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Die
Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren (beispielsweise DNA und
RNA) aus komplexen Matrices, wie z.B. Blut, Bakterienzellkulturmedien
und forensischen Proben, ist ein wichtiges Verfahren in der Genforschung,
der Nukleinsäuresondendiagnostik,
dem Testen von forensischer DNA und in weiteren Bereichen. Wichtige
Techniken in diesen Bereichen stellen ebenfalls die Trennung einzelsträngiger von
doppelsträngiger
DNA und die gebundener von ungebundenen Nukleinsäurehybridisierungssonden dar.
Im Fachgebiet sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren bekannt,
die jedoch jeweils mit Beschränkungen
behaftet sind.
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Traditionell
verwendete man bislang eine Phenol-Chloroform-Extraktion, doch erfordert
diese die Verwendung toxischer und korrosiver Chemikalien und kann
nicht leicht automatisiert werden. Die Festphasenextraktion wurde
ebenfalls zur Nukleinsäurereinigung
verwendet. So wird beispielsweise von Boom et al. (US-Pat. Nr. 5,234,809)
ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Nukleinsäurequelle
beschrieben, bei dem man eine Suspension aus Siliziumdioxidpartikeln
mit einem gepufferten chaotropen Reagens, wie z.B. Guanidiniumthiocyanat,
in einem Reaktionsgefäß mischt,
anschließend
die Probe hinzugibt und dann gründlich
mischt. In Gegenwart des Chaotrops werden die Nukleinsäuren an
das Siliziumdioxid adsorbiert, das dann aus der flüssigen Phase
abzentrifugiert, mit einem Alkohol-Wasser-Gemisch gewaschen und schließlich unter
Verwendung eines verdünnten
wäßrigen Puffers
eluiert wird. Die Festphasen-Siliziumdioxidextraktion benötigt den
Einsatz des Alkohol-Waschschrittes, um Chaotropreste zu entfernen,
ohne dabei die Nukleinsäure
zu eluieren: es muß dabei
jedoch sehr sorgfältig
darauf geachtet werden, alle Spuren des Alkohols zu entfernen (durch
Verdampfen unter Erhitzen oder Waschen mit einem weiteren sehr flüchtigen
und entflammbaren Lösungsmittel),
um so die Hemmung von zur Amplifikation oder Modifi kation der Nukleinsäure in nachfolgenden
Schritten eingesetzten empfindlichen Enzymen zu verhindern.
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Ebenso
wird von Bastian et al. (WO 99/22021) die Isolierung von Nukleinsäuren über Festphasenextraktion
beschrieben. Dabei werden jedoch die Nukleinsäuren mit einem Puffer oder
Wasser eluiert, und man muß daher
darauf achten, daß die
Nukleinsäuren
während.
des Reinigungsvorgangs immobilisiert bleiben.
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Ionenaustauschverfahren,
wie z.B. die von Qiagen (Valencia, CA 91355) angebotenen, produzieren qualitativ
hochwertige Nukleinsäuren.
Bei diesen Verfahren entstehen jedoch hohe Salzkonzentrationen,
die entfernt werden müssen,
bevor man die Nukleinsäuren
weiter verwenden kann.
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In
der, vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Isolierung, einschließlich Konzentration,
und vorzugsweise Reinigung und Gewinnung von Nukleinsäuren bereitgestellt.
Ebenso werden Verfahren zur Reduzierung der Menge an Nukleinsäure, die
an einer Oberfläche
haftet, bereitgestellt. In einer Ausführungsform bringt man bei dem
Verfahren Nukleinsäure
auf ein hydrophobes organisches Polymermaterial, wie z.B. Polypropylenpulver
und Polytetrafluorethylenfibrillen, auf und entfernt (z.B. eluiert)
die Nukleinsäuren
von solchen hydrophoben Materialien mit einem nichtionischen Tensid.
In einer weiteren Ausführungsform
wird ein nichtionisches Tensid zur Behandlung einer hydrophoben
Oberfläche
verwendet, um die Anhaftung von Nukleinsäuren an hydrophobe Oberflächen zu
reduzieren und vorzugsweise zu verhindern.
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Erfindungsgemäß isolierte
Nukleinsäuren
eignen sich beispielsweise in Tests zum Nachweis des Vorhandenseins
einer bestimmten Nukleinsäure
in einer Probe. Solche Tests sind bei der Vorhersage und Diagnose
einer Krankheit, in der forensischen Medizin, der Epidemiologie
sowie dem öffentlichen
Gesundheitswesen wichtig.
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So
kann beispielsweise DNA einer Hybridisierung und/oder Amplifikation
ausgesetzt werden, um das Vorhandensein eines infektiösen Virus
oder eines mutierten Gens in einem Individuum nachzuweisen, wobei die
Wahrscheinlichkeit, daß das
Individuum an einer Krankheit infektiösen oder genetischen Ursprungs
leidet, bestimmt werden kann. Die Fähigkeit, ein infektiöses Virus
oder eine Mutation in einer Probe unter den hunderten oder tausenden
von einem Screening unterzogenen Proben nachzuweisen, ist von erheblicher
Bedeutung bei der frühen
Diagnose oder Epidemiologie einer durch Krankheit gefährdeten
Population, z.B. dem frühen
Nachweis einer HIV-Infektion, von Krebs oder der Anfälligkeit
für Krebs,
oder beim Screening von Neugeborenen auf Krankheiten, wo ein früher Nachweis
für die
Diagnose und Behandlung entscheidend sein kann. Darüber hinaus
kann das Verfahren auch in Grundlagenforschungslaboratorien zur
Isolierung von Nukleinsäure
aus kultivierten Zellen oder in biochemischen Reaktionen verwendet
werden. Die Nukleinsäure
läßt sich
zur enzymatischen Modifikation, wie z.B. einer Restriktionsenzymverdauung,
einer Sequenzierung und Amplifikation, verwenden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird bei dem Verfahren zur Isolierung einer Nukleinsäure aus einer
Probe: eine Zielnukleinsäure
aufweisende Probe (z.B. DNA, RNA, PNA) einer hydrophoben organischen Polymerfestphase
zugeführt,
so daß wenigstens
ein Teil der Zielnukleinsäure
an die Festphase haftet, und ein nichtionisches Tensid auf die Festphase
aufgetragen wird, um wenigstens einen Teil der daran haftenden Zielnukleinsäure abzulösen. Vorzugsweise
handelt es sich bei der Probe um eine biologische Probe, die beispielsweise
Zellen enthält.
In bestimmten Ausführungsformen
wird bei dem Verfahren vor dem Zuführen der biologischen Probe
eine Zellyse durchgeführt,
um den Zelleninhalt in Form eines Lysats, das Nukleinsäure enthält, freizusetzen.
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In
bestimmten Ausführungsformen
wird bei dem Verfahren weiterhin der hydrophoben organischen Polymerfestphase
ein ein zugesetztes Salz aufweisender Bindungspuffer zugeführt, um
das Anhaften der Nukleinsäure
an die Festphase zu unterstützen.
Dabei wird der Bindungspuffer vorzugsweise vor Zuführen der Probe
zugeführt.
In bestimmten Ausführungsformen
wird bei dem Verfahren weiterhin die Festphase mit der daran haftenden
Nukleinsäure
gewaschen, um Probenbestandteile, bei denen es sich nicht um Nukleinsäure handelt,
abzutrennen. Ein solcher Waschschritt wird typischerweise mit einem
ein zugesetztes Salz aufweisenden Waschpuffer durchgeführt.
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Das
hydrophobe organische Polymerfestphasenmaterial enthält vorzugsweise
ein fluoriniertes Polymer, wie z.B. Polytetrafluorethylen. Besonders
bevorzugt enthält
es ein, Polyolefin, wie z.B. Polyethylen oder Polypropylen. Bei
dem nichtionischen Tensid handelt es sich vorzugsweise um ein Polyoxyethylentensid
und besonders bevorzugt um ein Polyoxyethylen-Cooxypropylen-Tensid.
