TW201726917A - 分離分析方法 - Google Patents

分離分析方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201726917A
TW201726917A TW105141232A TW105141232A TW201726917A TW 201726917 A TW201726917 A TW 201726917A TW 105141232 A TW105141232 A TW 105141232A TW 105141232 A TW105141232 A TW 105141232A TW 201726917 A TW201726917 A TW 201726917A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
column
separation
synthetic oligonucleotide
water
analysis method
Prior art date
Application number
TW105141232A
Other languages
English (en)
Inventor
小木戶謙
青木裕史
米田正
Original Assignee
昭和電工股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 昭和電工股份有限公司 filed Critical 昭和電工股份有限公司
Publication of TW201726917A publication Critical patent/TW201726917A/zh

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

為了將合成寡核苷酸應用在醫藥品，本發明係提供一種將寡核苷酸反應混合物中所含有之非全長的寡核苷酸等雜質高度地分離分析之手法。此係藉由使用包含水溶性有機溶劑與水之溶離液之管柱層析，將19聚物以上的合成寡核苷酸分離分析之方法。係包含固定有疏水性官能基之非多孔性的粒子填充劑。

Description

分離分析方法
本發明係關於合成寡核苷酸的分離分析方法。
本申請案係根據2015年12月28日於日本提出申請之日本特願2015-256977號公報主張優先權，並在此援引該內容。
合成寡核苷酸，係應用在聚合酶連鎖反應的引子、診斷探針、單核苷酸多型性(SNP：Single Nucleotide Polymorphism)檢測、DNA配列決定等之多樣的分子生物學實驗。合成寡核苷酸，主要是藉由在固相載體上使用亞磷醯胺核酸單體之連續性反應而合成。
近年來，合成寡核苷酸於醫療領域上的應用乃逐漸受到關注。例如可列舉出核糖核酸酵素、適配體、反義、及RNA干涉(RNAi)等，此等被稱為核酸醫藥品。
為了於體內穩定地輸送合成寡核苷酸，必須 考量到鍵結強度、標的特異性、血清穩定性、耐核酸酶性、細胞穿透性等之各種因素。改善此等之手法，例如有硫代磷酸酯或膦酸甲酯等之改質，或是鎖核酸(LNA：Locked Nucleic Acid)等的使用等之骨架改變。
此等骨架改變，可賦予耐核酸酶性，但同時可能產生配列非特異性的效果或穿透性能的降低，且進一步亦可能發揮細胞毒性。
寡核苷酸的合成方法，在對PCR引子等的使用中，可最適化至不須精製的等級，但為了應用在醫藥品，係要求更高度的精製、分析。尤其是長鏈DNA或是改質、骨架改變體，於合成時容易引起偶合未反應、副反應。因此，於合成寡核苷酸反應混合物中，主要含有非全長的寡核苷酸、或是非全體的寡核苷酸。例如，總是含有被稱為n-x碎片之從目的之寡核苷酸產生核酸缺損之碎片(n為目的之核苷酸(核酸)數，x為缺損數，n、x為正整數，n>x，例如n-1、n-2等)，此外，雙重地嵌入之n+1碎片則作為雜質而含有。再者，亦含有非全體或不正確地脫保護之碎片、或是具有部分掌性之異構物(專利文獻1)。
將合成寡核苷酸高度地分離之方法，一般可選擇凝膠電泳、凝膠過濾層析、反相層析、離子交換層析。層析，其操作性優異，尤其不須進行脫鹽操作之反相層析，係被廣泛地應用。
合成寡核苷酸的反相層析中，一般係使用於分子內具 有正的解離基與疏水性官能基之離子對試藥(專利文獻1)。
將合成寡核苷酸高度地分離之方法，例如於非專利文獻1中，係記載有使用Thermo公司的DNAPac PA200之陰離子交換層析之方法。DNAPac PA200，為將具有四極銨官能基之130nm的微珠鍵結於直徑8μm的無孔性基材者。藉由設計為可迅速地進行物質移動之基材，可將12聚物至60聚物的合成寡核苷酸高度地分離。
此外，非專利文獻2中，係記載有使用Imtakt公司的Presto FF-C18之反相層析之方法。Presto FF-C18，為粒徑2μm的非多孔性之具有十八烷基之二氧化矽管柱。藉由具有管柱效率的降低少之特徵之非多孔性管柱，可將12聚物至18聚物的合成寡核苷酸高度地分離。
〔先前技術文獻〕 〔專利文獻〕
〔專利文獻1〕日本國際公開第2006/107775號
〔非專利文獻〕
〔非專利文獻1〕Thermo公司Application Note 20996
〔非專利文獻2〕Imtakt公司Technical Information No. TI106E
