JP3395906B2

JP3395906B2 - 核酸断片の分離法

Info

Publication number: JP3395906B2
Application number: JP51239094A
Authority: JP
Inventors: グンターボン、; クリスティアンフーバー、; ペーターエフナー、
Original assignee: トランスジエノミツク・インコーポレーテツド
Priority date: 1992-11-18
Filing date: 1993-11-17
Publication date: 2003-04-14
Anticipated expiration: 2018-04-14
Also published as: GR3029863T3; ATA228592A; EP0669897A4; US5585236A; EP0669897B1; ATE176454T1; EP0669897A1; AT398973B; DE69323435D1; WO1994011305A1; JPH08505700A; AU5667894A; ES2130396T3; DK0669897T3; DE69323435T2

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本願発明は、無孔性（nonporous）高分子ビーズを用
いた核酸の分離法に関する。より詳細には、本願発明
は、アルキル化無孔性高分子ビーズを含んでいるクロマ
トグラフ・カラムを用いるクロマトグラフィーによる一
本鎖及び二本鎖の両核酸のクロマトグラフィー的分離に
関する。

背景技術核酸の分離は科学的興味対象の焦点になっており、多
くの研究者グループが、この分野における種々の技術的
局面の改善を達成すべく努力している。陰イオン交換分
離は、イオン対／逆相クロマトグラフィーともども、核
酸種の分離を目的として最も頻繁に用いられる方法の１
つである。

欧州特許出願（EP 0 507 591 A2）において、W.Bloch
は、DNA断片の長さ関連の分離は、溶離液を含有するテ
トラメチルアンモニウムクロリド（TMAC）を使った無孔
性陰イオン交換体で、ある程度まで可能であることを示
した。しかし、本願発明の図５に示すように、458及び5
04塩基対（46塩基対の差）をもつ断片が同時に溶離し分
離できない。とはいえ一方では、僅かに34塩基対だけ異
なる断片（434及び458塩基対をもつ断片）を分離するこ
とは可能であった。

さらに、TMACの添加は、分離度（resolution）の顕著
な全面的低下の原因となる。また、Blochの方法による
分離を達成するのに必要なイオン強度の勾配のため及び
高濃度の不揮発性塩生成のため、その後の分離断片に関
する試験と測定は何れも不可能である。

Y.Ohimya等（Y.Ohimya等、Anal.Biochem.,（1990）,1
89:126−130）によって報告されたトリメチルアンモニ
ウム基を保持している陰イオン交換物質でのDNA断片の
分離法は、DNA断片の分離にジエチルアミノエチル基を
有する陰イオン交換体を利用する方法（Y.Kato等、J.Ch
romatogr.,（1989）,478:264）と同じ欠点がある。厳密
にDNA断片の寸法に依存する分離は、両方法では不可能
である。さらに、分離断片に対するその後の測定は、こ
れらの分画の高い塩分濃度のため何れも不可能である。

二本鎖核酸の陰イオン交換分離が抱える重大な不利点
は、GC−及びAT−塩基対の保持挙動が異なることであ
る。この効果のため、分子サイズによる分離が不可能と
なる。従って、核酸分析に対する陰イオン交換の一般的
有用性は大幅に縮小される。陰イオン交換法に関する他
の重要な欠点は、核酸の分子量の全範囲にわたって溶離
を達成するためにイオン強度の勾配を使う必要があるこ
とである。イオン強度の勾配に起因する塩による溶離ピ
ークゾーンの酷い汚染のため、それに続くDNA分子断片
の調査が非常に困難となる。

また、二本鎖DNA断片の分離に逆相／イオン対クロマ
トグラフィーを利用することについても、少なくともEr
iksson等が紹介した現行方法手順では深刻な欠点があ
る。最も重大なことには、この方法のもつ比較的低分離
効率のため、極く短い制限断片に対する分離度が不十分
となり且つ回収率が低くなることである。イオン対／逆
相クロマトグラフィーでの典型的分析実行時間は、１乃
至数時間の範囲である（S.Eriksson,G.Glad,P.A.Pernem
alm,E.Westman J.Chromatogr（1986）,359:265−274参
照）。

無孔性高分子充填ビーズを用いるいくつかの限定分離
は、Biochromatography,（1986）,1:16;（1986）,1:22;
（1986）,1:68;（1987）,2:4）においてJ.Thompsonによ
り報告された。

Huber等は、いち早く、逆相／イオン対クロマトグラ
フィーの固定相として無孔性ポリスチレンビーズを利用
することを徹底して議論した。Eriksson等によって用い
られた方法の不利なところは、逆状態の固定相に多孔性
シリカビーズを使用していることに集中すると考えられ
た（C.G.Huber,P.J.Oefner及びG.K.Bonn,J.Chromatog
r.,（1992）,599:113−118）。Huber等は、一本鎖の核
酸の分離は、事実、シリカを素地とした逆相物質を無孔
性ポリスチレンビーズに切り替えることにより改善でき
ることを示すことができた。さらに別の改善は、ポリス
チレン無孔性ビーズにポリビニルアルコールを含ませて
行われた。ポリビニルアルコールを含有させるには、無
孔性高分子ビーズを導出する手順の合成段階の１つで添
加するという方法を採った。

