DE19907023A1

DE19907023A1 - Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren

Info

Publication number: DE19907023A1
Application number: DE19907023A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Podszun; Rainer Neumann
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1999-02-19
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2000-08-24
Also published as: WO2000049031A3; WO2000049031A2; EP1155026A2; JP2002537306A; AU2547100A; CA2362979A1

Abstract

Nucleinsäuren können bei neutralem und saurem pH-Wert an speziellen wasserunlöslichen Perlpolymerisaten mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 mum effizient adsorbiert werden und bei basischen pH-Werten in hoher Ausbeute wieder freigesetzt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen und selektiven Freisetzen von Nucleinsäuren unter Verwendung spezieller Perlpolymerisate.

In jüngster Zeit gewinnt die sogenannte Gen-Diagnostik zunehmend an Bedeutung. Die Gen-Diagnostik hat Eingang gefunden in die Diagnostik humaner Erkrankungen (u. a. Nachweis von Infektionserregern, Nachweis von Mutationen des Genoms, Entdeckung von zirkulierenden Tumorzellen und Identifizierung von Risikofaktoren für die Prädisposition einer Erkrankung). Aber auch in der Veterinärmedizin, der Umweltanalytik und Nahrungsmitteltestung findet die Gen-Diagnostik mittlerweile ihre Anwendung. Ein weiteres Anwendungsgebiet stellen Untersuchungen an Pathologischen-/Zytologischen Instituten oder im Rahmen forensischer Frage stellungen dar. Aber auch im Rahmen der Qualtitätskontrolle (beispielsweise Untersuchungen von Blutproben auf Infektionserreger-Freiheit) wird die Gen- Diagnostik mittlerweile eingesetzt und der Gesetzgeber plant, solche Testungen per Gesetz in Zukunft anzuordnen.

Methoden, die auch bei der Gen-Diagnostik zum Einsatz kommen (wie z. B. Hybridisierungs- oder Amplifikationstechniken wie die PCR, bDNA oder NASBA Technologie) gehören auch bei wissenschaftlichen Grundlagenarbeiten zu den Routineverfahren.

Durch die zunehmende Verbreitung nicht-radioaktiver Detektionsverfahren, die auch im Rahmen der Gen-Diagnostik eine Rolle spielen, ist zu erwarten, daß die Gen- Diagnostik in Zukunft noch weitere Verbreitung als zur Zeit finden wird.

Bei der Gen-Diagnostik ist die Gewinnung von Gen-Proben aus biologischem Material wie Zellen, Blut, Serum oder Urin ein wichtiger Teilschritt.

Die Bindung von Nucleinsäuren an polyquarternäre kationische Polymere ist aus der US 4046750 bekannt. Allerdings ist die Bindung irreversiebel, so daß bei dieser Methode die adsorbierten Nucleinsäuren nicht wieder freigesetzt werden können.

Die US 4055469 offenbart eine Methode zur Reinigung von Enzymen, wobei Nucleinsäuren und unerwünschte Proteine mit Hilfe wasserlöslicher kationischer Polymere ausgefällt werden.

Aus der US 4839231 sind mit Vinylpyridinpolymer beschichtete Träger bekannt, die Proteine und Nucleinsäuren adsorbieren können. Allerdings ist die Kapazität der Träger recht niedrig und die Adsorption der Nucleinsäuren nicht quantitativ.

Die WO 9105606 beschreibt ein silanisiertes, poröses Trägermaterial mit Hydroxy alkylaminogruppen für die chromatographische Trennung von Nucleinsäuren. Dieses Material ist jedoch zum schnellen und möglichst quantitativen Abtrennen von Nucleinsäuren aus biologischem Material weniger gut geeignet.

In der DE 41 39 664 wird eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren mit Hilfe von Anionenaustauschern beschrieben. Nachteilig bei diesem Verfahren ist, daß die Desorption der Nucleinsäuren vom Anionenaustauscher nur mit Pufferlösungen hoher Ionenstärke gelingt und die Abtrennung der Salze aus der Pufferlösung zusätzliche Präparationsschritte erfordert.

Die DE 43 33 805 beansprucht die Extraktion von Nucleinsäuren aus einer Probe mit Hilfe von wasserlöslichen Trägern wie Dextran, Acrylamid oder Carboxymethyl cellulose und weiteren Reagenzien, wobei die Nucleinsäuren ausgefällt werden.