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In
der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren zur Isolierung
von Doppelstrang-DNA aus einer Probe bereitgestellt. Bei dem Verfahren
wird eine Doppelstrang-DNA aufweisende Probe einer hydrophoben organischen
Polymerfestphase zugeführt,
so daß wenigstens
ein Teil der Doppelstrang-DNA an die Festphase haftet, die Festphase
mit der daran haftenden Doppelstrang-DNA gewaschen, um Probenbestandteile, bei
denen es sich nicht um Doppelstrang-DNA handelt (einschließlich Einzelstrang-DNA),
abzutrennen, und ein nichtionisches Tensid auf die Festphase aufgetragen,
um wenigstens einen Teil der daran haftenden Doppelstrang-DNA abzulösen. Somit
werden in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verschiedene
Arten von Nukleinsäure
getrennt.
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In
der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren bereitgestellt,
um die an einer hydrophoben organischen Polymeroberfläche haftende
Nukleinsäuremenge
zu reduzieren (und vorzugsweise Nukleinsäure an diesem Anhaften zu hindern).
Bei dem Verfahren wird ein nichtionisches Tensid auf die hydrophobe
organische Polymeroberfläche
aufgetragen, die Oberfläche
mit einem Lösungsmittel
(wie z.B. Wasser oder einem anderen Lösungsmittel, wie z.B. demjenigen,
in dem das Tensid gelöst
ist) gewaschen und mit einer die Nukleinsäure aufweisenden Probe in Kontakt
gebracht.
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In
der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein Kit bereitgestellt,
der eine hydrophobe organische Polymerfestphase, an die Nukleinsäure haftet,
sowie ein nichtionisches Tensid, mit dem sich wenigstens ein Teil der
Nukleinsäure
von der Festphase ablösen
läßt, aufweist.
Der Kit weist weiterhin vorzugsweise einen Durchflußbehälter auf.
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Definitionen
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„Nukleinsäure" besitzt die im Fachgebiet
bekannte Bedeutung und bezieht sich sowohl auf DNA als auch auf
RNA in vielen verschiedenen Formen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein,
Doppelstrang- und Einzelstrang-Konfigurationen, zirkuläre Form,
Plasmide, relativ kurze Oligonukleotide, Peptidnukleinsäuren, auch
PNSs genannt (wie in Nielsen et al., Chem. Soc. Rev., 26, 73–78 (1997))
beschrieben, u.ä.
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„Isoliert" bezieht sich auf
Nukleinsäure,
die aus der Probe, in der sie ursprünglich gefunden wurde, abgetrennt
wurde. Dazu gehört
das einfache Konzentrieren der gewünschten Nukleinsäure, ohne
dabei notwendigerweise irgendwelche anderen Materialien, außer dem
in der ursprünglichen
Probe vorliegenden ursprünglichen
Lösungsmittel,
zu entfernen. Dazu gehört
ebenso das Trennen einer gewünschten
Nukleinsäure
von anderen Materialien, z.B. zellulären Komponenten, wie z.B. Proteinen,
Lipiden, Salzen usw. Besonders bevorzugt wird die isolierte Nukleinsäure weitgehend
gereinigt. „Weitgehend
gereinigt" bezieht
sich auf Nukleinsäure,
die wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 80% und besonders bevorzugt
wenigstens 95% rein im Hinblick auf die Entfernung einer Verunreinigung,
z.B. zellulärer
Komponenten, wie z.B. Protein, Lipid oder Salz, ist. Diese Prozentangaben
beziehen sich auf die Menge an Zielnukleinsäure (z.B. DNA, RNA, PNA) relativ
zur Gesamtmenge der Zielnukleinsäure
plus anderer (Nicht-Ziel-)Nukleinsäure und
Verunreinigungen, z.B. zellulären
Komponenten, wie z.B. Proteinen, Lipiden, Salzen usw., mit Ausnahme
des in der Probe vorliegenden Lösungsmittels.
Somit bezieht sich der Ausdruck „weitgehend gereinigt" im allgemeinen auf
die Trennung einer Mehrzahl an zellulären Komponenten oder Reaktionsverunreinigungen
von der Probe, so daß dabei
Verbindungen, die die nachfolgende Verwendung der isolierten Nukleinsäure stören können, abgetrennt
werden.
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„Haftet
an" oder „Anhaftung" oder „Bindung" bezieht sich auf
die reversible Bindung über
viele verschiedene Mechanismen, einschließlich schwacher Kräfte, wie
z.B. Van-der-Waals-Wechselwirkungen, elektrostatischen Wechselwirkungen,
Affinitätsbindung
oder physikalischem Einfangen. Die Verwendung dieses Ausdrucks impliziert
keinen Wirkmechanismus und schließt Adsorptions- und Absorptionsmechanismen
ein.
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„Hydrophobe
organische Polymerfestphase" bezieht
sich auf ein aus sich wiederholenden Einheiten organischer Verbindungen
natürlichen
und/oder synthetischen Ursprungs aufgebautes Polymer, wobei die
Einheiten gleich oder unterschiedlich sein können. Dazu gehören Homopolymere
und Heteropolymere (z.B. Copolymere, Terpolymere, Tetrapolymere
usw., die beispielsweise in Zufalls- oder Blockform vorliegen können). Ein
hydrophobes Polymer weist eine kritische Oberflächenspannung auf, die geringer
als die Oberflächenspannung
von Wasser (z.B. weniger als 72 dynes/cm) und vorzugsweise geringer
als die kritische Oberflächenspannung
von Nylon (z.B. weniger als etwa 43 dynes/cm) ist. Unter diesen
Ausdruck fallen fibröse
oder partikuläre
Formen eines Polymers, die mit im Fachgebiet allgemein bekannten
Verfahren leicht hergestellt werden können. Derartige Materialien
bilden typischerweise eine poröse
Matrix, obwohl bei gewissen Ausführungsformen
sich die Festphase auch auf eine feste Oberfläche, wie z.B. eine nichtporöse Folie
aus organischem Polymermaterial, bezieht.
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„Tensid" bezieht sich auf
eine Substanz, die die Oberflächen-
oder Grenzflächenspannung
des Mediums, in dem sie gelöst
ist, herabsetzt. „Nichtionisches
Tensid" bezieht
sich auf ein Tensidmolekül,
dessen polare Gruppe nicht elektrisch geladen ist.
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Es
wurde festgestellt, daß Nukleinsäuren an
hydrophobe organische Polymermaterialien, wie z.B. Polypropylenpulver
und Polytetrafluorethylenfibrillen, haften und daß sich Nukleinsäuren von
solchen hydrophoben Materialien mit einem nichtionischen Tensid
wirksam ablösen
lassen. Weiterhin läßt sich
ein nichtionisches Tensid dazu verwenden, eine hydrophobe organische
Polymeroberfläche,
wie z.B. eine Plastikfolie, zu behandeln, so daß die Anhaftung von Nukleinsäuren an
hydrophobe Oberflächen
reduziert und vorzugsweise verhindert wird.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
lassen sich zur Isolierung von Nukleinsäuren aus vielen verschiedenen
Proben, insbesondere biologischen Proben, wie z.B. Körperflüssigkeiten
(z.B. Vollblut, Blutserum, Urin, Speichel), verschiedenen Geweben,
Zellkulturen usw., verwenden. Dabei stellt die Art der Probe keine
Beschränkung
der vorliegenden Erfindung dar. Bei den biologischen Proben handelt
es sich um solche biolo gischen oder biochemischen Ursprungs. Zur
Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren
geeignete Proben lassen sich aus Säuger-, Pflanzen-, Bakterien-
oder Hefequellen gewinnen. Dabei kann die biologische Probe in Form
von Einzelzellen oder in Form eines Gewebes vorliegen. Zellen oder
Gewebe können
aus einer in-vitro-Kultur
gewonnen werden.
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Bei
zellhaltigen Proben werden die Zellmembranen zunächst lysiert, um den Inhalt
der Zellen als ein nukleinsäurehaltiges
Lysat freizusetzen. Lyse bedeutet hier das physikalische Aufbrechen
der Zellmembranen, womit die äußere Zellmembran
und, wenn vorhanden, die Kernmembran gemeint sind. Dies läßt sich
mit Standardtechniken, wie z.B. durch Kochen, durch Behandlung mit
chaotropen Reagentien, durch physikalisches Aufbrechen oder Einfrieren/Auftauen,
durchführen.
