CN107001460B - Il-17抗体中半胱氨酸残基的选择性还原 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的IL‑17抗体或其抗原结合片段制品(例如苏金单抗抗体制品)中的CysL97的方法。本发明还提供了通过这些方法生产的IL‑17抗体或其抗原结合片段的纯化制品，例如苏金单抗的纯化制品，其中该制品中的完整IL‑17抗体或其抗原结合片段(例如苏金单抗)的含量较高，例如通过十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE‑SDS)测得为至少约90％，并且其中该制品中的IL‑17抗体或其抗原结合片段(例如苏金单抗)的活性水平较高，例如通过阳离子交换色谱(CEX)测得为至少约92％。

Description

IL-17抗体中半胱氨酸残基的选择性还原
相关申请
本申请要求2014年12月22日提交的美国临时专利申请第62/095361号的优先权，其通过引用全文纳入。
技术领域
本发明涉及在通过哺乳动物细胞以重组体方式生产的IL-17抗体及其抗原结合片段的制品(例如苏金单抗制品)中选择性还原CysL97的方法。
技术背景
经典抗体由分子量各约为25kD的两个轻链(L)和分子量各约50kD的两个重链(H)组成。轻链和重链通过二硫键(L-S-S-H)连接，两个LH单元还在重链之间通过两个二硫键连接。经典抗体的通式为L-SS-H(-SS-)2H-SS-L或简式H2L2(HHLL)。除了这些保守性链间二硫键以外，还有保守性链内二硫键。这两种二硫键对于抗体的稳定性和行为(例如亲和性)都很重要。一般来说，二硫键通过抗体链中保守性位置处的两个半胱氨酸残基(Cys-SH)产生，它们自发形成二硫键(Cys-S-S-Cys)。二硫键的形成由环境的氧化还原电势以及由特异于硫醇-二硫化物交换的酶的存在决定。内部二硫键(Cys-S-S-Cys)使得抗体的三维结构稳定化。
还存在异常抗体，其包含参与抗原识别和结合的额外的游离半胱氨酸(即，不成对的半胱氨酸)。对于这些抗体，游离半胱氨酸的改性会对该分子的活性和稳定性产生负面影响，并会导致提高的免疫原性。结果是难以处理这些抗体，因为最终产物可能包含显著量的惰性、错误折叠且无用的抗体材料。通过引用全文纳入的US20090280131提供了IL-17抗体，例如苏金单抗(即，AIN457)，其在轻链互补决定区(CDR)3环(L-CDR3)中顺-脯氨酸之后存在游离半胱氨酸(即，SEQ ID NO:6所示L-CDR3的氨基酸8，其对应于SEQ ID NO:10所示轻链可变区的氨基酸97，后文称为“CysL97”)。为了保持完全活性，苏金单抗的不成对的半胱氨酸残基不能通过与其他半胱氨酸残基的氧化性二硫配对或通过与外源化合物的氧化(例如，与其他蛋白质形成混合的二硫键，与细胞代谢产物[例如半胱氨酸或谷胱甘肽]发生衍生作用，以及通过氧气形成亚砜)而被掩蔽。不幸的是，由于苏金单抗是使用哺乳动物细胞制造的，的确会发生不利的基于细胞的CysL97改性。
该文献描述了在细菌细胞中表达的哺乳动物蛋白质的再折叠，其产生作为具有混合二硫键的未折叠不溶性聚集体(包含体)的哺乳动物蛋白质。为了从细菌获得哺乳动物蛋白质，要用强离液剂和还原剂对包含体蛋白质进行分离、溶解和变性。使用变性剂、还原剂、二硫加合物形成剂和温和的氧化/还原环境(pH 7-9)的完全变性与还原二硫键也已用来正确地再折叠得自商业来源或在酵母中重组产生的植物蛋白质(US 4766205)。这些采用蛋白质的完全变性和再折叠的工艺昂贵、苛性、耗时，且对于在哺乳动物细胞中产生的蛋白质是不必要的。
已知使用还原/氧化偶联剂来纠正非自然产生的Fc融合蛋白的错误折叠(WO02/68455)。据推测WO02/68455的Fc融合蛋白在Fc区域中包含链间二硫键，其通过所揭示的工艺被还原并被再氧化，但其中没有指出如何生产具有被选择性还原的半胱氨酸残基的分子。而且，Fc融合蛋白显然并非抗体，抗体是高度复杂的免疫球蛋白，其结构和活性依赖于无数正确连接的链间和链内二硫键。
US20050123532提供了通过用还原剂活化抗体、或通过在补充有L-半胱氨酸的无血清培养基中培育抗体产生细胞来生产具有游离半胱氨酸的抗体的方法。使用这种细胞培育方法时，之后的处理步骤例如过滤、病毒灭活和色谱法会导致通过细胞培育方法生产的游离半胱氨酸发生氧化。在这种情况中，通过用氧化剂改性游离的硫醇基团使之后步骤过程中游离半胱氨酸理想地得到保护，之后采用各种技术例如过滤除去该氧化剂(US20060257393)。对于商业生产，这种方法在原始培育培养基中需要大量还原剂，在之后处理过程中需要大量氧化剂，并且需要额外的过滤方法来除去氧化剂，增加了生产消耗的时间以及费用。
美国专利第7928205号提出了优先使用氧化还原对来再折叠得自哺乳动物细胞培育的IgG2抗体，以及使146B7(IgG1)抗体的可变区中的游离半胱氨酸脱半胱氨酰基化(decysteinylation)的方法。相应的研究出版物：Banks等的《药物科学杂志》(J.Pharmaceutical Sci.)97:764-779(2008)指出了对重组单克隆IgG1抗体(MAB007)的可变区中的不成对巯基的脱半胱氨酰基化。Banks等研究了MAB007的脱半胱氨酰基化是否需要使用强变性剂(GdnHCL)和还原剂(半胱氨酸)，或是否能在仅存在半胱氨酸时发生选择性还原。这些作者确定，在存在和不存在变性剂的情况下有效地从MAB007中除去了半胱氨酰基。
以上参考文献都没有指出是否能在苏金单抗中选择性还原CysL97。以上参考文献也没有指出在苏金单抗中选择性还原CysL97所需的试剂和条件，其取决于苏金单抗的一级、二级和三级结构；苏金单抗中被氧化的CysL97的位置和场所(例如溶剂可接近的或不可接近的)；以及抗体中保守性二硫键的相对强度(例如CysL97是否首先与给定的还原剂反应，或只有在保守性半胱氨酸被还原之后再反应)等等。而且，这些参考文献都未描述苏金单抗中被氧化的CysL97的选择性还原是否会导致改变抗体结构(例如折叠)、化学组成(例如脱酰氨基化)、或性质(结合活性、聚集或降解倾向)，所有这些都使得商业规模地选择性还原苏金单抗在技术上是不可行/不现实的。
发明概述
为了保持最大的苏金单抗抗原结合活性，发明人确定需要在处理苏金单抗过程中将CysL97从被掩蔽的式(1)转化成游离的式(2)形式(见以下I)而不明显还原保守性二硫键；否则就会因链脱连接而形成较低活性和非活性的较低分子量变体(H2L2→H2L，HL2，HL，H和L)。
(I)H2L2-Cys-SX+试剂→H2L2-Cys-SH+X-试剂
(1) (2)
在商业规模的抗体制备过程中引入还原条件是违反直觉的(参见例如Trexler-Schmidt等，《生物技术和生物工程》(Biotech and Bioengineering)106:452-61(2010)，其采用各种试剂和方法来防止抗体的细胞培育制造过程中的抗体二硫键还原)。尽管如此，发明人确定可以在哺乳动物细胞中的大规模商业生产过程中选择性还原苏金单抗中的CysL97而无抗体的明显变性。本发明揭示了在US20090280131中所揭示IL-17抗体(及其片段)、具体是苏金单抗的抗原结合位中选择性还原CysL97的方法。这些方法有助于恢复这些抗体的结合活性，并从而增加其制品的生物活性。而且，这些方法有助于增加完整抗体的含量，并提高这些抗体制品的同质性。所揭示的工艺倚赖于:孵育过程中体系中抗体:还原剂的具体比值以及受控传氧速率的组合效果。
因此，本发明揭示了在通过哺乳动物细胞重组生产的IL-17抗体制品中选择性还原CysL97的方法，其包括:
a)使该制品在体系中接触至少一种还原剂以形成还原混合物:和