In der EP 0 707 077 (entspricht der US 5582988) wird eine Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren aus biologischem Material unter Verwendung von löslichem, schwach basischem Polymer beschrieben. Bei dieser Methode wird in einem sauren pH-Bereich ein Fällungsprodukt aus dem löslichen, schwach basischen Polymer und der Nucleinsäure erzeugt, das Fällungsprodukt von den nicht gefällten Bestandteilen des biologischen Materials abgetrennt und gewaschen und die Nucleinsäure aus dem Fällungsprodukt durch Einstellung eines basischen pH-Wertes wieder freigesetzt.

Ein Nachteil der Methoden nach DE 43 33 805 und EP 0707 077 besteht darin, daß die Handhabung, insbesondere die Abtrennung und Reinigung des Fällungsproduktes schwierig und sehr zeitaufwendig ist. Diese Methoden lassen sich auch nicht bzw. nur unter erschwerten Bedingungen mit Hilfe automatisierter Analysegeräte aus führen.

Die WO 9618731 beschreibt eine Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren mit Hilfe eines Detergenz und eines festen Trägers. Da feste Träger ohne Poren und ohne Quellbarkeit eingesetzt werden, ist die Bindungskapazität der Träger relativ gering.

In der WO 9708547 wird eine Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren be schrieben, bei der die Nucleinsäuren an einem festen hydrophilen organischen Polymer ohne effektive positive Ladung, beispielsweise an Cellulose, gebunden werden. Bei dieser Methode erfolgt die Bindung über schwache Kräfte, wie Van der Waals Wechselwirkungen.

Die WO 9734909 beschreibt eine Methode zur Isolierung von Nucleinsäuren unter Verwendung eines speziellen teilchenförmigen Polymerisates mit einer unteren kritischen Löslichkeitstemperatur (lower critical solubility temperature, LCST) von 25-45°C. Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, daß zur Freisetzung der Nucleinsäuren Puffer mit hohen Ionenstärken, die bei der weiteren Verwendung der Nucleinsäuren stören können, angewendet werden müssen. Wegen der geringen Größe der verwendeten Partikel von 0,05 bis 2 µm ist zudem die Verarbeitung zeitaufwendig und schwierig zu automatisieren.

Trotz der zahlreichen vorbeschriebenen Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren besteht noch immer ein dringender Bedarf für eine einfache, möglichst automatisier bare Methode zur effektiven Abtrennung und Wiederfreisetzung von Nucleinsäuren aus biologischem Material.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß bestimmte in Wasser unlösliche Perlpolymerisate polymerisierter Einheiten von Aminomonomer, Vernetzer und Vinylmonomer in hervorragender Weise zur Isolierung von Nucleinsäuren geeignet sind.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, umfassend die nachfolgenden Schritte

A) Vermischen der Probe mit einem wasserunlöslichen, im basischen und neutralen Bereich nicht ionischen Polymerisat bei einem pH-Wert von 7 oder weniger, wobei die Nucleinsäuren adsorbiert werden,
B) Abtrennen des wasserunlöslichen Polymerisates und
C) Vermischen des wasserunlöslichen Polymerisates mit einer wäßrigen Phase mit einem pH-Wert von größer 7, wobei die adsorbierten Nucleinsäuren freigesetzt werden,

dadurch gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche Polymerisat ein Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm ist und aus polymerisierten Einheiten von

A) 5 bis 98 Gew.-% Aminomonomer
B) 0,3 bis 30 Gew.-% Vernetzer und
C) 0 bis 93 Gew.-% Vinylmonomer

besteht.

Bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, umfassend die Schritte

dadurch gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche Polymerisat ein Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm und einer spezifischen Ober fläche gemessen nach BET von 5 bis 500 m²

/g ist und aus polymerisierten Einheiten von

A) 5 bis 98 Gew.-% Aminomonomer
B) 0,3 bis 30 Gew.-% Vernetzer und
C) 0 bis 93 Gew.-% hydrophobem Vinylmonomer

besteht, oder daß das wasserunlösliche Polymerisat aus
in Wasser gut quellbarem Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm, das aus polymerisierten Einheiten von

A) 5 bis 79,7 Gew.-% Aminomonomer
B) 0,3 bis 10 Gew.-% Vernetzer und
C) 10 bis 93 Gew.-% hydrophilem Vinylmonomer

besteht.

