JP2002537306A - 核酸を単離する方法 - Google Patents
核酸を単離する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
核酸が、平均粒径３〜１００μｍを有する特定の水不溶性粒状ポリマー上に中性または酸性ｐＨ値で効率良く吸着できる。次いで酸をアルカリ性ｐＨで高収率で遊離できる。
Description
【０００１】 本発明は、特殊な粒状ポリマー(bead polymer)の使用による核酸の分離および
選択的な遊離のための方法に関する。
選択的な遊離のための方法に関する。
【０００２】 いわゆる遺伝子診断は、最近ますます重要となって来ている。遺伝子診断は、
ヒト疾患の診断に必要となった（なかでも病原体の検出、ゲノム突然変異の検出
、循環ガン細胞の分析および疾患に対する素質の危険因子の同定）。しかし、遺
伝子診断は、獣医薬、環境解析および食品試験にも現在では適用されている。適
用の別の領域は、病理学／細胞学の学界または法医学的問題の範囲内における研
究を含んでなる。しかし、遺伝子診断は、いまでは品質およびプロセス制御の目
的（例えば病原体を含まない血液試料の研究のため）にも使用され、そして法規
により現在すでに必要な試験の数を将来拡大するように法制が計画されている。
ヒト疾患の診断に必要となった（なかでも病原体の検出、ゲノム突然変異の検出
、循環ガン細胞の分析および疾患に対する素質の危険因子の同定）。しかし、遺
伝子診断は、獣医薬、環境解析および食品試験にも現在では適用されている。適
用の別の領域は、病理学／細胞学の学界または法医学的問題の範囲内における研
究を含んでなる。しかし、遺伝子診断は、いまでは品質およびプロセス制御の目
的（例えば病原体を含まない血液試料の研究のため）にも使用され、そして法規
により現在すでに必要な試験の数を将来拡大するように法制が計画されている。
【０００３】 遺伝子診断にも使用される方法（例えばハイブリダイゼーションおよび増幅技
術、例えばＰＣＲ、ｂＤＮＡまたはＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ技術）も、基礎的科学研
究における日常的な方法の内である。
術、例えばＰＣＲ、ｂＤＮＡまたはＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ技術）も、基礎的科学研
究における日常的な方法の内である。
【０００４】 遺伝子診断中でも役割を果たしている非放射能的検出方法のますます拡大する
使用は、遺伝子診断が、現在よりも将来にはさらに広範に使用されるであろうと
の予想に導く。
使用は、遺伝子診断が、現在よりも将来にはさらに広範に使用されるであろうと
の予想に導く。
【０００５】 遺伝子診断における重要な工程は、生物学的物質、例えば細胞、血液、痰、Ｃ
ＳＦ、血清または尿からの遺伝子試料の入手である。
ＳＦ、血清または尿からの遺伝子試料の入手である。
【０００６】 ポリ四級カチオンポリマーへの核酸の結合が米国特許（ＵＳ−Ａ）第４ ０４
６ ７５０号中に開示されている。しかし、結合は非可逆であり、吸着された核
酸は、この方法では再び遊離できない。
６ ７５０号中に開示されている。しかし、結合は非可逆であり、吸着された核
酸は、この方法では再び遊離できない。
【０００７】 米国特許（ＵＳ−Ａ）第４ ０５５ ４６９号は、核酸および望まないタンパ
ク質を水溶性カチオンポリマーの助けをかりて沈殿させる、酵素を精製するため
の方法を開示している。
ク質を水溶性カチオンポリマーの助けをかりて沈殿させる、酵素を精製するため
の方法を開示している。
【０００８】 米国特許（ＵＳ−Ａ）第４ ８３９ ２３１号は、ビニルピリミジンポリマー
を用いて被覆され、そしてタンパク質および核酸を吸着できる支持体を開示して
いる。しかし、支持体の能力はかなり低く、そして核酸の吸着は定量的ではない
。
を用いて被覆され、そしてタンパク質および核酸を吸着できる支持体を開示して
いる。しかし、支持体の能力はかなり低く、そして核酸の吸着は定量的ではない
。
【０００９】 ＷＯ−Ａ−９１／０５６０６号は、核酸のクロマトグラフィー分離のためのヒ
ドロキシアルキルアミノ基を有する、シラン化した多孔性支持体を記載している
。しかし、この物質は、生物学的物質から核酸の迅速で最高に定量的な分離には
あまり適していない。
ドロキシアルキルアミノ基を有する、シラン化した多孔性支持体を記載している
。しかし、この物質は、生物学的物質から核酸の迅速で最高に定量的な分離には
あまり適していない。
【００１０】 ドイツ特許公開（ＤＥ−Ａ）第４ １３９ ６６４号は、アニオン交換体を用
いる核酸の単離および精製のための装置および方法を記載している。この方法の
欠点は、これが高イオン強度の緩衝液を用いてのみアニオン交換体から核酸の脱
着が可能であり、そして、緩衝溶液からの塩の分離は、追加の精製工程を必要と
することにある。
いる核酸の単離および精製のための装置および方法を記載している。この方法の
欠点は、これが高イオン強度の緩衝液を用いてのみアニオン交換体から核酸の脱
着が可能であり、そして、緩衝溶液からの塩の分離は、追加の精製工程を必要と
することにある。
【００１１】 ドイツ特許公開（ＤＥ−Ａ）第４ ３３３ ８０５号は、水溶性キャリヤー、
例えばデキストラン、アクリルアミドまたはカルボキシメチルセルロースおよび
その他の試薬を用いる試料からの核酸の抽出を請求しており、その際核酸が沈殿
する。
例えばデキストラン、アクリルアミドまたはカルボキシメチルセルロースおよび
その他の試薬を用いる試料からの核酸の抽出を請求しており、その際核酸が沈殿
する。
【００１２】 欧州特許公開（ＥＰ−Ａ）第０ ７０７ ０７７号（米国特許（ＵＳ−Ａ）第
５ ５８２ ９８８号に相当）は、可溶性で弱塩基性ポリマーを用いる生物学的
物質からの核酸の単離のための方法を記載している。この方法では、沈殿物が、
可溶性で弱塩基性ポリマーおよび核酸から酸性ｐＨ領域で生成し、沈殿物を生物
学的物質の非沈殿成分から分離し、そして洗浄し、そして塩基性ｐＨに調節して
沈殿物から核酸を再遊離する。
５ ５８２ ９８８号に相当）は、可溶性で弱塩基性ポリマーを用いる生物学的
物質からの核酸の単離のための方法を記載している。この方法では、沈殿物が、
可溶性で弱塩基性ポリマーおよび核酸から酸性ｐＨ領域で生成し、沈殿物を生物
学的物質の非沈殿成分から分離し、そして洗浄し、そして塩基性ｐＨに調節して
沈殿物から核酸を再遊離する。
【００１３】 ドイツ特許公開（ＤＥ−Ａ）第４ ３３３ ８０５号および欧州特許公開（Ｅ
Ｐ−Ａ）第０ ７０７ ０７７号の方法の一つの欠点は、操作、特に沈殿物の分
離および精製が、困難で著しく時間を要することにある。さらにこれらの方法は
、困難な条件下でのみ自動化分析装置を用いて行うことができるか、あるいは全
く行えない。
Ｐ−Ａ）第０ ７０７ ０７７号の方法の一つの欠点は、操作、特に沈殿物の分
離および精製が、困難で著しく時間を要することにある。さらにこれらの方法は
、困難な条件下でのみ自動化分析装置を用いて行うことができるか、あるいは全
く行えない。
【００１４】 ＷＯ−Ａ−９６／１８７３１号は、界面活性剤および固体支持体を用いる核酸
単離のための方法を記載している。細孔がなくそして膨潤性もない固体支持体を
使用するので、支持体の結合能力は比較的低い。
単離のための方法を記載している。細孔がなくそして膨潤性もない固体支持体を
使用するので、支持体の結合能力は比較的低い。
【００１５】 ＷＯ−Ａ−９７／０８５４７号は、有効な正電荷を持たない固体親水性有機ポ
リマー、例えばセルロースに核酸が結合する、核酸を単離するための方法を記載
している。この方法では、結合は弱い力、例えばファンデルワールス相互作用に
より行われる。
リマー、例えばセルロースに核酸が結合する、核酸を単離するための方法を記載
している。この方法では、結合は弱い力、例えばファンデルワールス相互作用に
より行われる。
【００１６】 ＷＯ−Ａ−９７／３４９０９号は、２５〜４５℃の下部臨界溶解温度（ＬＣＳ
Ｔ）を有する特定の粒子状ポリマーを用いる核酸を単離するための方法を記載し
ている。この方法の欠点は、高いイオン濃度の緩衝液を核酸遊離のために使用し
なければならないが、しかしこれは核酸の以後の使用を妨げるであろうことにあ
る。使用する小さい粒径、０．０５〜２μｍのために、さらに、この処理は時間
を要しそして自動化が困難である。
Ｔ）を有する特定の粒子状ポリマーを用いる核酸を単離するための方法を記載し
ている。この方法の欠点は、高いイオン濃度の緩衝液を核酸遊離のために使用し
なければならないが、しかしこれは核酸の以後の使用を妨げるであろうことにあ
る。使用する小さい粒径、０．０５〜２μｍのために、さらに、この処理は時間
を要しそして自動化が困難である。
【００１７】 核酸単離のための多数の上記の方法にもかかわらず、生物学的物質から核酸を
