JP2014512805A - プラスミドｄｎａアイソフォーム及びトポロジー異性体の液相分離 - Google Patents

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Abstract

本発明は、プラスミドDNA（pDNA）のアイソフォーム、トポロジー異性体、オリゴマー及びマルチマー形を分離するために、不均質マトリックスに固定又は包埋されたカルバモイル修飾陰イオン交換リガンドを含む物質を使用することに関し、ここで陽イオン基（C）及び水素供与基（N-H）は長さが3から5原子のスペーサーによって連結される。

Description

本発明は、不均質なマトリックスに固定又は包埋されたカルバモイル修飾陰イオン交換リガンドを使用することによって実施される、プラスミドDNA（pDNA）のアイソフォーム、トポロジー異性体、オリゴマー及びマルチマー形を分離するためのクロマトグラフィー用物質及び方法に関する。
プラスミドDNA（pDNA）は、その宿主細胞にさらに別の機能性を提供する染色体外遺伝単位である。遺伝子治療又は遺伝子ワクチン免疫付与での使用におけるその大きな潜在能力の発見により、これら新規タイプの薬剤のバイオ技術による製造に大きな注意が寄せられている（Schleef, M., Plasmids for Therapy and Vaccination, Wiley-VCH, Weinheim 2001）。より可能性が高いアイソフォームから、いわゆる共有結合閉環状（ccc）形が治療薬としてもっとも活性が高いと考えられる。医薬等級のcccプラスミドDNAは、しばしば大腸菌（E. coli）での発酵とその後のpDNAの採集、アルカリ性溶解及び多段工程精製によって製造される（Urthaler, J., et al., Journal of Biotechnology, 2007, 128, pgs:132-149）。ヒトの遺伝子治療のために、これらの工程のいずれも規制ガイドラインに適合しなければならない。したがって、動物由来化合物（例えばニワトリ卵白リゾチームのような酵素）及び／又は有毒な試薬の使用は避けるべきである。さらにまた、製造プロセスは、低レベルの宿主関連不純物（例えば細菌宿主の場合のエンドトキシン）に対する保証を示さなければならない（例えば以下を参照されたい：Urthaler, J., Chemical Engineering & Technology, 2005, 28, pgs: 1408-1420）。さらにまた、他のpDNAアイソフォームと対比してccc形の含有量が高いことが生物活性医薬の最終処方物では推奨される（FDA, U., in: Administration, F. a. D. (Ed.), Considerations for Plasmid DNA Vaccines for Infectious Disease Indications, Rockville, MD 2007）。
品質管理と同様に上流及び下流におけるプロセッシング時のプラスミドアイソフォームの分布に関する信頼できる分析が希求されている。ccc形とは別に、治療及びワクチン免疫付与で有効性が低いと考えられる以下の形態もモニターする必要がある：（a）DNA骨格の単一切れ目によってccc形から生じる開環状形（oc）、及び（b）2つのニックが接近している場合に生じる線状形（lin）。これらのモノマー形の他に、ダイマー及びオリゴマー種が発酵中に生成され得る（Lahijani, R. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, pgs: 1971-1980）。前記ダイマー及びオリゴマー種は、例えばコンカテマー（すなわち連続してつながる同じDNA配列のマルチコピーを含む長い連続するDNA分子）及びカテナン（すなわち1つの鎖の中で複数の輪として一緒に絡み合う環状DNA）である。末端と末端が結合するコンカテマー化DNAとは対照的に、カテナン化DNAはループとループが結合する。
全プラスミドDNAの効率的な分離に利用できる多様な方法が存在する（Stadler J., et al., J Gene Med, 2004; 6, pgs: S54-S66）。前記方法は、例えばチオ親和性芳香族クロマトグラフィー（Sandberg, L.M., et al., Journal of Biotechnology, 2004, 109, pgs:193-199）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ferreira, G.N.M., etal., Pharm. Pharmacol. Commun., 1999, 5, pgs: 57-59; Diogo, M.M., et al., Journal of Chromatography A, 2005, 1069, pgs: 3-22; Tiainen P. et al., Journal of Chromatography A, 2007, 1138, pgs: 84-94; Urthaler J. et al., Chemical Engineering and Technology, 2005, 28, pgs: 1408-1420）、又はペプチド親和性クロマトグラフィー（Han Y. and Gareth M.F., J. Chromatogr. B, 2008, 874, pgs:21-26）である。EP1187840B1では、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）を用いることによる、2つのpDNAアイソフォーム（すなわちccc及びoc）の調製的分離が開示されている。しかしながらこの事例では、分離は非特異的（すなわち疎水的）相互作用を基礎にしており、本発明のプロセスと比較したとき比較的低い分離効率（例えば33ページの図7）が問題である。さらにまた、HIC分離に必要とされる極めて高負荷のコスモトロピックな塩のために（例えば28ページの図1）、そのような負荷後に得られる生成溶液はしたがって脱塩を必要とする（すなわち大量の塩は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、透析又は膜分離の使用によって除去されねばならない）。さらにまた、蓄積された塩の廃棄は多大な資金を要する。さらに、ポリ(L-リジン)珪藻土クロマトグラフィーの使用による多様なタイプの核酸の分離が報告された（例えば、Finkelstein D. B., et al., J. Biochemistry, 1972,11, 25, pgs: 4853-8; or in Monaghan-Cannon M. and Dunican L. K., The Biochemical Journal, 1969, 115, 3, 7P）。さらにまた、アミノ酸（Arg、His、Lys）親和性クロマトグラフィーによる分離が、（a）分析的使用（Sousa A., et al., J. Sep. Sci. 2010, 33, pgs: 2610-2618）及び（b）調製的目的（Sousa F., et al., Trends in Biotechnology, Vol.26 No.9, 2008, pgs:518-525）のために開示された。最近、ポリメタクリレートモノリスに結合させた16-merのペプチド（配列NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His-Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn-Gln-COOHを有する）は、pDNAと結合し、さらにいくつかのアイソフォームと選択的に結合することが報告された（Y. Han, et al., J. Chromatogr. B, 2008,874, pgs: 21-26）。
cccプラスミドのそのままのサンプルは、一連の個々のトポロジー異性体（トポ異性体）から成る（前記異性体はスーパーコイリングの程度が様々である）。これらのcccトポ異性体は多様なリンキング数を有し、したがって多様な数のスーパーヘリックスターンを有する（Depew, R. E., Wang, J. C., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1975, 72, pgs: 4275-4279）。スーパーコイリングは2つの量（ツイスト（Tw）及びライジング（Wr）数）から成り、前記量は相互に変換可能であるが、ある種のトポ異性体については両者の合計は不変である。細菌プラスミド（バイオテクノロジー、分子生物学並びに新規なバイオ医薬及び治療薬の開発に重要な成分である）はin vivoでは負にスーパーコイルする。スーパーコイリングの量はほぼ6％であり、これは、標準的な条件下ではもっとも一般的タイプのDNA（いわゆるB-DNA）の100ヘリックスターンにつき平均して6つの負のスーパーコイルが導入されることを意味し、平均して1050塩基対に付き6つの負のスーパーコイルと一致する（ターン1つに付き10.5塩基対の標準的値が計算に用いられる場合）。トポ異性体パターンは、細菌細胞の分裂中に24時間周期リズムにしたがってin vivoで変化することが見出された（Woelfle, M.A., PNAS, 2007, 104, 47, pgs: 18819-18824）。
プラスミドのトポ異性体分離の方法に関して、多様なゲル系電気泳動法（最高の解析能力を有するキャピラリーゲル電気泳動を含む）が利用可能であるが（Schmidt, T., et al., Analytical Biochemistry, 1999, 274, pgs: 235-240）、しかしながら、不動性が低いこと、サンプルの塩耐性が低いこと及び時間消費性が高いことにより全体的に問題が多い。DNA挿入剤の前提条件は、この方法で望ましくない有害性を引き起こす可能性がある。したがって、液体クロマトグラフィーによる方法は分析用及び調製用の両方の適用において好ましい。多数の異なるクロマトグラフィー用アプリケーション及び種々のクロマトグラフィー用支持体が、多様な品質優位性を示すプラスミドの調製的精製のために利用可能である（例えばDiogo, M. M., et al., Journal of Chromatography, A 2005, 1069, pgs: 3-22; Wu, L., Pang, G.-c., Chromatographia 2007, 66, pgs:151-157; Tiainen, P. et al., Journal of Chromatography, A 2007, 1149, pgs: 158-168; Sousa, F. et al., Analytical Biochemistry 2005, 343, pgs:183-185; or Urthaler, J., et al., Journal of Chromatography, A 2005, 1065, pgs: 93-106）。しかしながら分析的規模では、選択は、陰イオン交換カラム、例えばトーソーバイオサイエンスのDNA-NPR（Tosoh Bioscience, Tosoh Corporation, Tokyo, Japan）又はウォーターズのGenPak FAX（Waters, Waters Corporation, Milford, Massachusetts, USA）に限定され、前記は、同じ基礎物質（すなわちジエチルアミノエチル（DEAE）系リガンドを有する親水性有機ポリマーを含む無孔性2.5μm粒子）を利用する。トポ異性体の分布はこれまでのところ電気泳動技術によってのみ分析可能である。そのこととは別に、当技術の現状ではこのタイプのcccプラスミドDNAの分離のために利用可能な物質も方法も（クロマトグラフィーを含む）存在しない。
