TW202346312A - 於核酸純化中降低內毒素含量之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種用於自核酸中降低內毒素含量或移除內毒素之方法。為此,使用基於膜或單塊結構之吸著劑在核酸之陰離子交換層析純化期間添加選自胺氧化物或其混合物之群之兩性離子清潔劑。
Description
本發明係關於一種用於降低內毒素含量或自核酸移除內毒素之方法。為此,使用基於膜或單塊結構之吸著劑在核酸之陰離子交換層析純化期間添加某種類型之兩性離子清潔劑。
對於自生物來源獲得高純度核酸(如質體DNA)之快速且有效之方法之需求不斷增加,因為重組DNA對於外源表現或治療應用之重要性漸增。特別地,對於亦可在更大規模上進行的純化方法之需求亦漸增。高純度質體DNA之使用在各種應用(如聚合酶鏈式反應(PCR)擴增、DNA定序、活體外mRNA合成、及轉殖基因之次選殖)中至關重要。因此,用於以高產率及品質產生質體DNA之方案已引起廣泛關注。
用於純化特別是相對較大量之核酸(如質體DNA)之許多已知方法包括層析純化步驟。該步驟之效率一般亦決定製造製程之效率及有效性。
於純化尤其質體DNA中之另一個問題係由雜質引起的,該質體DNA待自該等雜質分離。此等首先是基因組DNA及RNA。純化核酸時之另一種雜質為內毒素。內毒素係脂多醣(LPS),其位於革蘭氏陰性(Gram-negative)宿主細胞(諸如(例如)大腸埃希氏菌(
Escherichia coli))之外膜上。在細胞裂解期間,除了質體DNA之外,亦釋放LPS及其他膜成分。內毒素可以約3.5 x 10
6個複本/細胞之數量存在於細胞中(Escherichia coli and Salmonella Typhimurium Cell. and Mol.Biology,J. L. Ingraham等人編,1987,ASM)且因此超質體DNA分子數量104倍還多。為此,自革蘭氏陰性宿主細胞獲得的質體DNA經常含有大量內毒素。然而,此等物質導致許多非所欲副反應(Morrison及Ryan,1987,Ann. Rev. Med. 38,417-432;Boyle等人,1998,DNA and Cell Biology,17,343-348)。若意欲採用質體DNA用於基因療法及疫苗,則極其重要的是,由於雜質所致之發炎或壞死副反應不會發生。因此,對於用於降低內毒素濃度至最低可能含量之有效方法存在極大需求。
用於降低內毒素含量之已知方法係基於複數個純化步驟,頻繁地使用陰離子交換層析術。
首先,該等宿主細胞藉由已知方法(諸如(例如)鹼性裂解)來消解。其他裂解方法(諸如(例如)使用高壓、煮沸裂解、使用清潔劑或藉由溶菌酶消解)亦適用。
以此方式獲得的介質中之質體DNA (「澄清溶解產物」)主要被相對較小的細胞成分、來自前述處理步驟之化學品、RNA、蛋白質及內毒素污染。移除此等雜質通常需要複數個後續純化步驟,陰離子交換層析術係一種可能性。
陰離子交換層析術之一個缺點係顯著量之內毒素與質體DNA結合在一起且不能以此種方式充分分離。為了降低內毒素含量,因此需要進一步純化步驟(諸如(例如)層析步驟(凝膠過濾)或用異丙醇、乙酸銨或聚乙二醇沉澱)。將層析方法(諸如(例如)陰離子交換層析術)與另外內毒素移除步驟組合之純化方法使得能夠獲得具有小於50 EU/mg質體DNA之內毒素含量之質體DNA。然而,此種類型之方法通常係複雜、耗時且對於相對較大量之DNA之純化僅具有有限適用性。
WO 95/21179描述一種用於降低內毒素含量之方法,其中首先將澄清溶解產物與鹽水性溶液及清潔劑預培養。此後係藉由離子交換層析術進行純化,其中該離子交換材料係用另一鹽溶液洗滌,及該質體DNA係經溶離且於隨後進一步例如藉由異丙醇沉澱純化。該方法同樣具有上文提及的缺點。
US6617443揭示一種使用無鹽清潔劑溶液及吸著劑自核酸製劑移除內毒素之方法,該吸著劑之官能基鍵結至觸手(tentacle)。
WO2009/129524揭示適合在小規模上以平行形式純化質體DNA之方案,其使質體DNA與兩性離子清潔劑接觸。
US6428703描述一種用於藉由使生物大分子與非離子清潔劑接觸且進行層析純化來純化生物大分子之方法。
US2005/245733報告一種用於在質體製備中使用碳水化合物非離子清潔劑利用二氧化矽層析術或有機聚合物樹脂來降低內毒素之方法。
所有此等文件均顯示自內毒素純化質體DNA之方法。但是,仍然需要將增強之性能與高效率組合之製程。
生物醫藥及生物技術工業中之下游製程通常仰賴於在填充床管柱中以珠粒基樹脂作為固定相之層析步驟。該等樹脂通常具有30至500 µm之直徑且一般提供具有高結合能力之有效層析技術。然而,該方法相當緩慢且代表生物分子生產之主要成本,因為將溶質分子運輸至樹脂孔內的結合位點受到粒子內擴散的限制。管柱上之壓降甚至在低流速下亦很高且在處理期間由於床固結及管柱盲化而增加。因此,在過去幾十年中已開發幾種其他創新固定相(包括單塊結構及膜)作為經典層析載體的可能替代。使用膜或單塊結構之主要優點歸因於短的擴散時間,因為分子與膜或單塊結構中之活性位點之間之相互作用發生在對流貫通孔(through-pore)中而不是發生在樹脂孔內的停滯流體(stagnant fluid)中。因此,膜及單塊結構層析術具有在高流速及低壓降下操作之潛力。
但如上所述,基於膜或單塊結構之層析術尤其由於不存在孔擴散及更高流速可顯示不同層析行為及因此不同分離性質。
已發現,在不損及核酸產率及宿主細胞蛋白質之移除下,組合使用選自胺氧化物之群之兩性離子清潔劑,可顯著改良使用基於膜或單塊結構之層析基質之核酸純化中之內毒素清除率。所選類型之清潔劑證明與某些高生產性層析膜或單塊結構材料組合尤其有效。為所提出解決方案提供的實例指示優於利用常用替代清潔劑(諸如(例如) Triton
TMX100)之珠粒基材料之現有方法的在大規模上增強質體製造之獨特潛力。
