ES2545701T3

ES2545701T3 - Nuevos mutantes de proNGF y usos de los mismos en la producción de beta-NGF

Info

Publication number: ES2545701T3
Application number: ES12805695.9T
Authority: ES
Inventors: Susan Lorey; Bernhard Janowski; Heiko PULTKE; Daniela KATHMANN; Antje PARTHIER; Andreas Anton
Original assignee: Wacker Chemie AG
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2015-09-15
Anticipated expiration: 2032-12-19
Also published as: NZ627054A; JP2019011330A; US20150087020A1; MX2014007317A; EP2907521A1; AU2012357052B2; EP2672984A1; EA031333B1; EP2907521B1; US20160244496A1; KR101837802B1; PT2672984E; EP2672984B1; CN109400693A; JP6622683B2; CY1117016T1; SI2907521T1; CN104203264A; US9617322B2; RS56893B1

Abstract

Un mutante de proNGF en el que el sitio de disociación con proteasas R1SK3R4 está sustituido en las posiciones R1 y K3, correspondientes a las posiciones 101 y 103 de la secuencia de un proNGF de tipo silvestre humano (SEQ ID NO: 1), por valina en la posición 101 y por alanina en la posición 103.

Description

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Se podrían usar unos alternativos sistemas de barajadura redox tales como el de cistamina y cisteamina.

En una forma de realización preferida, el agente asistente del plegamiento es arginina. Unos compuestos que favorecen el plegamiento de las proteínas se pueden emplear generalmente como “agentes auxiliares del plegamiento”. Tales compuestos son conocidos por una persona experta en la especialidad. Ellos pueden ayudar al plegamiento de diversas maneras. Se supone que la arginina desestabiliza a unos compuestos que están incorrectamente plegados, de manera tal que éstos son desplegados de nuevo por lo menos parcialmente (desde un extremo inactivo termodinámicamente) y por lo tanto pueden ser plegados de nuevo correctamente. Por otro lado, el glicerol estabiliza usualmente a las proteínas. Unos compuestos que aumentan el rendimiento absoluto de una muteína de proNGF plegada en el método de acuerdo con el invento en más de un 5 %, en particular en más de un 10 % o más de un 20 % (basado en la cantidad total de proNGF que se emplea para el plegamiento) en comparación con un método sin el uso del agente auxiliar del plegamiento, son apropiados en particular como agentes auxiliares del plegamiento.

El replegamiento se lleva a cabo de manera preferible a un pH comprendido entre 8 y 11, en particular a un pH de 9,5.

Para aumentar la concentración de la proteína en el recipiente de replegamiento, se llevó a cabo una renaturalización por impulsos. Es limitativa para el número de impulsos la concentración de guanidinio HCl, que no debería superar el valor de 0.3 M. La concentración de la proteína por cada impulso no debería superar el valor de 50 µg/ml en relación con el volumen de replegamiento final.

En una forma de realización preferida del invento, el material solubilizado es añadido a la tanda de plegamiento en varias fracciones o de una manera continua a lo largo de varios días. Preferiblemente, el material solubilizado es añadido en una “renaturalización por impulsos” mediante una dilución rápida en el material solubilizado. En este contexto, por ejemplo pero sin quedar limitado de ninguna manera a ello, se podrían ejecutar por lo menos 6 impulsos en un intervalo de, por ejemplo, 24 horas. El número de impulsos es ajustado de una manera tal que, después de la adición de la tanda de solubilización, la concentración de la proteína que todavía no ha sido plegada no es demasiado alta, puesto que en caso contrario se obtienen unos conglomerados. Por ejemplo, con cada impulso se transfieren de nuevas a la tanda de plegamiento con cada impulso de 0,05 g/l a 0,2 g/l, de manera preferible 0,1 g/l de proteína (basado en la concentración de proteína en la tanda de plegamiento después de la adición del material solubilizado). Por ejemplo cada etapa de replegamiento dura por lo menos 1-2 h.

Después de un replegamiento, la tanda de reacción de replegamiento necesita ser clarificada antes de cargarla sobre una columna. Esto puede hacerse por cualesquiera métodos conocidos en la especialidad, por ejemplo por filtración.

En una forma de realización preferida, el método para producir un mutante de proNGF correctamente plegado incluye las siguientes etapas: a) unos cuerpos de inclusión, que comprenden un mutante de proNGF insoluble de acuerdo con el invento, son solubilizados en una solución desnaturalizante, tal como se ha descrito más arriba, y b) el proNGF solubilizado es luego renaturalizado en un tampón de solución de replegamiento, tal como se ha descrito más arriba.