b)孵育该还原混合物同时保持该体系中的体积氧传质系数(kLa*)小于等于约0.37h-1，所述kLa*通过将饱和曲线适配至溶解氧曲线而算得；
其中IL-17抗体各自包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该VH包含如SEQ ID NO:8所示VH的三个互补决定区(CDR)，该VL包含如SEQ ID NO:10所示VL的三个互补决定区，而且在步骤a)之前，该制品中的初始氧饱和百分比至少约为60％，该比值使用在25℃校准的氧探针测定。
本发明还揭示了在通过哺乳动物细胞重组生产的IL-17抗体制品中选择性还原CysL97的方法，其包括:
a)使该制品与一组选自半胱氨酸/胱氨酸和半胱氨酸/胱胺的氧化/还原试剂接触以形成还原混合物；和
b)在约37℃的温度厌氧条件下孵育该还原混合物至少约4小时，或在约18-24℃的温度下孵育该还原混合物约16-24小时；
其中该IL-17抗体各自包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该VH包含如SEQ ID NO:8所示VH的三个互补决定区，该VL包含如SEQ ID NO:10所示VL的三个互补决定区。
本发明还揭示了苏金单抗的纯化制品，其中该制品中的完整苏金单抗含量至少约为90％，该值通过十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)测定，并且其中该制品中的苏金单抗活性水平至少约为90％，该值通过胱胺-CEX测定。
附图简要描述
图1显示接受不同还原剂处理之后完整抗体(LHHL)的百分比随时间的变化。
图2A显示在厌氧条件下接受8mM半胱氨酸的选择性还原处理之后完整抗体(LHHL)的百分比在室温下随时间的变化。图2B显示在有氧条件下接受8mM半胱氨酸的选择性还原处理之后完整抗体(LHHL)的百分比在室温下随时间的变化。图2C显示在厌氧条件下接受8mM半胱氨酸的选择性还原处理之后完整抗体(LHHL)的百分比在37℃下随时间的变化。图2D显示在有氧条件下接受8mM半胱氨酸的选择性还原处理之后完整抗体(LHHL)的百分比在37℃下随时间的变化。
图3显示在各种溶解氧浓度下接受8mM半胱氨酸的选择性还原处理之后完整抗体的百分比在37℃温度下随时间的变化。
图4A显示CEX所测活性的4D等高线图。图4B显示CE-SDS所测纯度的4D等高线图。图4的各图分析了半胱氨酸浓度、蛋白质浓度和半胱氨酸/胱氨酸比值对CEX所测活性和CE-SDS所测纯度的输出参数的影响和相互作用。
图5A显示CEX所测活性的4D等高线图。图5B显示CE-SDS所测纯度的4D等高线图。图5的各图分析了半胱氨酸浓度、蛋白质浓度和胱氨酸浓度对CEX所测定活性和CE-SDS是测纯度的输出参数的影响好相互作用。
图6显示CEX所测活性的4D等高线图，关注pH、时间、温度和半胱氨酸浓度的影响和相互作用。
图7显示CE-SDS所测纯度的4D等高线图，关注pH、时间、温度和半胱氨酸浓度的影响和相互作用。
图8显示验证1号试验(confirmation run 1)的半胱氨酸处理的溶解氧图表。
图9显示验证2号试验的半胱氨酸处理的溶解氧图表。
图10显示验证3号试验的半胱氨酸处理的溶解氧图表。
图11显示验证4号试验的半胱氨酸处理的溶解氧图表。
图12就CEX所测活性和CE-SDS所测纯度比较了验证3号试验和验证4号试验中的反应动力学。
图13A显示对于REACT.P由CEX所测活性的带刻度并居中的系数图。图13B显示对于REACT.P由CEX所测活性的4D等高线图。图13的各图分析了半胱氨酸浓度、蛋白质浓度和搅拌器速度对CEX所测活性和CE-SDS所测纯度的输出参数的影响和相互作用。
图14A显示0rpm的过程表征试验的溶解氧曲线图(图例中的数字表示试验号、搅拌器速度和半胱氨酸及抗体浓度)。图14B显示50rpm的过程表征试验的溶解氧曲线图(图例中的数字表示试验号、搅拌器速度和半胱氨酸及抗体浓度)。图14C显示100rpm的过程表征试验的溶解氧曲线图(图例中的数字表示试验号、搅拌器速度和半胱氨酸及抗体浓度)。图14D比较了以50mL规模在50rpm和6.0mM半胱氨酸条件下进行的两次试验的溶解氧曲线图，一次试验中不含抗体，另一次试验中包含12.7g/L抗体。
图15显示在不同的孵育温度下CEX所测活性的选择性还原动力学。
图16显示来自按比例缩减的模型定性试验的溶解氧重叠图表，标出了该过程中各步骤的时间(半胱氨酸添加、加热、孵育、冷却和pH调节)。
图17显示制造规模的试验和按比例缩减的模型试验中在选择性还原过程中CEX所测活性的动力学。
发明详述
本发明的目的是提供在某些IL-17抗体或其抗原结合片段例如苏金单抗的抗原结合位中选择性还原CysL97的方法。“选择性还原”是指将所揭示的IL-17抗体或其抗原结合片段中的CysL97还原成氧化形式而不还原这些抗体的保守性半胱氨酸残基。在经典IgG1抗体的情况中，保守性半胱氨酸残基是:铰链区中的两个二硫桥，两个链间二硫桥(各Fab中有一个)，Fc区中的四个链内二硫桥，和抗体的Fab部分中的八个链内二硫桥。在该选择性还原过程中，可能在特定制品中发生一些抗体的保守性半胱氨酸的瞬时还原。但是，在反应完成时，被瞬时还原的保守性半胱氨酸中的大部分将再氧化形成典型抗体中的保守性二硫键，导致抗体的选择性还原制品(即，纯化制品)的高纯度和活性。应理解，在选择性还原反应完成时，并不预计该选择性还原制品(即，纯化制品)包含100％的完整抗体；而是该选择性还原制品理想地包含至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或约100％(相对于理论最大值)的完整抗体，该比值通过CE-SDS测定。
术语“包括(包含)”涵盖了“包括”以及“由……组成”的含义，例如“包含X”的组合物可仅由X组成，或可包含一些其他成分，例如X+Y。
涉及数值x的术语“约”表示例如±10％。当用于数值范围或数字列表之前时，术语“约”应用于该系列中的每个数字，例如“约1-5”应理解为“约1-约5”，或例如“约1、2、3、4”应理解为“约1、约2、约3、约4等”。
基于翻译后的氨基酸序列，苏金单抗的相对分子量为147944道尔顿。本公开全文用这个分子量(即147944道尔顿)计算苏金单抗的摩尔值和摩尔比。但是，在CHO细胞中的生产过程中，通常从各重链中除去了C-端赖氨酸。从各重链中除去了C-端赖氨酸的苏金单抗的相对分子量为147688道尔顿。苏金单抗制品包含在重链中具有和不具有C-端赖氨酸残基的分子的混合物。因此在本公开中使用的苏金单抗摩尔值(以及使用这些摩尔值的比率)是估计值，提及这些数值使用的术语“约”、“大约”等包括在相对分子量以及由其所得计算值的至少这种变化。
“基本上”并不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可能“完全不含”Y。在需要时，可以从本发明的定义中省略“基本上”。
本文术语“抗体”是指包括整个抗体及其任意抗原结合部分或单链。自然产生的“抗体”是包含通过二硫键互相连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的醣蛋白。各重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个域，CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个域CL。VH和VL区可进一步细分成多个高变区域，称为高变区或互补决定区(CDR)，其间有更保守性地称为骨架区(FR)的区域。各VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基端至羧基端如下排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的不同细胞(例如效应细胞)和经典补体体系的第一组分(C1q)。