因此,本發明係關於一種用於自核酸耗盡或移除內毒素之方法,其包括
a) 提供包含該等核酸及內毒素之樣品,
b) 使步驟a)之該樣品在包含陰離子交換基團之膜或單塊結構上進行層析分離
其中使該樣品與選自胺氧化物之群之兩性離子清潔劑接觸。
在一個較佳實施例中,步驟b)包括
i) 將包含該等核酸及內毒素之樣品裝載至包含陰離子交換基團之膜或單塊結構上;
ii) 用洗滌緩衝液洗滌該膜或單塊結構;及
iii) 用溶離緩衝液溶離結合至該膜或單塊結構之核酸。
在一個實施例中,該等核酸藉由在步驟ii)中用包含該兩性離子清潔劑之洗滌緩衝液洗滌該膜或單塊結構而與兩性離子清潔劑接觸。
在一個較佳實施例中,該兩性離子清潔劑為胺氧化物。
在一個極佳實施例中,其為N,N-二甲基十四烷胺N-氧化物。
在一個較佳實施例中,該等核酸包含質體DNA或由其組成。
在一個較佳實施例中,使該等核酸與包含0.01至10% (w/v)之兩性離子清潔劑之溶液接觸。
在一個較佳實施例中,該陰離子交換捕獲材料為膜。在一個極佳實施例中,該膜為水凝膠膜。
在一個較佳實施例中,步驟ii)包括兩個或更多個洗滌步驟,其中一個洗滌步驟係用包含乙醇之洗滌緩衝液進行。
在一個實施例中,本發明之方法提供核酸,其與以其他方面相同但使用Triton® X100作為唯一清潔劑的製程同等有效或更有效地耗盡內毒素。
定義
在詳細描述本發明之前,應理解,本發明不受限於特定組合物或製程步驟,因此可變化。必須注意,如本說明書及隨附申請專利範圍中所用,除非本文清楚地另作指明,否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數個指示物。因此,例如,提及「一配位體」包括複數個配位體及提及「一抗體」包括複數個抗體及類似者。
除非另有定義,否則本文所使用的所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬技術者通常所理解相同的含義。出於本發明之目的如本文所述定義以下術語。
可根據本發明之方法藉由耗盡或移除內毒素純化之核酸(亦稱為靶核酸)包括DNA、RNA及嵌合DNA/RNA分子,且可來自於任何生物來源,包括真核細胞及原核細胞,或可係合成的。可純化的核酸包括染色體DNA片段、核糖體RNA、mRNA、snRNA、tRNA、質體DNA、病毒RNA或DNA、合成寡核苷酸、核酶及類似者。特別受關注的是編碼治療基因之質體DNA。「治療基因」意欲包括可在適宜宿主細胞中表現以補充宿主細胞中之缺陷或表現不足之基因之功能基因或基因片段、以及當表現時抑制或遏制基因在宿主細胞中之功能之基因或基因片段,包括(例如)反義序列、核酶、反式顯性(transdominant)抑制劑及類似者。
因此,例如,病毒DNA或RNA可自原核細胞或真核細胞病毒純化,其中該等病毒粒子最初根據習知技術自允許病毒感染之培養物或細胞(例如自細菌、昆蟲、酵母、植物或哺乳動物細胞培養物)純化。
術語「質體DNA」係指不為宿主細胞的原代基因組之部分或片段之任何不同細胞衍生之核酸實體。如本文所用,術語「質體」可指由DNA或DNA衍生物組成之環形或線性分子。術語「質體DNA」可指單股或雙股分子。質體DNA包括天然存在之質體以及編碼所關注基因(包括(例如)標記基因或治療基因)之重組質體。
質體通常為具有4至20 kB之長度之表觀基因組環形DNA分子,其對應於2.6 x10
6至13.2 x 10
6道耳頓之分子量,經常能夠在產生細胞中自主複製。甚至在其緊湊形式(超螺旋)中,質體DNA分子通常具有幾百nm的大小。
如本文所用且除非另有說明,否則術語「樣品」係指含有核酸之任何組合物或混合物。樣品可衍生自生物或其他來源。生物來源包括真核及原核來源,諸如植物及動物細胞、組織及器官。該樣品亦可包括經發現與靶分子混合之稀釋劑、緩衝液、清潔劑及污染物質、碎屑及類似者。該樣品可係「部分純化」 (亦即,已經受一或多個純化步驟,諸如過濾步驟)或可直接自產生核酸之宿主細胞或生物體獲得(例如,該樣品可包含收穫的細胞培養液)。
如本文所用,術語「雜質」或「污染物」係指任何外來或不良分子,包括一或多種宿主細胞蛋白質、內毒素、質體及一或多種添加劑,其可存在於含有核酸之樣品中,該核酸係使用本發明之製程與外來或不良分子中之一者或多者分離。利用本發明之製程耗盡或移除的一種污染物為內毒素。
術語「純化」、「分離」或「單離」如本文可互換使用係指自包含靶核酸及一或多種雜質之組合物或樣品增加靶核酸之純度。通常,該靶核酸之純度藉由自組合物(完全或部分地)移除至少內毒素來增加。
術語「層析術」係指將所關注分析物(例如靶核酸)與存在於樣品中之其他分子分離之任何種類之技術。通常,由於混合物之個別分子在移動相之影響下結合至及/或遷移穿過層析基質之速率之不同所致,靶核酸與其他分子分離。
術語「批次」係指一定量之質體或核酸材料,其意欲具有在限定限度內之均一特性及品質且係在具有限定起點及終點之相同製造循環期間根據單一生產順序製造。在連續製程之情況下,批次通常基於時間-及/或體積策略來限定。
術語「基質」或「層析基質」在本文中可互換使用且係指樣品在層析分離過程中遷移透過之固相。該基質通常包含基體材料及共價結合至基體材料之配位體。本發明之基質包含膜、珠粒基樹脂或單塊結構或由其組成,較佳地,該基體材料為膜或單塊結構,最佳係膜。
「配位體」係官能基,其係層析基質之一部分,通常,其係連接至基質之基體材料,且其確定基質之結合性質及相互作用性質。「配位體」之實例包括(但不限於)離子交換基團、疏水相互作用基團、親水相互作用基團、親硫相互作用基團、金屬親和基團、親和基團、生物親和基團及混合模式基團(前述之組合)。亦可能的是,一個配位體具有超過一種結合/相互作用性質。本發明之基質包含至少陰離子交換基團。此等可例如為強陰離子交換基團,諸如氯化三甲基銨或弱陰離子交換基團,諸如N,N-二乙基胺基或DEAE。該基質可另外包含其他類型之配位體,使得該基質為混合模式基質。此類配位體可例如具有疏水性相互作用基團,諸如苯基、丁基、丙基、己基。