本發明，為了將合成寡核苷酸應用在醫藥品，係提供一種將寡核苷酸反應混合物中所含有之非全長的寡核苷酸等雜質高度地分離分析之手法者為目的。
本發明者係對寡核苷酸反應混合物的精密分離進行精心探討，結果發現到藉由固定有疏水性的官能基之非多孔性管柱，可將19聚物以上的合成寡核苷酸高度地分離分析，因而完成本發明。本發明如下所述。
〔1〕一種分離分析方法，其係藉由使用包含水溶性有機溶劑與水之溶離液之管柱層析，將19聚物以上的合成寡核苷酸分離分析之方法，其特徵為：使用包含固定有疏水性官能基之非多孔性的粒子填充劑之管柱。
〔2〕如〔1〕之分離分析方法，其中前述分離分析方法，包含：於前述管柱中，藉由水、或是含有前述水溶性有機溶劑與水之第1溶離液來進行平衡化之步驟；使前述合成寡核苷酸溶解於前述第1溶離液，以準備分析用樣本之步驟；將前述分析樣本注入於在前述平衡化步驟中使前述樣本平衡化之前述管柱，並固定在前述管柱之步驟；以及使用前述水溶性有機溶劑的含量多之第2溶離液，至少從前述第1溶離液中，選擇性地溶離前述合成寡核苷酸之步驟。
〔3〕如〔1〕或〔2〕之分離分析方法，其中前述固定在填充劑之疏水性官能基，係選自由丁基、苯基、辛基及十八烷基所組成之群組之至少1種。
〔4〕如〔1〕~〔3〕中任一項之分離分析方法，其中前述填充劑為二氧化矽凝膠或合成聚合物。
藉由本發明，可提供一種即使是19聚物以上的長鏈合成寡核苷酸，亦可藉由反相層析高度地分離分析之合成寡核苷酸的分離分析方法。
圖1係使用實施例1之層析用填充劑與溶離液所測得之紫外線檢測法(波長254nm)層析圖。
圖2係使用實施例2之層析用填充劑與溶離液所測得之紫外線檢測法(波長254nm)層析圖。
圖3係使用比較例1之層析用填充劑與溶離液所測得之紫外線檢測法(波長254nm)層析圖。
圖4係使用比較例2之層析用填充劑與溶離液所測得之紫外線檢測法(波長254nm)層析圖。
將用以實施本發明之最適形態說明如下。以 下所說明之實施形態，僅表示本發明之代表性實施形態的一例，並非藉此狹隘地解釋本發明的範圍。
本發明之合成寡核苷酸的分離分析方法，係藉由：使用包含水溶性有機溶劑與烷基銨鹽與水之溶離液，並使用包含固定有疏水性官能基之非多孔性的粒子填充劑之管柱之管柱層析，將19聚物以上之合成寡核苷酸的合成過程中所含有之雜質高度地分離分析之手法。
本發明之一樣態的分離分析方法，係包含：於管柱中藉由含有水溶性有機溶劑與水之第1溶離液來進行平衡化之步驟；使合成寡核苷酸溶解於第1溶離液以準備分析用樣本之步驟；將分析樣本注入於在平衡化步驟中使分析用樣本平衡化之管柱，並固定在管柱之步驟；以及使用前述水溶性有機溶劑的含量多之第2溶離液，至少從前述第1溶離液中，選擇性地溶離合成寡核苷酸之步驟。
所謂「合成寡核苷酸」，一般係在固相載體上使核酸單體連續地反應而合成者，佳為藉由亞磷醯胺法所合成之核酸寡聚物。一般而言，合成寡核苷酸之目的的鏈長為10至110聚物，佳為10至70聚物，更佳為19至62聚物。
所謂「反相層析」，係利用目的對象物之疏水性的差，並且根據因往疏水性的固定相(填充劑)及非疏水性的移動相(溶離液)之分配的不同所發生之移動速度的差而成之反相分配層析。因應固定相(填充劑)及移動相(溶離液)之形態的不同，例如有管柱反相層析等。
所謂「固定有疏水性官能基之非多孔性的粒子填充劑」，係在由不具有物質可進入於介質內之細孔之二氧化矽或聚合物所構成之粒子填充劑中，固定有疏水性的官能基者。
所謂「非多孔性的粒子」，意指實質上不具有將成為本發明的分離對象之鹼值110以下的寡核酸容納並保持之細孔的粒子。亦即，在將該粒子填充於管柱，於乙腈100%的移動相中，亦即對象物與載體的疏水相互作用實質上不會作用之條件下，注入上述寡核酸並求取所得到之峰值的溶出容量與分子量的相關線，亦即所謂的校準曲線時，排除臨限分子量為700以下者。從校準曲線求取排除臨限之方法，係詳細記載於日本特公平08-7197((4)右第37行~(5)左第8行)。此外，日本專利第4662967號中，係記載有使用填充有顯示出特定的排除臨限之粒子之分離管柱的分析方法。
本發明之一樣態之粒子填充劑的構成，係佳為二氧化矽。佳為粒徑3μm以下者，更佳為粒徑2μm以下者。此外，所固定之疏水性官能基，佳為丁基、苯基、辛基、十八烷基，特佳為十八烷基。
所謂「合成過程中所含有之雜質」，為分子量與目的之合成寡核苷酸不同之雜質，例如有時候被稱為n-x碎片之非全長的寡核苷酸(n為目的之核苷酸(核酸)數，x為缺損數，n、x為正整數，n>x，例如n-1、n-2等)，雙重地嵌入之n+1碎片，乙醯基、異丁醯基、 氰乙基、甲基等之保護核酸單體之官能基的脫保護不足之寡核苷酸，脫嘌呤體或脫嘧啶體等之不完全寡核苷酸，硫代磷酸酯中之磷酸二酯雜質等之不充分骨架改變寡核苷酸，以及具有部分掌性之異構物等。
本發明之典型之合成寡核苷酸的分離分析方法，係如下所述。亦即，預先使適當的溶離液，例如，將含有水溶性有機溶劑與烷基銨鹽與水之溶離液，通液於包含固定有疏水性官能基之非多孔性的粒子填充劑之管柱來進行平衡化，然後將溶解有合成寡核苷酸之溶液通液於該溶離液，以使合成寡核苷酸鍵結於管柱內。之後藉由依序增大所通液之溶離液中的水溶性有機溶劑濃度之斜率，亦即所謂梯度，將合成寡核苷酸的合成過程中所含有之雜質，與目的之合成寡核苷酸分離而溶出。使平衡化時所通液之溶離液再度通液，以將管柱再生。