一般的にクロマトグラフィーによるいずれの方法の有効性も主として3つの基本的要素に左右される：（1）分離区画（クロマトグラフィー用物質を充填したカラム）の長さ、（2）分析物のカラム上の泳動速度を示す保持係数（容量係数）、及び（3）分離されるべき2つの種の保持係数間の選択性提示比。これらのうちでもっとも大きな影響は後者のもので、選択性は、支持物質の特徴及び支持体に結合又は包埋されるリガンドの特性によって影響を受ける（支持物質はまた固相/マトリックス/支持体としても知られている）。
小分子のために用いられる中間サイズの孔（メゾポア）を有する有孔性支持体は生物分子が内部に進入するのを許容しない（Rozing, G. P., Journal of Chromatography A, 1989, 476, pgs: 3-19）。大きくてギガ多孔性物質は、物質移動が遅くサンプル回収が低いという問題がある。分析に使用される当技術のもっとも有望な選択肢は、無孔性粒子表面の保持力を有する薄層を特徴とする微小薄膜性の静止相であると考えられる（Huber, C. G., Journal of Chromatography, A, 1998, 806, pgs: 3-30）。別の代替案（調製的使用に特に適切なもの）はモノリスであり、これはその優れた結合能力及び超短時間分析（速いカラム流での高い解析力及び物質移動限界がないという利点を有する）の故である（Hahn, R., et. al., Separation Science and Technology, 2002, 37, pgs: 1545-1565）。
当技術の現状では、プラスミド分離に陰イオン交換クロマトグラフィーで用いられるリガンドにはあまり注意が払われず、前記クロマトグラフィーでは単純な三級アミン（例えばDEAE（ジエチルアミノエチル））又は四級アミン（しばしばQと略される）が標準物として用いられる。これらのむしろ非特異的なグループは、分析物の陰性荷電の数にしたがって核酸を分離し（Wieder, W., et al., Journal of Separation Science, 2006, 29, pgs: 2478-2484）、相対的に不十分な分離をもたらす。分析的アプローチ及び調製的アプローチの両方に密接に関係する分離は荷電密度及び流体力学的因子に左右されるので（Onishi, Y., et al, Analytical Biochemistry, 1993, 210, pgs:63-68）、スラロムクロマトグラフィーと類似の効果が観察され得る（すなわち、閉じられたカラムの中のDNA分子の前進は流れの方向にしたがい、ヘビがじりじり進む（いわゆる“匍匐する”）のに似ている）。このアプローチでは、pDNAの異性体分離は流速及び勾配に依存し（Smith, C. R., et al., Journal of Chromatography, B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2007, 854, pgs: 121-127）、この系を不動性及び予測性の低いものにする。さらにまたMolloyら（Molloy et al., Nucleic Acid Research, 2004, 32, e129/121-e129/110）は、DEAEリガンドによるイオン交換クロマトグラフィーを用いることによる、プラスミド分離におけるある種の欠点を指摘している（この場合、アガロースゲル電気泳動の適用と比較して、ccc pDNAサンプル中のocアイソフォーム（不純度を示す）の計算含有量は顕著に低かった）。
多様なキナアルカロイドリガンド（キナカルバメート及びキナウレアを含む）が、不整有機合成のキラル触媒として（WO92/20677及びUS6197994B1）、及び分析化学のキラル判別因子（すなわちキラル選別因子）として（Laemmerhofer M., et al., Journal of Chromatography, A 1996, 741, pgs: 33-48; WO97/46557; US6616825 B1; LeeY.-K. et al., Polymer 43, 2002, pgs: 7539-7547）開示された。さらにまた、分析規模でのoc及びccc pDNAアイソフォームの分離のために、アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）のリガンド構造がこれまでに文献に記載されている（Sousa F., Queiroz J.A., J of Chromatography A,doi:10.1016/j.chroma.2010.11.002 (印刷中) and Sousa A, et al., J. Sep. Sci. 2010, 33, pgs: 2610-2618）。
総合すれば、調製規模及び分析規模の両方でクロマトグラフィー（アフィニティクロマトグラフィーを含む）の使用による、3つのpDNAアイソフォーム全て（ccc、oc及びlin）の効率的な分離のために十分に不動で予測性、信頼性及び正確性を有する方法並びに物質は、当技術の現状では利用可能ではない。
本発明は、プラスミドDNAのアイソフォーム又はトポ異性体分離のための、下記式１のリガンドを含む物質の使用に関する：
Figure 2014512805
 (1)
式中、リガンドは、長さが3から5の原子のスペーサーによって連結された陽イオン基（C）及び水素供与基（N-H）を含み、
m、o及びrは互いにそれぞれ別個に0又は1であり、さらに
k、l、n及びpは互いにそれぞれ別個に0、1又は2であり、さらに
Yは、基-CH2-、-O-、-NH-又は-S-から選択される任意の基であり、さらに
Zは、基-C-、-S-又は-P-から選択される任意の基であり、さらに
R1、R2及びR3は、水素、C1-18分枝又は非分枝アルキル、C2-18分枝又は非分枝アルケニル、C2-18分枝又は非分枝アルキニル、C3-11-炭素環、C3-8-複素環、C5-18-アリール及びC5-13-ヘテロアリールから成る群の置換基のいずれかであり、
式中R1、R2及びR3は、場合によって互いにそれぞれ別個に、基-S-、-O-、-NH-から選択される1つ以上の成分を含んでもよく、さらに
R1、R2、R3の各々は、場合によってそれぞれ別個に、水素、C1-6分枝又は非分枝アルキル、C2-6分枝又は非分枝アルケニル、C2-6分枝又は非分枝アルキニル、C3-8-炭素環、C3-8-複素環及びC5-10-アリール、C5-10-ヘテロアリールから成る群から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよく、さらに
陽イオン基Cは、少なくとも1つの窒素原子を含み、及び場合によって硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含んでもよいC3-11-複素環であるか、又は、少なくとも1つの窒素原子を含み、及び場合によって硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含んでもよいC5-18-ヘテロアリールであるか、
又は、少なくとも1つの窒素原子を含み、及び場合によって硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含んでもよいC5-18ヘテロアリール、または、少なくとも1つの窒素原子を含み、及び場合によって硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含んでもよい、分枝又は非分枝C1-10アルキル、分枝又は非分枝C2-10アルケニル、分枝又は非分枝C2-10アルキニルであり、ここでC及びR3又はC及びR2は環を形成することによって場合によって互いに連結されてもよく、さらに
前記リガンドは場合によって、R1又はR3基を介してマトリックスに固定又は包埋されてもよい。
さらに別に、本発明は、プラスミドDNAのアイソフォームを本発明の物質を使用することによって分離する方法に関する（プラスミドDNAのアイソフォームは、共有結合閉環状（ccc）、開環状（oc）及び線状（lin）形、オリゴマー及びマルチマー形（例えばモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、オリゴマー、マルチマー）、及び／又はcccトポ異性体を含む）。
pMCP1プラスミド（4.9kbp）のoc及びlin アイソフォームとのcccアイソフォームとの混合物を含むpDNAサンプルを同一溶出条件で分析した、258nm UV吸収記録クロマトグラフィー図：3つのカラムを用い、その各々は、種々のシリカマトリックス（構造f参照）に結合させたtert-ブチルカルバモイル-キニンリガンドを含む（前記シリカマトリックスは、すなわち1.5μm無孔性粒子（図1a）、10μm有孔性粒子（図1b）及びモノリス（Chromolith Si Performance, Merck）（図3c）である）。溶出条件：方法1（実施例4参照）。“Y”軸は、保持時間[min]に対応する“X”軸に対して、258nmでのUV吸収（ミリ吸収単位[mAU]）として検出されるpDNAアイソフォームの濃度を示す。 pMCP1プラスミド（4.9kbp）のoc及びlin アイソフォームとのcccアイソフォームとの混合物を含むpDNAサンプルを同一溶出条件で分析した、258nm UV吸収記録クロマトグラフィー図：3つのカラムを用い、その各々は、種々のシリカマトリックス（構造f参照）に結合させたtert-ブチルカルバモイル-キニンリガンドを含む（前記シリカマトリックスは、すなわち1.5μm無孔性粒子（図1a）、10μm有孔性粒子（図1b）及びモノリス（Chromolith Si Performance, Merck）（図3c）である）。溶出条件：方法1（実施例4参照）。“Y”軸は、保持時間[min]に対応する“X”軸に対して、258nmでのUV吸収（ミリ吸収単位[mAU]）として検出されるpDNAアイソフォームの濃度を示す。 pMCP1プラスミド（4.9kbp）のoc及びlin アイソフォームとのcccアイソフォームとの混合物を含むpDNAサンプルを同一溶出条件で分析した、258nm UV吸収記録クロマトグラフィー図：3つのカラムを用い、その各々は、種々のシリカマトリックス（構造f参照）に結合させたtert-ブチルカルバモイル-キニンリガンドを含む（前記シリカマトリックスは、すなわち1.5μm無孔性粒子（図1a）、10μm有孔性粒子（図1b）及びモノリス（Chromolith Si Performance, Merck）（図3c）である）。溶出条件：方法1（実施例4参照）。“Y”軸は、保持時間[min]に対応する“X”軸に対して、258nmでのUV吸収（ミリ吸収単位[mAU]）として検出されるpDNAアイソフォームの濃度を示す。 pMCP1プラスミド（4.9kbp）のccc、oc及びlin アイソフォームを含むpDNAサンプルの258nm UV吸収記録クロマトグラフィー図：3つの主ピークは3つの個々のpDNAアイソフォームoc、lin、cccと一致する（図2に示したとおり）。溶出条件：方法2。“Y”軸は、保持時間[min]に対応する“X”軸に対して、258nmでのUV吸収（ミリ吸収単位[mAU]）として検出されるpDNAアイソフォームの濃度を示す。 pMCP1プラスミド（4.9kbp）の高ccc含有量を含むpDNAサンプルをNaCl-媒介溶出で分析した、258nm UV吸収記録クロマトグラフィー図：ocアイソフォームの後で溶出する、これらのクロマトグラフィー図のccc形が個々のトポ異性体セットに分けられる。前記個々のトポ異性体間の分離は、構造eに示す3-メルカプトプロピル-改変シリカに固定したtert-ブチルキンコリニル-尿素リガンドを用いた（図3b）ときよりも、構造dに示す3-メルカプトプロピル-改変シリカに固定したtert-ブチルカルバモイル-キンコリンリガンドを用いた（図3a）ときに良好である。