該等配位體可藉由任何類型之共價連接連接至基質之基體材料。共價連接可例如藉由將官能基直接鍵結至基體材料上的適宜基團(如OH、NH2、羧基、苯酚、酸酐、醛、環氧化物或硫醇等)來進行。亦可經由適宜連接子連接配位體。亦可藉由使包含配位體及可聚合部分之單體聚合來產生基質。藉由適宜單體之聚合產生之基質之實例為藉由使適宜苯乙烯或丙烯醯基單體聚合產生之基於聚苯乙烯、聚甲基丙烯醯胺或聚丙烯醯胺之基質。
在另一個實施例中,該固定相可藉由將配位體接枝至基體材料上或自基體材料接枝配位體來產生。對於從利用控制自由基聚合之製程之接枝,以諸如,例如,原子轉移自由基聚合(ATRP)之方法為適宜。自例如經離子、親水或疏水基團官能化之丙烯醯胺、甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯等之聚合反應之一種極佳一步式接枝可藉由含羥基載體上的鈰(IV)引發,而該載體不必被活化。
當該層析基質用於層析分離中時,其通常用於分離裝置(亦稱為殼體)中作為固持基質的構件。
在一個實施例中,該裝置包括具有入口及出口之殼體及介於入口與出口之間之流體路徑。在一個較佳實施例中,該裝置為層析管柱。層析管柱為熟習此項技術者已知。其等通常包括填充固定相之圓柱形管或筒以及過濾器及/或用於將固定相固定於管或筒中之構件及視需要用於溶劑遞送至管或筒及自管或筒遞送溶劑之連接件。該層析管柱之尺寸根據應用(例如分析型或製備型)而變化。在一個實施例中,該管柱或一般而言該分離裝置為單次使用的裝置。
術語「陰離子交換基質」因此在本文中用於指攜載至少陰離子交換基團之層析基質。此意指其通常具有在所使用的層析條件下帶正電荷之一或多種類型之配位體,諸如四級胺基。
「緩衝液」為藉由其酸鹼結合物組分之作用而抵抗pH變化之溶液。可根據例如緩衝液之所需pH採用的各種緩衝液描述於Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems,Gueffroy, D.編,Calbiochem Corporation (1975)中。緩衝液之非限制性實例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽及銨緩衝液以及此等之組合。
根據本發明,術語「緩衝液」或「溶劑」係針對用以裝載、洗滌、溶離、再平衡、剝離及/或消毒層析基質之任何液體組合物使用。
當以結合及溶離模式「裝載」層析管柱時,將包含靶分子及一或多種雜質之樣品或組合物裝載至層析管柱上。在製備型層析中,較佳直接裝載該樣品而無需添加裝載緩衝液。若使用裝載緩衝液,則該緩衝液具有某種組成、電導率及/或pH使得該靶核酸結合至固定相同時理想地所有雜質(如內毒素)不結合且流過該管柱。通常,裝載緩衝液(若使用的話)具有與用於準備管柱進行裝載之平衡緩衝液相同或相似之組成。
裝載於該管柱上的樣品之最終組合物稱為進料。該進料可包含樣品及裝載緩衝液但較佳地其僅係樣品。
「洗滌(wash/washing)」層析基質意指使適宜液體(例如緩衝液)通過基質或流經基質。通常,在溶離靶分子之前,使用洗滌以在結合/溶離模式中自基質移除弱結合的污染物。另外,洗滌步驟可用於減少殘餘清潔劑之含量、增強病毒清除率及/或改變溶離期間之電導率留存(carryover)。
自基質「溶離」分子(例如靶核酸)意指自其移除該分子。溶離可藉由改變溶液條件使得不同於裝載及/或洗滌緩衝液之緩衝液與所關注分子競爭基質上的配位體位點或改變固定相與移動相之間靶分子之平衡使得其有利於靶分子優先存在於溶離緩衝液中而發生。
一個非限制性實例係藉由改變離子交換材料周圍的緩衝液之離子強度使得該緩衝液與分子競爭離子交換材料上的帶電荷位點而自離子交換樹脂溶離分子。
作為層析基質之膜可藉由以下事實與基於粒子之層析術區分開:溶質(例如靶核酸或污染物)與基質之間之相互作用不發生在粒子之死端孔中但主要發生在膜之貫通孔中。示例性類型之膜為平坦片系統、膜之堆疊、具有併入之纖維素之微孔聚合物片、基於聚苯乙烯或二氧化矽之膜以及徑向流動濾筒、中空纖維模組及水凝膠膜。較佳為水凝膠膜。此類膜包括膜載體及形成於該載體之孔內之水凝膠。該膜載體為水凝膠提供機械強度。水凝膠決定最終產品的性質,如孔隙大小及結合化學。
該膜載體可由任何多孔膜(如聚合物膜、基於陶瓷之膜及編織或非編織纖維材料)組成。用於膜載體之適宜聚合物材料為纖維素或纖維素衍生物以及其他較佳惰性聚合物(如聚乙烯、聚丙烯、聚對苯二甲酸丁二酯或聚偏二氟乙烯)。
該等水凝膠可透過一或多種可聚合單體與一或多種交聯劑及/或一或多種可交聯聚合物之原位反應以形成具有較佳大孔之交聯凝膠來形成。適宜可聚合單體包括含有乙烯基或丙烯基之單體。較佳為包含另外官能基之單體,該另外官能基直接形成基質之配位體或適合連接該等配位體。適宜交聯劑為含有至少兩個乙烯基或丙烯基之化合物。關於適宜膜載體、單體、交聯劑等以及適宜生產條件之其他詳細內容可見於WO04073843及WO2010/027955中。尤佳為由惰性可撓纖維網載體製成之膜,該載體包含以總成在纖維網載體內及周圍的具有四級銨基(強陰離子交換基團)之多孔聚丙烯醯胺水凝膠,如Natrix® Q層析膜,Merck KGaA,Germany。
根據所使用的膜裝置,各自的製程依不同操作原理進行,如死端操作、交叉流動操作及徑向流動操作系統。以死端操作為較佳。
用於本發明之方法中之適宜膜之實例為
- 具有基於聚醚碸(PES)之載體及交聯聚合物塗層、經四級銨基(強陰離子交換基團)官能化之膜,如Mustang® Q,Pall。
- 由經穩定之強化纖維素製成、經四級銨基(強陰離子交換基團)或經DEAE基(二乙基胺基乙基,弱離子交換基團)官能化之膜,如Sartobind®膜,Sartorius。
