Einwegzentrifugenfilter (Firma Schleicher & Schüll, z. B. Centrex, Katalognummer 467012 (April 1996): "Filter 1" in Fig. 2 und Fig. 3) werden unter Einsatz von 580 mg der hergestellten Mikropartikel gemäß Beispiel 2a und 2b als Filtermittel mit 3 ml einer Puffer 1 (siehe unten) Lösung equilibriert. (ggf. Zentrifuge (2000 U/min)). Anschließend werden 2 ml einer wässrigen DNA-Plasmidlösung (verwendetes Plasmid: pBluescript II SK) mit der Konzentration 50 µg/ml auf den Filter gegeben (ggf. Zentrifuge (5 min bei 2000 U/min)). Es erfolgt ein Referenzlauf mit ("Filter 2" in Fig. 2 und 3) Qiagen© Midipräp (Hilden, Deitschland) und ein weiterer Referenzlauf mit Qiagen® Midipräp - Kartuschen ohne Qiagen© Filtermittel, welche mit dem erfindungsgmäßen Filtermittel bestückt wurden.

Jeweils 5 µl Eluat, wird mit etwa 1/10 der Konzentration mit Anfärbereagenz (Marker) versehen und auf eine Agarosegelplatte (60% Saccharose, 20 mM EDTA, 0,025% Bromphenolblau) aufgetragen mit anschließender Gelelektrophorese (Firma Biorad, Power Supply, Modell 100/200). Als Referenz zur Abschätzung und Einordnung detektierter Plasmide wird ein Marker (MG 5.000) in Spur 1 und die verwendete DNA-Plasmidlösung als Referenz aufgetragen. Fig. 2 zeigt, daß am erfindungsgemäßen Filtermittel die Proben - DNA zurückgehalten wurde.

Anschließend werden 5 ml eines zweiten Puffers (Puffer 2) auf die Säule (Filter) zum Eluieren gegeben und schnell durch Zentrifugation aufgearbeitet (5 min bei 2000 U/min).

Die Eluate (Referenzen wie vorgenannt) werden auf eine Agarosegelplatte (60% Saccharose, 20 mM EDTA, 0,025% Bromphenolblau) aufgetragen und anschließend eine Gelelektrophorese (Firma Biorad, Power Supply, Modell 100/200) durchgeführt (siehe Fig. 3). Als Vergleich wurde ein Marker (MG 5000) (Spur 1) und die DNA-Plasmidlösung (Spur 7) aufgetragen.

Pufferbeschreibung

Puffer 1:
750 mM NaCl
50 mM MOPS (3-[N-morpholino]propanesulfonic acid, pKa 7.2)
15% Isopropanol
0,15% Triton® X-100
Puffer 2:
1,25 M NaCl
50 mM Tris, Tris.Clm, Ph 8,5
15% Isopropanol

Die Ergebnisse, die in Fig. 3 dargestellt sind, zeigen, daß sich die Plasmid-DNA problemlos vom Filtermittel eluieren läßt. Der Vergleich mit den handelsüblichen Filtermaterialien zeigt, daß das erfindungsgemäße Filtermittel auf Basis von wasserunlöslichen linearen α-1,4-D-Glucanen mindestens die gleiche Qualität wie die bereits bekannten Filtermittel besitzen.

Claims

1. Polysaccharidhaltiges Filtermittel, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein wasserunlösliches lineares Polysaccharid umfaßt.

2. Filtermittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wenigstens eine wasserunlösliche lineare Polysaccharid ausgewählt ist aus α-1,4-D- Glucanen und β-1,3-D-Glucanen.

3. Filtermittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche lineare α-1,4-D-Glucan eine Amylose ist.

4. Filtermittel nach einem der Ansprüche 2 oder 3, worin das wasserunlösliche lineare α-1,4-D-Glucan erhältlich ist durch in-vitro Polymerisation von Glucose unter Einwirkung eines Enzyms mit Amylosucrase-Aktivität.

5. Filtermittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche lineare Polysaccharid in Form von Mikropartikeln vorliegt.

6. Filtermittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropartikel sphärisch sind.

7. Filtermittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropartikel einen mittleren Durchmesser von 1 µm bis 5 µm besitzen.

8. Filtermittel nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropartikel eine spezifische Oberfläche von 3 m2/g bis 10 m2/g besitzen.

9. Filtermittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtermittel mikroporös ist.

10. Filtermittel nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropartikel durch Lösen der wasserunlöslichen linearen Polysaccharide in einem Lösungsmittel, Einbringen der Lösung in ein Fällmittel und Kühlen des dabei entstehenden Gemisches erhältlich sind.

11. Filtermittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das wasserunlösliche lineare Polysaccharid in eine poröse Matrix eingebettet ist.

12. Filtermittel nach Anspruch 11, worin die Matrix eine Polymermatrix ist.

13. Filtervorrichtung, enthaltend ein Filtermittel nach einem der Ansprüche 1 bis 12.

14. Filtervorrichtung nach Anspruch 13, umfassend wenigstens ein weiteres poröses Element.

15. Filtervorrichtung nach Anspruch 14, worin das poröse Element eine mikroporöse Membran ist.

16. Filtervorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, worin das poröse Element mit dem Filtermittel in direktem Kontakt ist und insbesondere kovalent oder nicht-kovalent an dieses gebunden ist.

17. Verfahren zur Herstellung eines Filtermittels nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder einer Filtervorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, umfassend die Schritte

a) Lösen oder Suspendieren wenigstens eines wasserunlöslichen linearen Polysaccharids in einem geeigneten Lösungs- bzw. Suspensionsmittel; und
b) Verfestigen der Suspension unter Bildung eines Filtermittels.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin das wenigstens eine wasserunlösliche lineare Polysaccharid ausgewählt ist aus α-1,4-D-Glucanen und β-1,3-D- Glucanen.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin das wenigstens eine wasserunlösliche lineare α-1,4-D-Glucan eine Amylose ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, worin das wenigstens eine wasserunlösliche lineare Polysaccharid in Form von Mikropartikeln, insbesondere sphärischen Mikropartikeln vorliegt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, worin das Suspensionsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasser, Alkoholen, Polymerlösungen und Hydrokolloiden.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, worin die Suspension zur Verfestigung auf ein poröses Element aufgebracht wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, worin das poröse Element eine mikroporöse Membran ist.

24. Verwendung von wasserunlöslichen linearen Polysacchariden als Filtermittel.

25. Verwendung nach Anspruch 24, worin das wasserunlösliche lineare Polysaccharid ausgewählt ist aus α-1,4-D-Glucanen und β-1,3-D-Glucanen.

26. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 oder 25, worin das wasserunlösliche lineare Polysaccharid in Form von Mikropartikeln, insbesondere sphärischen Mikropartikeln vorliegt.

27. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 26 zur Abtrennung und gegebenenfalls Reinigung und Isolierung von biologischem Material aus Flüssigkeiten.

28. Verwendung nach Anspruch 27, worin das biologische Material eine Nukleinsäure ist.