一方、Huber等は、それらの高分子ビーズで二本鎖の
核酸に対しても同種類の改善を達成することはできなか
った。さらに詳細には、二本鎖の分子に関しては、彼ら
は150を上回る塩基対を有する全ての分析物に対して分
離度が不十分であることを観測した。

改善された分離効率と分離度をもって核酸を分離する
クロマトグラフィー法に対する要請は依然として現存し
ている。

発明の概要それ故、本願発明の一つの目的は、改善された分離度
と効率で核酸を分離するクロマトグラフィー法を提供す
ることにある。

この目的及び以降の説明から明らかになるであろう他
の目的は、核酸がアルキル化無孔性高分子ビーズを充填
した分離カラムを使ってクロマトグラフィー的に分離さ
れる本願発明の方法により達成されている。

図面の簡単な説明図1aは、無孔性ポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニ
ルベンゼン）ビーズを充填したカラムによるDNA制限断
片の分離を示すクロマトグラムである。図1bは、ポリビ
ニルアルコールで処理した無孔性ポリ（エチルビニルベ
ンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを充填したカラムに
よる同じDNA制限断片の分離を示すクロマトグラムであ
る。図1cは、本願発明のアルキル化無孔性ポリ（エチル
ビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用した
同じDNA制限断片の分離を示すクロマトグラムである。

図２は、実施例２によるDNA制限断片の高分解能分離
を示すクロマトグラムである。

図３は、実施例３によるPCR生成物の高速反復分離・
分析を示すクロマトグラムである。

発明を実施するための最良の形態その最も一般的な形では、本願発明の主題は、平均直
径約１〜100ミクロン、好ましくは１〜10ミクロン、よ
り好ましくは１〜５ミクロンを有する無孔性高分子ビー
ズを充填したカラムを使って逆相イオン対クロマトグラ
フィー（RPIPC）により核酸を分離することである。平
均直径1.5〜3.0ミクロンを有するビーズは最も好ましい
ものである。カラムビーズのクロマトグラフィー上の効
率は、その表面及び近表面領域の特性によって顕著に影
響を受ける。この理由から、次の説明は高分子ビーズの
近接表面（close−to−the−surface）領域に特に関連
している。そのようなビーズの本体及び／又は中心部分
は、本願発明の高分子ビーズの表面又はその近くで観測
されたそれらとは全く異なった化学的性質及び一連の物
理的特性を示してよい。

本願発明の方法は、ほとんどの場合、約600以下の塩
基対を有する核酸の分離に用いられるであろうが、約10
00以下の塩基対を有する核酸の分離にも用いることがで
きる。この方法により、約200〜600の塩基対を有する比
較的長い核酸に対して及び僅かに約20〜800の塩基対を
有する短い核酸の分離に対しても良好な分離が行われ
る。本方法によって分離できる核酸には、DNAとRNAの一
本鎖及び二本鎖の両核酸が含まれる。核酸の混合体を含
有している試料は、核酸の全体的合成、制限エンドヌク
レアーゼによるDNAまたはRNAの開裂、並びにポリメラー
ゼ連鎖反応技術を使って増やされ且つ増幅された核酸試
料に由来してもよい。

本願発明の無孔性高分子ビーズは、２段階の処理で作
製され、そこでは先ず小さい種ビーズ（seed beads）が
適当な重合性単量体の乳化重合によって生成される。本
願発明の乳化重合手順は、Goodwin等（J.W.Goodwin,J.H
earn,C.C.Ho及びR.H.Ottewill,Colloid ＆ Polymer Sc
i.,（1974）,252:464−471）の手順を改良したものであ
る。種ビーズを生成する乳化重合処理に用いてよい単量
体には、スチレン、アルキル置換スチレン、アルファ−
メチルスチレン、及びアルキル置換アルファ−メチルス
チレン、好ましくはベンゼン環が１−４個のC_1-6アルキ
ル基で置換されている単量体、及び、例えば、米国特許
第4,563,510号に記載の単量体がある。この特許はその
全体を参考としてここに引用している。その後、高分子
種ビーズを拡大し、アルキル化して本願発明の無孔性高
分子ビーズを作り出すのである。

乳化重合で作られた種ビーズは、高分子ビーズのサイ
ズを大きくするために既知の任意のプロセスで拡大して
よい。例えば、高分子ビーズは、米国特許第4,563,510
号に開示された活性化膨潤プロセスで拡大してよい。拡
大もしくは膨潤した高分子ビーズは、架橋性重合性単量
体及び重合開始剤でさらに膨潤される。重合によって拡
大高分子ビーズの架橋密度が増加し、ビーズの表面気孔
率が減少する。適当な架橋性単量体は、開始剤の存在下
で重合できる少なくとも２つの炭素−炭素二重結合を含
むものである。望ましい架橋性単量体は、ジビニル単量
体、好ましくはC_4-20アルキル及びアリール（フェニ
ル、ナフチル、等）ジビニル単量体であり、ジビニルベ
ンゼン、ブタジエン、等を含む。高分子種ビーズの活性
化膨潤は、１から約100ミクロン以下の範囲の平均直径
を有する高分子ビーズを作るのに有用である。