- 由經穩定之強化纖維素製成、包含具有四級銨基(強陰離子交換基團)之水凝膠之膜,如Sartobind® Jumbo膜,其由經穩定之強化纖維素製成、經四級銨基(強陰離子交換基團)官能化,如Sartobind® Jumbo膜,Sartorius。
- 由精細纖維非編織架構製成之包含具有四級銨基(強陰離子交換基團)之水凝膠之膜,如3M™ Emphaze™ AEX Hybrid Purifier,3M。
- 由惰性可撓性纖維網載體製成之包含在纖維網載體內及周圍的具有四級銨基(強陰離子交換基團)之多孔聚丙烯醯胺水凝膠的膜,如Natrix® Q層析膜,Merck KGaA,Germany。
類似於膜之單塊結構或單塊結構吸著劑具有貫通孔,如互連通道,使得液體可自單塊結構的一側流過單塊結構至單塊結構的另一側。
由於流動相流過此等貫通孔,因此待分離的分子藉由對流而不是藉由擴散傳輸。由於其結構,單塊結構吸著劑顯示流速非依賴性分離效率及動態容量。
該單塊結構通常自反應物溶液原位形成且可具有任何形狀或密閉幾何形狀,通常具有無玻璃料(frit-free)構造,此保證操作之方便性。較佳地,單塊結構材料具有二元多孔結構、中孔及大孔。該等微米大小的大孔為貫穿孔且確保在應用中之快速動態傳輸及低背壓;中孔,較佳地位於該等貫穿孔之壁中,有助於足夠的表面積且因此高裝載容量。
該等單塊結構可由有機、無機或有機/無機混合材料製成。較佳為基於有機聚合物之單塊結構。
有機聚合物單塊結構之合成通常藉由一步式聚合進行,其提供具有定製官能基之可調多孔結構。一般而言,由單體、交聯劑、致孔性溶劑及引發劑以適宜比組成之預聚合混合物在適宜容器(亦稱為模具)中聚合,從而確定單塊結構之形式。聚合通常在引發劑存在下藉由加熱、使用UV輻射、微波或γ射線輻射引發。在適宜溫度下反應規定時間之後,所得材料通常用溶劑洗滌以移除未反應的組分及致孔性溶劑。
適宜有機聚合物為聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚氨酯等,如聚(甲基丙烯酸–二甲基丙烯酸乙二酯)、聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯–二甲基丙烯酸乙二酯)或聚(丙烯醯胺–乙烯基吡啶-N,N′-亞甲基雙丙烯醯胺)。
無機單塊結構可由二氧化矽或其他無機氧化物製成。較佳地,其由二氧化矽製成。二氧化矽單塊結構通常經由溶膠–凝膠方法利用相分離來製備。此主要包括二氧化矽前驅物之水解、縮合及縮聚。通常,將四乙氧基矽烷(TEOS)或四甲基正矽酸酯(TMOS)分佈在存在致孔劑(porogen) (例如聚(乙二醇) (PEG))之適宜溶劑中,接著按順序添加觸媒、酸或鹼、或二元觸媒、酸及鹼。在反應一段規定時間之後,用溶劑洗滌所得凝膠樣產物以移除未反應的前驅物、致孔劑及觸媒,接著進行恰當的後處理,通常係熱處理。
亦可藉由3D印刷來製備單塊結構。
該等單塊結構可經適宜官能基(較佳至少離子交換基團)修飾,以產生與包含靶分子之樣品之靶向相互作用且因此產生靶向分離。
通常,該等單塊結構包含在殼體(如管柱)中。
意欲用於液相層析術之基於粒子之樹脂通常由一起填充於稱為管柱的管狀圓柱體中以形成床之粒子組成。該填充床顯示粒子之間的獨特空間(所謂的空隙體積),其主要限定填充床之液態流體滲透性及流體動力性質。
該等粒子通常由呈具有相對均勻尺寸達成填充床之改良之層析及流體動力性質之球形、珠粒狀或顆粒形狀之交聯聚合物基質組成。其可具有含離散或極小孔之緻密結構但通常展現多孔多通道或網狀結構,其形成內孔隙體積及粒子內部的另外表面積。該粒子表面積可經適合於層析應用之各種官能基修飾,該修飾藉由使用針對主鏈-聚合物結構之官能單體,將官能基直接偶聯至通孔配位體或短聚合物結構(接枝物)之粒子表面。
兩性離子清潔劑為具有非極性尾部及攜帶帶陰離子及陽離子電荷原子基團之親水性頭部之兩性表面活性劑。該等兩性離子清潔劑之淨電荷及其他物理化學性質(黏度、溶解度、臨界膠束形成)隨著調整溶液之pH而變化。對於具有在等電點處之pH之溶液,表面活性劑分子上的負電荷精確地由該相同分子上的正電荷平衡,使得該清潔劑分子之淨電荷為零。
將胺氧化物指定為兩性離子清潔劑。
胺氧化物為具有式R1R2R3NO之化合物,其中各R1、R2及R3彼此獨立地為視需要經取代之C1-C30烴鏈。
尤佳使用的胺氧化物為其中R1為C10-C18烷基且R2及R3各獨立地為C1-C4烷基,特別是C12-C16烷基二甲基胺氧化物之彼等。
一個尤其適宜之胺氧化物為N,N-二甲基十四烷胺N-氧化物(TDAO),亦稱為肉豆蔻基二甲基胺-N-氧化物,CAS號3332-27-2。
待根據本發明之方法純化的核酸可源自於任何天然、遺傳工程改造或生物技術來源,諸如(例如)原核細胞培養物。若來自細胞製劑之核酸意欲進行純化,則首先藉由已知方法(諸如(例如)裂解)來消解該等細胞。若待純化的樣品已經以另一種方式進行預處理,則不必進行裂解消解。例如,該樣品可自生物材料藉由移除細胞碎屑及RNA沉澱物,自已經進行預純化且例如存在於緩衝液中之核酸樣品,或或者自已在擴增後形成且仍含有內毒素雜質之核酸溶液獲得。過濾、沉澱或離心步驟可必要。熟習此項技術者能夠根據待純化的核酸之來源來選擇適宜消解方法。在任何情況下,對於根據本發明之方法,待純化的樣品應存在於在添加清潔劑溶液時不形成沉澱或引起其他非所欲副反應之介質中。該樣品較佳為自細胞獲得的溶解產物,諸如,例如,澄清溶解產物。
為了純化來自大腸桿菌(
E. coli)之質體DNA,例如,首先藉由利用NaOH/SDS溶液之鹼性裂解來裂解該等細胞。然後添加酸性含鉀中和緩衝液引起沉澱形成,該沉澱可藉由離心或過濾來移除。剩餘的澄清上清液(澄清溶解產物)可作為起始材料(亦即,作為樣品)用於根據本發明之方法。亦可首先藉由已知方法(諸如透析或沉澱)濃縮或預純化該澄清溶解產物。