Zur Isolierung von Nukleinsäuren
aus einem Zellysat ist es normalerweise bevorzugt, zunächst die
Proteine zu entfernen. Dazu kann beispielsweise eine Behandlung
mit Azlactonkügelchen
(z.B. solchen des kommerziell als EMPHAZE AB1-Kügelchen von 3M Company, St.
Paul, MN, USA, erhältlichen
Typs oder solchen des in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 94/00464
(3M Company) offenbarten Typs) durchführen, oder die Probe kann durch
eine Kationenaustauschmembran oder -säule bei einem zur Erhaltung
der positiven Ladung der Proteine hinreichend niedrigen pH-Wert
geleitet werden.
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Die
Nukleinsäuren
können
erfindungsgemäß aus einer
unreinen, teilweise reinen oder einer reinen Probe isoliert (z.B.
konzentriert oder von Verunreinigungen getrennt) werden. Dabei ist
die Reinheit der ursprünglichen
Probe unkritisch, da Nukleinsäure
selbst aus extrem unreinen Proben isoliert werden kann. So kann
Nukleinsäure
beispielsweise aus einer unreinen Probe einer biologischen Flüssigkeit,
wie z.B. Blut, Speichel oder Gewebe, abgetrennt werden. Wird eine
ursprüngliche
Probe mit höherer
Reinheit gewünscht,
so kann die Probe vor Durchführung
der erfindungsgemäßen Isolierung
mit beliebigen herkömmlichen,
dem Fachmann bekannten Mitteln behandelt werden. Beispielsweise
kann die Probe so bearbeitet werden, daß bestimmte Verunreinigungen,
wie z.B. unlösliche
Materialien, vor der Nukleinsäureisolierung
abgetrennt werden.
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Die
wie hier beschrieben isolierte Nukleinsäure kann ein beliebiges Molekulargewicht
aufweisen und in Einzelstrangform, Doppelstrangform, zirkulär, als Plasmid
usw. vorliegen. Dabei lassen sich verschiedene Arten von Nukleinsäure voneinander
trennen (z.B. RNA von DNA oder Doppelstrang- von Einzelstrang-DNA). Beispielsweise
können
kleine Oligonukleotide oder Nukleinsäuremoleküle mit einer Länge von
etwa 10 bis etwa 50 Basen, wesentlich längere Moleküle mit einer Länge von
etwa 1000 Basen bis etwa 10 000 Basen und selbst hochmolekulare
Nukleinsäuren
von etwa 50 kb bis etwa 500 kb mit den erfindungsgemäßen Verfahren isoliert
werden. In einigen Aspekten kann eine erfindungsgemäß isolierte
Nukleinsäure
vorzugsweise im Bereich von etwa 10 Basen bis etwa 100 Kilobasen
liegen.
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Die
gemäß den hier
beschriebenen Verfahren auf das hydrophobe organische Festphasenmaterial aufgetragene
Nukleinsäureprobe
kann in vielen verschiedenen Volumen vorliegen. So kann beispielsweise das
aufgetragene Volumen bis zu 1 Liter groß oder bis zu 1 μL klein sein.
Sie könnte
auch in einem mikrofluidischen Format (dem sogenannten „Laboratorium
auf einem Chip"),
bei dem sehr kleine Volumen (weniger als 1 μL) eingesetzt werden verwendet
werden. Die auf die Festphasenmatrix wie hier beschrieben aufgetragene Nukleinsäuremenge
kann beliebig sein, wobei diese Menge durch die Menge an Festphase
bestimmt wird. Vorzugsweise ist die auf die Festphase aufgetragene
Nukleinsäuremenge
niedriger als das Trockengewicht der Festphase, typischerweise etwa
1/10 000 bis etwa 1/100 (Gewicht Nukleinsäure/Festphase). Die auf die Festphase
aufge tragene Nukleinsäuremenge
kann beispielsweise bis zu 100 Gramm groß oder bis zu 1 Pikogramm klein
sein.
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Die
aus dem Festphasenmaterial isolierte gewünschte Nukleinsäure liegt
vorzugsweise in einer Menge von etwa 30%, besonders bevorzugt von
etwa 70% und am meisten bevorzugt von etwa 90% oder mehr der ursprünglich auf
die Festphase aufgetragenen gewünschten
Nukleinsäuremenge
vor. Somit sorgen die erfindungsgemäßen Verfahren für eine hohe
Gewinnung der gewünschten
oder Zielnukleinsäure
aus einer Probe. Weiterhin können
ausgesprochen kleine Mengen an Nukleinsäuremolekülen erfindungsgemäß quantitativ gewonnen
werden. Die Gewinnung oder Ausbeute hängt hauptsächlich von der Qualität der Probe
und nicht so sehr von dem Verfahren selbst ab. Da durch die Erfindung
eine Nukleinsäurepräparation
bereitgestellt wird, die keine Konzentration aus einem großen Volumen
erfordert, wird erfindungsgemäß die Gefahr
des Verlusts der Nukleinsäure
vermieden.
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Typischerweise
wird eine nukleinsäurehaltige
Probe in einem Durchflußbehälter auf
die hydrophobe organische Polymerfestphase gegeben, obwohl dieser
Behälter
nicht absolut notwendig ist. Die Nukleinsäure haftet dann an das hydrophobe
organische Polymerfestphasenmaterial. Die Bindung der Nukleinsäure kann vorzugsweise
durch die Verwendung eines Bindungspuffers, der zusammen mit oder
vor der die Zielnukleinsäure
enthaltenden Probe zugegeben werden kann, verstärkt werden. Ein solcher Puffer
weist typischerweise einen biologischen Standardpuffer auf, der
mit Nukleinsäure
kompatibel ist und einen pH-Wert von etwa 3 bis 11 aufweist. Dazu
gehören
beispielsweise AMPSO (3-[(1,1-Dimethyl-2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropansulfonsäure (#A7585,
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178), MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure) (#M5287,
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178) oder PBS (phosphatgepufferte
Kochsalzlösung)
(typischerweise mit einer Salzkonzentration von etwa 20 millimolar
(mM)). Der Bindungspuffer weist typischerweise auch ein zugesetztes
Salz zur Förderung
der hydrophoben Bindung auf. Dazu zählen beispielsweise Natriumsalze
von Phosphat, Perchlorat, Citrat oder Sulfat mit Konzentrationen
von beispielsweise bis zu etwa 400 mM oder sogar 1 molar. Ungebundene
Materialien, wie z.B. verdaute Proteine, Lipide und andere unerwünschte zelluläre Komponenten,
werden dann vorzugsweise von der haftenden Nukleinsäure getrennt,
indem das Nukleinsäure/Festphasenmaterial
beispielsweise mit einem Puffer gewaschen wird. Bei diesem Waschpuffer handelt
es sich typischerweise um einen biologischen Puffer, der mit der
Nukleinsäure
kompatibel ist und typischerweise in einem pH-Bereich von etwa 3
bis etwa 11 liegt. Zu den für
die Abtrennung von unerwünschten Materialien
geeigneten Waschpuffern gehören
beispielsweise die oben unter dem Bindungspuffer aufgeführten Puffer.
Ein solcher Puffer kann gegebenenfalls zugesetzte Salze, wie z.B.
die oben für
den Bindungspuffer aufgeführten,
aufweisen. Sobald diese Materialien abgetrennt sind, kann die Nukleinsäure gewonnen
werden, indem sie von dem Festphasenmaterial mit einem nichtionischen
Tensid, das in einem Elutionspuffer, wie z.B. den oben aufgeführten Puffern
(ohne zugesetztes Salz), vorliegen kann, abgelöst werden (z.B. durch Eluieren).
Bei Verwendung dieses bevorzugten Verfahrens ist die gewonnene Nukleinsäure weitgehend
rein, konzentriert und für
die sofortige Verwendung in nachfolgenden Experimenten (z.B. Sequenzierexperimenten)
geeignet.