溶離液並無特別限定，佳係組合含有銨鹽，較佳由C1至4的烷基胺與酸所構成之鹽之水系溶離液與C1至3的醇或腈系水溶性有機溶劑。烷基胺，佳為三乙基胺或二丁基胺，酸，佳為碳酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸、丙酸。最佳為含有二丁基胺與乙酸之水系溶離液與乙腈之組合。水系溶離液的鹽濃度並無特別限制，佳為1至100mM，更佳為5至50mM，特佳為10至20mM。此外，水系溶離液的pH，只要是可進行往管柱之鍵結與溶出之範圍即可，並無特別限制，佳為6~8，更佳為6.5至7.5。
測定時的管柱溫度，係佳為25至80℃，更佳 為30至60℃，最佳為40至50℃。
本發明之一樣態之合成寡核苷酸的分離分析方法，可使用市售的反相層析裝置，例如可列舉出島津製作所公司的Prominence或Waters公司的Acquity等之分析‧分離用裝置。
本發明之一樣態的分離分析方法所使用之管柱，可使用市售的分析用或分離用管柱，例如可列舉出EPROGEN公司的MICRA(註冊商標)NPS ODS-1(粒徑1.5μm、33×4.6mm ID)、或是Imtakt公司的Prest FF-C18(粒徑2.0μm、75×4.6mm ID)等之分餾用管柱。
本發明之一樣態的分離分析方法所使用之檢測方法，例如可列舉出利用合成寡核苷酸等的紫外線/可見光吸收之檢測器，或是利用合成寡核苷酸等的質譜之檢測器等。為紫外線/可見光吸收檢測器時，檢測波長例如可列舉出254nm。
藉由此方法，可將合成寡核苷酸高度地分離分析。
〔實施例〕
以下係列舉實施例來說明本發明，但本發明並不限定於此實施例。
(實施例1)
依據MICRA(註冊商標)NPS ODS-1之合成寡核苷酸的分離分析
(1)管柱的平衡化步驟
管柱係使用非多孔性ODS管柱之EPROGEN公司的MICRA(註冊商標)NPS ODS-1(粒徑1.5μm、33×4.6mm ID)。層析，係使用系統控制器SCL-10AVP、送液單元LC10-AD、自動取樣器SIL-10ADVP、管柱烤爐CTO-AC10VP、檢測器SPD-M10A(島津製作所公司製)，管柱溫度40℃，溶離液使用添加有乙腈之二丁基銨乙酸酯水溶液。將乙腈添加於10mM之二丁基銨乙酸酯水溶液(pH7.0)，而調製出含有最終濃度4.5v/v%的乙腈之二丁基胺乙酸酯水溶液(pH7.0)作為第1溶離液，並使該第1溶離液通液10mL以上而使管柱平衡化。將移動相的流速設為1mL/分鐘。NPS ODS-1，為包含鍵結有十八烷基之非多孔性的二氧化矽粒子填充劑之管柱。
(2)分析用樣本的準備步驟
以10mM之二丁基銨乙酸酯水溶液，來溶解從Eurofins Genomics公司所購入之合成寡核苷酸62聚物(商品名稱：Standard Oligo 50nmol規格品salt-free等級；配列號碼1(以(5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCCCACACCGGCTGTTGTCATACTTCTCATGGTTCTTCGGAA-3')所示之鹼配列)，而調製出合成寡核苷酸的濃度為0.1mg/mL之分析用樣本。
(3)合成寡核苷酸的鍵結步驟
將調製後之分析用樣本之10uL注入於在(1)中已平衡化後之管柱，使用第1溶離液使合成寡核苷酸鍵結於管柱。將移動相的流速設為1mL/分鐘。
(4)合成寡核苷酸與雜質之分離溶出步驟
移動相，係從第1溶離液開始，將線性梯度構成為包含：以最初的7.5分鐘使乙腈的最終濃度增大至18v/v%之斜率的第1段梯度，並以接下來的32.5分鐘使乙腈的最終濃度增大至31.5v/v%之斜率的第2段梯度之2段梯度。藉由依序增大乙腈濃度之線性梯度斜率，以將鍵結於管柱之合成寡核苷酸或雜質分離而溶出。
檢測器，係使用紫外線/可見光(uv/vis)檢測器，檢測波長為254nm。
結果如圖1所示，於保持時間29分鐘時觀測到合成寡核苷酸的峰值，在此之前觀測到雜質的峰值。
(實施例2)
依據MICRA(註冊商標)NPS ODS-1之合成寡核苷酸的分離分析
(1)管柱的平衡化步驟
與實施例1同樣地進行。
(2)分析用樣本的準備步驟
以10mM之二丁基銨乙酸酯水溶液，來溶解從Eurofins Genomics公司所購入之合成寡核苷酸62聚物(商品名稱：Standard Oligo 50nmol之規格品salt-free等級；配列號碼1(以(5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCCCACACCGGCTGTTGTCATACTTCTCATGGTTCTTCGGAA-3')所示之鹼配列)，與40聚物(商品名稱：Standard Oligo 50nmol之規格品salt-free等級；配列號碼2(以(5'-CCACACCGGCTGTTGTCATACTTCTCATGGTTCTTCGGAA-3')所示之鹼配列)，與80聚物(商品名稱：Standard Oligo 