効率的に分離し、これから再度遊離させるために、可能なら自動化できる簡単な
方法に対する緊急の要求がまだ存在する。
効率的に分離し、これから再度遊離させるために、可能なら自動化できる簡単な
方法に対する緊急の要求がまだ存在する。
【００１８】 ここで意外にも、アミノモノマー、架橋剤およびビニルモノマーの重合した単
位のある種の水不溶性粒状ポリマーが、核酸単離のために優れて適することを発
見した。
位のある種の水不溶性粒状ポリマーが、核酸単離のために優れて適することを発
見した。
【００１９】 本発明は、Ａ）試料を、塩基性および中性の範囲内でイオン性ではない水不溶
性のポリマーと、ｐＨ７またはこれ未満において混合し、これにより核酸を吸着
する工程、 Ｂ）水不溶性ポリマーを分離する工程、ならびに Ｃ）水不溶性ポリマーを、７を越えるｐＨを有する水相と混合し、これにより吸
着された核酸を遊離する工程、 を含んでなる試料から核酸を単離する方法であって、 水不溶性ポリマーが平均粒径３〜１００μｍを有する粒状ポリマーであり、そし
て ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤０．３〜３０重量％および ｃ）ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなることを特徴とする方法に関する。
性のポリマーと、ｐＨ７またはこれ未満において混合し、これにより核酸を吸着
する工程、 Ｂ）水不溶性ポリマーを分離する工程、ならびに Ｃ）水不溶性ポリマーを、７を越えるｐＨを有する水相と混合し、これにより吸
着された核酸を遊離する工程、 を含んでなる試料から核酸を単離する方法であって、 水不溶性ポリマーが平均粒径３〜１００μｍを有する粒状ポリマーであり、そし
て ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤０．３〜３０重量％および ｃ）ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなることを特徴とする方法に関する。
【００２０】 適合する場合には、方法工程Ａ）の後に挿入される工程において、生物学的物
質を溶解させる。
質を溶解させる。
【００２１】 本発明は、好ましくは、工程 Ａ）試料を、塩基性および中性の範囲内でイオン性ではない水不溶性のポリマー
とｐＨ７またはこれ未満において混合し、これにより核酸が吸着され、 Ｂ）水不溶性ポリマーを分離し、そして Ｃ）水不溶性ポリマーを、７を越えるｐＨを有する水相と混合し、これにより吸
着された核酸が遊離される、 を含んでなる試料から核酸を単離する方法であって、 水不溶性ポリマーが、平均粒径３〜１００μｍ、細孔直径１０〜１０００ｎｍお
よびＢＥＴ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有し、そして ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤０．３〜３０重量％および ｃ１）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなる粒状ポリマー、または 水不溶性ポリマーが、水中で良く膨潤可能でありそして平均粒径３〜１００μｍ
を有し、そして ａ）アミノモノマー５〜７９．５重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ の重合した単位からなる粒状ポリマーであることを特徴とする方法に関する。
とｐＨ７またはこれ未満において混合し、これにより核酸が吸着され、 Ｂ）水不溶性ポリマーを分離し、そして Ｃ）水不溶性ポリマーを、７を越えるｐＨを有する水相と混合し、これにより吸
着された核酸が遊離される、 を含んでなる試料から核酸を単離する方法であって、 水不溶性ポリマーが、平均粒径３〜１００μｍ、細孔直径１０〜１０００ｎｍお
よびＢＥＴ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有し、そして ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤０．３〜３０重量％および ｃ１）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなる粒状ポリマー、または 水不溶性ポリマーが、水中で良く膨潤可能でありそして平均粒径３〜１００μｍ
を有し、そして ａ）アミノモノマー５〜７９．５重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ の重合した単位からなる粒状ポリマーであることを特徴とする方法に関する。
【００２２】 本発明は、特には好ましくは以上に定義した工程Ａ）、Ｂ）およびＣ）を含ん
でなる、試料から核酸を単離する方法であって、水不溶性ポリマーが、粒径３〜
１００μｍおよび細孔直径１０〜１０００ｎｍを有し、ＢＥＴ法により測定した
比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇ（特に好ましくは２０〜２００ｍ2 ／ｇ）を有しそ
して ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤２〜３０重量％および ｃ１）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなるマクロ多孔性粒状ポリマーであるか、 または水不溶性ポリマーが、水中で良く膨潤可能でありそして平均粒径３〜１０
０μｍを有しそして ａ）アミノモノマー５〜７９．５重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ２）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ の重合した単位からなる粒状ポリマーからなることを特徴とする方法に関する。
でなる、試料から核酸を単離する方法であって、水不溶性ポリマーが、粒径３〜
１００μｍおよび細孔直径１０〜１０００ｎｍを有し、ＢＥＴ法により測定した
比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇ（特に好ましくは２０〜２００ｍ2 ／ｇ）を有しそ
して ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤２〜３０重量％および ｃ１）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなるマクロ多孔性粒状ポリマーであるか、 または水不溶性ポリマーが、水中で良く膨潤可能でありそして平均粒径３〜１０
０μｍを有しそして ａ）アミノモノマー５〜７９．５重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ２）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ の重合した単位からなる粒状ポリマーからなることを特徴とする方法に関する。
【００２３】 本発明の方法は、種々の起源、例えば細胞、組織物質、血液または病原体から
の核酸の単離および／または精製のために適する。核酸の単離の前に、研究する
物質を自体公知の方法、例えばプロテアーゼ消化による破壊により破壊し、後続
の工程Ａ〜Ｃに適する試料、すなわち溶解物をもたらす。適合する場合には、生
物学的試料は、方法工程Ａ）の後に挿入された工程において溶解される。その他
の好ましい破壊方法は、ドイツ特許公開（ＤＥ−Ａ）第４ ３３３ ８０５号中
に記載されている。
の核酸の単離および／または精製のために適する。核酸の単離の前に、研究する
物質を自体公知の方法、例えばプロテアーゼ消化による破壊により破壊し、後続
の工程Ａ〜Ｃに適する試料、すなわち溶解物をもたらす。適合する場合には、生
物学的試料は、方法工程Ａ）の後に挿入された工程において溶解される。その他
の好ましい破壊方法は、ドイツ特許公開（ＤＥ−Ａ）第４ ３３３ ８０５号中
に記載されている。
【００２４】 試料をｐＨ７またはこれ未満、好ましくは２〜６の範囲内、特に好ましくは２
〜３の範囲内、室温で水不溶性ポリマーと混合する。水不溶性ポリマーは、例え
ば濾過または遠心分離により分離する。この方法で得られた核酸とポリマーとの
複合体は、次いで適当な緩衝液、例えばＴＥを用いて洗浄して精製できる。
〜３の範囲内、室温で水不溶性ポリマーと混合する。水不溶性ポリマーは、例え
ば濾過または遠心分離により分離する。この方法で得られた核酸とポリマーとの
複合体は、次いで適当な緩衝液、例えばＴＥを用いて洗浄して精製できる。
【００２５】 次いで、複合体から結合核酸を遊離するために、複合体を７を越えるｐＨ値、
好ましくは８〜１４、特に好ましくは１２〜１４の範囲内に調整する。
好ましくは８〜１４、特に好ましくは１２〜１４の範囲内に調整する。