Insbesondere bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, umfassend die oben definierten Schritte A), B) und C), dadurch gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche Polymerisat ein makroporöses Perlpolymerisat mit einer Teilchengröße von 3 bis 100 µm ist, einen Porendurchmesser im Bereich von 10 bis 1 000 nm aufweist, die spezifische Oberfläche bestimmt nach BET 5 bis 500 m²/g (ganz besonders bevorzugt 20 bis 200 m²/g) aufweist und aus polymerisierten Einheiten von

a) 5 bis 98 Gew.-% Aminomonomer
b) 2 bis 30 Gew.-% Vernetzer
c) 0 bis 93 Gew.-% hydrophobem Vinylmonomer

besteht, daß das wasserunlösliche Polymerisat aus in Wasser gut quellbarem Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm, das aus polymerisierten Einheiten aus

besteht.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Isolierung und Reinigung von Nuclein säuren unterschiedlicher Herkunft, beispielsweise aus Zellen, Gewebematerialien, Blut oder Infektionserregern geeignet. Vor der Isolierung der Nucleinsäuren wird das zu untersuchende Material durch an sich bekannte Techniken, wie z. B. Aufschluß durch Proteaseverdau aufgeschlossen, wobei eine für die weiteren Schritte A bis C geeignete Probe, ein Lysat, erhalten wird. Weitere geeignete Aufschlußverfahren sind in DE 43 33 805 beschrieben worden.

Es erfolgt das Vermischen der Probe mit einem wasserunlöslichen Polymerisat bei einem pH-Wert von 7 oder weniger, vorzugsweise im Bereich von 2-6, besonders bevorzugt im Bereich von 2-3 bei Raumtemperatur. Das Abtrennen des wasser unlöslichen Polymerisates erfolgt durch z. B. Filtration oder Zentrifugation. Der so gewonnene Komplex aus Nucleinsäure und Polymerisat kann nun durch Waschen mit geeigneten Puffern wie z. B. TE gereinigt werden.

Zur Freisetzung der gebundenen Nucleinsäuren aus dem Komplex erfolgt nun die pH-Einstellung des Komplexes auf pH-Werte oberhalb von 7, vorzugsweise von 8-14, besonders bevorzugt im Bereich 12-14.

Die erfindungsgemäßen Perlpolymerisate liefern höhere Adsorptions- und Wieder freisetzungsraten als die löslichen Polymerisate gemäß EP 707 077. Die Isolierung läßt sich leichter, d. h. mit weniger Arbeitsschritten und in kürzeren Zeiten durch führen. Die Reinheit der isolierten Nucleinsäuren ist höher, insbesondere erhalten sie weniger inhibierende Nebenprodukte, so daß eine Verstärkung der Nucleinsäuren, beispielsweise duch die sogenannte "PCR-Reaktion" und die "RT-PCR" besonders gut gelingt. Auch in Bezug auf Verdau der gewonnenen Nucleinsäuren mittels Restriktionsenzymen ist das erfindungsgemäße Verfahren der in der EP 707 077 beschriebenen Methode überlegen.

Weiterhin Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die makroporösen Perlpoly merisate, dadurch gekennzeichnet, daß diese eine mittlere Teilchengröße von 3 bis 100 µm, einen Porendurchmesser von 10 bis 1000 nm und eine spezifische Ober fläche gemessen nach BET von 5 bis 500 m²/g aufweisen und aus polymerisierten Einheiten von

a) 5 bis 98 Gew.-% Aminomonomer
b) 2 bis 30 Gew.-% Vernetzer und
c) 0 bis 93 Gew.-% hydrophobem Vinylmonomer

bestehen, sowie
die in Wasser unlöslichen aber quellbaren Perlpolymerisate, dadurch gekennzeichnet, daß diese eine mittlere Teilchengröße von 3 bis 100 µm aufweisen und aus polymerisierten Einheiten von

bestehen.