En una forma de realización preferida del invento, la solución de desnaturalización y/o la solución de replegamiento no contienen por consiguiente ningún detergente. Se ha encontrado que el uso de detergentes no es necesario para la solubilización y/o el plegamiento de una muteína de proNGF. Esto es ventajoso, puesto que ciertos detergentes son unas sustancias químicas comparativamente agresivas, que los productos farmacéuticos no deberían comprender o las deberían comprender solamente en pequeñas cantidades, y por lo tanto se deben de eliminar de una manera costosa. El método de acuerdo con el invento es por lo tanto ventajoso en comparación con el método de Soejima y colaboradores, 2001, en el que dichos agresivos detergentes (Triton X-100 o Brij-58) se emplean para plegar a la proteína. Con otras palabras, no se usan detergentes en todo el método de producción de acuerdo con el invento y por lo tanto el método de producción está libre de detergentes.

Etapa c: Purificación del mutante de proNGF por cromatografía

Llevando a cabo el método de acuerdo con el invento con la desnaturalización y el subsiguiente replegamiento, se obtiene una solución acuosa de una muteína de proNGF plegada de acuerdo con el invento. La muteína de proNGF plegada de acuerdo con el invento puede subsiguientemente ser purificada adicionalmente mediante unos métodos conocidos.

En una forma de realización preferida, el mutante de proNGF de acuerdo con el invento es purificado a partir de la solución de replegamiento (p.ej. mediante una desnaturalización ausente o débil) a través de una purificación por cromatografía, en particular por medio de una cromatografía de modalidad mixta (etapa c) del método de producción de beta-NGF a partir de un mutante de proNGF del invento). La columna más preferida para la cromatografía es una

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columna con un ligando de afinidad sintético, de manera preferible con la 4-mercapto-etil-piridina (MEP Hypercell; de Pall). Las ventajas de este medio consisten en que la fijación es independiente de la fuerza iónica, no es necesario un apilamiento de sales, y son posibles unos caudales más altos para acelerar el proceso. Por lo demás. la elución se efectúa mediante un desplazamiento del pH.

Se conocen, y se podrían usar, otras columnas de materiales de modalidad mixta. Por ejemplo, pero sin limitarse a ellas, se citan las columnas con MEP (de Pall; en donde el ligando de afinidad es 4-mercapto etil piridina), HEA (de Pall; en donde el ligando de afinidad es hexilamino), PPA (de Pall, en donde el ligando de afinidad: es fenilpropilamino), MBI (de Pall; en donde el ligando de afinidad es 2-mercapto-5-bencimidazol sulfo ácido), Capto MMC (GEHC), Capto adhere (GEHC; en donde el ligando de afinidad es N-bencil-N-metil etanolamina), CHT hidroxiapatito (de BioRad) y CHT fluoroapatito). Las columnas con MEP, HEA, PPA y MBI tienen una fijación hidrófoba, en donde el Capto MMC es un intercambiador de cationes con una funcionalidad de modalidad mixta y el Capto adhere es un intercambiador de aniones con una funcionalidad de modalidad mixta. Las columnas de BioRad son unas columnas de intercambio de iones con unos componentes hidrófobos. Cualquier otra columna con un material de modalidad mixta, que aquí no se haya enumerado, se podría usar para purificar el mutante de proNGF de acuerdo con el invento.

Etapa d: Disociación del proNGF para dar un beta-NGF

Un proNGF es el precursor de un beta-NGF. Por lo tanto en la etapa d) del método de producción de un beta-NGF a partir de un mutante de proNGF del invento, la pro-secuencia del mutante de proNGF es disociada con el fin de obtener un beta-NGF activo.

Unas proteasas que tienen un substrato similar a la tripsina disocian con especificidad a la proteína sin digerir la porción activa de la molécula de proteína. Unas proteasas similares a tripsina disocian a unos enlaces peptídicos a continuación de un aminoácido cargado positivamente tal como arginina o lisina. Igual a como las proteasas similares a tripsina, varias serina proteasas (serina endopeptidasas) son tomadas en consideración para que el procesamiento del proNGF dé como resultado un beta-NGF. De manera preferible, la serina proteasa tripsina es usada para la disociación de la pro-secuencia pero se podrían usar en vez de ella otras proteasas.