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Bei
dem für
die erfindungsgemäßen Verfahren
geeigneten hydrophoben organischen Polymerfestphasenmaterial kann
es sich um viele verschiedene organische Materialien handeln, die
Nukleinsäure
reversibel binden. Zu den geeigneten Polymeren gehören beispielsweise
Polyolefine und fluorinierte Polymere. Das Festphasenmaterial wird
typischerweise gewaschen, um Salze und andere Verunreinigungen vor
der Verwendung abzutrennen. Es kann entweder trocken oder in wäßriger Suspension
gebrauchsfertig aufbewahrt werden. Das Festphasenmaterial wird vorzugsweise
in einem Durchflußbehälter, wie
beispielsweise einer Pipette, Spritze oder größeren Säule, einer Mikrotiterplatte
oder einer mikrofluidischen Vorrichtung, verwendet, obwohl Suspensionsverfahren
ohne solche Behälter
ebenfalls verwendet werden könnten.
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Das
für die
erfindungsgemäßen Verfahren
geeignete hydrophobe organische Polymerfestphasenmaterial kann viele
verschiedene Materialien in vielen verschiedenen Formen aufweisen.
Es kann beispielsweise in Form von Partikeln, die lose oder immobilisiert
sein können,
Fasern, einem mikroporösen
Film oder einer Membran vorliegen. Bei den Durchflußanwendungen
der vorliegenden Erfindung liegen solche Materialien typischerweise
in Form einer porösen
Matrix vor. Bei derartigen Anwendungen weist das Festphasenmaterial eine
relativ große
Oberfläche,
wie beispielsweise von mehr als einem Quadratmeter pro Gramm (m2/g), auf. Bei Anwendungen, bei denen keine
Durchflußvorrichtung
verwendet wird, wie z.B. der Vorbehandlung einer festen Oberfläche zur
Verhinderung der Anhaftung von Nukleinsäure, kann das Festphasenmaterial
gegebenenfalls in einer porösen
Matrix vorliegen.
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In
einer Ausführungsform
weist das Festphasenmaterial eine Fibrillenmatrix auf, in der gegebenenfalls Partikel
eingebettet sein können.
Werden sowohl eine Fibrillenmatrix als auch Partikel verwendet,
so ist wenigstens eines (eine) davon hydrophobisch und dazu in der
Lage, die gewünschte
Nukleinsäure
(d.h. Zielnukleinsäure)
zu binden. Die Fibrillenmatrix kann beliebige Fasern aus einer großen Vielfalt
von Fasern enthalten. Die Fasern sind typischerweise in einem wäßrigen Milieu
unlöslich.
Dazu gehören
beispielsweise Glasfasern, Polyolefinfasern, insbesondere Polypropylen-
und Polyethylen-Mikrofasern, Aramidfasern, ein fluoriniertes Polymer,
insbesondere Polytetrafluorethylenfasern, sowie natürliche Cellulosefasern.
Es können
Faserngemische verwendet werden, die gegenüber der Bindung von Nukleinsäure aktiv
oder inaktiv sein können.
Die Fibrillenmatrix bildet vorzugsweise ein Netz, das wenigstens
etwa 15 Mikrometer und nicht mehr als etwa 1 Millimeter und besonders
bevorzugt nicht mehr als etwa 500 Mikrometer dick ist.
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Falls
Partikel verwendet werden, so sind diese typischerweise in einem
wäßrigen Milieu
unlöslich.
Sie können
aus einem Material oder aus einer Kombination von Materialien, wie
z.B. in einem beschichteten Partikel, aufgebaut sein. Sie können quellbar
oder nicht quellbar sein, sind jedoch vorzugsweise in Wasser und organischen
Flüssigkeiten
nicht quellbar. Falls das Anhaften durch das Partikel durchgeführt wird,
besteht das letztere vorzugsweise aus einem nicht quellbaren, hydrophoben
Material. Die Partikel können
hinsichtlich ihrer Affinität
für die
Zielnukleinsäure
gewählt
werden. Einige wasserquellbare Partikel sind beispielsweise in den US-Patenten
Nr. 4,565,663 (Errede et al.), 4,460,642 (Errede et al.) und 4,373,519
(Errede et al.) beschrieben. In Wasser nicht quellbare Partikel
sind in den US-Patenten Nr. 4,810,381 (Hagen et al.), 4,906,378
(Hagen et al.), 4,971,736 (Hagen et al.) und 5,279,742 (Markell
et al.) beschrieben. Bevorzugte Partikel sind Polyolefinpartikel,
wie z.B. Polypropylenpartikel (z.B. Pulver). Es können Partikelgemische
verwendet werden, die gegenüber
der Bindung von Nukleinsäure
entweder aktiv oder inaktiv sind.
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Falls
beschichtete Partikel verwendet werden, so handelt es sich bei der
Beschichtung vorzugsweise um ein in Wasser oder in organischem Lösungsmittel
unlösliches,
nicht quellbares Material. Bei der Beschichtung kann es sich gegebenenfalls
um eine Beschichtung handeln, an die Nukleinsäure haftet. Somit kann das beschichtete
Grundpartikel anorganisch oder organisch sein. Die Grundpartikel
können
anorganische Oxide, wie z.B. Siliziumdioxid, Aluminiumoxid, Titandioxid,
Zirkondioxid usw. enthalten, an die organische Gruppen kovalent
gebunden sind. So können
beispielsweise kovalent gebundene organische Gruppen wie z.B. aliphatische
Gruppen unterschiedlicher Kettenlänge (C2-, C4-, C8- oder C18-Gruppen)
verwendet werden.
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Geeignete
Festphasenmaterialien, die eine Fibrillenmatrix enthalten, sind
beispielsweise . in den US-Patenten
Nr. 5,279,742 (Markell et al.), 4,906,378 (Hagen et al.), 4,153,661
(Ree et al.), 5,071,610 (Hagen et al.), 5,147,539 (Hagen et al.),
5,207,915 (Hagen et al.) und 5,238,621 (Hagen et al.) beschrieben.
Dabei sind solche, die eine Polytetrafluorethylenmatrix (PTEF) aufweisen,
besonders bevorzugt.
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Die
PTFE-Matrix läßt sich
gemäß dem im
US-Patent Nr. 4,906,378 (Hagen et al.) beschriebenen Verfahren herstellen.
Kurz gesagt wird dabei das partikuläre Material mit einer wäßrigen Polytetrafluorethylendispersion
in Gegenwart von ausreichend Wasser als Gleitmittel, um die Absorptionskapazität der Feststoffe
zu erhöhen,
dabei jedoch eine kittartige Konsistenz zu bewahren, vermischt,
die kittartige Masse bei einer Temperatur von etwa 50°C bis etwa
100°C intensiv
gemischt, um eine erste Fibrillierung der Polytetrafluorethylenpartikel
auszulösen,
die kittartige Masse dann biaxial kalandert, um eine weitere Fibrillierung
der Polytetrafluorethylenpartikel unter Beibehaltung desselben Wassergehalts
auszulösen,
und die erhaltene Folie getrocknet.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
weist die Festphase (z.B. ein mikroporöser thermoplastischer Polymerträger) eine
mikroporöse
Struktur auf, die durch eine Vielzahl beabstandeter, beliebig dispergierter,
ungleichförmiger,
gleichachsiger Partikel aus thermoplastischem Polymer, die durch
Fibrillen verbunden sind, gekennzeichnet ist. Die Partikel sind voneinander
beabstandet, um so ein Netzwerk von dazwischenliegenden Mikroporen
bereitzustellen. Die Partikel sind miteinander durch Fibrillen verbunden,
die sich von jedem Partikel jeweils strahlenförmig zu den benachbarten Partikeln
erstrecken. Dabei können
die Partikel oder die Fibrillen oder sowohl die Partikel als auch
die Fibrillen hydrophobisch sein und das Anhaften von Nukleinsäuren gestatten.
Derartige Materialien weisen beispielsweise vorzugsweise eine große Oberfläche auf, die
häufig
bis zu 40 Quadratmeter/Gramm, wie mit Hg-Oberflächentechniken gemessen, groß sein kann,
sowie Porengrößen von
bis zu 5 Mikrometern auf.