Weiterhin Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher, makroporöser Perlpolymerisate mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm, einem Porendurchmesser von 10 bis 1000 nm und einer spezifi schen Oberfläche gemessen nach BET von 5 bis 500 m²/g dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mischung von

a) 5 bis 98 Gew.-Teilen Aminomonomer
b) 2 bis 30 Gew.-Teilen Vernetzer
c) 0 bis 93 Gew.-Teilen hydrophobem Vinylmonomer
d) 10-150 Gew.-Teilen Porogen und
e) 0,1-2,5 Gew.-Teilen Radikalbildner

in einem wäßrigem Medium unter Verwendung eines Schutzkolloides dispergiert, anschließend die erhaltene Dispersion durch Erhitzen auf die Zerfallstemperatur des Radikalbildners polymerisiert und nach erfolgter Polymerisation das Porogen durch Extraktion und/oder Abdampfen entfernt,
sowie ein Verfahren zur Herstellung von in Wasser unlöslichen aber quellbaren Perlpolymerisaten mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mischung von

a) 5 bis 79,7 Gew.-% Aminomonomer
b) 0,3 bis 10 Gew.-% Vernetzer und
c) 10 bis 93 Gew.-% hydrophilem Vinylmonomer
d) 10-I50 Gew.-Teilen Lösungsmittel und
e) 0,1-2,5 Gew.-Teilen Radikalbildner

in einem wäßrigem Medium unter Verwendung eines Schutzkolloides dispergiert, anschließend die erhaltene Dispersion durch Erhitzen auf die Zerfallstemperatur des Radikalbildners polymerisiert und nach erfolgter Polymerisation das Lösungsmittel durch Extraktion und/oder Abdampfen entfernt.

Aminomonomere (a) im Sinne der Erfindung sind polymerisierbare, ethylenisch ungesättigte Verbindungen mit mindestens einer primären, sekundären oder tertiären Aminogruppe. Die sekundäre oder tertiäre Aminogruppe kann dabei auch Teil eines cycloaliphatischen oder aromatischen Ringes sein. Beispielhaft seien genannt N- Vinylimidazol, N-Vinylbenzimidazol, 2-Vinylpyridin und 4-Vinylpyridin. Gut geeig nete Aminomonomere sind auch die Derivate der Acrylsäure und Methacrylsäure, wie beispielsweise 2-Aminoethylmethacrylat, N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat, N,N-Dimethylaminopropylmethacrylat, N,N-Dimethylaminoethylacrylat, N-tert.- Butylaminopropylmethacrylat, N-(3-Aminopropyl)methacrylamid, N-(3-Imidazoyl propyl)methacrylamid, N-(2-Imidazoylethyl)methacrylamid, N-(3-Aminopropyl)- acrylamid, N-(3-Imidazoylpropyl)acrylamid, N-(2-Imidazoylethyl)acrylamid, N-(1,1- Dimethyl-3-imidazoylpropyl)methacrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-imidazoylpropyl)- acrylamid, N-(3-Benzimidazoylpropyl)methacrylamid und (3-Benzimidazoylpropyl)- acrylamid.

Gut geeignete Aminomonomere sind auch die Umsetzungsprodukte von Isocyanato ethyl(meth)acrylat und Imidazoylalkylaminen, wie beispielsweise das im Rahmen der vorliegenden Erfindung neue Aminomonomer gemäß Formel (I)

Weitere geeignete Aminomonomere gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Pyridinderivate der Formeln (II) und (III)

Auch Derivate von Styrol und α-Methylstyrol mit Aminogruppen sind gut geeignet. Beispielhaft seien genannt: 4-N,N-Dimethylaminostyrol, 2-N,N-Dimethylamino styrol, 4-N,N-Diethylaminostyrol und 4-N,N-Bis(2-hydroethyl)aminostyrol.