然後,使包含核酸及內毒素及潛在的其他雜質之樣品(自該樣品應純化核酸且因此應移除或耗盡內毒素)經受在基於膜或單塊結構之包含陰離子交換基團之層析基質上的層析分離。為此,將該樣品裝載至層析基質上。裝載至該基質上之樣品之最終組合物稱為進料。較佳將該進料調整至40至90 mS/cm之電解電導率,最佳地,該進料經調整至高到足以防止RNA結合至陰離子交換材料但仍可接受用於捕獲靶核酸之電導率。
電導率調整藉由添加鹽、鹽濃縮物溶液或相應地用低電導率緩衝液或純水稀釋來進行。對於藉由鹽補充來進行進料電導率調整,較佳地,使用氯化鈉或氯化鉀,但亦可考慮通常用於純化應用中之任何其他鹽(諸如例如選自硫酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽/碳酸氫鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽之鹽)。
該進料通常顯示4.5至5.5之pH值但該方法亦可實施於顯示在4.0高至9.0之範圍內之pH值之進料。
管柱平衡及洗滌緩衝液通常為匹配於裝載至層析材料上之進料之pH及電導率之緩衝液。通常選擇具有7.5至9.0之pH及5至90 mS/cm之電導率之洗滌緩衝液,但超出該範圍之緩衝液亦適用。
裝載後,用至少一種洗滌緩衝液洗滌該基質。該洗滌緩衝液可與裝載緩衝液相同或不同於裝載緩衝液。
該基質亦可用2、3或4種不同洗滌緩衝液洗滌。該等洗滌緩衝液中之至少一者包含選自胺氧化物或其混合物之群之兩性離子清潔劑。通常,該洗液中清潔劑之濃度為0.01%至10% (w/v),較佳係0.1%至1.5% (w/v)。
由低電導率洗滌緩衝液(< 40 mS/cm)製成的具有pH範圍在所使用的兩性離子清潔劑之等電點的+/-1個單位之間的清潔劑洗滌溶液特別適合,但超出該範圍之緩衝液亦適用。
在另一個較佳實施例中,一種洗滌緩衝液(較佳係最後一種洗滌緩衝液)包含10至25% (v/v)濃度之乙醇。
較佳地,該等洗滌緩衝液之pH及離子強度與平衡/裝載緩衝液之pH及離子強度相同或相似。
然後,藉由使用溶離緩衝液來進行靶核酸之溶離。該溶離緩衝液具有與平衡/裝載緩衝液相比不同之pH及/或不同之離子強度。
在一個實施例中,其具有與平衡/裝載緩衝液相比更高之pH及/或更高之離子強度。在一個實施例中,該溶離緩衝液之pH高於pH 7,較佳在pH 8.5至9.5之間。在一個實施例中,該溶離緩衝液包含0.5至1.5M NaCl。
在任何情況下,在本發明之方法中,使用包含兩性離子清潔劑之洗滌溶液至少一次,較佳地,該兩性離子清潔劑選自胺氧化物之群或其混合物。最佳之清潔劑為N,N-二甲基十四烷胺N-氧化物。
本發明之方法可用於使用一個或幾個層析管柱之連續、半連續或分批層析。各種層析模式為熟習此項技術者已知且本發明之教示可容易地由熟練專家適應於相應模式。
使用兩性離子清潔劑進行根據本發明之方法的核酸純化,可獲得與省略使用清潔劑之純化方法相比具有顯著更低之內毒素污染之靶核酸。
根據用於核酸純化之陰離子交換捕獲材料之實際類型,該方法導致內毒素降低增強30至600倍。
AEX材料之類型及特定種類之清潔劑(其較佳針對本文所揭示的方法而選擇)特別適合於自包含核酸(如質體DNA)之樣品移除或耗盡內毒素。
體積量在5至5000公升之範圍內、核酸(例如質體DNA)濃度在0.02至1.0 mg/ml之範圍內之起始材料(亦即樣品)可利用本發明之方法來加工。該方法較佳應用在具有0.050至0.200 mg/mL之質體效價之50至500 L之樣品體積規模下。每mL體積的AEX膜或單塊結構吸附劑1至10 mg核酸(例如質體DNA)之總裝載、及每分鐘1至10體積之膜或單塊結構裝置之流速適合於本發明之方法。
因此,本發明之方法亦適合於核酸之大規模純化且因此自該等核酸樣品大規模移除或耗盡內毒素。此外,存在於樣品中之核酸之量可在大範圍內變化且可高至1 mg/ml。該方法亦允許高至20 mg核酸/ml體積膜或單塊結構之極高裝載。
利用本發明之方法,可加工不同量之靶核酸,尤其質體DNA,因此一個批次可以讓0.1 mg至高達5 kg之核酸進行層析純化。
靶核酸池中之最終內毒素含量取決於初始內毒素含量。在約275,000 EU/mg靶核酸之初始內毒素含量的情況下,利用本發明之方法,可達成低至10至40 EU/mg靶核酸之最終內毒素含量。
在一個實施例中,本發明之方法僅使用N,N-二甲基十四烷胺N-氧化物作為清潔劑而進行。在層析純化期間,進料或洗滌緩衝液或任何其他時間均不添加其他清潔劑。
然而,本發明藉由隨後圖式及實例進一步說明,然而,不限於此。
上文及下文引用的所有申請案、專利及公開案以及2022年3月22日申請之對應專利申請案US 63/318,548之全部揭示內容以引用之方式併入本文中。
實例
以下實例代表本發明之實際應用。
清潔劑清單
用於質體 DNA 捕獲之方案
化學品 | 商品號/ 批號 | 供應商 |
Deviron TM(N,N-二甲基十四烷胺N-氧化物) | 研究樣品/ 批84184 | Sigma |
Triton TMX100 | 1.12298.1001 / K29892598 | Merck |
備註:小體積膜篩選裝置係典型的,其中系統貯留(holdup)不成比例地大,極高體積用於洗滌、溶離、在適當位置清潔(CIP)及平衡。在較大規模下,可減小此等值且逆轉流動方向以增強個別步驟。此係任何熟習此項技術者之標準實務及常識。
層析材料
Natrix® Q 方案• 層析緩衝液
• 層析法
• 質體進料
材料(裝置) | 商品號 | 供應商 |
Natrix® Q Recon Mini 利用0.2 mL膜床體積 | NXF-01 | Merck Millipore |
Mustang® Q Acrodisc® 利用0.18 mL膜床體積 | MSTG25Q6 | Pall Life Sciences |
CIMmultus® DEAE 1 mL填充管柱體積 | 311.5114-2 | BIA Separations |
步驟 | 緩衝液 |
平衡 | 1M乙酸鉀 + 160 mM NaCl,pH 5.0 |