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Diese
Art von fibrösem
Material läßt sich
mit einer bevorzugten Technik herstellen, bei der eine induzierte
Phasentrennung eingesetzt wird. Dabei wird ein thermoplastisches
Polymer mit einer nicht mischbaren Flüssigkeit bei einer Temperatur
verschmolzen, die zur Bildung einer homogenen Mischung ausreicht,
ein Körper
aus der Lösung
in die gewünschte
Form gebracht, der Formkörper
gekühlt
wird, um so die Phasentrennung der Flüssigkeit und des Polymers zu
induzieren und schließlich
das Polymer zu verfestigen und einen beträchtlichen Anteil der Flüssigkeit
zu entfernen, wodurch eine mikroporöse Polymermatrix zurückbleibt.
Dieses Verfahren und die bevorzugten Materialien sind ausführlich in
den US-Patenten Nr. 4,726,989 (Mrozinski), 4,957,943 (McAllister
et al.) und 4,539,256 (Shipman) beschrieben. Derartige Materialien
werden als thermisch induzierte Phasentrennungsmembranen (TIPS [thermally
induced phase separation]Membranen) bezeichnet und sind besonders
bevorzugt.
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Die
Affinität
der Nukleinsäuren
für das
hydrophobe Festphasenpolymer läßt sich über die
während
der Bindung oder dem Haften von Nukleinsäuren an die Festphase verwendete
Salzkonzentration (die sich durch die Verwendung eines hier als
Bindungspuffer bezeichneten Puffers steuern läßt) oder die während des
Elutionsschritts verwendete Salzkonzentration (die sich durch die
Verwendung eines hier mit Elutionspuffer bezeichneten Puffers steuern
läßt) steuern.
Falls gewünscht,
können
die Bindungs- und Elutionspuffer, die typischerweise in einem pH-Bereich
von etwa 3 bis etwa 11 liegen, zur Trennung unterschiedlicher Formen
von Nukleinsäuren
verwendet werden. Je nach der Festphase kann die Bindung unterschiedlicher
Arten. von Nukleinsäuren über die
Beschaffenheit der Bindungs- und Elutionspuffer gesteuert werden.
Hohe Konzentrationen von Salzen wie beispielsweise Phosphaten erhöhen im allgemeinen
die Bindungskapazität
fester Träger, wie
z.B. eines partikulären
Polypropylenmaterials. In einigen Fällen kann dies zur Trennung
unterschiedlicher Formen von Nukleinsäuren verwendet werden.
-
Eine
bevorzugte wäßrige Lösung zur
Freisetzung der Nukleinsäuren
aus der Festphase zur Bildung einer nukleinsäurehaltigen Lösung weist
eine ausreichende Konzentration eines oder mehrerer nichtionischer Tenside
auf. Eine bevorzugte Lösung
zur Freisetzung der Nukleinsäure
enthält
Wasser und eine minimale Menge eines Puffers, wie z.B. PBS, zur
Aufrechterhaltung des benötigten
pH-Werts sowie eine minimale Menge an nichtionischem Tensid. Diese
minimale Menge hängt
davon ab, welches nichtionische Tensid verwendet wird. Für PLURONIC
F68 liegt diese Menge nicht unter etwa 0,06 mM. Im allgemeinen muß die für eine wirksame
Elution benötigte
Konzentration des nichtionischen Tensids oberhalb der kritischen
Mizellenkonzentration (d.h. der zur Bildung einer Mizelle, z.B.
einer submikroskopischen Aggregation von Tensidmolekülen, benötigten Minimalkonzentration
von Tensid in Wasser) für
dieses Tensid liegen. Die Elutionsfließgeschwindigkeit ist dabei
nicht kritisch, solange der Nukleinsäure zur Desorption vom festen
Träger
genügend
Zeit zur Verfügung
steht.
-
Viele
verschiedene geeignete nichtionische Tenside sind bekannt. Dazu
gehören
beispielsweise Polyoxyethylentenside, Carbonsäureestertenside, Carbonsäureamidtenside
usw. Zu den kommerziell erhältlichen nichtionischen
Tensiden gehören
n-Dodecanoylsaccharose, n-Dodecyl-β-D-glucopyranosid, n-Octyl-β-D-maltopyranosid,
n-Octyl-β-D-thioglucopyranosid,
n-Decanoylsaccharose, n-Decyl-β-D-maltopyranosid,
n-Decyl-β-D-thiomaltosid,
n-Heptyl-β-D-glucopyranosid,
n-Heptyl-β-D-thioglucopyranosid,
n-Hexyl-β-D-glucopyranosid,
n-Nonyl-β-D-glucopyranosid,
n-Octanoylsaccharose, n-Octyl-β-D-glucopyranosid,
Cyclohexyl-n-hexyl-β-D-maltosid,
Cyclohexyl-n-methyl-β-D-maltosid, Digitonin,
sowie diejenigen, die unter den Handelsnamen PLURONIC, TRITON, TWEEN
erhältlich
sind, ebenso wie zahlreiche weitere kommerziell erhältliche
und in Kirk Othme Technical Encyclopedia aufgeführte Verbindungen. Bevorzugte
Tenside sind die Polyoxyethylentenside. Besonders bevorzugte Tenside
sind die Polyoxyethylen-Cooxypropylen-Tenside.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Schritt zur Gewinnung von Nukleinsäuren in
einer weitgehend gereinigten Form bereitgestellt. Bei dieser Ausführungsform
werden Gewinnungsverfahren betrachtet, bei denen entweder das gesamte
Eluat oder Portionen der Eluatlösung, die
vom Festphasenmaterial abgelöste
weitgehend gereinigte Nukleinsäure
enthalten, entfernt werden. Solche Portionen können verschiedenen Analyse-
und Synthesetechniken, die dem Fachmann bekannt sind, unterzogen
werden.
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Zu
den Vorrichtungen zur Verwendung der Verfahren der vorliegenden
Erfindung gehören
beispielsweise Standard-Laborfilterhalter
und -filter, die von Firmen wie z.B. Millipore, Inc. (Bedford, MA
01730), Bio-Rad, Inc. (Hercules, CA 94547), Osmonics, Inc. (Westborough,
MA 01581) und Whatman, Inc. (Clifton, NJ 07014) produziert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren
kann in Filtrationsvorrichtungen durchgeführt werden, die die Bewegung
von Lösungen
durch Filter (als Durchflußvorrichtungen
bezeichnet) mittels einschließlich
Zentrifugation, Absaugen, Druck, erleichtern. Zu weiteren Vorrichtungen
gehören
Mikrotiterplatten sowie mikrofluidische Vorrichtungen.
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In
der vorliegenden Erfindung wird ebenso ein Kit bereitgestellt, der
einen festen Träger
entweder mit oder ohne einen Halter (z.B. einen Filterhalter wie
z.B. einen Spritzenfilterhalter oder einen Spin-Filterhalter, oder eine Säule mit
Rückhaltefritten
an beiden Enden zum Zurückhalten
von partikulärem
Material), ein nichtionisches Tensid, entweder pur oder in einer
Lösung,
sowie Anleitungen zur Bindung und Elution der Nukleinsäure aufweist.
Vorzugsweise werden in der folgenden Erfindung Kits bereitgestellt,
die einen Durchflußbehälter mit
einem darin befindlichen hydrophoben organischen Festphasenpolymermaterial
und ein nichtionisches Tensid aufweisen.
-
In
der vorliegenden Erfindung wird ebenso ein Verfahren zur Reduzierung
oder Verhinderung des Anhaftens von Nukleinsäure an ein hydrophobes organisches
Material bereitgestellt. Jedoch wird im Gegensatz zu
JP 2268682 (Hitachi Ltd.), das ein
nichtionisches Tensid in einem Gemisch mit der Nukleinsäure beinhaltet, bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
das Material mit einem Tensid vorbehandelt, das Material vorzugsweise
gewaschen und danach mit der Nukleinsäure in Kontakt gebracht.
-
Beispiele
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Materialien:
-
- DNA. Falls nicht anders angegeben, handelte es sich bei
der in diesen Experimenten verwendeten DNA um Kalbsthymus-DNA (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO 14508).