【００２６】 本発明の粒状ポリマーは、この場合にも欧州特許公開（ＥＰ−Ａ）第０ ７０
７ ０７７号内で開示された可溶性ポリマーよりも高い吸着および遊離速度をも
たらす。単離は、さらに容易に、すなわちさらに少ない作業工程およびさらに短
い時間で行うことができる。単離された核酸の純度はさらに高く、そして、特に
、これらはさらに少ない抑制性の副産物を含み、核酸の増幅は、例えばいわゆる
「ＰＣＲ反応」および「ＲＴ−ＰＣＲ」により特に良好に行われる。本発明の方
法は、得られた核酸の制限酵素消化に関しても、欧州特許公開（ＥＰ−Ａ）第０
７０７ ０７７号に記載の方法より優れている。
７ ０７７号内で開示された可溶性ポリマーよりも高い吸着および遊離速度をも
たらす。単離は、さらに容易に、すなわちさらに少ない作業工程およびさらに短
い時間で行うことができる。単離された核酸の純度はさらに高く、そして、特に
、これらはさらに少ない抑制性の副産物を含み、核酸の増幅は、例えばいわゆる
「ＰＣＲ反応」および「ＲＴ−ＰＣＲ」により特に良好に行われる。本発明の方
法は、得られた核酸の制限酵素消化に関しても、欧州特許公開（ＥＰ−Ａ）第０
７０７ ０７７号に記載の方法より優れている。
【００２７】 本発明は、さらに、平均粒径３〜１００μｍ、細孔直径１０〜１０００ｎｍお
よびＢＥＴ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有し、 ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤２〜３０重量％および ｃ）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなることを特徴とするミクロ細孔性粒状ポリマー、および平
均粒径３〜１００μｍを有し、そして ａ）アミノモノマー５〜７９．５重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ の重合した単位からなることを特徴とする水に不溶性であるが水中で膨潤可能で
ある粒状ポリマーに関する。
よびＢＥＴ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有し、 ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤２〜３０重量％および ｃ）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなることを特徴とするミクロ細孔性粒状ポリマー、および平
均粒径３〜１００μｍを有し、そして ａ）アミノモノマー５〜７９．５重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ の重合した単位からなることを特徴とする水に不溶性であるが水中で膨潤可能で
ある粒状ポリマーに関する。
【００２８】 本発明は、さらに、平均粒径３〜１００μｍ、細孔直径１０〜１０００ｎｍお
よびＢＥＴ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有する水不溶性、マ
クロ細孔性粒状ポリマーを製造する方法であって、 ａ）アミノモノマー５〜９８重量部 ｂ）架橋剤２〜３０重量部および ｃ１）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量部 ｄ）ポロゲン(porogen)１０〜１５０重量部および ｅ）フリーラジカル形成剤０．１〜２．５重量部 の混合物を、保護コロイドを用いて水性媒体内に分散させ、次いで得られた分散
液をフリーラジカル形成剤の分解温度まで加熱して重合させ、そして重合が起き
た後に、ポロゲンを抽出および／または蒸発により除去することを特徴とする方
法、 および 水中に不溶性であるが膨潤可能でありそして平均粒径３〜１００μｍを有する粒
状ポリマーの製造方法であって、 ａ）アミノモノマー５〜７９．７重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ１）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ ｄ）溶剤１０〜１５０重量部および ｅ）フリーラジカル形成剤０．１〜２．５重量部 の混合物を、保護コロイドを用いて水性媒体内に分散させ、次いで得られた分散
液をフリーラジカル形成剤の分解温度まで加熱して重合させ、そして重合が起き
た後に、溶剤を抽出および／または蒸発により除去することを特徴とする方法に
関する。
よびＢＥＴ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有する水不溶性、マ
クロ細孔性粒状ポリマーを製造する方法であって、 ａ）アミノモノマー５〜９８重量部 ｂ）架橋剤２〜３０重量部および ｃ１）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量部 ｄ）ポロゲン(porogen)１０〜１５０重量部および ｅ）フリーラジカル形成剤０．１〜２．５重量部 の混合物を、保護コロイドを用いて水性媒体内に分散させ、次いで得られた分散
液をフリーラジカル形成剤の分解温度まで加熱して重合させ、そして重合が起き
た後に、ポロゲンを抽出および／または蒸発により除去することを特徴とする方
法、 および 水中に不溶性であるが膨潤可能でありそして平均粒径３〜１００μｍを有する粒
状ポリマーの製造方法であって、 ａ）アミノモノマー５〜７９．７重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ１）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ ｄ）溶剤１０〜１５０重量部および ｅ）フリーラジカル形成剤０．１〜２．５重量部 の混合物を、保護コロイドを用いて水性媒体内に分散させ、次いで得られた分散
液をフリーラジカル形成剤の分解温度まで加熱して重合させ、そして重合が起き
た後に、溶剤を抽出および／または蒸発により除去することを特徴とする方法に
関する。
【００２９】 本発明のためのアミノモノマー（ａ）は、少なくとも１個の第一級、第二級ま
たは第三級アミノ基を有する重合可能、エチレン性不飽和化合物である。第二級
または第三級アミノ基は、さらに脂環式または芳香族の環の一部分であってもよ
い。挙げることができるこれらの例は、Ｎ−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルベ
ンズイミダゾール、２−ビニルピリジンおよび４−ビニルピリジンである。特に
適するアミノモノマーは、またアクリル酸およびメタクリル酸の誘導体、例えば
２−アミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレー
ト、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ
エチルアクリレート、Ｎ−ｔ−ブチルアミノプロピルメタクリレート、Ｎ−（３
−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−イミダゾイルプロピル）メタ
クリルアミド、Ｎ−（２−イミダゾイルエチル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−
アミノプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（３−イミダゾイルプロピル）アクリル
アミド、Ｎ−（２−イミダゾイルエチル）アクリルアミド、Ｎ−（１，１−ジメ
チル−３−イミダゾイルプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（１，１−ジメチル
−３−イミダゾイルプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（３−ベンズイミダゾイル
プロピル）メタクリルアミドおよび（３−ベンズイミダゾイルプロピル）アクリ
ルアミドである。
たは第三級アミノ基を有する重合可能、エチレン性不飽和化合物である。第二級
または第三級アミノ基は、さらに脂環式または芳香族の環の一部分であってもよ
い。挙げることができるこれらの例は、Ｎ−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルベ
ンズイミダゾール、２−ビニルピリジンおよび４−ビニルピリジンである。特に
適するアミノモノマーは、またアクリル酸およびメタクリル酸の誘導体、例えば
２−アミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレー
ト、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ
エチルアクリレート、Ｎ−ｔ−ブチルアミノプロピルメタクリレート、Ｎ−（３
