CN113440598B - 一种拓扑杂质的稳定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种拓扑杂质的稳定方法，包括以下步骤：向制备收集的多肽馏分中加入一定浓度的缓冲盐溶液，然后调节pH。TOP杂质作为空间异构杂质，其在溶液中由于没有离子间的相互作用，其C端肽链能够在溶液中移动，进而进行产品与拓扑异构的相互转化，而本发明用一定浓度的的缓冲盐溶液和pH值将其控制在一个相对稳定的范围中，过程操作简单，适用于任何方法制备的任何能够产生TOP杂质的多肽。经过此方法处理的药液可以进行旋蒸浓缩，在此过程中同样能够有效的控住TOP杂质的产生，这将为药液的再次制备，转盐，脱盐等步骤甚至于制剂提供有效的质量空间。

Description

一种拓扑杂质的稳定方法
技术领域
本发明属于杂质的控制方法技术领域，具体涉及一种拓扑杂质的稳定方法。
背景技术
拓扑杂质(Topological isomers，以下简称为TOP杂质)，存在于诸如芋螺毒素(conotoxin)，鸟苷(guanylin)，尿鸟苷(uroguanylin)等包含两条或者两条以上二硫键的多肽及其类似物中，这种杂质是一种空间异构杂质，拓扑杂质与产品之间拥有完全相同的分子量，多肽一级结构(序列)，以及各个氨基酸的空间结构。它们的产生并不是来自于氨基酸的消旋。通常氨基酸消旋只发生在氨基酸活化的过程中，而当氨基酸被偶联至多肽肽链，一般不会发生消旋(除了特殊的氨基酸，诸如苯丙氨酸等)。拓扑异构体不应该是氨基酸消旋之后的产物同样也并非二硫键错配产生，目前确定拓扑杂质的方法只能通过排除消旋杂质和错配杂质来进行。目前有大量文献可以证明，芋螺毒素(conotoxin)，鸟苷(guanylin)，尿鸟苷(uroguanylin)等包含两条或者两条以上二硫键的多肽及其类似物溶液中存在两种可以相互转换的拓扑异构体，该异构体的产生来源于多肽主链采取不同的空间二级甚至三级结构。这两种拓扑异构体可以通过NMR的方式辨析。有些拓扑异构体甚至可以在反相色谱上实现基线分离，并能够纯化出各个单独的拓扑异构体。Uroguanylin的拓扑异构体就可以分离，并且已经通过NMR得到验证。同时也证明目标多肽冻干后在低温下TOP杂质可以保持长时间的稳定，而在溶液中则会和目标多肽相互转化，这种转化在低温下仍然能够进行，但由于产生的拓扑杂质并没有与目标产物有相同的生物活性，故一直成为尿鸟苷素的类似物的药物如普卡那肽这类药物溶液存放的重要问题。
目前文献表明，TOP杂质相互转化的动力学主要受其COOH端影响，肽中心部分影响较小，通过引入确定空间结构的侧链在序列合适的位置上，可以控制他们的转化，并通过引入一个确定空间结构的片段进入肽序中来稳定多肽的结构，也起到了一定的作用，但如何在此类药物中溶液存放过程中有效的控制拓扑杂质的增长，未有详细文献提及。
本发明将针对易于产生拓扑杂质的药物在存放过程中稳定拓扑杂质，采用常用的缓冲盐通过调节pH和盐浓度的方法来抑制拓扑杂质的产生，增加药物溶液存放稳定性，确保质量和间接提高收率，增加产率。
发明内容
为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种拓扑杂质的稳定方法。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种拓扑杂质的稳定方法，包括以下步骤：向制备收集的多肽馏分中加入一定浓度的缓冲盐溶液，然后调节pH。
进一步地，所述缓冲盐为磷酸盐、醋酸盐、碳酸氢盐等在中性条件下具有较好的缓冲能力的缓冲盐，优选为磷酸盐。磷酸盐为常用缓冲盐，在中性条件下具有较强的缓冲能力，方便进行pH值的调节。磷酸盐具有3个pKa值，能够适用于跨度不同的pH，适用范围广。
进一步地，所述缓冲盐具体为磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸氢铵或醋酸铵。