Se hace observar que la disociación no está restringida a la efectuada con tripsina propiamente dicha, sino que puede implicar asimismo a otras proteasas que tienen unos substratos que son similares a la tripsina. Generalmente, si la relación del proNGF a la tripsina (o a otra proteasa) es ajustada de una manera apropiada, el beta-NGF maduro, correctamente plegado, no será disociado por esta proteasa. En contraste con ello, unas proteínas desnaturalizadas así como unos compuestos intermedios de plegamiento dejan expuestas a unas secuencias que son susceptibles a un ataque por la proteasa.

De manera preferible para la disociación de un mutante de proNGF para dar un beta-NGF, la relación de la tripsina (o de otra proteasa) al mutante de proNGF es de 1 : 200 -1 : 100.000, más preferiblemente de 1 : 5.000 -1 : 20.000, y es sumamente preferida una relación de 1 : 10.000 (p/p = peso/peso). En una forma de realización sumamente preferida, la disociación se realiza durante 8-23 horas a la temperatura ambiente, de modo sumamente preferido durante 18 horas. En las condiciones que se usan en este invento, el mutante de proNGF es disociado completamente y casi no se forman productos secundarios. No se observó ninguna conglomeración.

Tal como se describirá claramente en los Ejemplos, los autores del presente invento han encontrado que las modificaciones de aminoácidos que se han introducido en el mutante de proNGF del invento no solamente evitan una disociación de la proteína en unos sitios de disociación no deseados, sino que también dan como resultado inesperadamente un aumento en la eficiencia de la disociación con tripsina en comparación con la del proNGF del tipo silvestre, lo que permite llevar a cabo la disociación en unas condiciones muy selectivas para obtener un producto muy puro.

Con detalles, los datos experimentales muestran con claridad que ya en una relación muy baja de tripsina/proteína tal como la de 1:100.000, el mutante de proNGF del invento (SEQ ID NO: 5) da como resultado un beta-NGF humano recombinante en una pureza muy alta con un alto rendimiento de disociación (aproximadamente de 85 %). Por lo demás, el proNGF de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) con la misma relación de tripsina a proteína muestra un bajo rendimiento de disociación (aproximadamente de 5 %). Un rendimiento satisfactorio se obtiene solamente con unas relaciones de tripsina a proteína mucho más altas (1/250), pero esto está acompañado por una baja selectividad y una alta degradación de los productos debido a una digestión excesiva.

Etapa e: Purificación adicional del beta-NGF

El beta-NGF producido a partir de un mutante de proNGF del invento es purificado adicionalmente, por ejemplo, por diversos métodos cromatográficos. Se requieren unas adicionales etapas de purificación para separar a la tripsina y a las impurezas relacionadas con el producto de la digestión tríptica a partir del beta-NGF. Unas etapas de

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Ejemplo 3. Fermentación

La meta de esta fermentación fue obtener un producto y una biomasa para unas subsiguientes etapas del proceso. Para vigilar la sobreexpresión de la proteína diana durante el proceso de fermentación, las muestras fueron analizadas por medio de una SDS-PAGE antes y después de una inducción.

▪: Un medio de sal mineral sin antibióticos

▪: Fase µ de la tanda ≈ 0,25 h-1 (ODfinal =18)

▪: Fase de afluencia (fed batch) I: alimentación exponencial con µset = 0,18 h-1

▪: Fase de afluencia (fed batch) II: caudal de alimentación constante

▪: Punto de inducción de ODind = 60 ±5

▪: IPTG 1,0 mM

▪: Tiempo de inducción 5 h

▪: OD Final = 82 ±4

▪: Período de tiempo de procesamiento 28,5 h ±1,25

▪: Estabilidad del plásmido 100 %

▪: Rendimiento: 40 mg/g de proNGF; 1,2 g/l ± 0,2 g/l de proNGF

Ejemplo 4. Recuperación primaria de cuerpos de inclusión que contienen el SP174-101

En unas células bacterianas la proteína recombinante está presente en la forma de unos conglomerados. La expresión de la muteína de proNGF tuvo lugar en la forma de IBs. La descomposición de las células y la preparación de los IB se llevaron a cabo de acuerdo con unos protocolos clásicos y se pueden realizar a la escala de laboratorio hasta realizar un tratamiento de aproximadamente 200 g de la biomasa. La preparación de estos “cuerpos de inclusión” que contenían la muteína de proNGF se llevó a cabo de acuerdo con Rudolph, R., y colaboradores, (1987); Folding proteins. In: Creighton, T. E. (coordinador de edición): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, páginas 57-99, y de acuerdo con el documento EP0994188B1. Para la rotura de las células, los sedimentos celulares fueron suspendidos de nuevo en un tampón apropiado y subsiguientemente las células fueron rotas usando una homogenización en fosfato de sodio 50 mM de pH 7,0, EDTA 1 mM.