50nmol之規格品salt-free等級；配列號碼3(以(5'-GTTTCATGTTGTTGGGATTGAGTTTTGAACTCGGCAACAAGAAACTGCCTGAGTTACATCAGTCGGTTTTCGTCGAGGGC-3')所示之鹼配列)，與100聚物(商品名稱：Standard Oligo 50nmol之規格品salt-free等級；配列號碼4(以(5'-GCTGATCTGTGGCTTAGGTAGTTTCATGTTGTTGGGATTGAGTTTTGAACTCGGCAACAAGAAACTGCCTGAGTTACATCAGTCGGTTTTCGTCGAGGGC-3')所示之鹼配列)，與110聚物(商品名稱：Standard Oligo 50nmol之規格品salt-free等級；配列號碼5(以(5'-TGCTCGCTCAGCTGATCTGTGGCTTAGGTAGTTTCATGTTGTTGGGATTGAGTTTTGAACTCGGCAACAAGAAACTGCCTGAGTTACATCAGTCGGTTTTCGTCGAGGGC-3')所示之鹼配列)，而調製出各鏈長之合成寡核苷 酸的最終濃度成為0.01mg/mL之分析用樣本。
(3)合成寡核苷酸的鍵結步驟
除了將調製後之分析用樣本往管柱的注入量設為20uL之外，其他與實施例1同樣地實施。
(4)合成寡核苷酸與雜質之分離溶出步驟
除了以不改變斜率之方式，以第2段梯度58.5分鐘使乙腈的最終濃度增大至42.3v/v%之外，其他與實施例1同樣地實施。
檢測器，係與實施例1同樣地進行。
結果如圖2所示，於保持時間24分鐘時觀測到合成寡核苷酸40聚物的峰值，於保持時間29分鐘時觀測到合成寡核苷酸62聚物的峰值，於保持時間32分鐘時觀測到合成寡核苷酸80聚物的峰值，於保持時間35分鐘時觀測到合成寡核苷酸100聚物的峰值，於保持時間37分鐘時觀測到合成寡核苷酸110聚物的峰值。
(比較例1)
依據Shodex(註冊商標)C18P 4E所進行之合成寡核苷酸的分離分析
除了使用包含鍵結有十八烷基之多孔性的二氧化矽粒子填充劑之管柱之昭和電工公司製的C18P 4E(粒徑5μm、孔徑100Å、250×4.6mm ID)之外，其他與實施例1 同樣地實施。
於保持時間48分鐘時觀測到合成寡核苷酸的峰值。在如實施例1中所觀察到般之主峰值的面前所檢測出之雜質之一部分的峰值雖可分離，但在線性梯度的範圍內，合成寡核苷酸未溶出。因此，合成寡核苷酸的分離不足，無法進行高度的分離分析。
結果如圖3所示。
(比較例2)
依據Shodex(註冊商標)C18P 4E所進行之合成寡核苷酸的分離分析
使與實施例1中所使用者為相同之合成寡核苷酸，通液於包含鍵結有十八烷基之多孔性的二氧化矽粒子填充劑之管柱之昭和電工公司製的C18P 4E(粒徑5μm、孔徑100Å、250×4.6mm ID)。將實施例1的平衡化步驟(1)所使用之第一溶離液，設為含有最終濃度之9v/v%的乙腈之10mM的二丁基胺乙酸酯水溶液(pH7.0)，並將分離溶出步驟(3)之線性梯度的採集乙腈濃度設為54v/v%，除此之外，其他與實施例1同樣地實施。
於保持時間23分鐘時觀測到合成寡核苷酸的峰值。然而，在如實施例1中所觀察到般之主峰值的面前所檢測出之雜質的峰值無法分離，合成寡核苷酸的分離不足，無法進行高度的分離分析。
結果如圖4所示。
(比較例2)
依據Shodex(註冊商標)C18P 4E所進行之合成寡核苷酸的分離分析
除了使用包含鍵結有十八烷基之多孔性的二氧化矽粒子填充劑之管柱之昭和電工公司製的C18P 4E(粒徑5μm、孔徑100Å、250×4.6mm ID)之外，其他與實施例1同樣地實施。
於保持時間48分鐘時觀測到合成寡核苷酸的峰值。在如實施例1中所觀察到般之主峰值的面前所檢測出之雜質之一部分的峰值雖可分離，但在線性梯度的範圍內，合成寡核苷酸未溶出。因此，合成寡核苷酸的分離不足，無法進行高度的分離分析。
結果如圖4所示。
<110> SHOWA DENKO K.K.
<120> Separation and analysis method
<130> PC22449
<150> JP2015-256977
<151> 2015-12-28
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chemically synthesized oligonucleotide
<400> 1
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chemically synthesized oligonucleotide
<400> 2
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chemically synthesized oligonucleotide
<400> 3
<210> 4
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chemically synthesized oligonucleotide
<400> 4
<210> 5
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chemically synthesized oligonucleotide
<400> 5