あるいは、高分子種ビーズは、乳化重合から生ずる種
ラテックス（seed latex）を単に加熱して拡大してよ
い。この代替法では、活性溶剤による種ビーズの活性化
膨潤の必要性はなくなる。その代わり、種ラテックス
は、架橋性単量体用の水混和溶剤を使うか又は使わず
に、架橋性単量体及び上述の重合開始剤と混合される。
適当な溶剤としては、アセトン、テトラヒドロフラン
（THF）、メタノール及びジオキサンがある。得られる
混合物は、重合開始剤の開始温度以下の温度、一般的に
は約10〜80℃、好ましくは30〜60℃で、約１〜12時間、
好ましくは約４〜８時間加熱する。自由選択により、混
合物の温度を10〜20％高くし、さらに１〜４時間追加加
熱してよい。単量体の重合開始剤に対する比は、少なく
とも200の重合度を保証するためには、少なくとも100:
1、好ましくは約100:1〜約500:1、より好ましくは約20
0:1である。この重合度を有するビーズは、高圧液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）の用途に使えるよう圧力的に
十分安定している。この熱膨潤プロセスによって、ビー
ズの寸法を約110〜160％増大して、約５ミクロン以下、
好ましくは約２〜３ミクロンの平均直径を有する高分子
ビーズを得ることが可能となる。それ故、熱膨潤プロセ
スは、活性化膨潤法によってのみ予め入手可能な小さ目
の粒子サイズを得るのに使うことができる。

熱による拡大に続いて、余分の架橋性単量体を取除
き、その粒子を紫外線又は熱に曝して重合させる。重合
は、例えば、拡大した粒子を重合開始剤の活性化温度ま
で加熱し、所望の重合度が達成されるまで重合を続行す
ることにより実行してよい。加熱と重合を続行すること
により、500を上回る重合度を有するビーズを得ること
が可能となる。このプロセスで作製されたビーズの孔径
は30オングストロームより小さい。

本願発明では、Huber等によってもしくは米国特許第
4,563,510号によって作られた充填物質は改良され、少
なくとも３つの炭素原子を有する（エチルより長い）ア
ルキル鎖をもつ高分子ビーズのアルキル化により、一般
的に、短い核酸断片のRPIPCに対してのみならず考えら
れる任意の長さの断片にも適用することができる。アル
キル化という有益な効果は、DNA分離に関する分野に携
わるどの専門家にとっても驚きである。

十分に多孔性のアルキル化ポリスチレンビーズを使う
ことは、最初にMorganとCelebuski（R.L.MorganとJ.E.C
elebuski,J.Chromatogr.（1991）,536:84−93）によっ
て報告された、これらの筆者は、フルオレセイン又はビ
オチンで標識された核酸を無修正の十分に多孔性のポリ
−（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズ（PRP−１カ
ラム、Hamilton社、Reno,Nevada）から十分に溶離でき
ないという問題に対する解決策を見いだした。調製規模
の分離のための大量注入に続いて、標識された核酸はカ
ラムから完全に溶離できず、その後の分離ではゴースト
ピークとして溶離していることが観測された。この好ま
しくない挙動は、オクタデシル置換基（Polyspher RP−
18,EM Science,Cherry Hill,NJ,USA）で改良された別方
式の十分に多孔性のポリ−（スチレン−ジビニルベンゼ
ン）ビーズに切り替えることにより矯正された。しか
し、そうすることで溶離挙動は改善できたが、溶離ピー
クの分離度はむしろ劣ったままであった。

Huber等の研究は、核酸分離における最初の分離度の
改善がポリビニルアルコールを高分子ビーズに混和する
ことにより成就されたという理由から、本願発明の主題
とは外れている。前述の有益な効果は、筆者によって高
分子ビーズの表面もしくはそれに近接して極性のヒドロ
キシル基が存在することによるものと解釈された。それ
故、本願発明のオクタデシル基のような無極性置換基で
改良されたビーズに基づく全種類の核酸分離の分離度と
効率が大幅に改善されたことは、非常な驚きであった。

本願発明の無孔性高分子ビーズは、少なくとも３つの
炭素原子を有するハロゲン化アルキルのようなアルキル
化剤にビーズを接触させることによりアルキル化する。
適当なハロゲン化アルキルは、少なくとも３つの炭素原
子、好ましくは約３〜22の炭素原子、より好ましくは約
８〜18の炭素原子を含有している直鎖又は分岐した塩化
アルキル、臭化物及びヨウ化物である。アルキル化は、
無孔性高分子ビーズをフリーデル−クラフツ（Friedel
−Crafts）触媒の存在下でハロゲン化アルキルと混合し
て高分子ブレンド表面の芳香環で求電子芳香核置換（el
ectrophilic aromatic substitution）を起こさせるこ
とにより達成されるものである。適当なフリーデル−ク
ラフツ触媒は当業者によく知られたものであり、それに
はルイス酸、例えば塩化アルミニウム、三ふっ化ほう
素、四塩化スズ、等がある。無孔性高分子ビーズのアル
キル化により、高分子ビーズ表面への芳香基の好ましく
ない吸収は高分子ビーズ表面の芳香分子部分を遮蔽する
ことで軽減される。芳香基の吸収の軽減により本方法の
分離効率が改善される。