“Y”軸は、保持時間[min]に対応する“X”軸に対して、258nmでのUV吸収（ミリ吸収単位[mAU]）として検出されるpDNAアイソフォームの濃度を示す。 pMCP1プラスミド（4.9kbp）の高ccc含有量を含むpDNAサンプルをNaCl-媒介溶出で分析した、258nm UV吸収記録クロマトグラフィー図：ocアイソフォームの後で溶出する、これらのクロマトグラフィー図のccc形が個々のトポ異性体セットに分けられる。前記個々のトポ異性体間の分離は、構造eに示す3-メルカプトプロピル-改変シリカに固定したtert-ブチルキンコリニル-尿素リガンドを用いた（図3b）ときよりも、構造dに示す3-メルカプトプロピル-改変シリカに固定したtert-ブチルカルバモイル-キンコリンリガンドを用いた（図3a）ときに良好である。“Y”軸は、保持時間[min]に対応する“X”軸に対して、258nmでのUV吸収（ミリ吸収単位[mAU]）として検出されるpDNAアイソフォームの濃度を示す。 pMCP1プラスミド（4.9kbp）の高ccc含有量を含むpDNAサンプルの284μgをロードした後の258nm UV吸収記録クロマトグラフィー図。溶出は、1.5μmの無孔性シリカに結合させたトリエトキシシリル-活性化プロピルカルバモイルキニンリガンドを用いNaCl勾配により実施される。：最初のピークは開環状（oc）アイソフォームを表し、一方、cccアイソフォームの21トポ異性体はその後で溶出する。“Y”軸は、保持時間[min]に対応する“X”軸に対して、258nmでのUV吸収（ミリ吸収単位[mAU]）として検出されるpDNAアイソフォームの濃度を示す。 1.5μmの無孔性シリカに結合させたトリエトキシシリル-活性化プロピルカルバモイルキニンリガンドを用いてpMCP1プラスミド（4.9kbp）の高ccc含有量を含むpDNAサンプルをNaCl媒介溶出で分析した、258nm UV吸収記録クロマトグラフィー図の重ね合わせ：ocアイソフォームの後で溶出する、これらのクロマトグラフィー図のccc形が個々のトポ異性体セットに分けられる。A及びBは単離されたトポ異性体分画を表す。点線は、前もって溶出トポ異性体を分画した後で同じカラムに再注入した分画A及びBを表す。“Y”軸は、保持時間[min]に対応する“X”軸に対して、258nmでのUV吸収（ミリ吸収単位[mAU]）として検出されるpDNAアイソフォームの濃度を示す。 図4aに示す分画A及びBと同一の分画A及びBを含む混合物のキャピラリー電気泳動分離：線状形はもっとも速く移動する形状である。分画Bは分画Aより速く移動し、したがってそのより小さなサイズ及びより高度なスーパーコイリングを示す。“Y”軸は、移動時間[min]に対応する“X”軸に対して、258nmでのUV吸収（ミリ吸収単位[mAU]）として検出されるpDNAアイソフォームの濃度を示す。 pDNAの発酵中に得られるpDNAサンプルの258nm UV吸収記録クロマトグラフィー図の重ね合わせは、11、13、15及び17時間後に二次元クロマトグラフィー（すなわち粗サンプルの精製工程）のNaCl媒介勾配溶出で構造bとして開示される物質を利用して入手される：矢印はトポ異性体分布の中でもっとも豊富なトポ異性体を示し、したがって全体的スーパーコイリング（明らかに発酵中に変化する）の指標として役立つ。図4bを除く全てのクロマトグラフィー図で、“Y”軸は、保持時間[min]に対応する“X”軸に対して、258nmでのUV吸収（ミリ吸収単位[mAU]）として検出されるpDNAアイソフォームの濃度を示す。 もっとも豊富なトポ異性体の相対的リンキング数（全体的スーパーコイリングの測定値（発酵開始時にはこの値はゼロ）である）として示される最大分布トポ異性体（最大ピーク面積として計算される）が、発酵の全期間（X軸）に対してプロットされる。：全体的にトポ異性体パターンは発酵中に変化する。“Y”軸は、持続時間[h]を表す“X”軸に対して、相対的リンキング数ΔLKを示す。
発明の詳細な説明
今や予想に反して、プラスミドDNA（pDNA）のアイソフォーム、トポ異性体、オリゴマー形及びマルチマー形の分離のために、不均質なマトリックスに固定又は包埋されたカルバモイル修飾陰イオン交換リガンドを含む本発明の物質を用い得ることが見出された。
本発明は、そのもっとも広範な特徴で、プラスミドDNAのアイソフォーム又はトポ異性体分離のために下記式１のリガンドを含む物質を提供する：
Figure 2014512805
 (1)
式中、リガンドは、長さが3から5の原子のスペーサーによって連結された陽イオン基（C）及び水素供与基（N-H）を含み、
m、o及びrは互いにそれぞれ別個に0又は1であり、さらに
k、l、n及びpは互いにそれぞれ別個に0、1又は2であり、さらに
Yは、基-CH2-、-O-、-NH-又は-S-から選択される任意の成分であり、さらに
Zは、基-C-、-S-又は-P-から選択される任意の成分であり、さらに
R1、R2及びR3は、水素、C1-18分枝又は非分枝アルキル、C2-18分枝又は非分枝アルケニル、C2-18分枝又は非分枝アルキニル、C3-11-炭素環、C3-8-複素環、C5-18-アリール及びC5-13-ヘテロアリールから成る群の置換基のいずれかであり、
式中R1、R2及びR3は、場合によって互いにそれぞれ別個に、基-S-、-O-、-NH-から選択される1つ以上の成分を含んでよく、さらに
R1、R2、R3の各々は、場合によってそれぞれ別個に、水素、C1-6分枝又は非分枝アルキル、C2-6分枝又は非分枝アルケニル、C2-6分枝又は非分枝アルキニル、C3-8-炭素環、C3-8-複素環及びC5-10-アリール、C5-10-ヘテロアリールから成る群から選択される1つ以上の置換基で置換されてよく、さらに
陽イオン基Cは、少なくとも1つの窒素原子を含み、及び場合によって硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含むC3-11-複素環であるか、又は、少なくとも1つの窒素原子を含み、及び場合によって硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含んでよいC5-18-ヘテロアリールであるか、
又は、少なくとも1つの窒素原子を含み、及び場合によって硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含んでよい、分枝又は非分枝C1-10アルキル、分枝又は非分枝C2-10アルケニル、分枝又は非分枝C2-10アルキニルであり、ここでC及びR3又はC及びR2は環を形成することによって場合によって互いに連結されてよく、さらに
リガンドは場合によって、R1又はR3基を介してマトリックスに固定又は包埋され得る。
さらに別の好ましい実施態様の1つは、プラスミドDNA又はトポ異性体の分離のために下記式2の物質を提供する：
Figure 2014512805
式中、NAは陽イオン基の窒素原子を表し、
NB-Hは水素供与基（カルボニルC=Oに隣接して位置する）を表し、
Yは、酸素（-O-）でありしたがってカルバメート基を生じるか、又は（-NH-）であってしたがって尿素基を生じ、さらに
R1、R2及びR3は、水素、C1-18分枝又は非分枝アルキル、C2-18分枝又は非分枝アルケニル、C2-18分枝又は非分枝アルキニル、C3-11-炭素環、C3-8-複素環、C5-18-アリール及びC5-13-ヘテロアリールから成る群から選択される置換基のいずれかであり、
式中R1、R2及びR3は、場合によって互いにそれぞれ別個に、基-S-、-O-、-NH-から選択される1つ以上の成分を含んでよく、さらに
式中R1、R2及びR3は、場合によって及びそれぞれ別個に、水素、C1-6分枝又は非分枝アルキル、C2-6分枝又は非分枝アルケニル、C2-6分枝又は非分枝アルキニル、C3-8-炭素環、C3-8-複素環及びC5-10-アリール、C5-10-ヘテロアリールから成る群から選択される1つ以上の置換基で置換されてよく、さらに
前記置換は、場合によってR1又はR3を介してマトリックスへ固着することを含む。
式2のもっとも好ましい実施態様の1つでは、Y＝-O-であり、R1はシリカ又はチオールプロピル改変シリカに固定されたアルキルであり、R2はメトキシキノリンであり、さらにR3はエチル又はビニルである。
本発明の“材料”という用語はカルバモイル修飾陰イオン交換型リガンドを指し、さらに前記を含み、場合によって、前記リガンドは不均質（固体又は液体）マトリックス（例えばクロマトグラフィー用支持体、基質、膜又は液相）に固定又は包埋され得る。
本発明の意味する“カルバモイル”という用語は、-O-C(=O)-NH-、-C(=O)-NH-、-C(=O)-NH2の群から選択される成分を指すか、或いは前記はまた、尿素-NH-C(=O)-NH-又はカルバジド-NH-NH-C(=O)-NH-の部分であり得る。
本発明の意味するカルバモイルは、式2に規定した水素供与基受容基系（例えばスルホンアミド、ホスホンアミド及び同様な官能基）から成る他の等配電子官能基を排除しない。
本発明の“リガンド”という用語は、マトリックスにリンカーにより結合し又はマトリックスに包埋され、さらにプラスミドDNAと相互作用することができる化学構造物およびこれを含むものを指す。リガンドの好ましい実施態様は、キンコリン-若しくはキンコリジンカルバメート、又はキンコリン-若しくはキンコリジン尿素である。プラスミドDNAのアイソフォーム、トポ異性体、オリゴマー及びマルチマー形の分離に使用するという関係では、より好ましい実施態様の1つは、シンコナンカルバメート又はシンコナン尿素であり、もっとも好ましくはキニン-若しくはキニジンカルバメート、特にプロピルカルバモイルキニン若しくはキニジン、tert-ブチルカルバモイル-キニン若しくはキニジン、及びアリルカルバモイル-10,11-ジヒドロキニン若しくはキニジンである。
“場合によって置換される”という用語は、メチレン基の水素原子又は芳香族若しくはヘテロ芳香族環の水素原子が異なる有機又は無機置換基で置換されることを意味するものである。
本明細書の“C1-18アルキル”という用語は、1−18の炭素原子を有する飽和分枝又は非分枝炭化水素鎖を意味する。
本明細書の“C1-6アルキル”という用語は、1−6の炭素原子を有する飽和分枝又は非分枝炭化水素鎖を意味する。
本明細書の“C2-18アルケニル”という用語は、2−18の炭素原子を有する不飽和分枝又は非分枝炭化水素鎖を意味し、前記は少なくとも1つの二重結合を含む。
本明細書の“C2-6アルケニル”という用語は、2−6の炭素原子を有する不飽和分枝又は非分枝炭化水素鎖を意味し、前記は少なくとも1つの二重結合を含む。
“C2-18アルキニル”という用語は、2−18の炭素原子を有する不飽和分枝又は非分枝炭化水素鎖を意味するもので、前記は少なくとも1つの三重結合を含む。
“C2-6アルキニル”という用語は、2−6の炭素原子を有する不飽和分枝又は非分枝炭化水素鎖であり、前記は少なくとも1つの三重結合を含む。
“分枝”という用語は、炭化水素鎖（場合によって硫黄、酸素又は窒素から選択される連鎖原子を含む）の少なくとも1つの原子が、共有結合によって別の炭素鎖の原子と結合することを意味するものである。
“非分枝”という用語は、炭化水素鎖（場合によって硫黄、酸素又は窒素から選択される連鎖原子を含む）のいずれの原子も、他のいずれの炭素鎖原子とも共有結合しないことを意味するものである。
本発明の意味する“炭素鎖原子”という用語は、2つの別個の結合を示す原子（例えば炭素、硫黄、酸素又は窒素）に関する。
“C3-11炭素環”という用語は、炭素数3−11の脂肪族炭化水素が環化した炭化水素環を意味するものである。
“C3-8炭素環”という用語は、炭素数3−8の脂肪族炭化水素が環化した炭化水素環を意味するものである。
“C3-8複素環”という用語は、3−8の環原子を含む炭素環であり、ここで前記環原子の少なくとも1つは炭素ではなくN、O又はSから選択される原子である。