Gemäß der vorliegenden Erfindung geeignete Vernetzer (b) sind: Ethylenglycoldi methacrylat, Butandioldimethacrylat, Hexandioldimethacrylat, Pentaerytritoldimeth acrylat, 1,2-Glycerindimethacrylat, 1,3-Glycerindimethacrylat, Triethylenglycoldi methacrylat, Tetraetylenglycoldimethacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat, Pen taerytritoltrimethacrylat, Pentaerytritoltetramethacrylat, Ethylenglycoldiacrylat, Butandioldiacrylat, Pentaerytritoldiacrylat, 1,3-Glycerindiacrylat, Triethylenglycol diacrylat, Trimethylolpropantriacrylat, Pentaerytritoltriacrylat, Pentaerytritoltetra acrylat, Allylmethacrylat, Allylacrylat, Methylen-N,N'-bisacrylamid, p-Divinyl benzol und m-Divinylbenzol.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete hydrophobe Vinylmonomere (c1), die in dem erfindungsgemäßen Perlpolymerisat enthalten sein können, sind Acryl säure-C₁-C₈-alkylester, Methacrylsäure-C₁-C₈-alkylester, wie beispielsweise Methylmethacrylat oder Butylacrylat, Acrylnitril, Methacrylnitril, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Vinylacetat und aromatische Vinylmonomere, wie z. B. Styrol, Vinylnaphthalin, Vinyltoluol, Ethylstyrol, α-Methylstyrol, Chlorstyrole und Vinyl benzylchlorid.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete hydrophile Vinylmonomere (c2) sind beispielsweise: 2-Hydroxyethylmethacrylat, 2-Hydroxypropylmethacrylat, 2- Hydroxyethylacrylat, 2-Hydroxypropylacrylat, Triethylenglycolmonomethacrylat, Tetraethylenglycolmonomethacrylat, Acrylamid, Methacrylamid und N,N-Dimethyl acrylamid.

Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen makro porösen Perlpolymerisaten werden Porogene eingesetzt. Hierfür sind flüssige mit Wasser nicht mischbare Verbindungen, die die eingesetzten Monomere lösen und das gebildete Polymer ausfällen, geeignet. Beispielhaft seien genannt aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Hexan, Heptan, Octan, Isooctan, Isododekan und Alkohole wie Octanol. Das Porogen wird in Mengen von 10 bis 150 Gew.-%, vorzugsweise von 20 bis 100 Gew.-% bezogen auf die Summe der eingesetzten Monomere und Vernetzer eingesetzt.

Geeignete Radikalbildner im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise öllösliche Initiatoren. Beispielhaft seien genannt: Peroxyverbindungen wie Diben zoylperoxid, Dilaurylperoxid, Bis(p-chlorbenzoylperoxid), Dicyclohexylperoxy dicarbonat, tert.-Butylperoctoat, 2,5-Bis(2-ethylhexanoylperoxy)-2,5-dimethylhexan und tert.-Amylperoxy-2-etylhexan, desweiteren Azoverbindungen wie 2,2'-Azo bis(isobutyronitril), 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvalereonitril) und 2,2'-Azobis(2- methylisobutyronitril). Die Initiatoren werden im allgemeinen in Mengen von 0,05 bis 2,5 Gew.-%, vorzugsweise 0,2 bis 1,5 Gew.-% bezogen auf die Monomer mischung angewendet.

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen gelförmigen und makroporösen Perl polymerisate werden Schutzkolloide in der wäßrigen Phase eingesetzt. Geeignete Schutzkolloide gemäß der vorliegenden Erfindung sind natürliche und synthetische wasserlösliche Polymere, wie beispielsweise Gelatine, Stärke, Cellulosederivate, insbesondere Celluloseester und Celluloseether, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrro lidon, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure und Copolymerisate aus Acrylsäure, Methacrylsäure, Methacrylsäureestern und/oder Acrylsäureestern. Besonders gut geeignet sind mit Alkalihydroxid neutralisierte Copolymerisate aus Methacrylsäure und Methacrylsäureester. Die Einsatzmenge der Schutzkolloide beträgt im allge meinen 0.05 bis 2% bezogen auf die wäßrige Phase, vorzugsweise 0.1 bis 1%.

Die wäßrige Phase kann darüberhinaus ein Puffersystem enthalten. Bevorzugt werden Puffersysteme, die den pH-Wert der wäßrigen Phase bei Beginn der Polymerisation auf einen Wert zwischen 12 und 5, vorzugsweise zwischen 10 und 6 einstellen. Unter diesen Bedingungen liegen Dispergiermittel mit Carbonsäure gruppen ganz oder teilweise als Salze vor. Auf diese Weise wird die Wirkung der Schutzkolloide günstig beeinflußt. Besonders gut geeignete Puffersysteme enthalten Phosphat- oder Boratsalze.

Die Menge an Wasserphase beträgt im allgemeinen 75 bis 1200 Gew.-%, vor zugsweise 100 bis 500 Gew.-% bezogen auf die Summe aus Monomeren, Vernetzer und Porogen.