进一步地，所述缓冲盐溶液的浓度为25-125mmol/L。浓度为25-125mmol/L能够保证馏分中含有足够的离子强度，如果离子强度较低则不能起到稳定样品溶液的作用，而浓度过高则容易造成样品析出，适合的盐浓度将用于保证控制多肽馏分中拓扑杂质的产生。
进一步地，所述多肽馏分与缓冲盐溶液的体积比为0.2-1：1。
进一步地，所述pH为6.00-7.00。
进一步地，所述pH采用磷酸或者氨水调节。
进一步地，所述多肽馏分为任何方法制备的任何能够产生TOP杂质的多肽。本发明适用于任何能够产生拓扑杂质的多肽类物质，在控制拓扑杂质的同时，保证多肽的生物活性。本发明适用于任何制备方法制备的多肽溶液，适用范围广，实用性大，对环境的损害小，操作简便，容易实施。
本发明的有益效果是：TOP杂质作为空间异构杂质，其在溶液中由于没有离子间的相互作用，其C端肽链能够在溶液中移动，进而进行产品与拓扑异构的相互转化，而本发明用一定浓度的的缓冲盐和pH值将其控制在一个相对稳定的范围中。过程操作简单，适用于任何方法制备的任何能够产生TOP杂质的多肽。
经过此方法处理的药液可以进行旋蒸浓缩，在此过程中同样能够有效的控住TOP杂质的产生，这将为药液的再次制备，转盐，脱盐等步骤甚至于制剂提供有效的质量空间。
附图说明
图1是实施例1中普卡那肽制备后色谱图和普卡那肽制备后杂质表；
图2是实施例1中普卡那肽存放后色谱图和普卡那肽存放后杂质表；
图3是实施例2中普卡那肽制备后色谱图和普卡那肽制备后杂质表；
图4是实施例2中普卡那肽存放后色谱图和普卡那肽存放后杂质表；
图5是实施例3中芋螺毒素多肽溶液色谱图和芋螺毒素多肽溶液杂质表；
图6是实施例3中芋螺毒素多肽溶液存放后色谱图和芋螺毒素多肽溶液存放后杂质表；
图7是实施例4中尿鸟苷素多肽溶液色谱图和鸟苷素多肽溶液杂质表；
图8是实施例4中尿鸟苷素多肽溶液存放后色谱图和尿鸟苷素多肽溶液存放后杂质表；
图9是对比例1中普卡那肽用pH值为6.50存放7天后色谱图和普卡那肽用pH值为6.50存放7天后杂质表；
图10是对比例1中普卡那肽用pH值为4.03存放7天后色谱图和普卡那肽用pH值为4.03存放7天后杂质表；
图11是对比例2中普卡那肽2-8摄氏度存放7天后色谱图和普卡那肽2-8摄氏度存放7天存放后杂质表；
图12是对比例2中普卡那肽室温存放7天后色谱图和普卡那肽室温存放7天后杂质表；
图13是对比例3中普卡那肽用缓冲盐溶液浓度为50mmol/L存放7天后色谱图和普卡那肽用缓冲盐溶液浓度为50mmol/L存放7天后杂质表；
图14是对比例3中普卡那肽用缓冲盐溶液浓度为10mmol/L存放7天后色谱图和普卡那肽用缓冲盐溶液浓度为10mmol/L存放7天后杂质表；
图15是普卡那肽TOP杂质核磁图；
图16是普卡那肽产品核磁图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
缩写及英文 含义
top Topological isomers 拓扑杂质
conotoxin 芋螺毒素
uroguanylin 尿鸟苷
实施例1：普卡那肽制备馏分存放
向反相制备收集的普卡那肽馏分溶液中加入35mmol/L磷酸二氢钾溶液，普卡那肽馏分溶液和磷酸二氢钾溶液的体积比为0.5：1，然后用氨水调节pH值为6.8，在2-8摄氏度放置7天，TOP杂质增长0.04％。普卡那肽制备后色谱图和普卡那肽制备后杂质表如图1所示，普卡那肽存放后色谱图和普卡那肽存放后杂质表如图2所示。
实施例2：普卡那肽制备馏分存放
向反相制备收集的普卡那肽馏分溶液中加入45mmol/L磷酸氢二钠溶液，普卡那肽馏分溶液和磷酸氢二钠溶液的体积比为0.5：1，然后用氨水调节pH值为6.5，在2-8摄氏度放置7天，TOP杂质增长0.03％。普卡那肽制备后色谱图和普卡那肽制备后杂质表如图3所示，普卡那肽存放后色谱图和普卡那肽存放后杂质表如图4所示。
实施例3：芋螺毒素多肽溶液存放