“C5-18アリール”という用語は、5−18の環原子を有する芳香族炭化水素環である。
“C5-10アリール”という用語は、5−10の環原子を有する芳香族炭化水素環である。
“C5-13ヘテロアリール”という用語は、5−13の環原子を有する芳香族環であり、ここで少なくとも1つの環原子は炭素ではなくN、O又はSから選択される原子である。
“C5-10ヘテロアリール”という用語は、5−10の環原子を有する芳香族環であり、ここで少なくとも1つの環原子は炭素ではなくN、O又はSから選択される原子である。
好ましい実施態様の1つでは、R1は、水素、C1-8分枝又は非分枝アルキル、C2-8分枝又は非分枝アルケニル及びC2-8分枝又は非分枝アルキニルから成る群の置換基のいずれかで、場合によって1つ以上の硫黄原子を含む。
別の好ましい実施態様では、R1は、C3-8-炭素環、C5-8-複素環及びC5-10-アリール、C5-9-ヘテロアリールから成る群の置換基のいずれかである。
さらにまた別の好ましい実施態様では、R3は、水素、C1-8分枝又は非分枝アルキル、C2-8分枝又は非分枝アルケニル及びC2-8分枝又は非分枝アルキニルから成る群から選択される置換基のいずれかで、場合によって1つ以上の硫黄原子を含む。
別の好ましい実施態様では、R2は、水素、C5-10-アリール及びC5-9-ヘテロアリールから成る群の置換基のいずれかである。
式1のもっとも好ましい実施態様の1つでは、o＝0及びm＝1、または、o=1およびm=0である。
式1のさらに好ましい実施態様の1つでは、o＝0及びm＝1、であり、k＝1及びl＝1、Zは-C-であり、さらにn＝1である。或いは、別のもっとも好ましい実施態様では、o＝1及びm＝0であり、さらに、k＝1及びl＝1、Zは-C-であり、さらにp=1である。
式1のさらに好ましい実施態様では、o＝0及びm＝1であり、さらに、k＝1及びl＝1、Zは-S-であり、さらにn＝2である。
式1のさらに好ましい実施態様では、o＝1及びm＝0であり、k＝1及びl＝1、Zは-S-であり、さらにp＝2である。
“マトリックスに固着”という用語は、リガンドとマトリックスとの間又はリガンドとマトリックスに結合する残基との間に安定な結合を形成する任意の置換基を意味するものである。
本発明の“分子量”という用語は、本発明のリガンドの構成原子の相対的原子質量の合計を指す。好ましい実施態様では、リガンドの分子量は、200から2000Da、より好ましくは250から1200Da、もっとも好ましくは400から700Daである。
“陽イオン基C”は、少なくとも１つの窒素原子及び場合によって硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含むC3-11複素環、又は
少なくとも1つの窒素原子、及び場合によって硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含むC5-18-ヘテロアリールであるか、又は
少なくとも1つの窒素原子、及び場合によって硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含む、分枝又は非分枝C1-10アルキル、分枝又は非分枝C2-10アルケニル、分枝又は非分枝C2-10アルキニルであり、
ここでC及びR3又はC及びR2は場合によって、環を形成することによって互いに連結されていてよい。
本発明の意味する“環”という用語は、単環式、二環式、多環式又はスピロ環式環を指す。
さらに好ましい実施態様では、陽イオン基は単環式又は二環式環系に取り込まれる。
好ましい実施態様では、二環式環系は、トロパン、(ヒドロ)キノリジジン、(ヒドロ)ピロリジジン、1-アザ-アダマンタン、アザビシクロ[3.2.1]オクタン、アザビシクロ[3.2.1]ノナン、アザビシクロ[3.3.1]ノナン、(ヒドロ)インドリジジン、(ヒドロ)ベンゾイミダゾール、(ヒドロ)キノリン、(ヒドロ)イソキノリン、であり、より好ましくはアザビシクロ[4.4.0]デカンであり、もっとも好ましくはキヌクリジンである。
本発明の意味する“陽イオン基”という用語はさらに、三級、四級、二級、一級アミン又はグアニジン、アミジン及び(ヘテロ)芳香族アミノ基から成る群から選択される、局部的又は永続的陽性荷電を有する、１つの窒素原子を含む成分を指す。陽イオン基の好ましい実施態様は、脂肪族アミン、より好ましくは四級アミン、もっとも好ましくは三級アミンである。もっとも好ましい実施態様の１つでは、三級アミンはキヌクリジンの一部分である。
“水素供与成分”という用語は、電気的陰性原子（例えば窒素、酸素又はフッ素）と結合した水素原子の組合せを指す。
“水素受容基”という用語は、少なくとも1つの自由電子対を有する電気的陰性原子、例えば酸素、窒素、フッ素又は硫黄を指す。
本発明の意味する“スペーサー”という用語は、機能的に重要な実体（すなわち陽イオン基（C））と一方の側で、さらに水素供与成分（N-H）と他方の側で結合する規定数の隣接原子群を指す。スペーサーの長さは3から5原子である。もっとも好ましい実施態様では、スペーサーの長さは4原子と等しい。
別のより好ましい実施態様では、本発明のリガンドはマトリックスから6原子よりさらに離れて存在することはない。
本発明の意味する“固定された”という用語は、固体又は液体マトリックス（支持体）上での共有結合を指す。
本発明の意味する“包埋された”という用語は、固体又は液体マトリックス（支持体）への非共有結合的封入を指す。
“マトリックスに固着”という用語は、リガンドとマトリックスとの間又はリガンドとマトリックスに結合する残基との間に安定な結合を形成する任意の置換基を意味するものである。
本発明の意味する“不均質なマトリックス”という用語は、溶解させたプラスミドDNAを含む溶媒と一体化し得ない、不溶性又は非混和性であるマトリックス（支持体）に関する。
“プラスミドDNA”という用語は、二本鎖デオキシリボ核酸から成る染色体外遺伝単位を指す。
本発明の意味する“アイソフォーム”という用語は、共有結合閉環状（ccc）、開環状（oc）及び線状（lin）プラスミドの群から選択される、等しい分子量を有するプラスミドの種々の形態を指す。そのようなアイソフォームの関連する分析は、アイソフォーム分析と称されるはずである。
本発明の意味する“オリゴマー及びマルチマー”という用語は、モノマーアイソフォームのより大きな分子への合体から生じる、異なる分子量（その分子量はモノマーの分子量の完全な倍数である）を有するプラスミドDNAの種々の形態に関する。続いて、オリゴマーという用語は、2つ、3つ又は4つのモノマーの合体を示し、一方、マルチマーという用語は5以上のモノマーの合体を示す。オリゴマー及びマルチマー合体物はカテナン又はコンカテマーのどちらかの形態で存在し得る。
本発明の“カテナン”という用語は、1つの鎖の中で複数の輪として一緒に絡み合う環状DNAを指す。
本発明の“コンカテマー”という用語は、連続してつながる同じDNA配列のマルチコピーを含む長い連続するDNA分子を指す。
“カテナン”及び“コンカテマー”という用語は、末端と末端が結合するコンカテマー化DNAとは対照的に、カテナン化DNAはループとループが結合するということを特徴とする。
本発明の意味する“トポ異性体”という用語は、種々の程度のスーパーコイリング（トポロジーによるリンキング数又はリンキング数の相違によって示される）を有する共有結合閉環状（ccc）プラスミドDNA分子を指す。個々のあるプラスミドのトポ異性体は等しい分子量及び結合性（conectivity）を有する。そのようなトポ異性体の関連する分析はトポロジー分析又はトポ異性体分析と称されるはずである。
本発明の意味する“分離”という用語は、プラスミドDNAの種々の形態（例えばアイソフォーム、トポ異性体、オリゴマー及びマルチマー形）のリガンドに対するこれら形態の種々の親和性を基準にした分離（化学親和性基本概念と称される）に関する。
“クロマトグラフィー”という用語は、2つの不均質相を利用する分離技術一式を指し、一方の相（いわゆる移動相）は他の相（いわゆる静止相）に沿って移動する。
好ましい実施態様は、水素供与基N-Hが水素受容基に隣接して位置する、本発明の材料である。
本発明の意味する“隣接”という用語は、ただ1つの共有結合による2つの原子又は原子群の間の直接結合を示す。
好ましい実施態様では、水素受容基は、カルボニル（C=O）、スルホニル（SO2）及びホスホニル（P=O）から選択される。
さらに別の好ましい実施態様では、水素受容基及び水素供与基は、アミド、カルバメート、尿素、ホスホンアミド又はスルホンアミド基の部分を形成する。
さらに別の好ましい実施態様では、プラスミドDNAは、プラスミドのサイズ及びそのヌクレオチド配列とは無関係に、ccc及びそのトポ異性体、oc、lin、ダイマー、トリマー、オリゴマー、マルチマー（カテナン又はコンカテマーの形態にある）から成る群から選択される任意の成分の混合物を含む。
本発明の意味するところでは、“マトリックス”という用語は、リガンドを結合させることができる固体支持体、又はリガンドを溶解させることができる液体を包含する。
本発明の意味する“固体マトリックス”という用語は、所望のクロマトグラフィーによる分離又は液体-固体抽出に適した固体支持体（無機ポリマー又は有機ポリマーから選択される）、好ましくは微小薄膜性のシリカ系粒子を指す。
“微小薄膜性”という用語は無孔性マトリックス粒子を指し、前記は、静止相の薄く保持能力を有する相によって被覆された液体を通さない支持体物質（溶融シリカ粒子又は有機ポリマー微小球）のコアを特徴とする。静止相の薄く保持力を有する相は、標的溶質を保持できる吸着表面を得るために、表面をでこぼこにして対応するクロマトグラフィー用リガンドを結合させることによって入手できる。
“液体マトリックス”という用語は、非極性溶媒（例えばアルカン、シクロアルカン）、又はポリマー液体（例えばポリシロキサン、ポリエチレンオキシド）、又は別の溶媒で希釈したポリマー液体（例えばポリシロキサン又はポリエチレンオキシド）の群から選択される液体を指す。
好ましい実施態様では、本発明のマトリックスは有機又は無機ポリマーから選択される。
“有機ポリマー”という用語は、固体の有機ポリマー（例えばポリ(メタ)アクリルアミド及びそのコポリマー、開環メタテーシスポリマー、多糖類及びそのコポリマー（例えばアガロース）を指し、スペーサー及び／又はリガンドの共有結合による付着を可能にする化学基を当該ポリマー表面に保有する。
“無機ポリマー”という用語は、固体の無機ポリマー、例えば酸化ケイ素（シリカ）、酸化チタニウム、酸化ゲルマニウム、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム及びガラスを指す。前記ポリマー表面はスペーサー及び／又はリガンドを共有結合により付着させることができる。
さらにまた別の実施態様では、固体マトリックスは粒子、モノリス樹脂、膜又は磁性ビーズである。
“粒子”という用語は、多様なサイズ及び形態学的特色（不規則、規則的、球状、有孔性、無孔性、微小薄膜性を含むが、ただしこれらに限定されない）を有する固体マトリックス構造を指す。通常は、1つの分離区画内に多数（＞1000）の個々の粒子が存在する。
“モノリス樹脂”という用語は、移動流を可能にするフロースルーチャネル（マクロポアとも称される）を含み、場合によってさらに別のより小さなサイズのポア（例えばメゾポア及びミクロポア）を含む固体マトリックス構造を指す。通常は、1つの分離区画内にただ1つのピース又は少数（＜10）の個々のモノリス樹脂が存在する。
“膜”という用語は、溶媒に対して透過性であり、さらに溶質（サンプル成分を含む）に対して半透過性である薄層の形状を有する固体マトリックスを指す。膜は、多糖類、例えばセルロース、セルロースエステル、ポリ(メタ)アクリレート、ポリ(スチレン)。ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリフェニレンオキシド、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニリデンクロリド、PVC、ポリイミド、PVA、ポリカーボネートの群から選択される。