本文使用术语“抗原结合片段”表示保持特异性结合抗原(例如IL-17)能力的抗体片段。已经显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段进行。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的例子包括Fab片段，包含VL、VH、CL和CH1域的单价片段；F(ab)2片段，包含通过二硫桥在铰链区处连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH区组成的Fv片段；由某VH区组成的dAb片段(Ward等，1989 Nature 341:544-546)；分离的CDR。示例性的抗原结合位包括苏金单抗的CDR，如SEQ ID NO:1-6和11-13(表1)中所示，优选重链CDR3。而且，虽然Fv片段的两个域VL和VH由独立的基因进行编码，它们可通过合成连接子采用重组方法连接，从而使得它们可制为单蛋白链，其中的VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等，1988 Science 242:423-426；Huston等，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。这些单链抗体也预计涵盖在术语“抗体”之内。单链抗体和抗原结合部分可采用本领域技术人员已知的常规技术获得。
本文使用“分离的抗体”表示基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合IL-17的分离抗体基本上不含特异性结合IL-17以外的其他抗原的抗体)。本文使用术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”表示单分子组合物的抗体分子的制品。本文使用术语“人类抗体”意在包括如下抗体，这些抗体所含可变区中的骨架和CDR区都得自于人类来源的序列。“人类抗体”不一定由人类、人体组织或人体细胞产生。本发明的人类抗体可包含并非由人类序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机或位置特异性突变形成、通过在抗体基因重组过程中在体内在接合处添加N-核苷、或通过在体内体细胞突变而引入突变)。在本发明工艺和组合物的一些实施方式中，IL-17抗体是人类抗体、分离的抗体、和/或单克隆抗体。
术语“IL-17”是指IL-17A，之前称为CTLA8，包括来自不同物种(例如，人类、小鼠、和猴子)的野生型IL-17A、IL-17A的多形变体和IL-17A的功能等价物。本发明所述IL-17A的功能等价物优选与野生型IL-17A(例如人类IL-17A)具有至少约65％、75％、85％、95％、96％、97％、98％、或甚至99％的的整体序列同一性，并基本保持通过人体皮肤纤维原细胞诱导IL-6产生的能力。
术语“KD”意在表示特定抗体-抗原相互作用的离解率。本文使用术语“KD”意在表示离解常数，其从Kd相对于Ka的比值获得(即，Kd/Ka)，并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可采用本领域充分确立的方法确定。确定抗体KD的一种方法是通过使用表面等离子共振，或使用生物传感器系统例如
Figure GDA0002469027060000081
系统。在一些实施方式中，IL-17抗体或抗原结合片段例如苏金单抗的KD约为100-250pM(对人类IL-17)。
术语“亲和性”是指抗体和抗原之间在单一抗原位处的相互作用强度。在各抗原位之内，抗体“臂”的可变区通过非共价弱作用力与抗原在多点相互作用；相互作用越大，则亲和性越强。评价抗体对不同物种IL-17的结合亲和性的标准检测方法是本领域中已知的，包括例如ELISA、蛋白质印记法(western blot)和RIA。还可通过本领域中已知的标准检测方法来评估结合动力学(例如，结合亲和性)，例如通过Biacore分析。
通过根据本领域已知和如本文所述的方法确定的“抑制”一种或多种这些IL-17功能性质(例如，生物化学、免疫化学、细胞学、生理学或其他生物活性、或其他)的抗体应理解为与特定活性相比无抗体时(或存在不相关特异性的对照抗体时)统计学显著降低相关。抑制IL-17活性的抗体会造成IL-17功能活性统计学显著降低，例如按所测参数降低至少约10％，至少50％、80％活90％，在所揭示的方法和组合物的一些实施方式中，所用IL-17抗体可能抑制IL-17功能活性超过95％、98％或99％。
本文使用“抑制IL-6”表示IL-17抗体或其抗原结合片段(例如苏金单抗)降低原代人体皮肤纤维原细胞的IL-6产生的能力。原代人体(皮肤)纤维原细胞中的IL-6产生依赖于IL-17(Hwang等，(2004)Arthritis Res Ther；6:R120-128)。简言之，在不同浓度的IL-17结合分子或具有Fc部的人体IL-17受体的存在下，重组IL-17刺激人体皮肤纤维原细胞。嵌合型抗-CD25抗体
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(巴利昔单抗)可方便地用作阴性对照。刺激16小时之后取上清液并通过ELISA检测IL-6。IL-17抗体或其抗原结合片段例如苏金单抗抑制IL-6产生(存在1nM人类IL-17时)的IC50通常约等于或小于50nM(例如从约0.01至约50nM)，如上测试，即在人体皮肤纤维原细胞中通过人-IL-17诱导的IL-6产生来测定所述抑制活性。在所揭示的方法和组合物的一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段例如苏金单抗及其功能衍生物的如上所述的抑制IL-6产生的IC50约等于或小于20nM，更优选约等于或小于10nM，更优选约等于或小于5nM，更优选约等于或小于2nM，更优选约等于或小于1nM。
术语“衍生物”(除非另外指明)用于定义本发明所述IL-17抗体或其抗原结合片段例如苏金单抗的氨基酸序列变体和共价改性物，例如具有指定序列的(例如可变区)。“功能衍生物”包括具有所揭示的IL-17抗体共有的定性生物活性的分子。功能衍生物包括如本文所揭示的IL-17抗体的片段和肽类似物。片段包含位于本发明所述多肽序列内的区段，例如具有指定序列的。本文所揭示的IL-17抗体的功能衍生物(例如苏金单抗的功能衍生物)优选所含VH和/或VL区与本文所揭示的IL-17抗体及其抗原结合片段的VH和/或VL序列(例如表1的VH和/或VL序列)具有至少约65％、75％、85％、95％、96％、97％、98％、或99％的的整体序列同一性，并基本保持结合人类IL-17或例如抑制IL-17诱导的人体皮肤纤维原细胞的IL-6产生的能力。
“基本相同”表示相关的氨基酸或核苷序列(例如VH或VL区)与特定参比序列相同或具有不明显的差异(例如通过保守性氨基酸取代基)。不明显的差异包括较小的氨基酸改变，例如在指定区(例如VH或VL区)的5个氨基酸序列中的1或2个取代基。在抗体的情况中，第二个抗体与相应抗体具有相同的特异性，并具有其亲和性的至少50％。与本文所揭示的序列基本相同(例如至少约85％的序列同一性)的序列也属于本申请的一部分。在一些实施方式中，相对于所揭示的序列，衍生IL-17抗体(例如苏金单抗的衍生物，例如苏金单抗生物类似抗体)的序列同一性可约等于或大于90％，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