−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−イミダゾイルプロピル）メタ
クリルアミド、Ｎ−（２−イミダゾイルエチル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−
アミノプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（３−イミダゾイルプロピル）アクリル
アミド、Ｎ−（２−イミダゾイルエチル）アクリルアミド、Ｎ−（１，１−ジメ
チル−３−イミダゾイルプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（１，１−ジメチル
−３−イミダゾイルプロピル）アクリルアミド、Ｎ−（３−ベンズイミダゾイル
プロピル）メタクリルアミドおよび（３−ベンズイミダゾイルプロピル）アクリ
ルアミドである。
【００３０】 特に適するアミノモノマーは、イソシアナトエチル（メタ）アクリレートとイ
ミダゾイルアクリルアミンとの反応生成物、例えば本発明の範囲内で新規である
式（Ｉ）のアミノモノマーである。
ミダゾイルアクリルアミンとの反応生成物、例えば本発明の範囲内で新規である
式（Ｉ）のアミノモノマーである。
【００３１】
【化２】
【００３２】 本発明に従うさらに適するアミノモノマーは、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の
ピリジン誘導体である。
ピリジン誘導体である。
【００３３】
【化３】
【００３４】 アミノ基を有するスチレンおよびα−スチレンの誘導体も特に適する。挙げる
ことができるその例は、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスチレン、２−Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアミノスチレン、４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノスチレンおよび４−Ｎ，Ｎ
−ビス（２−ヒドロエチル）アミノスチレンである。
ことができるその例は、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスチレン、２−Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアミノスチレン、４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノスチレンおよび４−Ｎ，Ｎ
−ビス（２−ヒドロエチル）アミノスチレンである。
【００３５】 本発明に従う適当な架橋剤（ｂ）は、エチレングリコールジメタクリレート、
ブタンジオールジメタクリレート、ヘキサンジオールジメタクリレート、ペンタ
エリトリトールジメタクリレート、グリセロール １，２−ジメタクリレート、
グリセロール １，３−ジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリ
レート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパン
トリメタクリレート、ペンタエリトリトールトリメタクリレート、ペンタエリト
リトールテトラメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、ブタンジ
オールジアクリレート、ペンタエリトリトールジアクリレート、グリセロール １，３−ジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロ
ールプロパントリアクリレート、ペンタエリトリトールトリアクリレート、ペン
タエリトリトールテトラアクリレート、アリルメタクリレート、アリルアクリレ
ート、メチレン−Ｎ，Ｎ’−ビスアクリルアミド、ｐ−ジビニルベンゼンおよび
ｍ−ジベニルベンゼンである。
ブタンジオールジメタクリレート、ヘキサンジオールジメタクリレート、ペンタ
エリトリトールジメタクリレート、グリセロール １，２−ジメタクリレート、
グリセロール １，３−ジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリ
レート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパン
トリメタクリレート、ペンタエリトリトールトリメタクリレート、ペンタエリト
リトールテトラメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、ブタンジ
オールジアクリレート、ペンタエリトリトールジアクリレート、グリセロール １，３−ジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロ
ールプロパントリアクリレート、ペンタエリトリトールトリアクリレート、ペン
タエリトリトールテトラアクリレート、アリルメタクリレート、アリルアクリレ
ート、メチレン−Ｎ，Ｎ’−ビスアクリルアミド、ｐ−ジビニルベンゼンおよび
ｍ−ジベニルベンゼンである。
【００３６】 本発明の粒状ポリマー中に存在してもよくそして本発明の目的に適する疎水性
ビニルモノマー（ｃ１）は、Ｃ1 〜Ｃ8 −アルキルアクリレート、Ｃ1 〜Ｃ8 −
アルキルメタクリレート、例えばメチルメタクリレートまたはブチルアクリレー
ト、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、酢
酸ビニルおよび芳香族ビニルモノマー、例えばスチレン、ビニルナフタレン、ビ
ニルトルエンン、エチルスチレン、α−メチルスチレン、クロロスチレンおよび
ビニルベンジルクロリドである。
ビニルモノマー（ｃ１）は、Ｃ1 〜Ｃ8 −アルキルアクリレート、Ｃ1 〜Ｃ8 −
アルキルメタクリレート、例えばメチルメタクリレートまたはブチルアクリレー
ト、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、酢
酸ビニルおよび芳香族ビニルモノマー、例えばスチレン、ビニルナフタレン、ビ
ニルトルエンン、エチルスチレン、α−メチルスチレン、クロロスチレンおよび
ビニルベンジルクロリドである。
【００３７】 本発明の目的に適する親水性ビニルモノマー（ｃ２）は、例えば２−ヒドロキ
シエチルメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロ
キシエチルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、トリエチレン
グリコールモノメタクリレート、テトラエチレングリコールモノメタクリレート
、アクリルアミド、メタクリルアミドおよびＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドで
ある。
シエチルメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロ
キシエチルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、トリエチレン
グリコールモノメタクリレート、テトラエチレングリコールモノメタクリレート
、アクリルアミド、メタクリルアミドおよびＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドで
ある。
【００３８】 ポロゲンは、水不溶性マクロ細孔性粒状ポリマーを製造するために本発明の方
法に使用される。この目的に適するのは、使用するモノマーを溶解しそして形成
されたポリマーを沈殿させる液状の水と非混合性の化合物である。挙げることが
できる例は、脂肪族炭化水素、例えばヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオク
タン、イソドデカンおよびアルコール、例えばオクタノールである。ポロゲンは
、使用するモノマーおよび架橋剤の合計に対して、１０〜１５０重量％、好まし
くは２０〜１００重量％の量で使用される。
法に使用される。この目的に適するのは、使用するモノマーを溶解しそして形成
されたポリマーを沈殿させる液状の水と非混合性の化合物である。挙げることが
できる例は、脂肪族炭化水素、例えばヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオク
タン、イソドデカンおよびアルコール、例えばオクタノールである。ポロゲンは
、使用するモノマーおよび架橋剤の合計に対して、１０〜１５０重量％、好まし
くは２０〜１００重量％の量で使用される。
【００３９】 本発明の目的に適しそして好ましいフリーラジカル形成剤は、油溶性開始剤で
ある。挙げることができる例は、過酸化物、例えばジベンゾイルペルオキシド、
ジラウロイルペルオキシド、ビス（ｐ−クロロベンゾイルペルオキシド）、ジシ