“磁性ビーズ”という用語は、磁性又は鉄磁性内部コア及び外部固体マトリックスシェルを含む粒子を指し、前記は磁場を適用したとき引き寄せられる。
本発明の材料の好ましい実施態様は以下から成る群から選択される：
（構造a）
Figure 2014512805
3-メルカプトプロピルシリカマトリックスに固定された3-(アリルカルバモイルオキシ)-N-ベンジルピペリジン
Figure 2014512805
点線の左側の部分構造は支持マトリックスを表し、右側の部分構造はリガンドを表す。
（構造b）
Figure 2014512805
シリカマトリックスそのものに固定されたトリエトキシシリル-活性化プロピルカルバモイルキニン-リガンド
Figure 2014512805
点線の左側の部分構造は支持マトリックスを表し、右側の部分構造はリガンドを表す。
（構造c）
Figure 2014512805
3-メルカプトプロピル-改変シリカマトリックスに固定されたアリルカルバモイル-10,11-ジヒドロキノリンリガンド
Figure 2014512805
点線の左側の部分構造は支持マトリックスを表し、右側の部分構造はリガンドを表す。
（構造d）
Figure 2014512805
3-メルカプトプロピル-改変シリカマトリックスに固定されたO-tert-ブチルカルバモイル-キンコリン
Figure 2014512805
点線の右側の部分構造は支持マトリックスを表し、左側の部分構造はリガンドを表す。
（構造e）
Figure 2014512805
3-メルカプトプロピル-改変シリカマトリックスに固定されたtert-ブチルキンコリニル-尿素リガンド
Figure 2014512805
点線の右側の部分構造は支持マトリックスを表し、左側の部分構造はリガンドを表す。
（構造f）
Figure 2014512805
メルカプトプロピル-改変シリカマトリックスに固定されたtert-ブチルカルバモイル-キニン
Figure 2014512805
点線の右側の部分構造は支持マトリックスを表し、左側の部分構造はリガンドを表す。
（構造g）
Figure 2014512805
チオール改変ポリメタクリレートビーズ（Suprema-Gel 30u）に固定されたtert-ブチルカルバモイル-キニンリガンド
Figure 2014512805
点線の右側の部分構造は支持マトリックスを表し、左側の部分構造はリガンドを表す。
3つのpDNAアイソフォーム又はトポ異性体の全ての分離は、カルバモイル修飾陰イオン交換リガンドを含む材料によって実施される。このリガンドはこのタイプの液相分離のためにこれまで用いられたことはなかった。本発明のこれらのリガンドは、NH-供与基、H-受容基、及び陰イオン交換部位の十分に規定された配置を含む。したがって、前記リガンドを含む材料とのプラスミドアイソフォーム/トポ異性体の相互作用は所定の態様で支配され、不変の溶出順序が担保される。したがって、本発明は、非常に大きな生物分子の分離のために、化学親和性の基本概念に基づく新規で信頼性及び予測性を有する概念を主張する。さらにまた、cccトポ異性体は、バイオテクノロジーによる製造（最終製品の性状決定を含む）でさらに別の品質管理パラメーターを提示する潜在能力を有する。
本発明の材料、方法及びプロセスに多様な改変を加え得ることは当業者には明白であろう。したがって、本発明は、そのような改変及び変型をカバーするが、ただしそれらが本特許請求の範囲及びその等価物の範囲内にあることを条件とする。本明細書に引用される全ての刊行物は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
プラスミドDNA分離に適切なクロマトグラフィー用リガンドは、マトリックスとの容易な結合を可能にするために設計され（実施例1）、末端アルケン基を含むリガンドはラジカル付加反応でチオール基と反応する。したがって、第一の工程で、リンカーは末端チオール基を含むマトリックスと結合する。第二の工程で、マトリックス及びアルケン含有リガンドがラジカルイニシエーターの存在下で混合され、リガンドとマトリックス結合リンカー（構造aを参照）との間に安定なチオ-エーテル結合を付与する。このプロセスを用いて、マトリックス表面が高密度でリガンドに覆われたクロマトグラフィー用材料が容易に得られる。
本発明の材料の役割を実用的に評価するために、プラスミドpMCP1（Boehringer Ingelheim, サイズ4.9kb）のクロマトグラフィーによる分析分離に、2つのキニン-カルバメートリガンド（すなわちプロピルカルバモイルキニン及びアリルカルバモイル-10,11-ジヒドロキニン）を用いる。第一のリガンドは、当該リガンドとシリカマトリックスとの間に短いプロピルリンカーを介して（マトリックスの第一のケイ素原子とNH水素供与基との間に4つの結合（構造b参照））チオプロピル改変シリカマトリックスに固着させ、他方のリガンドは長いリンカーを介して（マトリックスの第一のケイ素原子とNH水素供与基との間に8つの結合（構造c参照））固着させる。長いリンカーと短いリンカーのクロマトグラフィー特性の比較によって、短連結リガンドの使用がoc形の回収の顕著な改善をもたらすことが開示される（すなわち、実施例2に示すように、1回のクロマトグラフィー操作で4.9kbのプラスミドの1μgに等しい完全な回収が記録される）。もっとも重要な相違はリンカーの長さ（3原子対7原子）で、すなわちリガンドとマトリックス表面との間の距離は同一ではない。短いリンカーを含む材料を用いたとき、全てのアイソフォーム（oc形を含む）の完全な回収が認められ、これは、負に荷電した残留シラノール（pDNAに対し反発作用を有する）が近接するためである。さらにまた、これらのデータは、pDNAアイソフォーム分析にこれまで用いられてきた市販のカラムと比較して、材料のoc回収に関するだけでなくoc形とccc形間の分離に関しても本材料の特性の全体的改善（秀逸性）を示している。
マトリックスの形態の影響を試験するために、上記パラグラフで述べた長連結リガンドを、以下のシリカ系マトリックスに長いリンカーを介して結合させる：1.5μm無孔性粒子、10μm有孔性粒子及びモノリス（実施例3）。これらの物質を含むカラムを、上記パラグラフで開示した同じ実験設定で試験する。pDNAの3つのアイソフォームの全て（pMCP1プラスミドのoc、ccc及びlinアイソフォーム）を含むサンプルをカラムにロードし、同一条件下で溶出させる。実質的相違がこれらの固体支持体間で観察される。全ての被検マトリックスが、ocアイソフォームからcccアイソフォームを分離するために、さらにlinアイソフォームからcccアイソフォームを分離するために適切である。さらにまた、1.5μmマトリックスを使用するとき、ocアイソフォーム及びlinアイソフォーム間の効率的分離が達成される（図1a参照）。したがって、分析目的では1.5μm支持体が好ましい選択である。しかしながら、単にccc形の分離に焦点を当てた調製的適用には、10μmの有孔性マトリックス（図1b参照）及びモノリス支持体（図1c参照）がともに適切である。oc及びlinアイソフォームの同時溶出にもかかわらず、この事例ではccc形のなお効果的な分離が達成される。
トポ異性体分離に関しては、もっとも豊富なトポ異性体間の保持時間の相違として計算されるクロマトグラフィーの選択性は全ての被検支持体で同等であることが判明した（0.12±0.02）。このことは、高い分離不動性をもたらす化学親和性分離の基本概念の重要性を示している。しかしながら、1.5μmマトリックスは、狭いピーク幅のために最高の分離効率を提供し、したがって分析目的には好ましい選択である。一般的には、小さな無孔性球状粒子は、pDNAアイソフォーム及びトポ異性体のための最良の分離効率を提供し、したがって分析規模の分離には最適であることが見出された。大きな有孔性粒子及びモノリスは、特にoc及び線状形からcccアイソフォームを分離するときはなおpDNA形の良好な分離を提供する。特にモノリスに固有の低い圧の低下及び高い結合能力のために、モノリスは調製的適用により適切である。
さらにまた、実施例4では以下の2つの異なるpDNA分離方法が比較される：塩化ナトリウム（NaCl）の上昇勾配を用いる方法1及びpH上昇勾配を用いる方法2。両方の事例で、1.5μm無孔性粒子を土台にした物質（構造b）を含むクロマトグラフィーカラムがpDNA分離に適用される。これら2つの分析方法間でpDNAの性状決定について顕著な相違が認められる。
結合したDNAを溶出させるためにNaClと2-プロパノールの勾配組合せを用いる方法1による分析の際に、NaCl及び2-プロパノールの両方の移動相中の濃度は同時に増加する。この事例では、oc、線状及び個々のcccトポ異性体は、1回のクロマトグラフィーの操作中に全て分離される（図1a参照）。
結合したDNAを溶出させるためにpHと2-プロパノールの勾配組合せを用いる方法2による分析の際に、移動相のpH値及び移動相の2-プロパノール含有量は同時に増加する。この事例では、3つのアイソフォームの全て（oc、ccc及び線状）の分離は達成されるが（図2a参照）、個々のトポ異性体の分離を欠いている。cccアイソフォームは単一ピークとして溶出するので、NaCl媒介溶出と比較して他の2つの形態の分離はさらに改善される。さらにまた、各アイソフォームの1μgを50ｘ4.6mmカラムにロードしたとき、被検プラスミドサイズの全範囲において（すなわち4.9kb、特に9.9kb及び14.5kb）、全アイソフォーム（oc、lin及びccc）の完全な回収が認められる（すなわち、公知の技術（例えばイオン交換クロマトグラフィー）と比較したとき大きなサイズのpDNAの分離に優れている）。したがって、方法2は、プラスミドのサイズに無関係に、プラスミドの均質性（すなわち他の形態（oc及びlin）に対して相対的なccc含有量）を分析的に決定するために好ましく、同様にccc pDNAの単離のための調製的適用（トポ異性体の分離は必要としない）にも好ましい（NaCl媒介溶出と比較してその狭いピーク形状と収集分画の低い塩負荷による）。
pDNAアイソフォーム及びトポ異性体分離に用いられるリガンドの可変性を示すために、3つの異なるリガンドを5μm球状シリカ粒子に結合させる：すなわちtert-ブチルカルバモイル-キンコリン（構造d）及びtert-ブチルキンコリニル-尿素（構造e）（両方とも長いリンカーで結合される）並びに支持体に直接結合させたポリカルバモイルキニン（構造d）（実施例5）。約5％のocアイソフォームを含むccc pDNAをこれらのカラムの各々にロードし、塩化ナトリウム及び2-プロパノールの直線状勾配を用いる同一条件下で溶出させる。図3aは、tert-ブチルキンコリニル-尿素リガンドを用いるそのようなpDNAサンプルのクロマトグラフィー分離を示し、図3bは、tert-ブチルカルバモイル-キンコリンリガンドを用いるそのような分離を示し、一方、図4aではポリカルバモイルキニンリガンドを用いるそのような分離が示されている（実線）。これらのカラムの全てで、類似性のある溶出パターン（等価の溶出順序）が得られ、化学親和性の基本概念の不動性を示している。最初に、ocアイソフォームがカラムから溶出し、その後でcccトポ異性体のいわゆるボルツマン（Boltzmann）分配パターンが得られる（すなわち、それらの自由エネルギーに応じた各々の種の個々の相対的濃度；当該エネルギーに応じた形の状態の分布に対する蓋然性の測定）。そのような新規で不動性を示す、特にプラスミドのトポ異性体の分離は、プラスミドDNAで使用される本発明の重要な部分であり、分析的規模及び調製的規模の両方での適用に対して顕著な利点を示す。