アルキル化は、多くの既知の合成手順で行ってよい。
これらには、ハロゲン化アルキルを用いたフリーデル−
クラフツのアルキル化、エーテルを形成するアルキルア
ルコールのクロロメチル化ビーズへの付着、等がある。
本願発明の無孔性高分子ビーズをアルキル化する好まし
い方法は、高分子ビーズが形作られた後でアルキル化す
ることであるが、アルキル化の代替法は、アルキル化さ
れた単量体を重合してアルキル化高分子ビーズを得るも
のである。この実施態様では、その単量体は、少なくと
も３つの炭素原子、好ましくは３〜22の炭素原子、より
好ましくは８〜18の炭素原子を有するアルキル基で置換
されてアルキル化高分子ビーズを供給する。

ここで用いられている用語“無孔性”（nonporous）
は、水銀気孔率測定法を使って測定して直径30オングス
トローム未満の表面孔を有する高分子ビーズを指すもの
とする。本願発明で作製された無孔性ビーズに関する窒
素吸着（BET）測定では、理論的表面積のほぼ２倍の表
面積であった。好ましくは、本願発明の無孔性ビーズ
は、窒素吸着で測定して約６〜30、好ましくは10〜20m²
/gの表面積をもつ。

本願発明によるRPIPCの改善により、先ず初めに、腫
瘍遺伝子及びウイルス遺伝子の臨床診断におけるこの方
法論の広範囲な応用についての可能性が開拓される。現
行の臨床実務では、ウイルス遺伝子に対する検定は、通
常、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の生成物及びスラブ
ゲル電気泳動（SGE）を使って実施される。SGEは、多く
の労力集中段階から成るむしろ労力を要する処置であ
り、自動化は容易にはし難いものである。遺伝子検定に
対するプロトコルは、N.C.Stellwageny Adv.Electropho
resis,（1987）,1:177−228に記述されており、参考ま
でにここに引用した。

PCR生成物のクロマトグラフィー分離は、最初に、Kat
z等（E.D.Katz,L.A.Haff及びR.Eksteen,J.Chromatogr.,
（1990）,512:433−444）により報告された。Katz等に
採用された方法（陰イオン交換HPLC又はAEHPLC）は、上
記で議論した低分離度という不利さだけではなく、PCR
試料から及びカラムを通して徐々に溶離するイオン性不
純物に起因して基線が徐々に持ち上がる現象をも示すも
のである。これらの欠点は、極端に長い実行時間ともど
も、臨床診断にAEHPLCを実際に利用することを阻んでき
た。

従って、本願発明は、ヒト又は動物の器官における悪
性腫瘍及び／又はウイルス性疾病の検出に関して、これ
らの疾病の特異的マーカーである核酸の分離と識別によ
る時間効率の良い診断に役立つ検定を可能にする。本願
発明の分離法は、既知のPCR技術の助力で増幅された腫
瘍形成遺伝子またはウイルス遺伝子に直接適用できるも
のである。本願発明の分離法により、本願発明のアルキ
ル化無孔性高分子ビーズを充填したカラムを使って稼動
するRPIPCに基づくPCR生成物の有効な分離と定量的測定
が可能となる。

本願発明の分離法は、一般的に、一本鎖及び二本鎖核
酸のクロマトグラフ的分離に適用することができる。好
ましい具体例では、分離はRPIPCによるものである。ま
た、本願発明の範囲内で、アルキル化無孔性ビーズを使
うのは固相抽出処置においてである。

特に好ましい具体例では、高分子ビーズは、狭い粒子
サイズ分布を生ずる２段階プロセスで作られた無孔性、
球状のポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼ
ン）である。これらの２段階の初段で、スチレンが乳化
重合され、平均直径約0.8〜３ミクロン、より好ましく
は1.5〜２ミクロンを有するポリスチレンの種粒子を形
作る。手順の第二の段階で、ポリスチレンの種粒子は、
モノビニル及びジビニル単量体の混合物（即ち、エチル
ビニルベンゼンとジビニルベンゼン）と接触させ、１〜
10ミクロンのサイズまで膨潤させる。その後、反応混合
物の温度を段階的に上昇させることにより重合する。急
な変化よりむしろ段階的温度変化は、一般的に球状をし
ているビーズの集塊形成を回避するのに役立つ。

RPIPCにおいて、核酸は、イオンペアリング（ion pai
ring）剤で１対にし、次いで本願発明のアルキル化ビー
ズを使って逆相クロマトグラフィーにかける。イオンペ
アリング剤の同一性は重大ではなく、核酸とイオン対を
形成できる在来のイオンペアリング剤は、本願発明に使
ってよい。典型的なイオンペアリング剤には、有機又は
無機酸のトリアルキルアンモニウム塩、例えば、テトラ
メチル、テトラエチル、テトラプロピル及び酢酸テトラ
ブチルアンモニウム、ハロゲン化物、等がある。特に好
ましいイオンペアリング剤は酢酸テトラエチルアンモニ
ウム（TEAA）である。

核酸の高分解能クロマトグラフ分離を達成するには、
クロマトグラフカラムに固相高分子ビーズを密に充填す
る必要がある。適当な高分解能分離を得るため、カラム
充填物質をカラムに充填する既知の何れの方法も、本願
発明に用いてよい。典型的には、アルキル化高分子ビー
ズのスラリーは、高分子ビーズの密度と等しいか又はそ
れより小さい密度をもっている溶剤を使って作製され
る。その後、カラムに高分子ビーズのスラリーを充填
し、振動するか又は攪拌してカラム内の高分子ビーズの
充填密度を高める。機械的振動もしくは超音波処理する
ことは、充填密度改善に典型的に用いられることであ
る。