- Plasmid-DNA. PUC119-Plasmid-DNA wurde von ATG Laboratories,
Eden Prairie, MN 55344, USA, hergestellt. Diese wurde auf eine Konzentration
von etwa 30 μg/mL
in entweder 10 oder 400 mM Phosphatpuffer bei pH 6,8 gelöst.
- Hydroxyapatit (HAP). HTP-Hydroxyapatit wurde von Bio-Rad Co., Hercules,
CA 94547, USA, bezogen.
- Phosphatpuffer. Alle verwendeten Phosphatpuffer wurden aus äquimolaren
Mengen an mono- und dibasischem Kaliumphosphat hergestellt.
- Tensid. Nichtionisches Tensid PLURONIC F68 (BASF Corp., Parsippany,
NJ 07054, USA).
-
Mit
Hydroxyapatit beladene EMPORE-Membran mit etwa 90 Gew.-% HAP wurde
nach dem Verfahren von Beispiel 1 in US-Patent Nr. 4,906,378 hergestellt.
-
Mit
Polypropylen beladene EMPORE-Membran wurde nach dem Verfahren von
Beispiel 1A in US-Patent Nr. 5,071,610 hergestellt, mit der Ausnahme,
daß Polypropylen
verwendet wurde.
-
Die
mit C18-beladene EMPORE-Membran (C18 ist Siliziumdioxid, an das
Octadecylgruppen (C18H37) kovalent
gebunden sind) ist kommerziell von 3M Co. (St. Paul, MN) erhältlich.
-
Thermisch
induzierte Phasentrennungsmembranfilter (TIPS-Membranen) sind Polymermembranen mit
einer großen
Oberfläche
(bis zu 40 Quadratmetern pro Gramm) und Porengrößen im Mikrometer- bis Submikrometerbereich.
Die in diesen Experimenten verwendeten Membranen bestanden aus Polypropylen
(hergestellt nach Beispielen 1–4
des US-Patents Nr. 4,726,989) oder Polyethylen (hergestellt nach
Beispiel 8C des US-Patents Nr. 4,539,256).
-
Beispiel 1
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Vergleich der DNA-Anhaftungseigenschaften
für HAP
in einer herkömmlichen
Chromatographiesäule
und eingebracht in eine EMPORE-Membran
-
HAP
wurde in eine herkömmliche
Chromatographiesäule
wie folgt eingebracht: 100 mg HAP wurden in eine auf einer Vakuumverteilervorrichtung
aufgesetzte 2-mL-Standard-Chromatographiesäule (Bio-Rad
Co., Hercules, CA 94547, USA) gegeben. Diese wurde mit 3 mL 500
mM Phosphatpuffer und anschließend
mit 5 mL 50 mM Phosphatpuffer gewaschen. Danach wurde 1 mL 53-μg/mL DNA
in 50 mM Phosphatpuffer auf die Säule aufgetragen, die danach
mit 2 mL 50 mM Phosphatpuffer gewaschen und anschließend mit
1 mL 300 mM Phosphatpuffer eluiert wurde. Die Filtrate von jedem
Schritt wurden jeweils auf Absorption bei 260 nm (dem Absorptionsmaximum
für DNA) überprüft.
-
2
25-mm-Scheibchen der mit HAP beladenen EMPORE-Membran (die nur HAP-
und PTFE-Fibrillen enthielt) wurden in einen Spritzenfilterhalter
einsetzt und mit Hoch- und Niedrig-Phosphatpuffer (3 mL 500 mM Phosphatpuffer
und danach 5 mL 50 mM Phosphatpuffer) gewaschen. Danach wurden 2
mL 22 μg/mL
DNA in 50 mM Phosphat auf die Scheibchen aufgetragen, die danach
mit 2 mL 50 mM Phosphat und anschließend mit 2 mL 300 mM Phosphat
und dann mit 2 mL 50 mM Phosphat und 2 mL 1,0 M Phosphatpuffer gewaschen wurden.
Die DNA-Konzentration in den Filtraten wurde wiederum durch Überprüfen der
Absorption bei 260 nm bestimmt. Die als Absorption bei 260 nm angegebenen
Ergebnisse lauteten wie folgt:
-
-
-
Bei
niedriger Phosphatkonzentration (50 mM) haftete die DNA an das HAP
in der Säule
und wurde eluiert, wenn die Phosphatkonzentration auf 300 mM erhöht wurde.
Die Ergebnisse mit der mit HAP beladenen EMPORE-Membran waren jedoch
unerwartet. Zwar haftete die DNA unter Niedrig-Phosphat-Bedingungen, doch
ließ sie
sich bei den höheren
Phosphatkonzentrationen nicht eluieren. Nachfolgende Experimente
zeigten, daß DNA
an diese Membran haften würde,
selbst wenn sie in 400 mM Phosphat gelöst wurde. Weiterhin zeigten
Röntgenbeugungsstudien,
daß das
HAP beim Einbringen in die Membran nicht verändert wurde. Die DNA war bei
solchen hohen Phosphatkonzentrationen an die Polytetrafluorethylenfibrillen
der EMPORE-Membran und nicht an den HAP-Partikeln gebunden.
-
Beispiel 2
-
DNA-Anhaftung und -Elution
an einer mit HAP beladenen EMPORE-Membran
-
Ein
einzelnes 25-mm-Scheibchen einer mit HAP beladenen EMPORE-Membran
in einem Spritzenfilterhalter wurde mit 2 mL von etwa 35 μg/mL DNA
in 50 mM Phosphat mit 4 mg/mL PLURONIC F68 beladen. Das Scheibchen
wurde mit 2 mL 50 mM Phosphat mit 4 mg/mL PLURONIC F68 und anschließend mit
zwei 2-mL-Portionen 400 mM Phosphat mit 4 mg/mL PLURONIC F68 gewaschen.
Wie die Messung der Absorption der Filtrate bei 260 nm zeigte, haftete
die DNA vollständig
und wurde mit 50 mM Phosphat nicht eluiert, doch wurden mindestens
90% eluiert, wenn die Phosphatkonzentration auf 400 mM erhöht wurde.
-
In
einem weiteren Experiment wurde ein frisches 25-mm-Scheibchen mit 2
mL von etwa 35 μg/mL DNA
in 50 mM Phosphat beladen, einmal mit 2 mL einer 50 mM Phosphat-Waschlösung und
dreimal mit jeweils 2 mL einer 400 mM Phosphat-Waschlösung und
schließlich
zweimal mit jeweils 2 mL einer 400 mM Phosphat-Waschlösung mit
4 mg/mL PLURONIC F68 gewaschen. Wiederum wurde die DNA an die Membran
gebunden, jedoch nicht eluiert (selbst bei der höheren Phosphatkonzentration),
bis die Membran mit dem PLURONIC enthaltenden Hoch-Phosphatpuffer
behandelt wurde. Die als Absorption bei 260 nm angegebenen Ergebnisse
lauteten wie folgt:
-
-
Diese
Ergebnisse deuten an, daß in
Gegenwart von PLURONIC F68 sich die Membran wie HAP verhält; doch
bei dessen Abwesenheit kann die DNA nicht von der Membran eluiert
werden.
-
Beispiel 3
-
Anhaften von DNA unter
Verwendung von mit Polypropylen beladenen und mit C18 beladenen
EMPORE-Membranen
-
Eine
mit Polypropylen beladene (hergestellt aus gepulvertem Himont-Polypropylen,
Montell North America, Wilmington, DE, USA) sowie eine mit C18 beladene
EMPORE-Membran wurden in Experimenten auf ähnliche Weise wie die mit HAP
beladene Membran verwendet. Beide Membranen wurden vorbereitet,
indem sie mit 5 mL Methanol und anschließend mit 5 mL Wasser und dann
mit 5 mL 400 mM Phosphatpuffer gewaschen wurden. Bei der Challenge-Lösung handelte
es sich um ungefähr
60 μg/mL
Kalbsthymus-DNA in 400 mM Phosphatpuffer. Zwei Portionen dieser
Lösung
von jeweils 1 mL wurden auf die Membran aufgetragen, und anschließend wurde
viermal mit jeweils 1 mL 400 mM Phosphat-Waschlösung und dann viermal mit jeweils
1 mL Waschlösung
mit 50 mg/mL PLURONIC F68 in Wasser gewaschen. Die Filtrate wurden
bei 260 nm hinsichtlich der DNA-Konzentrationen überprüft. Die als UV-Absorption bei
260 nm angegebenen Ergebnisse lauteten wie folgt:
-
-
-
Diese
Ergebnisse zeigten, daß die
DNA sowohl an die Polypropylen- und an die C18-Empore-Membran anhaftet
und daß sie
mit dem PLURONIC F68 desorbiert werden konnte. Dabei wurden fast
90% von der Polypropylenmembran und etwa 75% von der C18-Membran
wiedergewonnen. Andere nichtionische Tenside, wie z.B. PLURONIC
L31, TWEEN 20, TERGITOL MN6 und NONIDET P40, verhielten sich alle ähnlich wie PLURONIC
F68, indem sie die Elution der Nukleinsäure unter diesen Bedingungen
erleichterten.