本材料のローディング能力を示すために、ポリカルバモイルキニンリガンドを有する1.5μmの無孔性シリカ支持体を含む50ｘ4.6mmカラムに総量284μgのpDNAをロードする。この実験には、HPLC系の最大注入体積を用いる。塩と2-プロパノールの組合せ勾配による溶出で、図3cに示すクロマトグラフィー図が得られる。過剰ローディング作用も個々のトポ異性体間のクロマトグラフィー分解能力低下も認められない。したがって、そのような小さな寸法のただ1つの分析カラムを使用することによって、約30から50回の操作後にミリグラム量の個々のトポ異性体を容易に単離することができる。さらにまた、一般的クロマトグラフィーは直線的測定能力を特徴とし、したがってクロマトグラフィーのアップスケールのために、以下の一般的規則にしたがってより大規模の調製的適用を設定することができる。
相補的方法、キャピラリー電気泳動を用いて溶出分画を分析することによって、トポ異性体の溶出パターンを評価する（実施例6）。個々のトポ異性体が溶出しているとき、より小さい負の値にスーパーコイルされたものが最初に溶出することが判明した。したがって、より大きい負の値のスーパーコイリングを有するトポ異性体が後で溶出し、これは、図4aの単離クロマトグラフィー分画“A”及び“B”（点線）をクロロキン含有キャピラリーゲル電気泳動により分離することによって示される（図4b）。より少なくスーパーコイルされたトポ異性体（この実施例ではトポ異性体“A”）はまたより少ないライジングを有し、したがってこの分子は、より多くスーパーコイルされたトポ異性体“B”よりも大きなサイズを有する。ゲル電気泳動分離はサイズ依存性であるので、トポ異性体“B”はトポ異性体“A”より速く移動し、弛緩型ocアイソフォームはこのサンプルでもっとも遅く移動する種である。ボルツマン分布にしたがう、pMCP1プラスミド（4.9kb）のこのトポ異性体パターンはまた、プロピルカルバモイルキニンリガンドを含むカラムを用いて市販のプラスミド、例えばpUC19（2.7kbp, Sigma Aldrich）、pBR322（4.4 kb, Sigma Aldrich）、pET-40b(+)（6.2 kbp, Invitrogen）、又はpBACsurf-1（9.5 kbp, Invitrogen）を分析することによっても記録される。
本トポ異性体分析の適切さを示すために、プラスミドトポ異性体パターンをプラスミド発酵の時間経過にしたがって調べる（実施例７）。細菌細胞を含む細胞塊サンプルをNaOH/SDSを用いて破壊する。懸濁物を遠心分離してpDNAを含む細胞内容物を入手する。二次元高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によるアプローチを用いる。第一の工程では、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて混合物から全pDNAを単離し、二次元では、アリルカルバモイル-10,11-ジヒドロキニンリガンド含有シリカ（構造cに示される）カラムがcccトポ異性体の分離に用いられる。2時間間隔で取り出した発酵サンプルを2D HPLCで分析する。結果は二次元の後で得られたクロマトグラフィー図の重ね合わせとして示されている（図5a）。提示のクロマトグラフィー図は、発酵の開始から11、13、15及び17時間後に採取されたサンプルの記録である。もっとも豊富なcccトポ異性体（図5aに矢印でマークされている）によって表される最大分布トポ異性体は発酵中にシフトする。この事例では、全体的スーパーコイリングはより低い負のスーパーコイリングに向かってシフトする。最大分布の全体的進行が図5bに示されている。発酵プロセスの間、ccc pDNAのスーパーコイリングは発酵の最初の数時間に顕著に変化するが、終わり頃には類似したままである。これらのデータは、液体クロマトグラフィーによる簡単な方法で決定される、プロセスステージの指標として及び品質管理パラメーターとして、さらに全製造プロセスにわたる安定性試験のために用いることができる、トポ異性体分析の重要性を支持する。
リガンドの合成及び固体マトリックスとの結合のためのスキーム
スキーム1：980mg（5mmol）の(R)-(-)-1-ベンジル-3-ヒドロキシピペリジン（Sigma Aldrich）を3首丸底フラスコに移し、15mLのジクロロメタンに溶解する。この装置に窒素をフラッシュし、触媒としての3μL（5μmol）のジブチルチンジラウレート（Aldrich）とともに、502μL（5.7mmol、1.15eq.）のアリルイソシアネート（Fluka）を前記混合物に添加する。黄色系の溶液を3時間還流させ、反応の進行をTLC（ジクロロメタン：メタノール＝20：1）でモニターする。急速シリカカラムクロマトグラフィー（溶離剤としてジクロロメタン：メタノール＝25：1を用いる）の後で、生成物、3-(アリルカルバモイルオキシ)-N-ベンジルピペリジンが58％の収量で単離される。3-メルカプトプロピル-改変シリカマトリックス（又は支持体）は、裸の5μmの球状シリカ（30g, Daiso, Japan）及び3-メルカプトプロピル-メチルジメトキシシラン（8.6mL）から、それらを4-ジメチルアミノピリジン（57 mg, Fluka）の存在下で乾燥トルエン中にて7時間還流させることによって生成される。エンドキャッピングは、生成された3-メルカプトプロピル-改変シリカを1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザン（Fluka）とともにトルエン中で3時間還流させてトリメチルシリル（TMS）-エンドキャップシラノールを形成することによって実施する。330mg（1.2 mmol）の3-(アリルカルバモイルオキシ)-N-ベンジルピペリジン及び2.05gのエンドキャップメルカプトプロピル改変-5μmシリカを、機械攪拌装置付きの3首丸底フラスコに移し、30mLのメタノール中に懸濁させる。この装置を激しくフラッシュし、その間に5mLのメタノール中の5mgのアゾ-ビス-(イソブチロニトリル)（AIBN, Merck）の溶液を添加する。この混合物を窒素雰囲気下で20時間還流させ、続いて半融硝子フィルター（気孔率3）でろ過する。前記シリカ物質をメタノールでよく洗浄した後、60℃で48時間乾燥させる。この合成物質は、3-メルカプトプロピルシリカマトリックスに固定された3-(アリルカルバモイルオキシ)-N-ベンジルピペリジン（構造a）を表す。
スキーム2：チオール改変有機ポリマーマトリックスは以下のように得られる：20mLの蒸留水及び5mLの2-プロパノール（Roth）の混合物に178mgのリン酸水素二ナトリウム（Merck）を溶解することによって反応緩衝液を調製する。pHを稀釈オルトリン酸で8.0に調整する。132.6mgのスプレーマゲル（Suprema-Gel）30u（Polymer Standards Service-USA, Inc.）を1.8mLの反応緩衝液に懸濁する。続いて反応緩衝液中のNaSH水和物（Sigma Aldrich）の溶液（100 mg/ml）192μLを添加し、この混合物をサーモミキサー（Eppendorf）にて63℃で2時間攪拌する。小さなガラスロート（気孔率3）によって、前記改変物質を反応緩衝液で2回、水で2回、0.1mol/LのHClで1回、再度水で、さらにメタノールで2回洗浄する。
末端チオールへのジスルフィドの還元：11.8mLの水及び2.8mLのメタノールの混合物（測定pHは4.6）に672mgのリン酸二水素ナトリウムを溶解させることによってTCEP緩衝液を調製する。続いて、19mg（75μmol）のトリス(2-カルボキシエチル)-ホスフィンヒドロクロリド（TCEP）（Fluka）を1mLのTCEP緩衝液に溶解させる。34.5mgのチオール改変スプレーマゲルを前記溶液に添加し、この混合物を室温で一晩攪拌する。前記懸濁物を小ロートでろ過し、前記物質をTCEP緩衝液、メタノール、最後にヘキサンで洗浄する。元素分析（炭素54.52％、水素7.67％、硫黄1.40％）は硫黄濃度が0.44mmol/gであることを示すが、窒素は存在しない。反応性チオールの濃度は、質量分析で決定したとき0.14mmol/gである（Nogueira et al., Analytica Chimica Acta, 2005, vol. 533 (2), pp. 179-183）。
リガンド改変：14.4mgの還元チオール改変スプレーマゲル30uを安全ロック付きプラスチック管（Eppendorf）に移す。メタノール中のtert-ブチルカルバモイルキニン溶液（3.2mg/mL）（自家製造）の130μL、メタノール中のAIBN溶液（2mg/mL）（Merck）の10μL、及び0.36mLのメタノールを添加し、前記混合物を窒素でパージする。この反応管を65℃で18時間攪拌する。前記懸濁物を小ロートでろ過し、前記物質をメタノールで3回，最後に石油エーテルで洗浄する。元素分析（炭素50.27％、水素7.70％、窒素0.11％、硫黄0.97％）は、チオール改変有機ポリマーマトリックスへのtert-ブチルカルバモイルキニンリガンド（構造g）の良好な固定を示す。
プラスミドアイソフォームの回収に対するリンカーの長さの影響
キニンカルバメートリガンドを有する2つの固体クロマトグラフィー支持体を合成する。前記支持体の一方には、リガンドが短いリンカーを介してマトリックスに固着され（裸のシリカ上にトリエトキシシリル-活性化プロピルカルバモイルキニン、構造b）、他方のマトリックスには長いリンカーを介して固着される（3-メルカプトプロピル-改変シリカ上に9-アリルカルバモイル-10,11-ジヒドロキニン、構造c参照）。実施例1のスキーム1にしたがい、長いリンカーを有する支持体を10,11-ジヒドロキニン（Buchler、ドイツ）及びアリルイソシアネート（Sigma Aldrich）から出発して95％収量で合成し、さらにエンドキャップ3-メルカプトプロピル-改変シリカに結合させる。元素分析（炭素14.01％、水素2.18％、窒素1.38％及び硫黄1.90％）によれば、リガンド密度は318μmol/gである。
短いリンカーで連結されたリガンドを有するマトリックスの製造のために、3-イソシアネートプロピル-トリエトキシシラン（1mol eq.）及びキニン（1.05mol eq.）をメタノール中で還流させ、カルバメート含有生成物を得る。裸の5μmシリカを前記混合物に直接添加し（キニン1mmolにつき0.5gの裸のシリカ）、その間機械的に攪拌し、前記懸濁物をさらに還流させてトリエトキシシリルプロピルカルバモイルキニン-改変シリカを得る。メタノールで洗浄後、シラノール基を実施例1のスキーム1にしたがってエンドキャップする。元素分析（炭素7.90％、水素1.21％、窒素0.911％）によれば、リガンド密度は217μmol/gである。
前記生成支持体を含むHPLCカラムに改変5μmシリカ静止相を600barの圧で自家充填する。HPLC分析は、1対のポンプを有するアジレント（Agilent）1200SL系（Waldbronn、ドイツ）、サーモスタット付きオートサンプラー（4℃に冷却）及びDAD UV検出装置（UV源としてD2ランプを使用）を用いて実施する。サンプルの成分は方法1を用いて溶出させる（すなわちNaCl勾配及び2-プロパノール勾配の同時上昇を用いる（“NaCl及び2-プロパノール混合勾配”））。
HPLC溶離剤及びクロマトグラフィー条件：最初に、NaH2PO4（Merck）から0.5mol/Lのストック溶液を調製する。溶離剤Aはストック溶液の1：10希釈から成り（50mmol/L NaH2PO4）、5MのNaOHで7.0に調整される。溶離剤Bは、0.6mol/L NaCl（Fluka）及び10％（v/v）のイソプロパノール（Roth）を含むストック溶液の1：10希釈から成り（50mmol/L NaH2PO4）、5MのNaOHで7.0に調整される。分析時には15分で0から100％Bに至る勾配で流される。流速は0.7ml/分、検出波長は258nm（スリット：4nm、リファレンス360nm（バンド幅100nm））及び温度は50℃（溶媒は3μL熱交換器中で予熱）に設定する。