向离子交换制备收集的芋螺毒素多肽溶液中加入25mmol/L磷酸氢二铵溶液，芋螺毒素多肽溶液和磷酸氢二铵溶液的体积比为0.5：1，然后用氨水调节pH值为6.3，在2-8摄氏度放置7天，TOP杂质增长0.02％。芋螺毒素多肽溶液色谱图和芋螺毒素多肽溶液杂质表如图5所示，芋螺毒素多肽溶液存放后色谱图和芋螺毒素多肽溶液存放后杂质表如图6所示。
实施例4：尿鸟苷素多肽溶液的存放
向凝胶柱制备的尿鸟苷素多肽溶液中加入95mmol/L磷酸氢二钾溶液，尿鸟苷素多肽溶液和磷酸氢二钾溶液的体积比为1：1，然后用磷酸调节pH值为6.7，在2-8摄氏度放置7天，TOP杂质增长0.04％。尿鸟苷素多肽溶液色谱图和鸟苷素多肽溶液杂质表如图7所示，尿鸟苷素多肽溶液存放后色谱图和尿鸟苷素多肽溶液存放后杂质表如图8所示。
对比例1：普卡那肽的馏分溶液存放pH值对比
向反相制备收集的普卡那肽馏分溶液加入65mmol/L磷酸氢二钠溶液，普卡那肽馏分溶液和磷酸氢二钠溶液体积为0.5：1，然后用氨水调节pH值为6.5，在2-8摄氏度放置7天，TOP杂质增长0.03％。普卡那肽用pH值为6.50存放7天后色谱图和普卡那肽用pH值为6.5存放7天后杂质表如图9所示。
向反相制备收集的普卡那肽馏分溶液加入65mmol/L磷酸氢二钠溶液，普卡那肽馏分溶液和磷酸氢二钠溶液体积为0.5：1，然后用氨水调节pH值为4.0，在2-8摄氏度放置7天，TOP杂质增长15.69％。普卡那肽用pH值为4.03存放7天后色谱图和普卡那肽用pH值为4.0存放7天后杂质表如图10所示。
对比例2：普卡那肽的馏分溶液存放温度对比
向反相制备收集的普卡那肽馏分溶液加入80mmol/L磷酸二氢钾溶液，普卡那肽馏分溶液和磷酸二氢钾溶液体积为0.5：1，然后用氨水调节pH值为6.8，在2-8摄氏度放置7天，TOP杂质增长0.04％。普卡那肽2-8摄氏度存放7天后色谱图和普卡那肽2-8摄氏度存放7天后杂质表如图11所示。
向反相制备收集的普卡那肽馏分溶液加入80mmol/L磷酸二氢钾溶液，普卡那肽馏分溶液和磷酸二氢钾溶液体积为0.5：1，然后用氨水调节pH值为6.8，在室温放置7天，TOP杂质增长4.73％。普卡那肽室温存放7天后色谱图和普卡那肽室温存放7天后杂质表如图12所示。
对比例3：普卡那肽的馏分溶液存放缓冲盐溶液的浓度对比
向反相制备收集的普卡那肽馏分溶液加入50mmol/L磷酸二氢钾溶液，普卡那肽馏分溶液和磷酸二氢钾溶液体积为1：1，然后用氨水调节pH值为6.5，在2-8℃存放7天，TOP杂质增长0.04％。普卡那肽用缓冲盐溶液浓度为50mmol/L存放7天后色谱图和普卡那肽用缓冲盐溶液浓度为50mmol/L存放7天后杂质表如图13所示。
向反相制备收集的普卡那肽馏分溶液加入10mmol/L磷酸二氢钾溶液，普卡那肽馏分溶液和磷酸二氢钾溶液体积为1：1，然后用氨水调节pH值为6.5，在2-8℃存放7天，TOP杂质增长3.04％。普卡那肽用缓冲盐溶液浓度为10mmol/L存放7天后色谱图和普卡那肽用缓冲盐溶液浓度为10mmol/L存放7天后杂质表如图14所示。
普卡那肽TOP杂质核磁图如图15所示。普卡那肽产品核磁图如图16所示。
以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (2)

1.一种拓扑杂质的稳定方法，其特征在于，包括以下步骤：向制备收集的多肽馏分中加入一定浓度的缓冲盐溶液，然后调节pH，在2-8摄氏度放置；
所述缓冲盐为磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾；
所述缓冲盐溶液的浓度为25-95mmol/L；
所述pH为6.3-6.8；
所述多肽馏分与缓冲盐溶液的体积比为0.5-1：1；
所述多肽馏分为普卡那肽、芋螺毒素多肽或尿鸟苷素多肽。
2.根据权利要求1所述的拓扑杂质的稳定方法，其特征在于，所述pH采用磷酸或者氨水调节。
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