在本文中将相对于原生多肽及其功能衍生物的“同一性”定义为在对齐序列并在需要时引入空位以实现最大的同一百分比，并不考虑任何保守性取代作为序列同一性一部分的任意保守性取代之后，候选序列中与相应原生多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。N-或C-端延伸部分和插入部分都不视为降低同一性。用于比对的方法和计算机程序是众所周知的。同一性百分比可通过标准比对算法确定，例如，Altshul等描述的基本局部比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST)((1990)J.Mol.Biol.，215:403-410)；Needleman等的算法((1970)J.Mol.Biol.，48:444-453)；或Meyers等的算法((1988)Comput.Appl.Biosci.，4:11-17)。一组参数可以是空位罚分为12、空位延伸罚分为4、并且移码空位罚分为5的Blosum 62评分矩阵。两个氨基酸或核苷序列之间的同一性百分比也可采用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，4:11-17)的算法确定，其已纳入ALIGN程序(2.0版)，采用PAM120权重残基表、空位长度罚分位12且空位罚分为4。
“氨基酸”是指(例如)所有自然产生的L-α-氨基酸，并包括D-氨基酸。“氨基酸序列变体”是指与本发明所述序列相比在其氨基酸序列中具有一些差异的分子。本发明所述抗体的氨基酸序列变体，例如具有指定序列的，仍具有结合人类IL-17、或例如抑制IL-17诱导的人体皮肤纤维原细胞的IL-6产生的能力。氨基酸序列变体包括取代变体(在本发明所述多肽中有至少一个氨基酸残基被除去并在相同位置处插入另一氨基酸的情况)，插入变体(在本发明所述多肽中在特定位置处紧邻某氨基酸插入一个或多个氨基酸的情况)，和删除变体(在本发明所述多肽中除去一个或多个氨基酸的情况)。
可互换的“游离半胱氨酸”、“非传统半胱氨酸”和“不成对半胱氨酸”是指不参与保守性抗体二硫键的半胱氨酸。游离半胱氨酸可存在于抗体骨架区或可变区中(例如在CDR之内)。在苏金单抗中，SEQ ID NO:6所示L-CDR3的氨基酸8对应于SEQ ID NO:10所示轻链可变区的氨基酸97(以下称为CysL97)，其为游离半胱氨酸。苏金单抗的各分子包含两个这样的游离半胱氨酸残基——各VL区中有一个。本发明工艺能选择性地还原苏金单抗中的这两个游离半胱氨酸残基。在一些实施方式中，例如由于所揭示的IL-17抗体或其抗原结合片段的轻链中存在删除和/或取代，在CysL97位置处将不会有游离半胱氨酸存在。在这样的情况中，相应的游离半胱氨酸是该选择性还原反应的目标并包括在术语“CysL97”之内。
IL-17抗体及其抗原结合片段
本发明各工艺与某些IL-17抗体或其抗原结合片段(例如苏金单抗)的选择性还原相关。在一种实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含至少一个免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:2，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:3。在一种实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含至少一个免疫球蛋白轻链可变区(VL′)，其包含高变区CDR1′、CDR2′和CDR3′，所述CDR1′具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，所述CDR2′具有氨基酸序列SEQ ID NO:5，所述CDR3′具有氨基酸序列SEQ ID NO:6。在一种实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含至少一个免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含高变区CDR1-x、CDR2-x和CDR3-x，所述CDR1-x具有氨基酸序列SEQ ID NO:11，所述CDR2-x具有氨基酸序列SEQ IDNO:12，所述CDR3-x具有氨基酸序列SEQ ID NO:13。
在一种实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含至少一个免疫球蛋白VH区和至少一个免疫球蛋白VL区，其中：a)该VH区包含(例如按序列)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:2，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:3；或ii)高变区CDR1-x、CDR2-x和CDR3-x，所述CDR1-x具有氨基酸序列SEQ ID NO:11，所述CDR2-x具有氨基酸序列SEQ ID NO:12，所述CDR3-x具有氨基酸序列SEQ ID NO:13；和b)该VL区包含(例如按序列)高变区CDR1′、CDR2′和CDR3′，所述CDR1′具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，所述CDR2′具有氨基酸序列SEQ ID NO:5，所述CDR3′具有氨基酸序列SEQ ID NO:6。
在一种实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含：a)免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；b)免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；c)免疫球蛋白VH区，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，和免疫球蛋白VL区，其包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；d)免疫球蛋白VH区，其包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、和SEQ ID NO:3所示的高变区；e)免疫球蛋白VL区，其包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:6所示的高变区；f)免疫球蛋白VH区，其包含如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、和SEQ ID NO:13所示的高变区；g)免疫球蛋白VH区，其包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、和SEQ ID NO:3所示的高变区，和免疫球蛋白VL区，其包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:6所示的高变区；或h)免疫球蛋白VH区，其包含如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、和SEQ ID NO:13所示的高变区，和免疫球蛋白VL区，其包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:6所示的高变区。