Die Rührgeschwindigkeit bei der Polymerisation ist wichtig für die Einstellung der Teilchengröße. Beim erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren nimmt die Größe der erhaltenen Perlpolymerisate mit zunehmender Rührerdrehzahl ab. Die exakte Rührdrehzahl zur Einstellung einer bestimmten vorgegebenen Perlgröße hängt im Einzelfall stark von der Reaktorgröße, der Reaktorgeometrie und der Rührer geometrie ab. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die notwendige Rührdrehzahl experimentell zu ermitteln. Für Laborreaktoren mit 3-Liter-Reaktionsvolumen, die mit Blattrühren ausgestattet sind, werden bei Verwendung von Copolymerisaten aus Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylsäureestern und/oder Methacrylsäureestern als Dispergiermittel im allgemeinen Perlgrößen von 6 bis 30 µm bei Drehzahlen von 300 bis 500 Upm erreicht.

Die Polymerisationstemperatur des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens richtet sich nach der Zerfallstemperatur des eingesetzten Initiators. Sie liegt im allge meinen zwischen 50 bis 150°C, vorzugsweise zwischen 55 und 100°C. Die Poly merisation dauert 0.5 bis einige Stunden. Es hat sich bewährt, ein Temperaturpro gramm anzuwenden, bei dem die Polymerisation bei niedriger Temperatur, beispielsweise 70°C begonnen wird und mit fortschreitendem Polymerisationsumsatz die Reaktionstemperatur erhöht wird.

Nach der Polymerisation kann das Polymerisat mit üblichen Methoden, beispielsweise durch Filtrieren oder Dekantieren, isoliert und gegebenenfalls nach ein oder mehreren Wäschen getrocknet werden. Das Porogen kann während der Trocknung entfernt werden. Bei niedrig siedenden Porogenen, wie beispielsweise Hexan ist es auch möglich, das Porogen aus dem wäßrigen Reaktionsgemisch vor dem Isolieren des Perlpolymerisates ganz oder teilweise durch Destillation abzu trennen.

Die Herstellung der in Wasser quellbaren Perlpolymerisate erfolgt analog der Herstellung der makroporösen, wobei anstelle der hydrophoben Vinylmonomere (c1) hydrophile Vinylmonomere (c2) und anstelle des Porogens ein Lösungsmittel eingesetzt wird.

Geeignete Lösungsmittel sind solche, die mit Wasser nicht mischbar sind, die Monomeren und den Vernetzer lösen und das gebildete Polymerisat nicht ausfällen sondern lösen bzw. quellen. Geeignete Lösemittel sind Toluol, Xylol, Tetrachlor methan, Chloroform, Methylenchlorid, Dichlorethan und. Ethylacetat. Die Menge an Hilfslösemittel beträgt im allgemeinen 10 bis 200 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 150 Gew.-%, besonders bevorzugt 20 bis 100 Gew.-% bezogen auf die Summe aus Monomeren und Vernetzer. Sofern gewünscht kann das Hilfslösemittel nach der Polymerisation beispielsweise durch Destillation abgetrennt werden. Toluol läßt sich besonders einfach durch azeotrope Destillation entfernen.

Die erfindungsgemäßen in Wasser quellbaren Perlpolymerisate haben Quellungs indices von 1,2 bis 12, vorzugsweise 1,5 bis 8 gemessen bei 25°C und pH 7. Als Quellungsindex ist der Quotient aus dem Volumen des bis zur Sättigung in Wasser gequollenen Perlpolymerisates und dem Volumen des wasserfreien Perlpolymerisates definiert.

Weiterhin Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind Mittel zur Isolierung von Nucleinsäuren enthaltend wasserunlösliche makroporöse Perlpolymerisate mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm, einen Porendurchmesser von 10 bis 1000 nm und einer spezifischen Oberfläche gemessen nach BET von 5 bis 500 m²/g, bestehend aus polymerisierten Einheiten von

oder von in Wasser unlöslichen aber quellbaren Perlpolymerisaten mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm, bestehend aus polymerisierten Einheiten von

a) 5 bis 79,7 Gew.-% Aminomonomer
b) 0,3 bis 10 Gew.-% Vernetzer und
c) 10 bis 93 Gew.-% hydrophilem Vinylmonomer.

Diese Mittel liegen vorzugsweise als wässrige Dispersionen mit einem Feststoff gehalt von 0,1-50%, besonders bevorzugt 1-10% vor. Die wässrige Phase kann Puffer enthalten, die vorzugsweise im Bereich von 2-6 wirksam sind.