クロヘキシルペルオキシジカルボナート、ｔ−ブチルペルオクトアート、２，５
−ビス（２−エチルヘキサノイルペルオキシ）−２，５−ジメチルヘキサンおよ
びｔ−アミルペルオキシ−２−エチルヘキサン、さらにアゾ化合物、例えば２，
２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチ
ルバレロニトリル）および２，２’−アゾビス（２−メチルイソブチロニトリル
）である。開始剤は、モノマー混合物に対して、一般に０．０５〜２．５重量％
、好ましくは０．２〜１．５重量％の量で使用される。
ある。挙げることができる例は、過酸化物、例えばジベンゾイルペルオキシド、
ジラウロイルペルオキシド、ビス（ｐ−クロロベンゾイルペルオキシド）、ジシ
クロヘキシルペルオキシジカルボナート、ｔ−ブチルペルオクトアート、２，５
−ビス（２−エチルヘキサノイルペルオキシ）−２，５−ジメチルヘキサンおよ
びｔ−アミルペルオキシ−２−エチルヘキサン、さらにアゾ化合物、例えば２，
２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチ
ルバレロニトリル）および２，２’−アゾビス（２−メチルイソブチロニトリル
）である。開始剤は、モノマー混合物に対して、一般に０．０５〜２．５重量％
、好ましくは０．２〜１．５重量％の量で使用される。
【００４０】 本発明のマクロ細孔性ゲル粒状ポリマーの製造において、適合する場合には、
水相内で保護コロイドが使用される。本発明に従って適する保護コロイドは、天
然および合成の水溶性ポリマー、例えばゼラチン、デンプン、セルロース誘導体
、特にはセルロースエステルおよびセルロースエーテル、ポリビニルアルコール
、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸およびアクリル酸
、メタクリル酸、メタクリルエステルおよび／またはアクリルエステルのコポリ
マーである。アルカリ金属水酸化物で中和されたメタクリル酸とメタクリルエス
テルとのコポリマーが特に適する。使用する保護コロイドの量は、水相に対して
、一般に０．０５〜２％、好ましくは０．１〜１％である。
水相内で保護コロイドが使用される。本発明に従って適する保護コロイドは、天
然および合成の水溶性ポリマー、例えばゼラチン、デンプン、セルロース誘導体
、特にはセルロースエステルおよびセルロースエーテル、ポリビニルアルコール
、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸およびアクリル酸
、メタクリル酸、メタクリルエステルおよび／またはアクリルエステルのコポリ
マーである。アルカリ金属水酸化物で中和されたメタクリル酸とメタクリルエス
テルとのコポリマーが特に適する。使用する保護コロイドの量は、水相に対して
、一般に０．０５〜２％、好ましくは０．１〜１％である。
【００４１】 水相は、適する場合には緩衝系をさらに含んでもよい。好ましい緩衝系は、水
相のｐＨを重合の開始時に１２〜５の間。好ましくは１０〜６の間に調整する。
これらの条件下で、カルボキシル基を有する分散体は、全体または一部分が塩の
形にある。保護コロイドの効果は、この方法で有利に影響を受ける。特に適する
緩衝系は、リン酸塩またはホウ酸塩を含む。
相のｐＨを重合の開始時に１２〜５の間。好ましくは１０〜６の間に調整する。
これらの条件下で、カルボキシル基を有する分散体は、全体または一部分が塩の
形にある。保護コロイドの効果は、この方法で有利に影響を受ける。特に適する
緩衝系は、リン酸塩またはホウ酸塩を含む。
【００４２】 水相の量は、モノマー、架橋剤およびポロゲンの合計に対して、一般に７５〜
１２００重量％、好ましくは１００〜５００重量％である。
１２００重量％、好ましくは１００〜５００重量％である。
【００４３】 重合の間の攪拌速度は、粒径を調整するために重要である。本発明の製造方法
において、精製する粒状ポリマーの大きさは、攪拌速度の上昇と共に低下する。
特定の所定粒状の大きさに調整するための正確な攪拌速度は、個々の場合に、反
応器の大きさ、反応器形状および攪拌機形状に大きく依存する。必要な攪拌速度
を実験により決定することが適切なことが証明されている。反応容積３リットル
を有しそしてパドル形攪拌機を有する実験室用反応器に対して、アクリル酸、メ
タクリル酸、アクリルエステルおよび／またはメタクリルエステルのコポリマー
を分散体として使用すると、一般粒子サイズ６〜３０μｍが、３００〜５００ｒ
ｐｍの速度で到達される。
において、精製する粒状ポリマーの大きさは、攪拌速度の上昇と共に低下する。
特定の所定粒状の大きさに調整するための正確な攪拌速度は、個々の場合に、反
応器の大きさ、反応器形状および攪拌機形状に大きく依存する。必要な攪拌速度
を実験により決定することが適切なことが証明されている。反応容積３リットル
を有しそしてパドル形攪拌機を有する実験室用反応器に対して、アクリル酸、メ
タクリル酸、アクリルエステルおよび／またはメタクリルエステルのコポリマー
を分散体として使用すると、一般粒子サイズ６〜３０μｍが、３００〜５００ｒ
ｐｍの速度で到達される。
【００４４】 本発明の製造方法における重合温度は、使用する開始剤の分解温度に依存する
。これは一般に、５０〜１５０℃、好ましくは５５〜１００℃の間である。重合
は０．５時間から数時間を要する。重合が低温、例えば７０℃で開始し、そして
重合反応が進行するに従って反応温度を上昇させる温度プログラムを用いると適
当なことが証明されている。
。これは一般に、５０〜１５０℃、好ましくは５５〜１００℃の間である。重合
は０．５時間から数時間を要する。重合が低温、例えば７０℃で開始し、そして
重合反応が進行するに従って反応温度を上昇させる温度プログラムを用いると適
当なことが証明されている。
【００４５】 重合の後に、ポリマーを慣用の方法、例えば濾過またはデカンテーションによ
り単離することが可能で、適する場合には１回またはそれ以上の洗浄の後、乾燥
する。ポロゲンは、乾燥の間に除去できる。低沸点ポロゲン、例えばヘキサンの
場合には、粒状ポリマーを単離する前に蒸留によりポロゲンの全部または一部分
を水性反応混合物から除去することも可能である。
り単離することが可能で、適する場合には１回またはそれ以上の洗浄の後、乾燥
する。ポロゲンは、乾燥の間に除去できる。低沸点ポロゲン、例えばヘキサンの
場合には、粒状ポリマーを単離する前に蒸留によりポロゲンの全部または一部分
を水性反応混合物から除去することも可能である。
【００４６】 水中で膨潤が可能な粒状ポリマーの製造は、マクロ細孔性粒状ポリマーの製造
に類似して、疎水性粒状ポリマー（ｃ１）の代わりに親水性ビニルモノマー（ｃ
２）、そしてポロゲンの代わりに溶剤を用いて行われる。
に類似して、疎水性粒状ポリマー（ｃ１）の代わりに親水性ビニルモノマー（ｃ
２）、そしてポロゲンの代わりに溶剤を用いて行われる。
【００４７】 適当な固体は、水とは非混合性でそしてモノマーおよび架橋剤を溶解しそして
沈殿させないが、しかし形成されたポリマーを溶解または膨潤するものである。
適当な溶剤は、トルエン、キシレン、テトラクロロメタン、クロロホルム、メチ
レンクロリド、ジクロロエタンおよび酢酸エチルである。補助溶剤の量は、モノ
マーおよび好ましくは架橋剤の合計に対して、一般に１０〜２００重量％、好ま
しくは１０〜１５０重量％、特に好ましくは２０〜１００重量％である。必要な
場合には、補助溶剤は重合の後に例えば蒸留により除去できる。トルエンは、特
に簡単に共沸蒸留により除去できる。
沈殿させないが、しかし形成されたポリマーを溶解または膨潤するものである。
適当な溶剤は、トルエン、キシレン、テトラクロロメタン、クロロホルム、メチ
レンクロリド、ジクロロエタンおよび酢酸エチルである。補助溶剤の量は、モノ
マーおよび好ましくは架橋剤の合計に対して、一般に１０〜２００重量％、好ま
しくは１０〜１５０重量％、特に好ましくは２０〜１００重量％である。必要な
場合には、補助溶剤は重合の後に例えば蒸留により除去できる。トルエンは、特
に簡単に共沸蒸留により除去できる。
【００４８】 本発明に従って水中で膨潤可能な粒状ポリマーは、２５℃およびｐＨ７で測定
して、１．２〜１２、好ましくは１．５〜８の膨潤係数を有する。膨潤係数は、
水中で飽和まで膨潤した粒状ポリマーの体積と無水粒状ポリマーの体積との比と
して定義される。
して、１．２〜１２、好ましくは１．５〜８の膨潤係数を有する。膨潤係数は、
水中で飽和まで膨潤した粒状ポリマーの体積と無水粒状ポリマーの体積との比と
して定義される。
【００４９】 本発明は、平均粒径３〜１００μｍ、細孔直径１０〜１０００ｎｍおよびＢＥ
Ｔ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有し、 ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤２〜３０重量％および ｃ）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなる水不溶性、マクロ細孔性粒状ポリマー、または水中に不