为便于参比，基于Kabat定义并通过X射线分析测定及采用Chothia及同事的方法，下表1中提供了苏金单抗单克隆抗体的高变区的氨基酸序列。
Figure GDA0002469027060000121
表1：苏金单抗单克隆抗体的高变区的氨基酸序列。
在一些优选的实施方式中，恒定区也优选包含合适的人类恒定区，例如如“有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”，KabatE.A.等，美国健康和人类服务部(US Department of Health and Human Services)，公众健康服务(Public Health Service)，国立卫生研究院(National Institute of Health)中所述。编码苏金单抗VL的DNA如SEQ ID NO:9中所示。编码苏金单抗VH的DNA如SEQ ID NO:7中所示。
在一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段(例如苏金单抗)包含SEQ IDNO:10中的三个CDR。在另一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:8中的三个CDR。在另一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10中的三个CDR和SEQ ID NO:8中的三个CDR。SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10中的CDR可在表1中找到。轻链中的游离半胱氨酸(CysL97)可在SEQ ID NO:6中看到。
在一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:14的轻链。在另一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:15的重链(具有或不具有C-端赖氨酸)。在另一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:14的轻链和SEQ ID NO:15的重链(具有或不具有C-端赖氨酸)。在一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:14中的三个CDR。在另一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:15中的三个CDR。在另一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:14中的三个CDR和SEQ ID NO:15中的三个CDR。SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:15中的CDR可在表1中找到。
高变区可与任意种类的骨架区相连，不过优选人类来源的。合适的骨架区如KabatE.A.等(同前)中所述。优选的重链骨架是人的重链骨架，例如苏金单抗抗体的。其序列组成有(例如)FR1(SEQ ID NO:8的氨基酸1至30)、FR2(SEQ ID NO:8的氨基酸36至49)、FR3(SEQID NO:8的氨基酸67至98)和FR4(SEQ ID NO:8的氨基酸117至127)区。考虑通过X射线分析确定的苏金单抗的高变区，另一种优选的重链骨架的序列组成有FR1-x(SEQ ID NO:8的氨基酸1至25)、FR2-x(SEQ ID NO:8的氨基酸36至49)、FR3-x(SEQ ID NO:8的氨基酸61至95)和FR4(SEQ ID NO:8的氨基酸119至127)区。类似的，轻链骨架的序列组成有FR1′(SEQ IDNO:10的氨基酸1至23)、FR2′(SEQ ID NO:10的氨基酸36至50)、FR3′(SEQ ID NO:10的氨基酸58至89)和FR4′(SEQ ID NO:10的氨基酸99至109)区。
在一种实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段(例如苏金单抗)选自人类IL-17抗体，其至少包含：a)包含可变区的免疫球蛋白重链或其片段，该可变区的序列组成有高变区CDR1、CDR2和CDR3以及人类重链的恒定部分或其片段；所述CDR1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和b)包含可变区的免疫球蛋白轻链或其片段，该可变区的序列组成有高变区CDR1′、CDR2′和CDR3′以及人类轻链的恒定部分或其片段，所述CDR1′具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，所述CDR2′具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述CDR3′具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一种实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段选自包含抗原结合位的单链抗体或其抗原结合片段，该抗原结合位包含：a)其序列包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一域，所述CDR1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和b)其序列包含高变区CDR1′、CDR2′和CDR3′的第二域，所述CDR1′具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，所述CDR2′具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述CDR3′具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；和c)连至第一域的N-端末端并连至第二域的C-端末端、或者连至第一域的C-端末端并连至第二域的N-端末端的肽连接子。
或者，本发明方法中所用的IL-17抗体或其抗原结合片段可包含如本文按序列所示的IL-17抗体的衍生物(例如苏金单抗的聚乙二醇化的形式)。或者，本发明方法中所用的IL-17抗体或其抗原结合片段的VH或VL区具有的VH或VL区可与本文中所示的VH或VL区(例如在SEQ ID NO:8和10中所示的那些)基本相同。本发明的人类IL-17抗体包含的重链可与如SEQ ID NO:15所示的重链(具有或不具有C-端赖氨酸)基本相同和/或其轻链可与如SEQ IDNO:14所示的轻链基本相同。本发明的人类IL-17抗体可包含包含SEQ ID NO:15的重链(具有或不具有C-端赖氨酸)和包含SEQ ID NO:14的轻链。本发明的人类IL-17抗体可包含：a)重链，其包含具有与SEQ ID NO:8中所示基本相同的氨基酸序列的可变区和人类重链的恒定部分；和b)轻链，其包含具有与SEQ ID NO:10中所示基本相同的氨基酸序列的可变区和人类轻链的恒定部分。