Mögliche Einsatzgebiete eines beispielsweise als Testkit formulierten Mittels sind die oben bereits genannten Anwendungsbeispiele, beispielsweise bei der Isolierung von Nucleinsäuren aus Zellen, Gewebematerialien, Blut oder Infektionserregern, wobei besonders alle Fragen der Diagnostik eine Rolle spielen. Als Testkit werden auch die beschriebenen Polymerisate für Routine-Nucleinsäuretests in Mikrotiter platten und/oder Teströhrchen verstanden oder anderen Formaten wie z. B. im Rahmen der Chiptechnologie.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung des Aminomonomers der Formel 1

Zu einer gerührten Lösung aus 50,07 g (0,4 Mol) 3-Aminopropylimidazol, 140 mg 2,6-Di-tert.butyl-4-methylphenol (Stabilisator), 140 mg Dibutylzinndilaurat (Kataly sator) in 250 ml Chloroform wurden bei 20°C unter Kühlung 62,08 g (0,4 Mol) 2- Isocyanatoethylmethacrylat innerhalb von 60 Min zugetropft. Anschließend wurde der Ansatz solange auf 50°C erhitzt (ca. 5 h) bis im IR-Spektrum keine NCO-Bande nachweisbar war. Man erhielt 112 g Aminomonomer der Formel (I).

Beispiel 2 Herstellung eines gelförmigen Perlpolymerisates

In einem 250 ml-Reaktionsgefäß mit Blattrührer, Rückflußkühler, Thermometer, Gaseinlaß- und Gasauslaßrohr wurde eine Lösung aus 5 g Polyvinylalkohol (Mowiol® 40-88) und 1,5 g Dinatriumhydrogensulfat in 130 ml entionisiertem Wasser vorgelegt. Zu dieser wäßrigen Lösung wurde bei 20°C unter Rühren mit 450 Upm eine organische Lösung aus 7,91 g N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat, 7 g 2-Hydroxyethylmethacrylat, 0,17 g Triethylenglycoldimethacrylat, 0,225 g 2,2'- Azobis(2,4-dimethylvalereonitril) und 37,5 g Chloroform innerhalb von 15 min zugegeben. Es wurde leicht mit Stickstoff gespült und die Temperatur auf 67°C erhöht und 20 Stunden bei dieser Temperatur belassen. Nach dem Abkühlen wurde das gebildete Perlpolymerisat durch Dekantieren von der Reaktionsflotte abgetrennt und im Vakuum bei 50°C von Chloroform befreit. Man erhielt 13,5 g Perlpoly merisat mit einer mittleren Teilchengröße von 20 µm und einem Quellungsindex von 5,1 gemessen bei 25°C in Wasser.

Beispiel 3 Herstellung eines makroporösen Perlpolymerisates

In einem 2 Liter-Reaktionsgefäß mit Blattrührer, Rückflußkühler, Thermometer, Gaseinlaß- und Gasauslaßrohr wurde eine Lösung aus 42,5 g Polyvinylalkohol (Moviol 40-88) und 12,75 g Dinatriumhydrogensulfat in 1240 g entionisiertem Wasser vorgelegt. Zu dieser wäßrigen Lösung wurde bei 20°C unter Rühren mit 280 Upm (Umdrehungen pro Minute) eine organische Lösung aus 23,71 g N,N- Dimethylaminoethylmethacrylat, 13,04 g Styrol, 10,67 g Divinylbenzol, 0,71 g 2,2'- Azobis(2,4-dimethylvalereonitril) und 31,62 g Hexan innerhalb von 30 min bei 25°C zugegeben. Es wurde leicht mit Stickstoff gespült und die Temperatur auf 66°C erhöht und 20 Stunden bei dieser Temperatur belassen. Danach wurde bei einer Innentemperatur von 70 bis 98°C das Hexan abdestilliert. Nach dem Abkühlen wurde das entstandene Perlpolymerisat durch Dekantieren von der Reaktionsflotte abgetrennt und im Vakuum bei 50°C getrocknet. Man erhielt 38 g Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 15 µm und einer spezifischen Oberfläche von 62,3 m²/g.