樣品裝載 | 8 kb質體DNA溶解產物w/o清潔劑 |
洗滌1 | 100 mM Tris + 500 mM NaCl,pH 9.0 |
洗滌2 | 100 mM Tris + 500 mM NaCl,pH 9.0 利用在指定濃度下之清潔劑 |
洗滌3 | 100 mM Tris + 500 mM NaCl,pH 9.0 |
洗劑4 | 20 % EtOH + 150 mM NaCl |
溶離 | 1 M NaCl + 100 mM Tris,pH 9.0 |
CIP | 2 M NaCl + 1 M NaOH |
樣品泵洗 | 1M乙酸鉀 + 160 mM NaCl,pH 5.0 |
步驟 | 體積 | 流速 |
平衡 | 5 MV (膜裝置體積) | 2 mL/min |
裝載 | 變數 | 2 mL/min |
洗滌1 | 20 MV | 2 mL/min |
洗滌2 | 20 MV | 2 mL/min |
洗滌3 | 20 MV | 1 mL/min |
洗滌4 | 20 MV | 1 mL/min |
溶離 | 30 MV 質體溶離液溶離份:0-> 25 MV | 1 mL/min |
CIP | 20 MV->15分鐘暫停-> 20 MV | 2 mL/min |
平衡 | 40 MV | 2 mL/min |
用作進料之原始8 kb質體溶解產物顯示約275,000 EU/mg質體之初始內毒素含量。該溶解產物經0.22 µm PES介質過濾且補充有為pDNA之選擇性結合所需的175 mM NaCl。
Mustang® Q 方案• 層析緩衝液
• 層析法
• 質體進料
步驟 | 緩衝液 |
平衡 | 1M 乙酸鉀 + 375 mM NaCl,pH 5.0 |
樣品裝載 | 8 kb質體DNA溶解產物w/o清潔劑 |
洗滌1 | 100 mM Tris + 500 mM NaCl,pH 9.0 |
洗滌2 | 100 mM Tris + 500 mM NaCl,pH 9.0 利用在指定濃度下之清潔劑 |
洗滌3 | 100 mM Tris + 500 mM NaCl,pH 9.0 |
洗滌4 | 20 % EtOH + 150 mM NaCl |
溶離 | 1 M NaCl + 100 mM Tris,pH 9.0 |
CIP | 2 M NaCl + 1 M NaOH |
樣品泵洗 | 1M 乙酸鉀 + 375 mM NaCl,pH 5.0 |
步驟 | 體積 | 流速 |
平衡 | 5 MV | 1.8 mL/min |
裝載 | 變數 | 1.8 mL/min |
洗滌1 | 22 MV | 1.8 mL/min |
洗滌2 | 22 MV | 1.8 mL/min |
洗滌3 | 22 MV | 1.8 mL/min |
洗滌4 | 22 MV | 1.8 mL/min |
溶離 | 33 MV 質體溶離液溶離份:0-> 28 MV | 0.9 mL/min |
CIP | 22 MV->15分鐘暫停-> 22 MV | 1.8 mL/min |
平衡 | 40 MV | 1.8 mL/min |
利用經0.22 µm PES介質過濾且補充有為pDNA之選擇性結合所需的375 mM NaCl之原始溶解產物進行純化試驗。
CIMmultus® DEAE 方案• 層析緩衝液
• 層析法
• 質體進料
步驟 | 緩衝液 |
平衡 | 1M乙酸鉀 + 60 mM NaCl,pH 5.0 |
樣品裝載 | 8 kb質體DNA溶解產物w/o清潔劑 |
洗滌1 | 100 mM Tris + 250 mM NaCl,pH 7.5 |
洗滌2 | 100 mM Tris + 250 mM NaCl,pH 7.5 利用在指定濃度下之清潔劑 |
洗滌3 | 100 mM Tris + 250 mM NaCl,pH 7.5 |
洗滌4 | 20 % EtOH + 150 mM NaCl |
溶離 | 1 M NaCl + 100 mM Tris,pH 9.0 |
CIP | 2 M NaCl + 1 M NaOH |
樣品泵洗 | 100 mM Tris + 250 mM NaCl,pH 7.5 |
步驟 | 體積 | 流速 |
平衡 | 3 CV (管柱體積) | 5 mL/min |
裝載 | 變數 | 5 mL/min |
洗滌1 | 5 CV | 5 mL/min |
洗滌2 | 5 CV | 5 mL/min |
洗滌3 | 5 CV | 5 mL/min |
洗滌4 | 5 CV | 5 mL/min |
溶離 | 10 CV 質體溶離液溶離份:0-> 5 MV | 5 mL/min |
CIP | 3 CV-> 10分鐘暫停-> 2 CV | 5 mL/min |
平衡 | 5 CV | 5 mL/min |
利用經0.22 µm PES介質過濾且補充有為pDNA之選擇性結合所需的60 mM NaCl之原始溶解產物進行純化試驗。
質體 DNA 分析
藉助於分析型UV/HPLC法來測定自Natrix® Q捕獲試驗收集的原始裂解物及樣品中之純度及量及質體DNA。
自AEX捕獲試驗收集的質體溶離液溶離份中清潔劑之殘餘量藉助於如下文所述的分析型HPLC法來測量。該方法允許直接分析質體溶離液樣品而無需先前樣品製備來藉助於例如固相萃取移除潛在干擾基質組分。
使用自溶離液緩衝液基質中個別清潔劑之標準品獲得的校準曲線,基於分析物峰面積來計算未知溶離液樣品中清潔劑之量。
藉助於加標回收測試來證實用於真實質體樣品之分析方法之相容性及分析結果之有效性。為達該目的,驗證外加至質體溶離液樣品(來自不使用任何清潔劑之捕獲試驗)中之限定量之個別清潔劑之回收率。
結果 1) 利用 Natrix® Q 之質體捕獲
管柱類型: | Oasis HLB,25 µm 2.1x20 mm, 來自Waters,目錄號186002036 | |||