或者，本发明方法中所用的IL-17抗体或其抗原结合片段可以是本文所示参比IL-17抗体的氨基酸序列变体，条件是其包含CysL97。本发明还包括其中苏金单抗的VH或VL区的一个或多个氨基酸残基(但并非CysL97)(通常仅少数残基(例如1-10个))发生改变的IL-17抗体或其抗原结合片段；例如通过突变而改变，例如相应DNA序列的定向点突变形成。在所有这些衍生物和变体的情况中，IL-17抗体或其抗原结合片段能在约等于或小于50nM、约等于或小于20nM、约等于或小于10nM、约等于或小于5nM、约等于或小于2nM、或更优选约等于或小于1nM的所述分子浓度下抑制约1nM(＝30ng/ml)人类IL-17活性的50％，所述抑制活性是如WO 2006/013107的实施例1中所述在人体皮肤纤维原细胞中通过人-IL-17诱导的IL-6产生而测定的。
在一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段，例如苏金单抗，结合至包含Leu74、Tyr85、His86、Met87、Asn88、Val124、Thr125、Pro126、Ile127、Val128、His129的成熟人类IL-17的表位。在一些实施方式中，IL-17抗体，例如苏金单抗，结合至包含Tyr43、Tyr44、Arg46、Ala79、Asp80的成熟人类IL-17的表位。在一些实施方式中，IL-17抗体，例如苏金单抗，结合至具有两个成熟人类IL-17链的IL-17同型二聚体的表位，所述表位在一个链上包含Leu74、Tyr85、His86、Met87、Asn88、Val124、Thr125、Pro126、Ile127、Val128、His129，并在另一个链上包含Tyr43、Tyr44、Arg46、Ala79、Asp80。用于定义这些表位的残基编号方案是基于以成熟蛋白质的第一个氨基酸作为残基1(即，缺少23氨基酸的N-端信号肽并以甘氨酸开始的IL-17A)。不成熟IL-17a的序列在Swiss-Prot收录号Q16552中示出。在一些实施方式中，IL-17抗体具有约为100-200pM的KD。在一些实施方式中，IL-17抗体对于体外中和约0.67nM人类IL-17A的生物活性具有约为0.4nM的IC50。在一些实施方式中，皮下(s.c.)给药IL-17抗体的绝对生物利用率在约60-约80％的范围内，例如约76％。在一些实施方式中，IL-17抗体，例如苏金单抗，具有约4周的消除半衰期(例如约23至约35天，约23至约30天，例如约30天)。在一些实施方式中，IL-17抗体(例如苏金单抗)具有约7-8天的T最大。
本发明方法所用的特别优选的IL-17抗体或其抗原结合片段是人类抗体，尤其是如WO 2006/013107的实施例1和2中所述的苏金单抗。苏金单抗是一种重组高亲和性完全人类单克隆抗人白介素-17A(IL-17A，IL-17)的IgG1/κ同种型抗体，目前在临床试验中用于治疗免疫介导的炎症。苏金单抗(参见例如WO2006/013107和WO2007/117749)对于IL-17具有非常高的亲和性，即，KD约为100-200pM，并且体外中和约0.67nM人类IL-17A的生物活性的IC50约为0.4nM。因此，苏金单抗以约1:1的摩尔比抑制抗原。这种高结合亲和性使得苏金单抗抗体特别适合治疗应用。而且，已确定苏金单抗具有非常长的半衰期，即约4周，这允许给药之间的周期延长，在治疗慢性终生病症例如类风湿关节炎时是一种优越的性质。
本发明公开在上述IL-17抗体及其抗原结合片段(例如苏金单抗)的制品中选择性还原CysL97的方法。本发明方法便于对抗体(例如IL-17抗体，例如苏金单抗)制品进行以降低成本。抗体的“制品”是指具有多个抗体分子的组合物(例如溶液)。“制品”包括包含IL-17抗体或其抗原结合片段的任何液体组合物。因此，制品可包含存在于水或缓冲液中、存在于柱洗脱液中、存在于渗析缓冲液中等等的例如IL-17抗体或其抗原结合片段例如苏金单抗。在一些实施方式中，抗体的初始制品包含存在于缓冲液(例如，Tris，例如1mM-1M Tris，pH6.0-8.0)或WFI中的IL-17抗体或其抗原结合片段例如苏金单抗的原液(pool)。在向抗体加入还原剂之前，可通过调节溶解氧含量、溶液pH、抗体浓度等来调节该制品。在一些实施方式中，在加入还原剂之前，将制品中的抗体(例如苏金单抗)浓度调节至约4mg/ml-约19.4mg/ml，例如约10mg/ml-约19.4mg/ml、约10mg/ml-约15.4mg/ml、约12mg/ml-约15mg/ml、或约13.5mg/ml。在一些实施方式中，在加入还原剂之前，将制品中的氧饱和百分比调节至至少约60％(使用在25℃校准的氧探针测定)，例如至少约80％。在一些实施方式中，在加入还原剂之前，将制品的pH调节至约7.3-约8.5，例如约7.8-约8.2，例如约7.9-约8.1，例如约8.0。还可在刚加入还原剂之后(或甚至在加入过程中)调节抗体浓度、pH和氧含量，从而应理解为等价的。
本发明方法中所用的IL-17抗体或其抗原结合片段的制品可以是通过任何哺乳动物细胞采用任何哺乳动物细胞系而重组产生的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤NS0细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、人胚胎肾细胞系HEK-293、人视网膜细胞系Per.C6(Crucell，NL)、HKB11细胞克隆(得自HEK 293S和Burkitt淋巴瘤系2B8的混合细胞融合)等。“通过哺乳动物细胞重组产生”是指已经采用重组DNA技术实现在哺乳动物细胞中产生抗体。接受选择性还原的IL-17抗体制品可以是通过离心(随后进行或不进行澄清)从哺乳动物细胞收获的抗体原液。或者，接受选择性还原的IL-17抗体制品可以是来自更下游的色谱步骤的抗体原液，例如，来自亲和层析柱(例如蛋白质A柱)、阳离子交换柱、阴离子交换柱等的洗脱液。或者，接受选择性还原的IL-17抗体制品可以是来自下游过滤步骤的抗体原液，例如深部过滤、纳米过滤、超滤等。或者，接受选择性还原的IL-17抗体制品可以是来自下游步骤的抗体原液，在该下游步骤中，已经对该原液进行了处理以除去宿主细胞蛋白质和/或以灭活病毒。在一种实施方式中，接受选择性还原的IL-17抗体制品是抗体的蛋白质A洗脱原液。
根据所选的工艺条件，例如温度、反应时间长度、pH等，原始制品中的抗体浓度有所变化。在一些实施方式中，原始制品中所用的IL-17抗体的浓度为约2mg/ml至约20mg/ml、约3.8mg/ml至约19.5mg/ml、约4mg/ml至约19.5mg/ml、约10mg/ml至约19.4mg/ml，例如约10mg/ml至约15.4mg/ml，例如约12mg/ml至约15mg/ml，例如约13.5mg/ml的IL-17抗体或其抗原结合片段。在选择性还原之前，可按需要使用所选的注射用水(WFI)或缓冲剂来调节原始抗体制品中的抗体浓度。
本发明所述的选择性还原过程可在任意尺寸的容器中进行。在一些实施方式中，容器为实验室规模(例如1L-2L)。在另一些实施方式中，容器为中试规模(例如12L-20L)。在另一些实施方式中，容器为商业规模(例如大于10000L，例如14000L、15000L、16000L等)。
还原剂