例えば、50x4.6mm（内径）のカラムを充填するため、
1.4gのアルキル化ビーズを15mlのテトラヒドロフラン中
で超音波を使って懸濁してよい。次いでその懸濁液を70
MPaの圧力の50mlのメタノールを使ってカラムに充填
する。最終段階で、その充填層を50mlの脱イオン水で洗
浄する。これによりビーズの膨潤が軽減され、充填層の
密度が高められる。

本願発明の他の特長は、発明を限定しようとするもの
ではなくて発明の説明のために与えられる下記の例示的
具体例を説明する過程で明らかとなろう。

実施例実施例１塩化ナトリウム（0.236g）を容積1.0リットルの反応
器中の354mlの脱イオン水に加えた。反応器には、機械
的攪拌機、還流冷却器及びガス導入管を装備した。塩化
ナトリウムの溶解は、不活性雰囲気（アルゴン）下で、
攪拌（350rpm）しながら且つ高温（87℃）で実施した。
その後、新規に蒸留したスチレン（33.7g）と、50mlの
脱イオン水に溶かした0.2184gのペルオキソ二硫酸カリ
ウム（K₂S₂O₈）を添加した。この添加後直ちにガス導入
管を溶液から引き上げ、液体表面上に配置した。次ぎ
に、反応混合物を87℃で6.5時間攪拌した。この後、反
応器の内容物を周囲温度まで冷却し、第一段階で生ずる
懸濁液の容積1000ml中に54.6gの濃度の重合スチレンを
生ずる容積まで希釈した。1000ml中の重合スチレンの量
は、機械的攪拌機にそのまま粘着している重合体の量
（ほぼ５〜10g）を含めて計算した。懸濁液中の球形ビ
ーズの直径は、光顕微鏡により約1.0ミクロンであると
決定した。

第一段階から生ずるビーズは、クロマトグラフの充填
剤として使うには、依然として一般的には小さ過ぎ且つ
柔らか過ぎる（圧力の安定性が低い）ものである。これ
らのビーズが柔らかいのは、架橋度が不十分であること
が原因である。第二段階で、ビーズが拡大され、架橋度
が高められる。第二段階に対するプロトコルは、Ugelst
ad等（J.Ugelstad,P.C.Mork,K.Herder Kaggerud,T.Elli
ngsen及びA.Berge,Adv.Colloid Interface Sci.,（198
0）,13:101−140）によって説明された活性化膨潤法に
基づいている。活性化膨潤又は第二の合成処置を開始す
るため、第一段階からのポリスチレンの種の水性懸濁液
（200ml）を先ず60mlのアセトンと、次いで60mlの１−
クロロドデカン乳濁液と混合した。乳濁液を作製するに
は、0.206gの硫酸ドデシルナトリウム、49.5mlの脱イオ
ン水及び10.5mlの１−クロロドデカンを一緒にし、得ら
れる混合物を４時間の間０℃に保ち、その間ずっと超音
波をかけて混合し、＜0.3ミクロンの微細乳濁液が得ら
れるまで続けた。ポリスチレンの種、アセトン及び１−
クロロドデカン乳濁液の混合物を室温で約12時間攪拌
し、その間にビーズの膨潤が生じた。その後、アセトン
を80℃での30分蒸留により取り除いた。アセトン除去に
続いて、膨潤ビーズは、開始剤としてさらに2.5gの過酸
化ジベンゾイルを含有する310gのエチルジビニルベンゼ
ンとジビニルベンゼン（DVB）の（1:1.71）混合物を付
加することにより、さらに成長させた。その成長は、攪
拌で現れ及び光顕微鏡による不定期の粒子サイズ測定で
見出された。

膨潤及び成長段階終了後、反応混合物を分液漏斗に移
した。無攪拌溶液では、単量体の余剰量は、高分子ビー
ズの懸濁液を含有している層から分離し、従って容易に
取り除くことができた。残留しているビーズの懸濁液を
反応器に戻し、その温度を段階的に（63℃で約７時間、
73℃で約２時間及び83℃で約12時間）上昇させ、その結
果重合度がさらに高まった（＞500）。この方法で作製
したビーズの孔径は、水銀多孔度計の検出限界以下であ
った（＜30オングストローム）。

乾燥後、段階２からの乾燥ビーズ（10g）を100mlの１
−クロロドデカンに懸濁し、1gの塩化アルミニウムの付
加に続いて100℃で12時間攪拌した（370rpm）。この時
間が終わった時点で、反応混合物を80℃まで冷やし、15
0mlの4M塩酸と混合した。２分攪拌後、今度は塩酸を含
有している反応混合物を分液漏斗に移し、その上に300m
lのｎ−ヘプタンを重ねた。相を攪拌して混ぜ合わせ、
続いて相が分離した後、水性相を除去し捨てた。残りの
有機相をさらに２回200mlの1M塩酸で洗浄し、続いて500
0rpmで遠心分離した。分離したビーズを100mlのｎ−ヘ
プタンで４回、次いで100mlのジエチルエーテル、100ml
のジオキサン及び100mlのメタノールでそれぞれ２回洗
浄した。最後にビーズを乾燥した。