管柱尺寸: | 2.1 x20 mm (ID x L) | |||
保護管柱: | N/A | |||
溶離劑A: | 水 + 0.1% v/v甲酸 | |||
溶離劑B: | 乙腈 + 0.1% v/v甲酸 | |||
注入體積: | 5至100 µL | |||
流速: | 1 ml/min | |||
壓力: | 最大250巴 | |||
偵測: | 蒸發光散射偵測器(ELSD) | |||
梯度: | 時間(分鐘) | A% | B% | |
0.0 | 5 | 5 | ||
5.5 | 5 | 5 | ||
6.0 | 0 | 100 | ||
8.0 | 0 | 100 | ||
8.1 | 9.5 | 5 | ||
11.0 | 9.5 | 5 |
表R1 (部分A及B)及R2比較自遵循Natrix® Q方案之質體DNA捕獲試驗獲得的結果。該膜裝載為1.6 mg質體/mL膜體積。用作進料之原始8 kb質體溶解產物顯示約275,000 EU/mg質體之初始內毒素含量。
表R1-部分A. 自使用Natrix® Q之捕獲試驗獲得的質體溶離液池之分析數據。
洗滌緩衝液補充 | 洗滌緩衝液中之活性物質濃度 | 溶離液內毒素含量, 單位為EU/mg pDNA | pDNA池中之殘餘清潔劑, 單位為mg/L | ||
運行1 | 運行2 | 運行1 | 運行2 | ||
w/o | -/- | 2917 | 6955 | N/A | N/A |
Deviron TM | 1% w/v | 8 | 7 | 22 | 20 |
表R1-部分B. 自使用Natrix® Q之捕獲物獲得的質體溶離液池之分析數據。
洗滌緩衝液補充 | 洗滌緩衝液中之活性物質濃度 | 質體溶離液產率 (%) | 質體純度, 單位為% (總A260面積) | ||
運行1 | 運行2 | 運行1 | 運行2 | ||
w/o | -/- | 88 | 95 | 約94 | 約91 |
Deviron TM | 1% w/v | 85 | 92 | 約97 | 約97 |
使用Deviron TM洗滌方案進行pDNA捕獲所觀測到的內毒素移除之功效在表R2中給出。
表R2.質體溶離液池中相對於不使用清潔劑進行的基線實驗之內毒素降低因數。所述值係自重複運行計算得的平均值。
洗滌緩衝液 補充 | 洗滌緩衝液中之活性物質濃度 | 內毒素降低因數 |
Deviron TM | 1 % w/v | 658 |
自Natrix Q捕獲物獲得的質體溶離液池中之殘餘宿主細胞蛋白質濃度列於表3中。
表R3. 在Natrix Q捕獲步驟期間自質體DNA移除之大腸桿菌(
E.coli)宿主細胞蛋白質(HCP)。對於每個方案,分析自兩次連續運行收集的質體溶離液池(稱為運行1及運行2)。原始質體溶解產物中之HCP濃度總計為3,235 µg HCP/mg pDNA。
2) 利用 Mustang® Q 之質體捕獲
洗滌緩衝液 補充 | 洗滌緩衝液中之活性物質 | 殘餘HCP濃度 單位為ng/mg pDNA | |
運行1 | 運行2 | ||
w/o | -/- | 439 | 1000 |
Deviron TM | 1% w/v | 2734 | 1171 |
表R4 (部分A及B)及R5比較自利用Mustang® Q之質體DNA捕獲試驗獲得的結果。膜裝載為1.6 mg質體/mL膜體積。用作進料之原始8 kb質體溶解產物顯示約275,000 EU/mg質體之初始內毒素含量。
表R4-部分A. 自使用Mustang® Q之捕獲試驗獲得的質體溶離液池之分析數據。
洗滌緩衝液補充 | 洗滌緩衝液中之活性物質濃度 | 溶離液內毒素含量, 單位為EU/mg pDNA | pDNA池中之殘餘清潔劑, 單位為mg/L | ||
運行1 | 運行2 | 運行1 | 運行2 | ||
w/o | -/- | 3,983 | 7,081 | N/A | N/A |
Deviron TM | 1% w/v | 18 | 20 | 10 | 10 |
表R4-部分B. 自使用Mustang® Q之捕獲物獲得的質體溶離液池之分析數據。
洗滌緩衝液補充 | 洗滌緩衝液中之活性物質濃度 | 質體溶離液產率 (%) | 質體純度, 單位為% (總A260面積) | ||
運行1 | 運行2 | 運行1 | 運行2 | ||
w/o | -/- | 32 | 33 | >95 | >95 |
Deviron TM | 1% w/v | 30 | 29 | >95 | >95 |
使用Deviron TM洗滌方案進行pDNA捕獲所觀測到的內毒素移除之功效在表R5中給出。
表R5.質體溶離液池中相對於不使用清潔劑進行的基線實驗之內毒素降低因數。所述值係自重複運行計算得的平均值。
洗滌緩衝液 補充 | 洗滌緩衝液中之活性物質濃度 | 內毒素降低因數 |
Deviron TM | 1% w/v | 291 |
自Mustang® Q捕獲物運行獲得的質體溶離液池中之殘餘宿主細胞蛋白質濃度列於表6中。
表R6.在Mustang® Q捕獲步驟期間自質體DNA移除之大腸桿菌(
E.coli)宿主細胞蛋白質(HCP)。下表比較在Mustang® Q捕獲物之質體溶離液池中測得的殘餘HCP濃度。對於每個方案,分析自兩次連續運行收集的質體溶離液池(稱為運行1及運行2)。原始質體溶解產物中之HCP濃度總計為3,235 µg HCP/mg pDNA。
3) 利用 CIMmultus® DEAE 之質體捕獲物
洗滌緩衝液補充 | 洗滌緩衝液中之活性物質 | 殘餘HCP濃度 單位為ng/mg pDNA | |
運行1 | 運行2 | ||
w/o | -/- | 2380 | 6457 |
Deviron TM | 1% w/v | 769 | 769 |