还原剂是能在氧化还原反应中贡献电子的物质。具体来说，这种试剂可用于传递氢至存在于IL-17抗体或其抗原结合片段(例如苏金单抗抗体)中的被掩蔽(或被封闭)的半胱氨酸。本发明方法使用还原剂来选择性还原IL-17抗体。本文所称的各还原剂包括其衍生物(例如盐、酯和酰胺)。因此，例如称“半胱氨酸”包括半胱氨酸和半胱氨酸-HCl，称“TCEP”包括TCEP和TCEP-HCl，称硫代乙醇酸包括硫代乙醇酸钠等。用于本发明方法中的还原剂包括硫酸氢钠、氨、三乙基硅烷、甘氨酰(glycycl)半胱氨酸、氰基硼氢化钠、硫代乙醇酸铵、硫代乙醇酸钙、硫代乙醇酸钠、抗坏血酸、对苯二酚、氨基甲磺酸、磺基丙氨酸、半胱氨酸亚磺酸、乙二磺酸、乙磺酸、高牛磺酸、亚牛磺酸、羟基乙磺酸、巯基乙磺酸、N-甲基牛磺酸(MTAU)、TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)、N-N-二甲基-N-N二(巯基乙酰基)肼(DMH)、二硫代苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(β-巯基乙醇)、2-巯基乙酸(硫代乙醇酸，TGA)、半胱氨酸(L-半胱氨酸)、半胱胺(β-巯基乙胺，或MEA)、谷胱甘肽，及其组合。在一些实施方式中，用于本发明方法中的还原剂是含硫醇的还原剂(即，具有R-SH基团的化合物)，例如有机硫化合物。在一些实施方式中，用于本发明方法中的还原剂是，例如二硫代苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、2-巯基乙酸、半胱氨酸、半胱胺、谷胱甘肽和组合。
还原剂的强度通过其氧化还原电势E0指示，其以伏特(V)给出，通常在pH 7、25℃下测定。例如，CSH/CSSC的标准氧化还原电势E0为约-0.20V至约-0.23V(pH 7，25℃)(P.C.Jocelyn(1967(Eu.J.Biochem 2:327-31)；Liu《硫在蛋白质中的作用(The role ofSulfur in Proteins)》，The Proteins，第三版(Neurath编辑)，250-252，学院出版社(Academic Press)1977)。DTT的标准氧化还原电势E0为约-0.33V(pH 7，25℃)(M.J.O′Neil编辑，2001，Merck索引:化学、药物和生物学百科全书(Merck Index：an encyclopedia ofchemicals，drugs，biologicals)，第13版，美国MERCK出版公司；Liu同上)。谷胱甘肽的标准氧化还原电势E0为约-0.24V或约-0.26V(pH 7，25℃)(Rost和Rapoport(1964)Nature 201:185；Gilbert(1990)Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.63:69-172；Giles(2002)Gen.Physiol Biophys 21:65-72；Liu同上)。2-巯基乙醇的标准氧化还原电势E0为约-0.26V(Lee和Whitesides(1990)J.Org.Chem 58:642-647)。在一些实施方式中，还原剂的标准氧化还原电势E0类似于半胱氨酸(例如，约-0.20V至约-0.23V，约-0.20V至约-0.22V，约-0.20V至约-0.21V，约-0.21V至约-0.23V，约-0.21V至-0.22V，约-0.22V至约-0.23V，约-0.20V，约-0.21V，约-0.22V，约-0.23V)。
含硫醇的化合物的标准氧化还原电势E0可通过热分析、还原NAD+、极谱法、与Fe++反应、或硫醇-二硫化物交换研究测定(Jocelyn，同上；Borsook等(1937)J.Biol.Chem 117:281；Ghosh等(1932)J.Indian Chem.Soc.9:43；Kolthoff等(1955)J.Am.Chem.Soc.77:4739；Tanaka等(1955)J.Am.Chem.Soc.77:2004；Kolthoff等(1955)J.Am.Chem.Soc.77:4733；Eldjarn(1957)J.Am.Chem.Soc.79:4589)。在一些实施方式中，标准氧化还原电势E0通过热分析、极谱法、与Fe++反应、或硫醇-二硫化物交换研究测定，例如优选通过硫醇-二硫化物交换研究。在一些实施方式中，标准氧化还原电石E0在pH 7、25℃下测定。
当还原剂与抗体制品组合时，形成“还原混合物”。该还原混合物除了还原剂和IL-17抗体以外还可包含辅料。例如，在一些实施方式中，可与还原剂一起或相继地向还原混合物添加少量摩尔比的还原剂氧化形式(例如胱氨酸、胱胺)，例如在开始孵育10-30分钟或更长时间之后。例如，若还原剂是半胱氨酸，则可向还原混合物添加少量胱氨酸，例如与半胱氨酸同时，或在半胱氨酸与IL-17抗体或其抗原结合片段组合之后的15、20、30分钟时。因此，在一些实施方式中，还原混合物包含一组氧化/还原剂。“一组氧化/还原剂”是指氧化还原对氧化还原电对，即，出现在半方程式对侧的氧化和还原剂(例如，还原物质及其相应的氧化形式，例如，Fe2+/Fe3+、半胱氨酸/胱氨酸、半胱胺/胱胺)。
根据反应条件(温度、反应时间长度、IL-17抗体或其抗原结合片段的量、pH等)，特定还原混合物和选择性还原反应中所用的还原剂的浓度有所变化。在一些实施方式中，还原混合物中所用的还原剂的量为约1至约20mM。在一些实施方式中，还原混合物中所用的还原剂的浓度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16mM。在一种实施方式中，还原剂(例如半胱氨酸)的量为约4mM至约8mM，例如5.9mM、6mM、7.7mM、7.9mM、8mM。
在一种实施方式中，还原剂是β-巯基乙醇。在一些实施方式中，β-巯基乙醇的使用浓度为约2.0mM至约8.0mM。
在一种实施方式中，还原剂是谷胱甘肽。在一些实施方式中，谷胱甘肽的使用浓度为约2.0mM至约5.0mM。
在一种实施方式中，还原剂是半胱胺。在一些实施方式中，半胱胺的使用浓度为约1.0mM至20mM、约4.0mM至约19mM、约2.0mM至约8.0mM、约4.0mM至约8.0mM、约4.8mM至约8.0mM、约5.5mM至约6.7mM、或约6.0mM。
在一种实施方式中，还原剂是半胱氨酸。在一些实施方式中，还原混合物中的半胱氨酸浓度为约1.0mM至20mM、约4.0mM至约19mM、约2.0mM至约8.0mM、约4.0mM至约8.0mM、约4.8mM至约8.0mM、约5.5mM至约6.7mM、或约6.0mM。可使用例如120mM半胱氨酸-HCl储备液来调节半胱氨酸浓度。
各IL-17抗体具有两个需要进行选择性还原的CysL97残基。因此所用还原剂的量应足以选择性还原抗体制品中相当大部分的IL-17抗体上的两个CysL97残基，而不伴随不可逆地还原常规的二硫键造成的过度还原抗体。根据反应条件(氧化剂的存在、温度、反应时间长度、pH等)，特定还原混合物和选择性还原反应中所用的还原剂:IL-17抗体的摩尔比将变化。发明人发现，还原剂(例如半胱氨酸):抗体(例如苏金单抗)的摩尔比可在约11:1(实施例5.2)至高达约546:1(实施例6.2)的范围内。在本发明方法的一些实施方式中，还原剂(例如半胱氨酸):抗体(例如苏金单抗)的摩尔比为约11:1至约462:1(例如约21:1)、约31:1至约545:1(例如约31:1至约156:1)、约21:1至约296:1、或约46:1至约91:1。在另一些实施方式中，还原剂(例如半胱氨酸):抗体(例如苏金单抗)的摩尔比为约23:1至约91:1(例如约21:1至约57:1)、约44:1至约275:1(例如约44:1)、约44:1至约66:1(例如约44:1至约66:1)，优选为约46:1至约118:1(例如约56:1至约118:1)，更优选为约54:1至约82:1。在一种实施方式中，还原剂(例如半胱氨酸):抗体(例如苏金单抗)的摩尔比为约66:1。