溶性であるが膨潤可能でありそして平均粒径３〜１００μｍを有し、 ａ）アミノモノマー５〜７９．５重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ の重合した単位からなる粒状ポリマーを含んでなる、核酸を単離するための組成
物に関する。
Ｔ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有し、 ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤２〜３０重量％および ｃ）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなる水不溶性、マクロ細孔性粒状ポリマー、または水中に不
溶性であるが膨潤可能でありそして平均粒径３〜１００μｍを有し、 ａ）アミノモノマー５〜７９．５重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ の重合した単位からなる粒状ポリマーを含んでなる、核酸を単離するための組成
物に関する。
【００５０】 これらの組成物は、好ましくは固体含有量０．１〜５０％、特に好ましくは１
〜１０％を有する水分散液の形である。水相は、適する場合には、好ましくは２
〜６の範囲内で有効な緩衝剤を含んでもよい。
〜１０％を有する水分散液の形である。水相は、適する場合には、好ましくは２
〜６の範囲内で有効な緩衝剤を含んでもよい。
【００５１】 例えば試験キットとして処方される組成物の可能な使用領域は、すでに上記の
適用例、例えば細胞、組織物質、血液または病原体からの核酸の単離であって特
に診断問題が関係する場合である。上記のポリマーは、マイクロタイタープレー
トおよび／または試験管内の日常的な核酸試験のための試験キット、または他の
形態、例えばチップ技術の範囲内のものとしても考慮される。
適用例、例えば細胞、組織物質、血液または病原体からの核酸の単離であって特
に診断問題が関係する場合である。上記のポリマーは、マイクロタイタープレー
トおよび／または試験管内の日常的な核酸試験のための試験キット、または他の
形態、例えばチップ技術の範囲内のものとしても考慮される。
【００５２】
実施例１ 式１のアミノモノマーの製造 ２−イソシアナトエチルメタクリレート６２．０８ｇ（０．４ミリモル）を、
６０分間で、クロロホルム２５０ｍｌ中の３−アミノプロピルイミダゾール５０
．０７ｇ（０．４ミリモル）、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール
（安定剤）１４０ｍｇ、ジブチルジラウレート（触媒）１４０ｍｇの攪拌溶液に
、２０℃で冷却しながら滴下して加えた。次いで混合物を５０℃で、ＩＲスペク
トル内にＮＣＯバンドが検出されなくなるまで（約５時間）加熱した。式（Ｉ）
のアミノモノマー１１２ｇが得られた。 実施例２ ゲル粒状ポリマーの製造 脱イオン水１３０ｍｌ中のポリビニルアルコール（モヴィオール(Moviol)(R)
４０−８８）５ｇおよびリン酸水素二ナトリウム１．５ｇの溶液を、パドル形攪
拌機、還流冷却器、温度計、ガス入口管およびガス出口管を有する２５０ｍｌ反
応容器内に導入した。この水溶液に、２０℃で４５０ｒｐｍで攪拌しながら、Ｎ
，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート７．９１ｇ、２−ヒドロキシエチル
メタクリレート７ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート０．１７ｇ、２
，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．２２５ｇおよびクロ
ロホルム３７．５ｇの有機溶液を１５分間で加えた。混合物を窒素を用いて穏や
かにフラッシュし、そして温度を６７℃に上げ、そしてこの温度に２０時間保持
した。冷却の後、形成された粒状ポリマーをデカンテーションにより反応液から
分離し、そして減圧下、５０℃でクロロホルムを除去した。平均粒径２０μｍ、
２５℃、水中で測定した膨潤指数５．１を有する粒状ポリマー１３．５ｇが得ら
れた。 実施例３ マクロ細孔性粒状ポリマーの製造 脱イオン水１２４０ｇ中のポリビニルアルコール（モヴィオール４０−８８）
４２．５ｇおよびリン酸水素二ナトリウム１２．７５ｇの溶液を、パドル形攪拌
機、還流冷却器、温度計、ガス入口管およびガス出口管を有する２ｌ反応容器内
に導入した。この水溶液に、２０℃で２８０ｒｐｍ（毎分の回転数）で攪拌しな
がら、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート２３．７１ｇ、スチレン１
３．０４ｇ、ジビニルベンゼン１０．６７ｇ、２，２’−アゾビス（２，４−ジ
メチルバレロニトリル）０．７１ｇおよびヘキサン３１．６２ｇの有機溶液を３
０分間、２５℃で加えた。混合物を窒素を用いて穏やかにフラッシュし、そして
温度を６６℃に上げ、そしてこの温度に２０時間保持した。内部温度７０〜９８
℃でヘキサンを蒸留除去した。冷却の後、得られた粒状ポリマーをデカンテーシ
ョンにより反応液から分離し、そして減圧下、５０℃で乾燥した。平均粒径１５
μｍ、比表面積６２．３ｍ2 ／ｇを有する粒状ポリマー３５ｇが得られた。 実施例４ マクロ細孔性粒状ポリマーの製造 実施例１からのアミノモノマー２３．７１ｇ、スチレン１３．０４ｇ、ジビニ
ルベンゼン１０．６７ｇ、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリ
ル）０．７１ｇおよびヘキサン３８ｇの有機溶液を用いて実施例３を再度行った
。平均粒径２５μｍ、比表面積７４ｍ2 ／ｇを有するマクロ細孔性粒状ポリマー
３５ｇが得られた。 生物学的結果 ・血液１００μｌを１０5 カスキ(Caski) 細胞と混合した。これらの細胞は、タ
イプ１６のヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）を含む。 ・実施例２からの濃度２．４％の粒子分散液１０μｍをこの混合物に加えた。 ・適当な緩衝液、例えばＴＥ２００μｌの添加後、室温で５分間インキュベーシ
ョンした（ＴＥは、最終濃度でトリスＨＣｌの１０ミリモルおよびエチレンジア
ミン四酢酸１ミリモル、ｐＨ７．４のものを表す）。 ・次いで粒子をエッペンドルフ(Eppendorf) 遠心分離機中、７０００ｒｐｍ、３
分間で沈降させた。 ・次いで適当な緩衝液、例えばＴＥ中の０．５％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０(R ) （ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０(R) は、例えばシグマ(Sigma) から受註番号Ｉ
３０２１で購入できる非イオン性界面活性剤である）２００μｌを沈降物に加え
、そしてあらためて室温で５分間インキュベーションした。
６０分間で、クロロホルム２５０ｍｌ中の３−アミノプロピルイミダゾール５０
．０７ｇ（０．４ミリモル）、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール
（安定剤）１４０ｍｇ、ジブチルジラウレート（触媒）１４０ｍｇの攪拌溶液に
、２０℃で冷却しながら滴下して加えた。次いで混合物を５０℃で、ＩＲスペク
トル内にＮＣＯバンドが検出されなくなるまで（約５時間）加熱した。式（Ｉ）
のアミノモノマー１１２ｇが得られた。 実施例２ ゲル粒状ポリマーの製造 脱イオン水１３０ｍｌ中のポリビニルアルコール（モヴィオール(Moviol)(R)
４０−８８）５ｇおよびリン酸水素二ナトリウム１．５ｇの溶液を、パドル形攪
拌機、還流冷却器、温度計、ガス入口管およびガス出口管を有する２５０ｍｌ反
応容器内に導入した。この水溶液に、２０℃で４５０ｒｐｍで攪拌しながら、Ｎ
，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート７．９１ｇ、２−ヒドロキシエチル
メタクリレート７ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート０．１７ｇ、２
，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．２２５ｇおよびクロ
ロホルム３７．５ｇの有機溶液を１５分間で加えた。混合物を窒素を用いて穏や
かにフラッシュし、そして温度を６７℃に上げ、そしてこの温度に２０時間保持
した。冷却の後、形成された粒状ポリマーをデカンテーションにより反応液から
分離し、そして減圧下、５０℃でクロロホルムを除去した。平均粒径２０μｍ、