表R7 (部分A及B)及R8比較自利用CIMmultus® DEAE之質體DNA捕獲試驗獲得的結果。管柱裝載為約1 mg質體/mL管柱體積。用作進料之原始8 kb質體溶解產物顯示約275,000 EU/mg質體之初始內毒素含量。
表R7-部分A. 自使用CIMmultus® DEAE之捕獲試驗之質體溶離液之分析數據。
洗滌緩衝液補充 | 洗滌緩衝液中之活性物質濃度 | 溶離液內毒素含量, 單位為EU/mg pDNA | pDNA池中之殘餘清潔劑, 單位為mg/L | ||
運行1 | 運行2 | 運行1 | 運行2 | ||
w/o | -/- | 738 | N/A | N/A | N/A |
Deviron TM | 1% w/v | 12 | 35 | 19 | 20 |
表R7-部分B. 自使用CIMmultus® DEAE之捕獲物之質體溶離液之分析數據。
洗滌緩衝液補充 | 洗滌緩衝液中之活性物質濃度 | 質體溶離液產率 (%) | 質體純度, 單位為% (總A260面積) | ||
運行1 | 運行2 | 運行1 | 運行2 | ||
w/o | -/- | 91 | N/A | 92 | N/A |
Deviron TM | 1% w/v | 92 | 98 | 91 | 92 |
使用Deviron
TM洗滌方案進行pDNA捕獲所觀測到的內毒素移除之功效在表R8中給出。
表R8. 質體溶離液池中相對於不使用清潔劑進行的基線實驗之內毒素降低因數。所述值係自重複運行計算得的平均值。
洗滌緩衝液補充 | 洗滌緩衝液中之活性物質濃度 | 內毒素降低因數 |
Deviron TM | 1% w/v | 31 |
自CIMmultus® DEAE捕獲試驗獲得的質體溶離液池中之殘餘宿主細胞蛋白質濃度列於表9中。
表R9.在CIMmultus® DEAE捕獲步驟期間自質體DNA移除之大腸桿菌宿主細胞蛋白質(HCP)。對於每個方案,分析自兩次連續運行收集的質體溶離液池(稱為運行1及運行2)。原始質體溶解產物中之HCP濃度總計為3,235 µg HCP/mg pDNA。
4) 利用 Deviron
TM 之內毒素清除 率 ,與使用中性清潔劑 Triton
TMX100
之常用替代方法相比
洗滌緩衝液 補充 | 洗滌緩衝液中之活性物質 | 殘餘HCP濃度 單位為ng/mg pDNA | |
運行1 | 運行2 | ||
w/o | -/- | 117 | N/A |
Deviron TM | 1% w/v | 203 | 136 |
表R10. 遵循不同方案之質體純化中內毒素移除之比較。下表陳述相對於不使用清潔劑之基線實驗的內毒素降低因數。
AEX捕獲材料 | 內毒素移除因數 | |
Triton TMX100方案 | Deviron TM方案 | |
Natrix ® Q | 87 | 658 |
Mustang ® Q | 45 | 291 |
CIMmultus ® DEAE單塊結構 | 90 | 31 |
Claims (14)
- 一種用於自核酸耗盡或移除內毒素之方法,其包括 a) 提供包含該等核酸及內毒素之樣品, b) 使步驟a)之該樣品在包含陰離子交換基團之膜或單塊結構上進行層析分離, 藉此在層析分離之前或期間使該樣品與選自胺氧化物或其混合物之群之兩性離子清潔劑接觸。
- 如請求項1之方法,其中步驟b)包括 i) 將包含該等核酸及內毒素之該樣品裝載至包含陰離子交換基團之該膜或單塊結構上; ii) 用洗滌緩衝液洗滌該膜或單塊結構;及 iii) 用溶離緩衝液溶離結合至該膜或單塊結構之該等核酸。
- 如請求項1或2之方法,其中該等核酸藉由用包含該兩性離子清潔劑之洗滌緩衝液洗滌該膜或單塊結構而與該兩性離子清潔劑接觸。
- 如請求項3之方法,其中該包含兩性離子清潔劑之洗滌緩衝液包含0.01%至10% (w/v)之兩性離子清潔劑。
- 如請求項1至4中一或多項之方法,其中用於本發明方法中之該兩性離子清潔劑為C12-C16烷基二甲基胺氧化物。
- 如請求項1至5中一或多項之方法,其中用於本發明方法中之該胺氧化物為N,N-二甲基十四烷胺N-氧化物。
- 如請求項1至6中一或多項之方法,其中該等核酸包含質體DNA或由其組成。
- 如請求項1至7中一或多項之方法,其中使該等核酸與包含0.01至10% (w/v)之該兩性離子清潔劑之溶液接觸。
- 如請求項1至8中一或多項之方法,其中在步驟b)中使用膜,較佳水凝膠膜。
- 如請求項1至9中一或多項之方法,其中步驟ii)包括兩個或更多個洗滌步驟,其中一個洗滌步驟係用包含乙醇之洗滌緩衝液進行。
- 如請求項1至10中一或多項之方法,其中在步驟b)中,進行層析分離之該樣品之體積在5至5000公升之間,其質體DNA濃度在0.02至1.0 mg/ml之範圍內。
- 如請求項1至10中一或多項之方法,其中在步驟b)中,進行層析分離之核酸之質量在一批次0.1 gm至5 Kg之範圍內。
- 如請求項1至12中一或多項之方法,其中在步驟b)中,每mL體積之包含陰離子交換基團之膜或單塊結構裝載1至20 mg核酸。
- 如請求項1至13中一或多項之方法,其中在步驟b)中,該層析分離以在每分鐘1至10體積之該膜或單塊結構之流速進行。
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US202263318548P | 2022-03-10 | 2022-03-10 | |
US63/318,548 | 2022-03-10 |
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-
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- 2023-03-07 WO PCT/EP2023/055677 patent/WO2023170028A1/en unknown
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