Claims (4)

  1. 一種分離分析方法，其係藉由使用包含水溶性有機溶劑與水之溶離液之管柱層析，將19聚物以上的合成寡核苷酸分離分析之方法，其特徵為：使用包含固定有疏水性官能基之非多孔性的粒子填充劑之管柱。
  2. 如請求項1之分離分析方法，其中前述分離分析方法，包含：於前述管柱中，藉由水、或是含有前述水溶性有機溶劑與水之第1溶離液來進行平衡化之步驟；使前述合成寡核苷酸溶解於前述第1溶離液，以準備分析用樣本之步驟；將前述分析樣本注入於在前述平衡化步驟中使前述樣本平衡化之前述管柱，並固定在前述管柱之步驟；以及使用前述水溶性有機溶劑的含量多之第2溶離液，至少從前述第1溶離液中，選擇性地溶離前述合成寡核苷酸之步驟。
  3. 如請求項1或2之分離分析方法，其中前述固定在填充劑之疏水性官能基，係選自由丁基、苯基、辛基及十八烷基所組成之群組之至少1種。
  4. 如請求項1~3中任一項之分離分析方法，其中前述填充劑為二氧化矽凝膠或合成聚合物。
TW105141232A 2015-12-28 2016-12-13 分離分析方法 TW201726917A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015256977 2015-12-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201726917A true TW201726917A (zh) 2017-08-01