Ejemplo 5. Disolución del mutante de proNGF SP174-101 en una solución desnaturalizante (solubilización de cuerpos de inclusión)

Los cuerpos de inclusión fueron solubilizados en una solución desnaturalizante que comprendía una solución de (i) un agente caotrópico, (ii) un agente quelante, (iii) un tampón y (iv) un agente de reducción. Para la solubilización, se ensayó el guanidinio HCl (GuaHCl) en un intervalo de concentraciones de 4,0-6,0 M. El tampón de solubilización se mezcló en diferentes relaciones con una suspensión de cuerpos de inclusión (suspensión de IB). Todos los experimentos tenían una concentración final de cisteína de 5 mM y se llevaron a cabo a la temperatura ambiente. Los resultados fueron analizados mediante una SDS-PAGE (datos no mostrados). Los experimentos revelaron que una concentración de 4 M de GuaHCL era suficiente para una solubilización completa de los cuerpos de inclusión. La relación de la suspensión de cuerpos de inclusión al tampón (suspensión de IB: tampón).es de 1 + 1,25 (v/v = volumen/volumen) Las condiciones finales de la solución de desnaturalización para la solubilización de los cuerpos de inclusión fueron:

i. 4 M de guanidinio-HCl,

ii. 0,1 M de Tris,

iii. 10 mM de EDTA

iv.: 5 mM de cisteína

v.: pH 8,0

El material solubilizado es clarificado mediante una filtración profunda de acuerdo con procesos clásicos.

La concentración de la proteína se determinó luego usando el método de Bradford (Bradford, M. M., Anal. Biochem. 72 (1976) 248). La concentración de la proteína de muteína de proNGF estaba situada entre 10 y 20 mg/ml.

Ejemplo 6. Transferencia del mutante de proNGF SP174-101 a un tampón de replegamiento en donde elproNGF desnaturalizado adopta una conformación biológicamente activa

Después de una solubilización, es necesario replegar la proteína en su conformación nativa y de esta manera reducir al mínimo el plegamiento erróneo y la conglomeración. Para preparar la muteína de proNGF biológicamente activa de acuerdo con el invento a partir de unos materiales solubilizados, éstos fueron diluidos en una solución de replegamiento, en la que el proNGF adopta una conformación biológicamente activa.

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Tabla 4

Cantidad: Relación de % de % de % de betaNGF

µg: tripsina/ProNGF ProNGF betaNGF Formas excesivamente digeridas

ProNGF: Patrón 80 - 100

NGF: Patrón 42 100,0

ProNGF SEQ ID NO: 5: 80 1/10.000 1,9 84,5

ProNGF Tipo silvestre ProNGF Tipo silvestre ProNGF Tipo silvestre ProNGF Tipo silvestre: 80 80 80 80 1/10.000 1/5.000 1/1.000 1/250 67,1 21,5 0,0 0,0 4,6 18,6 77,9 67,9 -6,6 12,9 25,7

Ejemplo 11. Ensayo acerca de la actividad biológica de un proNGF mediante estimulación de la proliferación de células TF1

5 Unas células TF1 (ATCC, nº de catálogo CRL2003) se cultivaron de acuerdo con unos procesos clásicos. Un medio de ensayo (90 % del medio RPMI 1640, 10 % de un suero de bovino fetal FBS, 50 U/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina) se añadió a las células y se centrifugó. El sedimento se suspendió de nuevo con una densidad de 1,5·105 células/ml en un medio de ensayo a 37 ºC. La suspensión de células se mezcló con diferentes concentraciones de la proteína proNGF (10-10 M, 3·10-10 M, 10-9 M, 3·10-9 M, 10-8 M, 3·10-8 M, 10-7 M, 3·10-7 M,

10 10-6 M, 3·10-6 M, 10-5 M y 3·10-5 M) y se analizó en unas placas de 96 pocillos. Después de una incubación durante 48 h a 37 ºC, se añadió un reactivo para la proliferación de células (p.ej. el WST-1, de Roche Applied Science, nº de catálogo 1644807) y las placas se incubaron de nuevo durante 4 h a 37 ºC. La absorción se midió a 450 nm y el valor de la EC50 se determinó usando unos programas apropiados (p.ej. el Sigma-Plot 2000)..

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Claims

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