Beispiel 4 Herstellung eines makroporösen Perlpolymerisates

Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei eine organische Lösung aus 23,71 g Amino monomer aus Beispiel 1, 13,04 g Styrol, 10,67 g Divinylbenzol, 0,71 g 2,2'- Azobis(2,4-dimethylvalereonitril) und 38 g Hexan eingesetzt wurde. Man erhielt 35 g makroporöses Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 25 µm und einer spezifischen Oberfläche von 74 m²/g.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe umfassend die nachfolgenden Schritte

A) Vermischen der Probe mit einem wasserunlöslichen, im basischen und neutralen Bereich nicht ionischen Polymerisat bei einem pH-Wert von 7 oder weniger, wobei die Nucleinsäuren adsorbiert werden,
B) Abtrennen des wasserunlöslichen Polymerisates,
C) Vermischen des wasserunlöslichen Polymerisates mit einer wäßrigen Phase mit einem pH-Wert von größer 7, wobei die adsorbierten Nucleinsäuren freigesetzt werden,

dadurch gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche Polymerisat ein Perl polymerisat mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm ist und aus polymerisierten Einheiten von

besteht.

2. Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren umfassend die Schritte A), B) und C) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat ein wasserlösliches, makroporöses Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchen größe von 3 bis 100 µm und einer spezifischen Oberfläche gemessen nach BET von 5 bis 500 m²/g ist und aus polymerisierten Einheiten von

a) 5 bis 79,5 Gew.-% Aminomonomer
b) 0,3 bis 10 Gew.-% Vernetzer und
c) 10 bis 93 Gew.-% hydrophilem Vinylmonomer

besteht.

3. Wasserunlösliche, makroporöse Perlpolymerisate mit einer mittleren Teilchen größe von 3 bis 100 µm, einem Porendurchmesser von 10 bis 1000 nm und einer spezifischen Oberfläche gemessen nach BET von 5 bis 500 m²/g, dadurch gekennzeichnet, daß diese aus polymerisierten Einheiten von

bestehen.

4. Wasserunlösliche aber in Wasser quellbare Perlpolymerisate mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm, dadurch gekennzeichnet, daß diese aus polymerisierten Einheiten von

bestehen.

5. Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen, makroporösen Perlpoly merisaten mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm, einem Porendurchmesser von 10 bis 1000 nm und einer spezifischen Oberfläche gemessen nach BET von 5 bis 500 m²/g, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mischung von

in einem wäßrigen Medium unter Verwendung eines Schutzkolloides disper giert, anschließend die erhaltene Dispersion durch Erhitzen auf die Zerfalls temperatur des Radikalbildners polymerisiert und nach erfolgter Poly merisation das Porogen durch Extraktion und/oder Abdampfen entfernt.

6. Verfahren zur Herstellung von in Wasser unlöslichen aber quellbaren Perl polymerisaten mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mischung von

a) 5 bis 79, 7 Gew.-% Aminomonomer
b) 0,3 bis 10 Gew.-% Vernetzer und
c) 10 bis 93 Gew.-% hydrophilem Vinylmonomer
d) 10-150 Gew.-Teilen Lösungsmittel und
e) 0,1-2,5 Gew.-Teilen Radikalbildner

in einem wäßrigen Medium unter Verwendung eines Schutzkolloides disper giert, anschließend die erhaltene Dispersion durch Erhitzen auf die Zerfalls temperatur des Radikalbildners polymerisiert und nach erfolgter Polymeri sation das Lösungsmittel durch Extraktion und/oder Abdampfen entfernt.

7. Aminomonomer gemäß Formel (I)

8. Verfahren zur Herstellung von Aminomonomer der Formel (I) gemäß Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß man 2-Isocyanatoethylmethacrylat mit 3-Aminopropylimidazol umsetzt.

9. Verwendung von wasserunlöslichen, makroporösen Perlpolymerisaten mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm, einem Porendurchmesser von 10 bis 1000 nm und einer spezifischen Oberfläche gemessen nach BET von 5 bis 500 m²/g, bestehend aus polymerisierten Einheiten von

zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe.

10. Mittel zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe enthaltend wasser unlösliche makroporöse Perlpolymerisate mit einer mittleren Teilchengröße von 3 bis 100 µm, einem Porendurchmesser von 10 bis 1000 nm und einer spezifischen Oberfläche gemessen nach BET von 5 bis 500 m²/g, bestehend aus polymerisierten Einheiten von