あるいは、アルキル化は、塩化スズを用いて、他の点
では塩化アルミニウムを利用するそれと類似の処置によ
り実行された。100mlの１−クロロオクタデカン、10gの
ポリ（スチレン／エチルスチレン／ジビニルベンゼン）
ビーズ及び5mlのSnCl₄を100℃で12時間攪拌した。その
混合物を室温まで冷やし、100mlのｎ−ヘプタンを加
え、次いでその混合物を分液漏斗における4x300mlの水
で抽出した。それに続く遠心分離を5000rpmで５分間実
行した。上澄みと１−クロロオクタデカンを捨て、且つ
できるだけ完全に水を除去した。2x150mlのｎ−ヘプタ
ン、2x150mlのジオキサン及び2x150mlのメタノールで洗
浄してその処置を終了した。各々の洗浄段階の後で5000
rpmの遠心分離が行われた。続いて、アルキル化ビーズ
は、60℃で乾燥した。

重合体の芳香環のアルキル化は、フーリエ変換赤外分
光光度計（FTIR）で確認した。ビーズは、そのサイズが
お互いに僅かだけ異なっていた。粒径の平均値は、0.12
ミクロンの標準偏差で2.10ミクロンであることが分かっ
た。

一本及び二本鎖の核酸の分離は、RPIPCを使って達成
された。酢酸トリエチルアンモニウムをイオンペアリン
グ剤として用いた。溶離は、アセトニトリルの線形有機
溶剤の勾配を使って実施した。

図１は、上述のように作製した無孔性ポリ（エチルビ
ニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズでのDNA制限
断片の分離を示す。クロマトグラフ条件は、次の通りで
ある。カラム:50X4.6cm（内径）、移動相:0.1M TEAA,p
H7.0、勾配:7.5〜13.75％アセトニトリル（４分）、続
いて13.75〜16.25％アセトニトリル（６分）、流速:1ml
/分、カラム温度:50℃、検出:254nmのUV、試料:0.5μｇ
pBR322 DNA−Hae III制限消化。

図１（ａ）は、未改良ビーズによる分離を示し、図１
（ｂ）は、Huber等による手順に従ってポリビニルアル
コールで改良したビーズによる分離を示す．図１（ｃ）
は、上述の合成手順で作ったアルキル化ビーズで実行し
た結果を示す。３つのクロマトグラムの内、最後の１
つ、即ち図１（ｃ）だけが、広範囲の断片の長さにわた
って塩基数に関連してはっきりした断片特性を示してい
る。図１（ｂ）に示すような比較的短い断片長では、ポ
リビニルアルコールで改良したビーズが利用できる特性
を有しており、図１（ａ）のそれを凌ぐ改善された分離
度を示している。

実施例２ポリスチレン種ラテックスは、0.374gのNaCl、0.1638
のK₂S₂O₈、404mlの水、37mlのスチレンを使って作製
し、81℃,350rpmで６時間攪拌した。得られる種粒子の
直径は1.3ミクロンであった。次いで、200mlの種ラテッ
クスを、50mlのジビニルベンゼン、0.5の過酸化ジベン
ゾイル、及び5mlのアセトンの混合物で膨潤した。混合
物を40℃で６時間及び45℃で１時間攪拌した。粒子の最
終的直径は1.8ミクロンであった。次ぎに、余剰のジビ
ニルベンゼンを除去し、粒子を65℃で12時間、続いて85
℃で14時間重合した。

実施例３ 2.0ミクロンの種ポリスチレンは、0.374gのNaCl、K₂S
₂O₈、404mlの水、37mlのスチレンを使って作製し、71
℃,350rpmで12時間攪拌した。得られる種粒子は、2.0ミ
クロンであった。膨潤及び重合後では、最終の無孔性ビ
ーズ生成物は2.8ミクロンであった。最終の生成物を洗
浄し、先に述べた合成法の条件を使って１−クロロオク
タデカンでアルキル化した。DNA断片の分離には、これ
らの粒子を充填した4.6x50mmのカラムを用いた。

実施例４ハイブリッド形成及びDNAの配列決定を含む分子生物
学における多くの実験では、³²P又は³³Pのような放射性
同位元素もしくは蛍光染料、例えばフルオレセイン、
2',7'−ジメトキシ−4',5'−ジクロロフルオレセイン、
テトラメチルローダミン及びローダミン、を用いて核酸
に標識付けする必要がある（S.Fung等、Method of Dete
cting Electrophorectically Separated Oligonucleoti
des;米国特許第4,855,225号）。放射性同位元素及び蛍
光染料の結合は、通常不完全なため、標識された核酸は
未反応核酸から完全に浄化精製しておかなければならな
い（そうしないと配列決定及びハイブリッド形成に際し
て、染料で標識されたプライマー及びプローブと競合す
ることになる）。

標識した試料の精製は、無孔性のアルキル化（C₁₈）
ポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビー
ズでのRPIPCにより簡単且つ迅速に完了した。核酸の回
収率は、少なくとも96％であった。

蛍光染料で標識された核酸の未反応核酸からの分離
は、逆相クロマトグラフィーだけで、即ち、イオンペア
リング剤の存在しない状態で、実施してもよい。何故な
ら、発蛍光団（fluorophore）の疎水性により、アルキ
ル化固定相でのそれらの保持が未反応核酸と比較して著
しく増大されるからである。