クロマトグラフィー操作の記録のために、5％のoc形（ゲル電気泳動の結果を基にする）を含むccc pDNAサンプルの2.84mg/mL溶液の3μLをカラムにロードし、上昇量の溶離剤Bで溶出させる。3MのNaClの50μLプラグを4回注入してカラムを洗浄し、100％の溶離剤Bでカラムを洗浄して持ち越しが無いことを担保し、さらに0％Bで5分間カラムを再平衡化した後、ocアイソフォームの0.05mg/mL溶液の20μLを前記カラムにロードし、上昇量の溶離剤Bで溶出させる。3MのNaClの50μLプラグを4回注入してカラムを洗浄し、さらに100％の溶離剤Bでカラムを洗浄した後、linアイソフォームの0.05mg/mL溶液の20μLを前記カラムにロードし、上昇量の溶離剤Bで溶出させる。長いリンカーで連結したリガンドを有するマトリックスを用いてoc及びlinアイソフォームについて得られたピーク面積を比較したとき、回収は約60％である（pDNAの1μg当たりのocアイソフォームのピーク面積とpDNAの1μg当たりのlinアイソフォームのピーク面積との間の比率として計算）。しかしながら、短いリンカーで連結されたリガンドを用いたとき、データは分析誤差の範囲内（5％）で互いに類似する。ccc及び線状アイソフォームサンプルについて得られたピーク面積を比較したとき、試験した支持体の両方が95から100％の間の回収を示す。
pDNAアイソフォーム及びトポ異性体の分離に対するマトリックスの形態の影響
実施例2に記載の方法にしたがってtert-ブチルイソシアネート及びキニンから合成したtert-ブチルカルバモイルキニンリガンドを3-メルカプトプロピルシラン活性化支持体を介して1.5μm無孔性シリカ粒子（以下から入手：Micra Scientific Inc., USA）、10μm有効性シリカ粒子（以下から入手：Daiso Co, Ltd., Japan）、及び2μmのマクロポアを含むシリカモノリスクロモリス(商標)（ChromolithTM）（以下から入手：Merck, Germany）に結合させる。これらの支持体はそれぞれ以下のような比表面積を有する：1.5μm粒子は3m2/g、10μm粒子及びモノリスは300m2/g。1.5μm粒子は、ビスコフクロマトグラフィー（Bischoff Chromatography, ドイツ）により50ｘ4.6mmカラムに充填され、一方、10μm粒子は600barの圧で150ｘ4.0mmカラムに自家充填される。クロマトグラフィーの装置は、用いたクロマトグラフィー条件と同様に実施例2に記載されてある。
3つのアイソフォームの全てを含むサンプルは、10mMのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（“EDTA・Na2”（Fluka））の水溶液60μL、2.84μg/μLのccc pDNAサンプル10μL（10％のocアイソフォームを含む）、及び0.05μg/μLの線状アイソフォーム50μLを混合することによって調製される。線状アイソフォームは、製造業者の指示にしたがってEcoRV（Sigma Aldrich）で消化することによって作製し、EDTAはエンドヌクレアーゼの不活化のために添加する。クロマトグラフィーの操作では、3つ全てのpDNAアイソフォーム（pMCP1プラスミドのoc、ccc及びlinアイソフォーム）を含むこれらpDNAサンプル溶液10μLがカラムにロードされ、同一条件下で溶出される。分析の目的には、1.5μm支持体が好ましい選択である。しかしながら、10μm有孔性支持体（図1b参照）及びモノリス支持体（図1c参照）の両方が、ccc形の分離のみに焦点を絞った調製的適用に適切である。
NaCl/2-プロパノール混合勾配溶出（方法1）と比較したpH及び2-プロパノール混合勾配溶出（方法2）によるクロマトグラフィーの方法
100μLのDNAサンプル（0.15μgのocアイソフォーム、0.3μgの線状アイソフォーム及び14.2μgのcccアイソフォームを含む）を、1.5μmの無孔性シリカに結合したトリエトキシシリルプロピルカルバモイルキニンリガンド（構造b参照）を含む物質にロードする。サンプル成分は方法2を用いて溶出させる（すなわちAgilent1200SL系でpH勾配及び2-プロパノール勾配を同時に上昇させ（“pH及び2-プロパノール混合勾配”）、UV吸収を258nmで記録する）。
HPLC溶離剤及びクロマトグラフィー条件：最初に、NaH2PO4（Merck, Darmstadt, Germany）から0.5mol/Lのストック溶液を調製する。溶離剤Aはストック溶液の1：10希釈から成り（50mmol/L NaH2PO4）、5MのNaOHで7.0に調整される。溶離剤Bは、1：10希釈ストック溶液（50mmol/L NaH2PO4）及び20％（v/v）の2-プロパノールから成り、5MのNaOHで7.9に調整される。分析時には15分で0から100％Bに至る直線状勾配で操作される。分析操作の間に、塩化ナトリウムのプラグによってカラムを洗浄し（50μLのNaCl（3M）の注入）、プラグを4回注入してカラムを洗浄し、その間移動相の組成物は80％Bに1分間保持され、続いて0％Bで5分間再平衡化される。流速は0.7ml/分、検出波長は258nm（スリット：4nm、リファレンス360nm（バンド幅100nm））及び温度は60℃（溶媒は3μL熱交換器中で予熱）に設定する。これらのクロマトグラフィー図を実施例2に記載の方法1で得られたもの（図1aを参照）と比較するとき、pDNAトポ異性体の分離には後者の方が好ましい。方法2は、ccc pDNAの単離のための調製的適用（トポ異性体の分離を必要としない）と同様に、プラスミドの均質性（すなわち他の形態（oc及び線状形）と対比したccc形の含有量）を分析的に決定するために好ましい。
リガンドの多様性と高いローディング性能の提示
クロマトグラフィー用の3つの固体支持体を合成する。実施例1のスキーム１にしたがって、tert-ブチルカルバモイル-キンコリンリガンド（構造d）をキンコリン（Buchler, ドイツ）及びtert-ブチルイソシアネートから出発し、10：1の酢酸エチル（自家再蒸留）/トリエチルアミン（Fluka）で急速シリカカラムクロマトグラフィーを実施して96％収量で合成し、さらにエンドキャップされたメルカプトプロピル-改変5μmシリカ粒子に結合させる。元素分析（炭素10.51％、水素1.98％、窒素0.979％及び硫黄1.85％）によれば、リガンド密度は307μmol/gである。
実施例1のスキーム１にしたがって、tert-ブチルキンコリニル尿素リガンド（構造e）を、キンコリンアミン（Buchler, ドイツ）及びtert-ブチルイソシアネートから出発し、10：1：1の酢酸エチル（自家再蒸留）/メタノール/トリエチルアミン（Fluka）で急速シリカカラムクロマトグラフィーを実施して96％収量で合成し、さらにエンドキャップされた3-メルカプトプロピル-改変5μmシリカ粒子に結合させる。元素分析（炭素8.965％、水素1.87％、窒素0.979％及び硫黄1.94％）によれば、リガンド密度は210μmol/gである。
トリエトキシシリルプロピルカルバモイルキニン改変シリカマトリックスは、実施例2にしたがって1．5μm無孔性シリカ粒子（Micra Scientific Inc., USA）を用いて作製される。元素分析によればリガンド密度は9μmol/gであり、これは100ｘ小さい比表面積のためである。トリエトキシシリルプロピルカルバモイルキニン改変シリカ物質を4.6ｘ50mmカラムに充填し、一方、他の2つの物質は150ｘ4.0mmカラムに充填する。
HPLC溶離剤及びクロマトグラフィー条件：最初に、NaH2PO4（Merck）から0.5mol/Lのストック溶液を調製する。溶離剤Aはストック溶液の1：10希釈から成り（50mmol/L NaH2PO4）、5MのNaOHで7.0に調整される。溶離剤Bは、0.6mol/L NaCl（Fluka）及び30％（v/v）のイソプロパノール（Roth）を含むストック溶液の1：10希釈から成り（50mmol/L NaH2PO4）、5MのNaOHで7.0に調整される。分析中に24分で60から100％Bに至る勾配（tert-ブチルカルバモイル-キンコリン及びtert-ブチルキンコリニル尿素ドリガンド）又は15分で0から25％Bに至る勾配（トリエトキシシリルプロピルカルバモイルキニンリガンド）で操作される。流速は0.7ml/分、検出波長は258nm（スリット：4nm、リファレンス360nm（バンド幅100nm））及び温度は60℃（溶媒は3μL熱交換器中で予熱）に設定する。
クロマトグラフィー操作の記録のために（図5c、5d及び6a）、5％のoc形を含むccc pDNAサンプルの2.84mg/mL溶液の3μLをカラムにロードし、上昇量の溶離剤Bで溶出させる。高いローディング性能を示すために、全pDNA 284μgを含むサンプル溶液100μLを4.6ｘ50mmカラムにロードし、上昇量の溶離剤Bで溶出させる。ざっと概算すると、前記カラムは約0.5gのクロマトグラフィー用物質を含み、この量は、全pDNA284μgを分離するために十分であることが判明している。本発明の全リガンドがpDNAアイソフォーム及びトポ異性体を分離でき、これは同じ溶出パターンによって確認され、したがって本化学親和性の基本概念の不動性が示される。
トポ異性体の実体及びその溶出順序の提示
実施例1のスキーム1にしたがい、アリルカルバモイル-10,11-ジヒドロキニンリガンドを含むマトリックス（図2b参照）を合成し、150ｘ4.0mmカラムに自家充填する。クロマトグラフィー系及びクロマトグラフィー条件は実施例5に記載したとおりであるが、ただし30分で10から60％Bの勾配で流した。
クロマトグラフィー操作の記録のために、約4％のoc形を含むccc pDNAサンプルの2.84mg/mL溶液の100μLをカラムにロードし、上昇量の溶離剤Bで溶出させる。溶出中に2つの分画（各々ただ1つのトポ異性体を含む）をUV検出後に収集する。VSWPセルロースエステル膜（直径25mm、孔25nm）（Millipore, MA, USA）を用いて前記分画を精製水に対して透析する。光る面を上にしてディスクを水面に置き、300μLの体積をディスク表面に注意深くロードする。4℃で15から30分間浮遊させた後、ピペットでサンプルを回収し、各分画から得たこの溶液の20μLを前記クロマトグラフィー系に再注入する。
キャピラリーゲル電気泳動を3DCE装置（Agilent Technologies）で実施する。内径が100μmのDB-17被覆キャピラリーをJ&Wサイエンティフィック（J&W Scientific, Folsom, CA）から購入し、長さ32cmに切断する。レーザーブレード（有効長24.5cm）を用いてポリイミド被覆を除去することによって検出ウィンドウを作成する。トポ異性体分析のために、0.1％のヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC、86kDa）（購入先：Acros organics, Geel, Belgium）を含むトリス-ホウ酸-EDTA緩衝液（TBE、89mMホウ酸、89mMトリス、2mM EDTA（NaOHでpH9.0に調整）を前記キャピラリーに充填する。前記緩衝液の完全な均質化のために、バイオポリマー添加後24時間前記溶液を攪拌し、その後でさらに24時間かき乱すことなく室温に静置する。高度にスーパーコイルされたcccプラスミドのより高度な解析を得るために、インターカレーターを電気泳動緩衝液に加える（de Carmejane et al., Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering, 1999, vol. 3602, p.346-354）。本事例では、4mLの電気泳動緩衝液に12μLの二リン酸クロロキン（Fluka）水溶液（5mg/mL）を添加して15μg/mLのクロロキンの最終濃度を提供する。サンプルは、-5kVで4秒間の電気動力学的注入により導入する。続いて電気泳動を3.3kVで25分間、25℃でマイナス態様で実施しUV検出は258nmで実施する。注入前に、キャピラリーを水で3分間フラッシュし、続いて泳動緩衝液で5分間の予備条件付けを実施する。全般的に、個々のトポ異性体の溶出中に、より小さい負の値にスーパーコイルされたトポ異性体が最初に溶出することが見出された。