-
Beispiel 4
-
Unterschied zwischen dem
Anhaften von Einzelstrang- und Doppelstrang-DNA
-
Wird
Doppelstrang-DNA (dsDNA) gekocht, so wird sie zu Einzelstrang-DNA
(ssDNA) denaturiert. Beim Zurückbringen
auf etwa Raumtemperatur geht die DNA nur sehr langsam wieder in
dsDNA über.
Im folgenden Experiment wurde eine 50 μg/mL-Lösung von DNA in 10 mM Phosphatpuffer
zweigeteilt. Eine Hälfte wurde
zehn Minuten gekocht, auf Raumtemperatur abgekühlt und sofort danach getestet,
während
die andere Hälfte
direkt ohne Kochen getestet wurde. Scheibchen (Durchmesser 25 mm)
einer mit Polypropylen beladenen EMPORE-Membran (hergestellt aus
MICROPRO 600-Polypropylenpulver, Micro Powders, Inc., Tarrytown,
NY, USA) wurden einem Challenge mit diesen beiden Lösungen unterzogen,
und die Absorption des Filtrats bei 260 nm wurde gemessen, um zu
bestimmen, wie viel DNA haftete.
-
Die
Hälfte
der DNA-Lösung
wurde zehn Minuten gekocht und schnell unmittelbar vor Gebrauch
auf Raumtemperatur abgekühlt.
Die Absorption bei 260 nm betrug 1,014 vor dem Kochen und 1,26 unmittelbar nach
dem Kochen. Die gekochten (denaturierten) und nativen Lösungen wurden
für ein
Challenge der EMPORE-Membran verwendet, und die optische Dichte
des Filtrats wurde überprüft. Die
Membranen wurden konditioniert, indem sie mit Methanol und anschließend mit
Wasser und danach mit 10 mM Phosphatpuffer wie in Beispiel 3 beschrieben
gewaschen wurden. Die als Absorption bei 260 nm angegebenen Ergebnisse
lauteten wie folgt:
-
-
Wie
aus diesen Experimenten ersichtlich ist, wies die native DNA eine
wesentlich größere Affinität für die Membran
auf als die denaturierte (Einzelstrang-)DNA. Dieser Unterschied
in der Affinität
könnte
verwendet werden, um Einzelstrang- von Doppelstrang-DNA zu trennen.
-
Beispiel 5
-
Verwendung der EMPORE-Membran
und eines nichtionischen Tensids zur Reinigung von Plasmid-DNA
-
Das
folgende Experiment zeigt, daß Plasmid-DNA
an eine mit Polypropylen beladene EMPORE-Membran (hergestellt aus
MICROPRO 600-Polypropylenpulver, Micro Powders, Inc., Tarrytown,
NY, USA) anhaften und mit einem nichtionischen Tensid eluiert werden
kann. In einem Fall wird das eluierte Plasmid von Verunreinigungen
getrennt.
-
Ein
25-mm-Scheibchen der Membran wurde in einen Spritzenfilterhalter
gelegt und durch Waschen mit 5 mL Ethanol und anschließend mit
5 mL Wasser und danach mit dem Challenge-Puffer (10 oder 400 mm Phosphat
bei pH 6,8) geprimt. Drei mL der Plasmid-DNA-Lösung wurden mit Hilfe einer
Spritze durch die Membran geleitet und das Filtrat gesammelt. Drei
mL 0,5% PLURONIC F68 in 10 mM Phosphat (pH 6,8) wurden dann zur
Elution der Plasmid-DNA
verwendet. Die optischen Dichten bei 260 nm der Challenge-Ausgangslösung des
Filtrats und des Eluats wurden danach gemessen. Fünfzig μL von jeder
Lösung
wurden jeweils mit 5 mL Standard-Gelladefarbstoff gemischt. Danach
wurden fünf
mL dieser Lösung
mittels Agarose-Elektrophorese analysiert. Die als Absorption bei
260 nm angegebenen Ergebnisse lauteten wie folgt:
-
-
Elektrophoreseergebnisse:
bei 400 mM Phosphat-Challenge haftete die gesamte Challenge-Menge, wobei
im Filtrat nichts zu sehen war. Wurde die Membran mit dem PLURONIC-Tensid
eluiert, so wurde etwa die Hälfte
des Plasmids zurückgewonnen,
doch war die Reinheit der eluierten Plasmid-DNA etwa die gleiche wie
in der Challenge-Lösung.
Wurde das Challenge-Experiment in 10 mM Puffer durchgeführt, enthielt
das Eluat die niedermolekularen Banden, die das Plasmid kontaminierten.
Das Eluat enthielt das nun gereinigte Plasmid.
-
Beispiel 6
-
Anhaften von
DMA an eine Polypropylen-TIPS-Membran und Elution mit einem nichtionischen
Tensid
-
Drei
Kreise mit einem Durchmesser von 2,54 cm wurden aus einer Polypropylen-TIPS-Membran
(100 Mikrometer dick, Dichte = 0,153 Gramm/cm3)
ausgeschnitten, in einen Spritzenfilterhalter (MSI Inc., Westboro, MA
01581, USA) eingesetzt und mit 5 mL Methanol und anschließend mit
5 mL Wasser gewaschen. Drei mL einer 200 μg/mL Lösung von Kalbsthymus-DNA in
100 mM Natriumphosphatpuffer mit pH 7,2 wurde durch den Filterstapel
im Filterhalter geleitet, gefolgt von 3 mL 10 mg/mL nichtionisches
PLURONIC F68-Tensid im Phosphatpuffer. Die UV-Absorption bei 260
nm wurde verwendet, um die Menge an DNA in diesen Lösungen zu bestimmen,
und die Ergebnisse lauteten wie folgt:
-
-
-
Diese
Ergebnisse zeigen, daß die
DNA an die Polypropylen-TIPS-Membran bindet und mit einer Lösung des
PLURONIC F68 eluiert wird.
-
Beispiel 7
-
Anhaften von DMA an eine
Polyethylen-TIPS-Membran und Elution mit einem nichtionischen Tensid
-
Ein
einziger Kreis mit einem Durchmesser von 2,54 cm wurde aus einer
Polyethylen-TIPS-Membran (Dicke 120 Mikrometer, Dichte = 0,186 Gramm/cm3) ausgeschnitten und in den Spritzenfilterhalter
eingelegt. Die Membran wurde mit 5 mL Methanol und anschließend mit
5 mL Wasser gewaschen und einem Challenge mit 3 mL 17 Mikrogramm/mL
Kalbsthymus-DNA in einem 50 mM AMPSO-Puffer (3-[(1,1-Dimethyl-2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropansulfonsäure(#A7585,
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178, USA)-Puffer mit einem pH-Wert
von 9,0 und 100 mM Natriumchlorid unterzogen. Das Filter wurde dann
mit 3 mL 5 mg/mL PLURONIC F68 im gleichen Puffer eluiert. Die UV-Absorption
bei 260 nm wurde zur Bestimmung der Konzentration der DNA in diesen
Lösungen
verwendet.
-
-
Diese
Ergebnisse zeigen, daß das
Polyethylenfilter DNA binden würde
und daß es
mit PLURONIC F68 eluiert werden könnte.