実施例５図２は、オクタデシルで改良された無孔性ポリ（エチ
ルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用し
たDNA制限断片の高分解能分離を示す。実験は次の条件
下で実行した。カラム:50x46mm（内径）、移動相:0.1M
TEAA,pH7.0、勾配:8.75〜11.25％アセトニトリル（２
分）、続いて11.25〜14.25％アセトニトリル（10分）、
14.5〜15.25％アセトニトリル（４分）、及び15.25〜1
6.25％アセトニトリル（４分）、流速:1ml/分、カラム
温度:50℃、検出:254nmのUV、試料:0.75μg p BR322
DNA−Hae III制限消化および0.65μｇφx174 DNA−Hin
c II制限消化の混合物。

議論した固定相の使用に加えて、図２に示された高分
解能は、酢酸トリエチルアンモニウム（TEAA）の濃度、
勾配曲線の形状、カラム温度及び流速を最適化すること
により得られたものである。酢酸トリエチルアンモニウ
ムの濃度に関する限り、ピークの分離度は、TEAAが25mM
から少なくとも125mMに達するうちは連続的に向上し
た。勾配は、DNA分子の断片長を増やして勾配曲線の峻
度を下げることにより最適化した。DNA分子の最良の分
離は、約30〜50℃で成就されている。約50℃を越える温
度でのDNAの変性のため、二本鎖のDNA断片に対してはそ
れより高いカラム温度を使うことはできない。

実施例６もし勾配遅延容積が最小化されたなら、PCR生成物及
び（動物及び植物の）生体と死体、並びにそうした有機
体の部分（例えば、血液細胞粒子、精子、等）を含む種
々の核酸源由来のハイブリッド核酸のオクタデシルで改
良された無孔性ポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニル
ベンゼン）ビーズでの分離は、２分以内の実行時間で達
成可能である。

PCR生成物及びハイブリッド核酸の分析には、通常、
既知の長さをもつ１つか２つの種の分離検出だけが必要
である。この理由から、分離度に対する要請は、DNA制
限断片の分離に要するよりもかなり緩くなる。そのよう
に分離度の要請が厳しくないので、急勾配を使うことが
でき、従って実行時間はやはり相対的に短くなる。404
塩基対を含むDNA断片の回収率は、約97.5％であった。

毛管電気泳動（CE）とは異なり、PCRの試料は、RPIPC
の分析に先立ち脱塩しなくてよい。このことは、CEを凌
ぐRPIPCの決定的有利さを表している。従って、RPIPCに
より、もし自動試料採取器（autosampler）を利用すれ
ば、PCR試料の完全自動分析が可能となる。さらに、試
料注入容積が既知であるため、CEとは対照的に、数桁以
上の大きさの定量化が、内部基準を必要としないで達成
でき、それ故、遺伝子発現の定量化のみならず組織及び
体液でのウイルス量レベルの測定が可能となる。本願発
明の完全自動化バージョンは、突然変異した遺伝子から
正常なものを識別（弁別）するため並びに診断を目的と
して腫瘍形成遺伝子、バクテリア及びウイルスのゲノム
核酸（肝炎Ｃ型ウイルス、HIV、結核）を検出するため
に用いられている。さらに、カラム温度を調節すること
により、ハイブリッド形成反応の厳しさを緩和すること
ができる。

臨床用途に使えるよう改良された本願発明の高分子ビ
ーズの安定性は、図３から明らかである。図３は、次の
条件下で実行された実験についての情報を提供するもの
である。カラム:50x46mm（内径）、移動相:0.1M TEAA,
pH7.0、勾配:11.25〜13.75％アセトニトリル（１分）、
続いて22.5％アセトニトリル（６分）及び11.25％アセ
トニトリル（54秒間）、流速:3ml/分、カラム温度:50
℃、検出:256nmのUV、試料:20μｌのPCR試料。図３にお
いて、１＝非特定PCR生成物、２＝120塩基対を有するPC
R生成物、３＝132塩基対を有するPCR生成物及び４＝167
塩基対を有するPCR生成物。

PCRの方法及びプロセスは、R.K.Sreke等、Science,
（1985）,230:1350−1354及びK.B.Mullis米国特許第4,6
83,202号に記述されている。これらの参考文献は、本願
発明の方法を使って分離し得るPCR試料を得るための方
法及びプロセスについてより完全な説明ができるようこ
こに引用している。

説明されているように、PCR生成物の繰返し分析は、
記述した分析条件下で高い再現性がある。特に重要なこ
とは、その結果がすぐ前の注入によってとにかく影響さ
れないという、観測である。この知見は、臨床研究室に
おける実際の条件下での日常的用途に対して本願発明が
さらに明確な安定性を有していることを表すものであ
る。

明かに、本願発明の無数の改良及び変更は、上記の技
術に照らし合わせれば可能である。従って、本願発明
は、添付されたクレームの範囲内で、本明細書に特異的
に記載されたものとは別の様相で実施してよいものと理
解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ０８Ｌ 29/04 Ｃ０８Ｌ 29/04 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 1/70 1/70 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 ＤＰ 33/50 33/50 Ｐ // Ｃ１２Ｎ 15/01 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｅ (72)発明者エフナー、ペーターオーストリア国アー―6020 インスブルックウンターベルガーシュトラッセ 19アー／５ (56)参考文献特開平３−297387（ＪＰ，Ａ) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，1986年，359，265− 274 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，1992年，599，113− 118 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，1990年，508，61− 73 ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，1985年，151，526−533 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，1993年, 212，351−358 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 30/88 C02F 1/28 C02F 1/42 C07H 21/04 C08F 212/00 C08L 29/04 C12Q 1/68 C12Q 1/70 G01N 30/48 G01N 33/50 C12N 15/01