Family

ID=59225164

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105141232A TW201726917A (zh) 2015-12-28 2016-12-13 分離分析方法

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JPWO2017115655A1 (zh)
TW (1) TW201726917A (zh)
WO (1) WO2017115655A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023282120A1 (ja) * 2021-07-06 2023-01-12 住友化学株式会社 核酸オリゴマーを含む組成物
CN113976187A (zh) * 2021-11-08 2022-01-28 天津中科博蕴生物技术有限公司 一种采用硅胶键合基质分离核酸的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT398973B (de) * 1992-11-18 1995-02-27 Bonn Guenther Dr Verfahren zur trennung von nukleinsäuren
WO1998048914A1 (en) * 1997-04-25 1998-11-05 Transgenomic, Inc. Improved liquid chromatographic media for polynucleotide separation

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2017115655A1 (ja) 2018-10-18
WO2017115655A1 (ja) 2017-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230203086A1 (en) Ribonucleic acid purification
US11912982B2 (en) Methods for HPLC analysis
EP3668977A1 (en) Analytical hplc methods
AU772213B2 (en) Biochemical purification devices with immobilized capture probes and their uses
EP0804448B1 (en) Method for the purification of short nucleic acids
Köse et al. PolyAdenine cryogels for fast and effective RNA purification
EP3272866B1 (en) Method for collecting nucleic acid
TW201726917A (zh) 分離分析方法
JP2014512805A (ja) プラスミドｄｎａアイソフォーム及びトポロジー異性体の液相分離
US9890376B2 (en) Chromatographic purification of polynucleotides with negatively charged particles
TW201734026A (zh) 分離分析法
WO2017205477A1 (en) Polynucleotide purification with monolith columns
CA2961177C (en) Methods and kits for separating nucleic acids by size
US20020094539A1 (en) Methods and reagents for analysis of RNA structure and function
JP2006527993A (ja) クリーンアップビーズ
WO2010027696A1 (en) Simple load and elute process for purification of genomic dna
Fu et al. Water‐elutability of nucleic acids from metal‐chelate affinity adsorbents: enhancement by control of surface charge density
WO2023218329A1 (en) Method of analysis of polynucleotides by restricted access reversed phase chromatography
WO2024150137A1 (en) Dipodal silane bonded sorbents for solid phase extraction and use thereof for oligonucleotide extraction
JP2006271292A (ja) メッセンジャーｒｎａの分離方法