２５℃、水中で測定した膨潤指数５．１を有する粒状ポリマー１３．５ｇが得ら
れた。 実施例３ マクロ細孔性粒状ポリマーの製造 脱イオン水１２４０ｇ中のポリビニルアルコール（モヴィオール４０−８８）
４２．５ｇおよびリン酸水素二ナトリウム１２．７５ｇの溶液を、パドル形攪拌
機、還流冷却器、温度計、ガス入口管およびガス出口管を有する２ｌ反応容器内
に導入した。この水溶液に、２０℃で２８０ｒｐｍ（毎分の回転数）で攪拌しな
がら、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート２３．７１ｇ、スチレン１
３．０４ｇ、ジビニルベンゼン１０．６７ｇ、２，２’−アゾビス（２，４−ジ
メチルバレロニトリル）０．７１ｇおよびヘキサン３１．６２ｇの有機溶液を３
０分間、２５℃で加えた。混合物を窒素を用いて穏やかにフラッシュし、そして
温度を６６℃に上げ、そしてこの温度に２０時間保持した。内部温度７０〜９８
℃でヘキサンを蒸留除去した。冷却の後、得られた粒状ポリマーをデカンテーシ
ョンにより反応液から分離し、そして減圧下、５０℃で乾燥した。平均粒径１５
μｍ、比表面積６２．３ｍ2 ／ｇを有する粒状ポリマー３５ｇが得られた。 実施例４ マクロ細孔性粒状ポリマーの製造 実施例１からのアミノモノマー２３．７１ｇ、スチレン１３．０４ｇ、ジビニ
ルベンゼン１０．６７ｇ、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリ
ル）０．７１ｇおよびヘキサン３８ｇの有機溶液を用いて実施例３を再度行った
。平均粒径２５μｍ、比表面積７４ｍ2 ／ｇを有するマクロ細孔性粒状ポリマー
３５ｇが得られた。 生物学的結果 ・血液１００μｌを１０5 カスキ(Caski) 細胞と混合した。これらの細胞は、タ
イプ１６のヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）を含む。 ・実施例２からの濃度２．４％の粒子分散液１０μｍをこの混合物に加えた。 ・適当な緩衝液、例えばＴＥ２００μｌの添加後、室温で５分間インキュベーシ
ョンした（ＴＥは、最終濃度でトリスＨＣｌの１０ミリモルおよびエチレンジア
ミン四酢酸１ミリモル、ｐＨ７．４のものを表す）。 ・次いで粒子をエッペンドルフ(Eppendorf) 遠心分離機中、７０００ｒｐｍ、３
分間で沈降させた。 ・次いで適当な緩衝液、例えばＴＥ中の０．５％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０(R ) （ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０(R) は、例えばシグマ(Sigma) から受註番号Ｉ
３０２１で購入できる非イオン性界面活性剤である）２００μｌを沈降物に加え
、そしてあらためて室温で５分間インキュベーションした。
【００５３】 しかし、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０(R) の代わりに、他の溶解緩衝液の使用
も可能である。挙げることができるその例は、プロテアーゼＫ消化および引き続
いてフェノール／クロロホルムまたはラウリル硫酸ナトリウム溶液（シグマ受註
番号；Ｌ６０２６）、例えば濃度０．５％水溶液を用いる精製を用いる従来法で
ある。 ・改めて遠心分離および沈降を７０００ｒｐｍで３分間、エッペンドルフ遠心分
離機を用いて行った。 ・次いで粒子を適当な緩衝液（例えばＴＥ）を用いて２回洗浄した。第二洗浄工
程の後、上清を廃棄し、そして以後の操作は粒子のみを用いて行った。 ・粒子に結合した核酸の遊離は、０．５Ｎ ＮａＯＨの１μｌを加えてｐＨ＞１
２に調整して行った。 ・次いで、室温で１５分間インキュベーションした。 ・遠心分離（エッペンドルフ遠心分離機中で３分間、７０００ｒｐｍ）の後、得
られた核酸の濃度を適当な方法、例えばゲル系中の分析、特に好ましくは、「浸
漬ゲル核酸電気泳動系」ＢＩＯ−ＲＡＤの受註番号１７０ ４４０６（ウエブペ
ージ：www.bio-rad.com ）により測定した。
も可能である。挙げることができるその例は、プロテアーゼＫ消化および引き続
いてフェノール／クロロホルムまたはラウリル硫酸ナトリウム溶液（シグマ受註
番号；Ｌ６０２６）、例えば濃度０．５％水溶液を用いる精製を用いる従来法で
ある。 ・改めて遠心分離および沈降を７０００ｒｐｍで３分間、エッペンドルフ遠心分
離機を用いて行った。 ・次いで粒子を適当な緩衝液（例えばＴＥ）を用いて２回洗浄した。第二洗浄工
程の後、上清を廃棄し、そして以後の操作は粒子のみを用いて行った。 ・粒子に結合した核酸の遊離は、０．５Ｎ ＮａＯＨの１μｌを加えてｐＨ＞１
２に調整して行った。 ・次いで、室温で１５分間インキュベーションした。 ・遠心分離（エッペンドルフ遠心分離機中で３分間、７０００ｒｐｍ）の後、得
られた核酸の濃度を適当な方法、例えばゲル系中の分析、特に好ましくは、「浸
漬ゲル核酸電気泳動系」ＢＩＯ−ＲＡＤの受註番号１７０ ４４０６（ウエブペ
ージ：www.bio-rad.com ）により測定した。
【００５４】 欧州特許公開（ＥＰ−Ａ）第０ ７０７ ０７７号の方法から公知の核酸抽出
のための粒子と比較して、明確に良い結果が、本発明の方法およびその中で使用
される粒状ポリマーを用いて驚異的に達成された。 ・この方法で得られた上清１５μｌを次いでＨＰＶ−特異性ＰＣＲ（ポリメラー
ゼ連鎖反応）に使用し、すなわち、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）に特異性のプ
ライマーをＰＣＲに使用した。ゲル系内の結果を解析して、期待した核酸バンド
を明らかにはっきりと同定することができた。
のための粒子と比較して、明確に良い結果が、本発明の方法およびその中で使用
される粒状ポリマーを用いて驚異的に達成された。 ・この方法で得られた上清１５μｌを次いでＨＰＶ−特異性ＰＣＲ（ポリメラー
ゼ連鎖反応）に使用し、すなわち、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）に特異性のプ
ライマーをＰＣＲに使用した。ゲル系内の結果を解析して、期待した核酸バンド
を明らかにはっきりと同定することができた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Claims (11)
- 【請求項１】 Ａ）試料を、塩基性および中性の範囲内でイオン性ではない
水不溶性のポリマーとｐＨ７またはこれ未満において混合し、これにより核酸を
吸着する工程、 Ｂ）水不溶性ポリマーを分離する工程、ならびに Ｃ）水不溶性ポリマーを、７を越えるｐＨを有する水相と混合し、これにより吸
着された核酸を遊離する工程、 を含んでなる試料から核酸を単離する方法において、 水不溶性ポリマーが平均粒径３〜１００μｍを有する粒状ポリマーであり、そし
て ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤０．３〜３０重量％および ｃ）ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 生物学的物質が工程Ａ）の後に溶解されることを特徴とする
、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 請求項１および２に記載の工程Ａ）、Ｂ）およびＣ）を含ん
でなる核酸を単離する方法において、ポリマーが、平均粒径３〜１００μｍおよ
びＢＥＴ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有する水溶性、マクロ
細孔性粒状ポリマーでありそして ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤０．３〜３０重量％および ｃ）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなるか、または水不溶性ポリマーが、 水中で良く膨潤可能でありそして平均粒径３〜１００μｍを有しそして ａ）アミノモノマー５〜７９．５重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ の重合した単位からなる粒状ポリマーからなることを特徴とする方法。 - 【請求項４】 平均粒径３〜１００μｍ、細孔直径１０〜１０００ｎｍおよ
びＢＥＴ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有する水不溶性、マク
ロ細孔性粒状ポリマーにおいて、これが ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤２〜３０重量％および ｃ）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなることを特徴とするポリマー。 - 【請求項５】 水に不溶性であるが水中で膨潤可能でありそして平均粒径３