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸の混合物を平均直径１〜100ミクロン
を有し、かつ、水銀多孔度計で測定した場合に30Å未満
の孔径を有するアルキル化高分子ビーズを含んでいる分
離カラムを通して流すことと、前記核酸混合物を分離す
ることから成る核酸混合物の分離法。
【請求項２】前記分離がイオン対逆相クロマトグラフィ
ーに基づく請求項１記載の方法。
【請求項３】前記高分子ビーズが１〜５ミクロンの平均
直径を有する請求項２記載の方法。
【請求項４】前記高分子ビーズがビニル芳香族単量体の
共重合体から構成されることを特徴とする請求項１記載
の方法。
【請求項５】前記ビニル芳香族単量体が、スチレン、ア
ルキル置換スチレン、アルファ−メチルスチレン及びア
ルキル置換アルファ−メチルスチレンから成る群から選
択される請求項４記載の方法。
【請求項６】前記高分子ビーズがスチレン、C_1-6アルキ
ル−ビニルベンゼン及びジビニルベンゼンの共重合体か
ら成る請求項１記載の方法。
【請求項７】前記高分子ビーズがさらにポリビニルアル
コールを含有する請求項１記載の方法。
【請求項８】前記高分子ビーズが少なくとも３つの炭素
原子を有するアルキル基でアルキル化されることを特徴
とする請求項１記載の方法。
【請求項９】前記アルキル基が３〜22個の炭素原子を有
する請求項８記載の方法。
【請求項１０】前記アルキル基が８〜18個の炭素原子を
有する請求項９記載の方法。
【請求項１１】有機体をサンプリングして発現した核酸
の試料を得ること、前記発現した核酸の多数複製を包含する混合物を作製す
ることと、前記の混合物を平均直径１〜100ミクロンを有し、か
つ、水銀多孔度計で測定した場合に30Å未満の孔径を有
するアルキル化高分子ビーズを含んでいる分離カラムと
接触させることにより前記混合物中の核酸を分離するこ
とと、前記の分離した混合物における前記発現した核酸の発生
を検出することととから成る、有機体において特異的核酸を発現する腫瘍
もしくはウイルスの発生を検出する方法。
【請求項１２】前記分離がイオン対逆相クロマトグラフ
ィーに基づく請求項11記載の方法。
【請求項１３】前記高分子ビーズが１〜５ミクロンの平
均直径を有する請求項11記載の方法。
【請求項１４】前記高分子ビーズがビニル芳香族単量体
の共重合体から構成されることを特徴とする請求項11記
載の方法。
【請求項１５】前記ビニル芳香族単量体が、スチレン、
アルキル置換スチレン、アルファ−メチルスチレン及び
アルキル置換アルファ−メチルスチレンから成る群から
選択される請求項14記載の方法。
【請求項１６】前記高分子ビーズがスチレン、C_1-6アル
キル−ビニルベンゼン及びジビニルベンゼンの共重合体
から成る請求項11記載の方法。
【請求項１７】前記高分子ビーズがさらにポリビニルア
ルコールを含有する請求項11記載の方法。
【請求項１８】前記高分子ビーズが少なくとも３つの炭
素原子を有するアルキル基でアルキル化されることを特
徴とする請求項11記載の方法。
【請求項１９】前記アルキル基が３〜22個の炭素原子を
有する請求項18記載の方法。
【請求項２０】前記アルキル基が８〜18個の炭素原子を
有する請求項19記載の方法。
【請求項２１】平均ビーズ直径１〜100ミクロンと窒素
吸収で測定した場合に表面積６〜30m²/gを有し、そして
水銀多孔度計で測定した場合に30Å未満の孔径を有する
アルキル化高分子ビーズ。
【請求項２２】前記高分子ビーズが平均直径１〜10ミク
ロンを有する請求項21記載の高分子ビーズ。
【請求項２３】前記高分子ビーズが平均直径１〜５ミク
ロンを有する請求項21記載の高分子ビーズ。
【請求項２４】前記高分子ビーズがビニル芳香族単量体
の共重合体から構成されることを特徴とする請求項21記
載の高分子ビーズ。
【請求項２５】前記ビニル芳香族単量体が、スチレン、
アルキル置換スチレン、アルファ−メチルスチレン及び
アルキル置換アルファ−メチルスチレンから成る群から
選択される請求項21記載の高分子ビーズ。
【請求項２６】前記高分子ビーズがスチレン、C_1-6アル
キル−ビニルベンゼン及びジビニルベンゼンの共重合体
から成る請求項21記載の高分子ビーズ。
【請求項２７】前記高分子ビーズがさらにポリビニルア
ルコールを含有する請求項21記載の高分子ビーズ。
【請求項２８】前記高分子ビーズが少なくとも３つの炭
素原子を有するアルキル基でアルキル化されることを特
徴とする請求項21記載の高分子ビーズ。
【請求項２９】前記アルキル基が３〜22個の炭素原子を
有する請求項21記載の高分子ビーズ。
【請求項３０】前記アルキル基が８〜18個の炭素原子を
有する請求項21記載の高分子ビーズ。