-
Beispiel 8
-
Verwendung eines Nichtionischen
zur Verhinderung des Anhaftens von DNA an die Polypropylenmembran
-
In
diesem Experiment wurde die Polypropylen-TIPS-Membran mit einem nichtionischen Detergens und
anschließend
in einem zweiten Waschschritt unter Verwendung des gleichen Puffers,
in dem das Nichtionische gelöst
war, gewaschen. Die erhaltene Behandlung blockierte auf wirksame
Weise die Nukleinsäure,
so daß diese
nicht an die Oberfläche
haftete. Eine kreisförmige
Polypropylen-TIPS-Membran mit einem Durchmesser von 2,54 cm wurde
in den Filterhalter eingelegt und mit 5 mL Methanol sowie anschließend mit
5 mL Wasser, 5 mL 10 mg/mL PLURONIC F68 in 20 mM AMPSO, 100 mM Natriumchloridpuffer
mit pH 9,0 und schließlich
5 mL AMPSO, Natriumchloridpuffer gewaschen. Sie wurde dann einem
Challenge mit zwei jeweils 3 mL großen Proben von 15 μg/mL Kalbsthymus-DNA
in dem AMPSO, Natriumchloridpuffer unterzogen. Die UV-Absorption
bei 260 nm wurde zur Bestimmung der DNA-Konzentrationen verwendet.
-
-
Die
erste durch das Filter passierende Probe wies eine niedrigere Absorption
als die Challenge-Lösung
aufgrund einer gewissen Verdünnung
durch die restliche Waschlösung
im Filterhalter auf. Die zweite Probe wies fast soviel DNA auf wie
die Challenge-Lösung.
Dieses Experiment wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt,
außer
daß es
sich bei dem Puffer um einen 20 mM MES-Puffer (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure) (#M5287,
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178, USA) mit einem pH-Wert
von 6,0 handelte. Die Ergebnisse waren im wesentlichen die gleichen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß ein
nichtionisches Detergens, wie z.B. PLURONIC F68, eine Polymeroberfläche passivieren
kann, so daß Nukleinsäure nicht
daran bindet. Diese Passivierung dauert an, selbst nachdem die Polymeroberfläche mit
Puffer, bei dem es sich um das Lösungsmittel
für das
nichtionische Tensid handelte, gewaschen wurde.
-
Beispiel 9
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Anhaften von RNA an eine
TIPS-Membran
-
Drei
Polypropylen-TIPS-Membranen mit jeweils einem Durchmesser von einem
Inch wurden in einem Filterhalter gestapelt und mit 5 mL Methanol
sowie anschließend
5 mL destilliertem Wasser und danach mit 5 mL 50 mM MES-Puffer mit pH 6,0
gewaschen. Zwei mL 50 μM/mL
Ribonukleinsäure
(Sigma) im gleichen MES-Puffer wurden durch den Filterstapel geleitet.
Der Stapel wurde dann mit 2 mL des MES-Puffers gewaschen und danach
mit 2 mL 0,5% PLURONIC F68 im MES-Puffer eluiert. Die RNA-Menge
in jeder dieser Stufen wurde jeweils durch UV-Absorption bei 260 nm überprüft.
-
-
Die
RNA haftete vollständig
an die TIPS-Membran und war resistent gegenüber der Desorption durch den
Puffer alleine, wurde jedoch zu mehr als der Hälfte mit dem nichtionischen
PLURONIC F68-Tensid eluiert.
-
Beispiel 10
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Anhaftung und Elution
eines kleinen DNA-Oligomers
-
Im
folgenden Experiment wurde die hydrophobe Polypropylen-TIPS-Membran
einem Challenge mit einem sehr kleinen DNA-Oligomer unterzogen und
danach gewaschen und mit dem nichtionischen Tensid eluiert. Bei
dem DNA-Oligomer handelte es sich um ein 22-mer aus Einzelstrang-DNA
mit einer Schmelztemperatur von 65,8°C, das von Genosys Biotechnologies
Inc., Woodlands, TX. 77380, USA bezogen wurde und mit Oligo22 bezeichnet
wird. Drei Polypropylen-TIPS-Membranen mit einem Durchmesser von
jeweils 25 mm wurden in einem Spritzenfilterhalter gestapelt und
mit 5 mL Methanol und anschließend
mit 5 mL Wasser und 5 mL 50 mM MES-Puffer mit pH 6,0 gewaschen. Der Filterstapel
wurde dann einem Challenge mit 2 mL einer 38 Mikrogramm/mL-Lösung Oligo22 im MES-Puffer
unterzogen. Das Filtrat wurde gesammelt und der Stapel mit 2 mL
des MES-Puffers und anschließend
mit 2 mL nichtionischem PLURONIC F68-Tensid im MES-Puffer gewaschen. Die
Oligo22-Konzentrationen
im Challenge-Filtrat und den Waschlösungen wurden durch UV-Absorption
bei 260 nm überprüft.
-
-
Die
Ergebnisse zeigen, daß das
kleine Oligomer in wirksamer Weise an die Polypropylen-TIPS-Membran
haftete und mit dem nichtionischen Tensid eluiert wurde.
-
Beispiel 11
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Bindung von RNA an eine
Polypropylen-TIPS-Membran und Elution mit nichtionischem Tensid
TWEEN 60
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Drei
Polypropylen-TIPS-Membranen mit einem Durchmesser von jeweils einem
Inch wurden in einem Filterhalter gestapelt und mit 5 mL Methanol
sowie anschließend
mit 5 mL destilliertem Wasser und danach mit 5 mL 50 mM MES-Puffer
mit pH 6,0 gewaschen. Danach wurden 2 mL 50 μM/mL Ribonukleinsäure (Sigma, #R7125)
im gleichen MES-Puffer
durch den Filterstapel geleitet. Der Stapel wurde dann mit 2 mL
des MES-Puffers gewaschen und danach mit 2 mL Polyoxyethylensorbitan-monostearat
(Tween 60, #P1629, Sigma Chemical Co., St. Louis MO 63178, USA)
im MES-Puffer eluiert. Die RNA-Menge in jeder dieser Stufen wurde
jeweils durch UV-Absorption bei 260 nm überprüft. Die Ergebnisse lauteten
wie folgt:
-
-
Die
RNA absorbierte vollständig
an die TIPS-Membran und war resistent gegenüber Desorption durch den Puffer
alleine, doch wurde zu mehr als die Hälfte mit dem nichtionischen
Polyoxyethylensorbitan-monostearat-Tensid eluiert.
-
Vergleichsbeispiel 1
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Anhaftung und Elution
von RNA von einer hydrophilen Membran
-
Das
folgende Experiment zeigt, daß hydrophile
Membranen Nukleinsäuren
nicht binden und somit nicht für
diese Nukleinsäureextraktionstechnik
verwendet werden können.
-
Drei
25-mm-MSI-Celluloseacetat-Membranen (MSI, Westboro, MA 01581, USA)
wurden in einen Spritzenfilterhalter eingelegt und mit 5 mL Wasser
und anschließend
mit 5 mL 50 mM AMPSO-Puffer mit pH 9,0 gewaschen. Der Filterstapel
wurde dann einem Challenge mit 2 mL 50 μg/mL RNA (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO 63178, USA) unterzogen und danach mit 2 mL des AMPSO-Puffers
sowie anschließend
mit 2 mL 0,5% PLURONIC F68 im AMPSO-Puffer gewaschen. Die RNA-Menge
in jedem dieser Eluate wurde durch UV-Absorption bei 260 nm überprüft. Dieses
Experiment wurde unter Verwendung von 50 mM MES-Puffer mit pH 6,0
sowie beiden pH-Werten mit einem Cellulosefilter (Osmonics Inc.)
wiederholt.
-
Von
den 100 μg
Challenge-RNA befanden sich 73 μg
im Filtrat und der Rest (27 μg)
in der ersten Puffer-Waschlösung. In
der PLURONIC F68-Waschlösung
wurde keine RNA gefunden. Ähnliche
Ergebnisse wurden bei pH 9,0 sowie mit dem Cellulosefilter erhalten.
Diese Ergebnisse zeigen, daß Nukleinsäuren nicht
an diese hydrophilen Membranen adsorbieren.