プラスミドDNAのバイオテクノロジー製造中のトポ異性体分布の進行下管理
大腸菌でAS24（4.4kb, Boehringer Ingelheim）としてコードされるpDNAのバッチ発酵中に、サンプルを2時間間隔で取り出し、直ちに凍結する。分析前に、サンプルを融解し、ミニプレップキット（MiniPrep Kit）（Qiagen）を製造業者の指示にしたがって用いてpDNAを単離及び濃縮する。粗プラスミドサンプルを二次元HPLC系に直接注入して分析する。
クロマトグラフィー条件：2D HPLC系（biocompatible Ultimate 3000, Dionex）（別に加えられた2つの10-1カラムスイッチングバルブを含む）。1次元：SRT SEC 1000（サイズ排除カラム）（Sepax Technologies Inc., USA）、溶離剤：0.1mol/LのNaCl及び1mmol/LのEDTAを含むpH7.5の0.1mol/Lトリス（Fluka）（イソクラチック溶出）、流速：2.0mL/分。二次元：図2bに開示のリガンドを有する5μmシリカを充填した100ｘ4.0mmカラム、溶離剤A：50mMリン酸緩衝液（pH7.2）、溶離剤B：0.6mol/LのNaCl及び10％（v/v）イソプロパノールを含む溶離剤A（pH7.2）、カラム温度60℃、流速1.0mL/分、UV検出258nm、直線状勾配15分で0−100％B、注入体積20μL。発酵進行中にccc pDNAのスーパーコイリングは顕著に変化し、前記変化は、本発明のpDNAトポ異性体分離方法を用いて信頼性の高い決定が得られる。
CIMモノリス上のシンコリン型リガンド
CIM(商標)エポキシディスクモノリスカラム（BIA Separations）を、新しく調製したメタノール及び0.1M リン酸二水素（Merck）水溶液の混合物（20：80、v/v）中の硫化水素ナトリウム（Sigma-Aldrich）2M溶液によりフロースルー態様で2時間HPLCポンプを用いて洗浄する。その後で、前記カラムをメタノール/水（20：80、v/v）で、続いてメタノールで洗浄する。
tert-ブチルカルバモイルキンコリン（構造d）の0.25M溶液を、前記をメタノールに溶解することによって調製し、さらにα,α’-アゾイソブチロニトリル（AIBN）（6mg/ml、0.037M）をラジカルイニシエーターとして添加する。前記混合物を5分間超音波処理し、ナイロン膜でろ過し、さらに窒素で10分間パージする。続いてこのtert-ブチルカルバモイルキンコリン溶液をチオール官能化CIMディスクカラムにポンプで注入する。前記カラムの両末端を封入し、水浴中に移す。ここでクロマトグラフィーリガンドのラジカル付加が60℃で発生する。24時間後にカラムを水浴から取り出し、メタノールで洗浄し、続いてHPLCポンプを使って移動相で平衡化する。プラスミドアイソフォームの分離を、方法1（NaCl勾配）とともに有機マトリックス（特に調製的目的に適切なもの）を用いて実施する。
エポキシ基含有無孔性有機ポリマー粒子の改変
エポキシ改変無孔性ポリメタクリレートビーズ（エポキシ-NPR、2.5μm（Tosoh））を3首丸底フラスコ中のメタノールに懸濁する。メタノール及び0.1M リン酸二水素ナトリウム水溶液の混合物（20：80、v/v（pH8.5））中の硫化水素ナトリウムの2M溶液を（エポキシ基に対して10倍モル過剰で）添加し、窒素流下で2時間攪拌する。その後で、前記粒子をろ過し、メタノール/水（20：80、v/v）で、続いてメタノールで洗浄する。tert-ブチルカルバモイルキンコリン（構造d）の0.25M溶液を、前記をメタノールに溶解することによって調製し、さらにα,α’-アゾイソブチロニトリル（AIBN）（6mg/ml、0.037M）をラジカルイニシエーターとして添加する。前記混合物を5分間超音波処理し、ナイロン膜でろ過し、さらに窒素で10分間パージする。続いてこのtert-ブチルカルバモイルキンコリン溶液を、上記で合成した3首丸底フラスコ中のチオール改変NPR粒子に添加する。前記選別物質とチオール官能化ビーズとの結合のためのラジカル付加反応は、窒素流下にて60℃で24時間攪拌することによって実施される。続いて粒子をろ過し、メタノールで数回洗浄する。この粒子を33ｘ4.6mm（内径）の寸法のステンレススチールカラムにスラリー状態で充填する。プラスミドアイソフォームの分離についてのカラムの試験を溶出方法1（NaClと2-プロパノールの同時勾配）とともに有機マトリックス（特に分析的目的に適切なもの）を用いて実施する。

Claims (21)

  1. プラスミドDNAのアイソフォーム又はトポロジー異性体の分離のための、下記式1のリガンドを含む物質の使用：
    Figure 2014512805
     (1)
    （式中、リガンドは、長さが3から5の原子のスペーサーによって連結された陽イオン基（C）及び水素供与基（N-H）を含み、
    m、o及びrは互いにそれぞれ別個に0又は1であり、さらに
    k、l、n及びpは互いにそれぞれ別個に0、1又は2であり、さらに
    Yは、基-CH2-、-O-、-NH-又は-S-から選択される任意の基であり、
    Zは、基-C-、-S-又は-P-から選択される任意の基であり、さらに
    R1、R2及びR3は、水素、C1-18分枝又は非分枝アルキル、C2-18分枝又は非分枝アルケニル、C2-18分枝又は非分枝アルキニル、C3-11-炭素環、C3-8-複素環、C5-18-アリール及びC5-13-ヘテロアリールから成る群の置換基のいずれかであり、
    R1、R2及びR3は、互いにそれぞれ別個に、基-S-、-O-、-NH-から選択される1つ以上の基を含んでもよく、さらに
    R1、R2、R3の各々は、及びそれぞれ別個に、水素、C1-6分枝又は非分枝アルキル、C2-6分枝又は非分枝アルケニル、C2-6分枝又は非分枝アルキニル、C3-8-炭素環、C3-8-複素環及びC5-10-アリール、C5-10-ヘテロアリールから成る群から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよく、さらに
    陽イオン基Cは、少なくとも1つの窒素原子を含み、さらに硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含んでもよいC3-11-複素環であるか、又は、少なくとも1つの窒素原子、及び場合によって硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含むC5-18-ヘテロアリールであるか、
    又は、少なくとも1つの窒素原子を含み、さらに硫黄、酸素、窒素及びリンから成る群から選択される別のヘテロ原子を含んでもよい、分枝又は非分枝C1-10アルキル、分枝又は非分枝C2-10アルケニル、分枝又は非分枝C2-10アルキニルであり、
    ここでC及びR3又はC及びR2は、環を形成することによって互いに連結されていてもよく、さらに
    前記リガンドは、R1又はR3基を介してマトリックスに固定又は包埋されていてもよい。）
  2. スペーサーの長さが4つの原子に等しい、請求項１に記載の使用。
  3. R1が、水素、C1-8分枝又は非分枝アルキル、C2-8分枝又は非分枝アルケニル、C2-8分枝又は非分枝アルキニルから成る群から選択される置換基のいずれかであり、1つ以上の硫黄原子を含んでもよい、請求項１また２に記載の使用。
  4. R1が、C3-8-炭素環、C5-8-複素環、C5-10-アリール及びC5-9-ヘテロアリールから成る群から選択される置換基のいずれかである、請求項１又は２に記載の使用。
  5. R3が、水素、C1-8分枝又は非分枝アルキル、C2-8分枝又は非分枝アルケニル、C2-8分枝又は非分枝アルキニルから成る群から選択される置換基のいずれかであり、1つ以上の硫黄原子を含んでもよい、請求項１から４の１項に記載の使用。
  6. R3が、C5-10-アリール及びC5-10-アリールヘテロアリールである、請求項１から４の１項に記載の使用。
  7. 水素供与基（N-H）が、カルボニル基（C=O）、スルホニル基（-SO2-）及びホスホニル基（-P(=O)-）から成る群から選択される少なくとも1つの水素受容基に隣接して位置する、請求項１から６の１項に記載の使用。
  8. 水素受容基がカルボニル基（C=O）である、請求項７に記載の使用。
  9. o＝0及びm＝1である、請求項１から８の１項に記載の使用。
  10. o＝1及びm＝0である、請求項１から８の１項に記載の使用。
  11. o＝0及びm＝1であり、さらに、k＝1及びl＝1、Zが-C-であり、さらにn＝1である、請求項１から８の１項に記載の使用。
  12. o＝1及びm＝0であり、さらに、k＝1及びl＝1、Zが-C-であり、さらにp＝1である、請求項１から８の１項に記載の使用。
  13. マトリックスが固体又は液体であり、さらに有機又は無機ポリマーから選択され、前記無機ポリマーがシリカ系又は酸化ジルコニウムであり、前記有機ポリマーがポリメタクリレート又はアガロース系である、請求項１から１２の１項に記載の使用。
  14. マトリックスが粒子、モノリス樹脂、膜又は磁性ビーズである、請求項１３に記載の使用。
  15. プラスミドDNAのアイソフォームが共有結合閉環状（ccc）形、開環状（oc）形又は線状（lin）形である、請求項１から１４の１項に記載の使用。
  16. プラスミドDNAのアイソフォームが、モノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、オリゴマー又はマルチマーの混合物を含み、前記オリゴマー及びマルチマープラスミドDNAがカテナン又はコンカテマーの形態である、請求項１５に記載の使用。
  17. 物質が以下から成る群から選択される、請求項１から１６の１項に記載の使用：
    構造（b）
    Figure 2014512805
     構造（c）
    Figure 2014512805
    構造（f）
    Figure 2014512805
    及び構造（g）
    Figure 2014512805
  18. 以下から成る群から選択される物質：
    構造（a）
    Figure 2014512805
    構造（d）
    Figure 2014512805
    及び構造（e）
    Figure 2014512805
  19. プラスミドDNAのアイソフォーム又はトポロジー異性体の分離のための、請求項１８に記載の物質の使用。
  20. 請求項１から１９の１項に記載の物質を用いることによる、プラスミドDNAのアイソフォーム又はトポロジー異性体のクロマトグラフィーによる分離方法。
  21. 以下の工程を含む、請求項２０に記載の方法：
    a．pDNAのアイソフォーム又はトポロジー異性体を含むサンプルを稀釈/溶解する工程；
    b．物質にサンプルをローディングする工程；
    c．結合サンプルを洗浄する工程；
    d．物質からサンプルを溶出させる工程；
    e．溶出分画を検出及び／又は収集する工程。
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