〜１００μｍを有する粒状ポリマーにおいて、これが ａ）アミノモノマー５〜７９．５重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ の重合した単位からなることを特徴とするポリマー。 - 【請求項６】 平均粒径３〜１００μｍ、細孔直径１０〜１０００ｎｍおよ
びＢＥＴ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有する水不溶性、マク
ロ細孔性粒状ポリマーを製造する方法において、 ａ）アミノモノマー５〜９８重量部 ｂ）架橋剤２〜３０重量部および ｃ１）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量部 ｄ）ポロゲン１０〜１５０重量部および ｅ）フリーラジカル形成剤０．１〜２．５重量部 の混合物を、保護コロイドを用いて水性媒体内に分散させ、次いで得られた分散
液をフリーラジカル形成剤の分解温度まで加熱して重合させ、そして重合が起き
た後に、ポロゲンを抽出および／または蒸発により除去することを特徴とする方
法。 - 【請求項７】 水中に不溶性ではあるが膨潤可能でありそして平均粒径３〜
１００μｍを有する粒状ポリマーの製造方法において、 ａ）アミノモノマー５〜７９．７重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ１）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ ｄ）溶剤１０〜１５０重量部および ｅ）フリーラジカル形成剤０．１〜２．５重量部 の混合物を、保護コロイドを用いて水性媒体内に分散させ、次いで得られた分散
液をフリーラジカル形成剤の分解温度まで加熱して重合させ、そして重合が起き
た後に、溶剤を抽出および／または蒸発により除去することを特徴とする方法。 - 【請求項８】 式（Ｉ） 【化１】 のアミノモノマー。
- 【請求項９】 ２−イソシアナトエチルメタクリレートを３−アミノプロピ
ルイミダゾールと反応させることを特徴とする、請求項８記載の式（Ｉ）のアミ
ノモノマーの製造方法。 - 【請求項１０】 平均粒径３〜１００μｍ、細孔直径１０〜１０００ｎｍお
よびＢＥＴ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有し、 ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤２〜３０重量％ ｃ）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなる水不溶性、マクロ細孔性粒状ポリマー、または水中に不
溶性であるが膨潤可能でありそして平均粒径３〜１００μｍを有し、 ａ）アミノモノマー５〜７９．５重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ の重合した単位からなる粒状ポリマーの、試料から核酸を単離するための使用。 - 【請求項１１】 平均粒径３〜１００μｍ、細孔直径１０〜１０００ｎｍお
よびＢＥＴ法により測定した比表面積５〜５００ｍ2 ／ｇを有し、 ａ）アミノモノマー５〜９８重量％ ｂ）架橋剤２〜３０重量％および ｃ）疎水性ビニルモノマー０〜９３重量％ の重合した単位からなる水不溶性、マクロ細孔性粒状ポリマー、または水中に不
溶性であるが膨潤可能でありそして平均粒径３〜１００μｍを有し、 ａ）アミノモノマー５〜７９．５重量％ ｂ）架橋剤０．３〜１０重量％および ｃ）親水性ビニルモノマー１０〜９３重量％ の重合した単位からなる粒状ポリマーを含んでなる、試料から核酸を単離するた
めの組成物。
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|---|---|---|---|
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| DE19907023A DE19907023A1 (de) | 1999-02-19 | 1999-02-19 | Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren |
| PCT/EP2000/001028 WO2000049031A2 (de) | 1999-02-19 | 2000-02-09 | Verfahren zur isolierung von nucleinsäuren |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002537306A true JP2002537306A (ja) | 2002-11-05 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012513385A (ja) * | 2008-12-23 | 2012-06-14 | キアゲン ゲーエムベーハー | 核酸の精製法 |
| WO2017110091A1 (ja) * | 2015-12-25 | 2017-06-29 | 株式会社クラレ | 水性エマルジョン及びそれを用いた接着剤 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6958392B2 (en) * | 1998-10-09 | 2005-10-25 | Whatman, Inc. | Methods for the isolation of nucleic acids and for quantitative DNA extraction and detection for leukocyte evaluation in blood products |
| US6383783B1 (en) * | 1999-09-21 | 2002-05-07 | 3M Innovative Properties Company | Nucleic acid isolation by adhering to hydrophobic solid phase and removing with nonionic surfactant |
| DE10261910A1 (de) * | 2002-12-30 | 2004-07-15 | Polymerics Gmbh | Adsorbermaterial für Blut-, Blutplasma- und Albuminreinigungsverfahren |
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| DE3935098C2 (de) * | 1989-10-21 | 1995-05-24 | Macherey Nagel & Co Chem | Chromatographisches Trägermaterial sowie seine Verwendung in einem Verfahren zur chromatographischen Trennung von Nukleinsäuren |
| NZ247458A (en) * | 1992-05-29 | 1994-09-27 | Rohm & Haas | Crosslinked beads predominantly formed from methacrylic anhydride, preparation and use in separation processes |
| US5804684A (en) * | 1995-08-24 | 1998-09-08 | The Theobald Smith Research Institute, Inc. | Method for isolating nucleic acids |
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-
1999
- 1999-02-19 DE DE19907023A patent/DE19907023A1/de not_active Withdrawn
-
2000
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- 2000-02-09 AU AU25471/00A patent/AU2547100A/en not_active Abandoned
- 2000-02-09 EP EP00903676A patent/EP1155026A2/de not_active Withdrawn
- 2000-02-09 WO PCT/EP2000/001028 patent/WO2000049031A2/de not_active Application Discontinuation
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