若使用较高的还原剂(例如半胱氨酸):抗体(例如苏金单抗)的摩尔比(表现为还原剂相对于抗体过量)，则可加入少量的相应氧化剂(例如胱氨酸或胱胺)来减轻还原剂(例如半胱氨酸或半胱胺)的还原力量。这在厌氧环境中特别有益。因此，在一些实施方式中，使用一组氧化/还原剂(例如在有氧或厌氧环境中，优选厌氧环境)进行选择性还原。在一些实施方式中，在还原混合物中进行的选择性还原使用如下的还原剂(例如半胱氨酸):氧化剂(例如胱氨酸)的摩尔比：约2:1至约80:1、约4:1至约80:1、约26:1至约80:1、约2:1至约10:1(例如约6:1至约10:1)、约4:1至约28:1(约4:1至约18:1)、约27:1至约53:1(例如约27:1)。在一些实施方式中，在还原混合物中使用半胱氨酸联合氧化剂胱氨酸或胱胺(优选胱氨酸)。在一些实施方式中，在一定条件下在还原混合物中使用约4mM-14mM半胱氨酸(例如约7.7mM至约8.0mM半胱氨酸)和约0.1至约1mM胱氨酸(例如约0.1至约0.3mM胱氨酸)进行选择性还原。在一些实施方式中，还原混合物包含约8.0mM半胱氨酸和约0.1mM胱氨酸、约7.9mM半胱氨酸和约0.1mM胱氨酸、或约7.7mM半胱氨酸和约0.3mM胱氨酸。应理解，若在本发明方法中使用氧化剂例如胱氨酸联合还原剂例如半胱氨酸，则可在将还原剂例如半胱氨酸与IL-17抗体或其抗原结合片段组合之后的时间点添加氧化剂例如胱氨酸。例如，IL-17抗体或其抗原结合片段可与半胱氨酸组合以形成还原混合物，然后孵育例如15-30分钟，然后可向反应中添加胱氨酸。
溶解氧
如本文所用，“溶解氧”、“dO2”和“DO”是指给定介质中溶解或携带的氧量。其可在液体介质中用氧探针测定，例如氧传感器或光纤化学传感器。DO报告为浓度(毫克每升(mg/L))或作为“饱和百分比”。毫克每升是一升溶剂中的氧量，也等同于百万分率＝ppm。氧饱和百分比是溶液中的氧量相对于特定温度下该溶液能容纳的总氧量。
如本文所用，“初始氧饱和百分比”表示IL-17抗体(例如苏金单抗)制品中在使该制品与还原剂在容器中接触以形成还原混合物之前的溶解氧量。初始氧饱和百分比可被直接(例如通过鼓泡)或间接(例如通过搅拌)调节以实现所需的氧含量，再开始选择性还原过程。例如，在一些实施方式中，将IL-17抗体制品中的初始氧饱和百分比调节到至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至高达100％，再接触还原剂。可以这样做以使还原剂刚加到IL-17抗体制品中以形成还原混合物在初始时减轻该还原剂的力，从而避免部分或完全地还原该抗体的常规二硫键，以至于导致损失活性和纯度。在一些优选的实施方式中，将IL-17抗体制品中的初始氧饱和百分比调节至至少60％(使用在25℃校准的氧探针测定)。在一些优选的实施方式中，将IL-17抗体制品中的初始氧饱和百分比调节至至少80％(使用在25℃校准的氧探针测定)。
发明人确定，在半胱氨酸处理步骤过程中的高氧含量会对抗体活性产生有害影响，可能是因为氧消除了半胱氨酸的还原力，导致苏金单抗的C97还原不充分。通过改变还原剂的量、改变还原剂:抗体的摩尔比、使用限定的搅拌速度或甚至采用搅拌中断，可以对这种从大气摄氧的问题进行管控，当以生产规模工作时尤其如此。应理解，较高的还原剂(例如半胱氨酸)量能处置还原混合物中较高的氧含量。在一些实施方式中，在选择性还原过程的孵育步骤中，还原混合物中的氧饱和一般保持在低百分比(例如，小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％)。
还原剂(例如半胱氨酸)还原力的损失可能导致在孵育步骤过程中CysL97-SH于较早时间点不完全解封闭，并且若在孵育步骤的较后部分(或在冷却步骤过程中)没有残余还原剂(例如半胱氨酸)可用于保护解封闭的Cys97L，则解封闭的Cys97L-SH可能发生再氧化。因此，理想上将低的氧饱和百分比保持至少约60分钟至约330分钟，例如至少约60分钟、至少约90分钟、至少约120分钟、至少约150分钟、至少约180分钟、至少约210分钟、至少约240分钟、至少约270分钟、至少约300分钟、或至少约330分钟。在一些实施方式中，这种低的氧饱和百分比将保持整个孵育步骤，以及部分冷却步骤。
氧饱和百分比可被直接(例如通过鼓泡)或间接(例如通过搅拌)调节，从而在还原混合物的孵育过程中实现所需的氧含量。在有氧环境中，可通过使用间歇(而非连续)混合还原溶液，例如小于15分钟/小时，例如小于2分钟/小时，或通过使用低转速的连续搅拌，来实现低的氧饱和百分比。在厌氧环境中，不存在或几乎不存在会导致消耗还原剂的氧。
体积氧传质(kLa*)
在有氧条件下进行选择性还原时，不直接控制反应中的氧含量，而是经由其他工艺参数例如搅拌速度来控制。各反应的物理设定也会影响反应混合物中存在的氧含量。因此，重要的是识别如下变量：其可用于比较经物理设定之间和在特定抗体加工步骤过程中传递到溶液中的氧——该变量为“kLa*”(参见例如，Garcia-0choa和Gomez(2009)Biotechnology Advances 27:153-176；Bandino等(2001)Biochem.Engineering J.8:111-119；Juarez和Orejas(2001)Latin Am.Appl.Res.31:433-439；Yange和Wang(1992)Biotechnol.Prog.8:244-61)。kLa*表示经由顶部空间在不鼓泡条件下随时间传递到溶液中的氧量。这个值对于各设定和规模而言是特定的，并取决于搅拌器种类、搅拌器速度、填充体积、以及溶液与顶部空间接触的表面积，其受到各容器的独立几何形状的影响。虽然各物理设定的kLa*不同，但由于选择性还原工艺过程中溶液中的氧含量影响苏金单抗的活性和完整性，所以发明人预计，在显示类似kLa*范围的系统中进行的选择性还原过程将导致具有类似性质的苏金单抗制品。
如本文所用术语“系统”同时包括影响氧经由顶部空间在不鼓泡条件下随时间传递到溶液中的物理设定(容器、搅拌种类等)和工艺条件(填充体积、转速等)，即，规模、搅拌器速度、填充体积、溶液与顶部空间接触的表面积，其受各容器的独立几何形状影响。
如本文所用术语“容器”是指其中发生选择性还原反应的任何容器。容器包括但并不限于用于中试和商业规模抗体生产的生物反应器(例如钢质、搅拌罐、一次性或非一次性的、等等)，以及普通实验室容器，例如烧瓶、试管等。在一些实施方式中，容器为能容纳至少约2升、至少约100升、至少约500升、至少约1000升、至少约2000升、至少约5000升、至少约10000升、至少约15000升或更大的体积的生物反应器。
kLa*无法在氧传递实验中直接测定。而是用氮替换测试溶液中的dO2并使用经校准的dO2探针来监测dO2随时间的增加，从而产生实验dO2曲线。然后，通过根据下示等式将饱和曲线匹配至实验dO2曲线(例如使用
Figure GDA0002469027060000221
)，计算对于特定系统的本文所用的kLa*值:
DO＝C×(1-e-kLa*×(t-t0))，
其中DO＝溶解氧测得值，C为氧饱和值(表示当无限搅拌并实现饱和时为100％)，欧拉数e＝2.718281…，t＝对应于DO值的时间点，t0＝开始时间点。
该等式代表为测定氧传递到溶液中(kLa*值)而建立经验式的积分形式。该经验式已由不同作者在各种实验中验证(Doran，P.M.1995.生物过程工程原理(BioprocessEngineering Principles)，学院出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚(California))。
发明人确定，相较于孵育步骤，选择性还原过程的加热和冷却步骤一般更容忍较高的kLa*。这是因为孵育步骤过程中的高氧含量会对抗体活性产生有害影响，这可能是由于增加的氧传递消除了还原剂(例如半胱氨酸)的还原力，导致苏金单抗的C97还原不充分。在有氧环境中，在选择性还原工艺过程中增加还原混合物中的搅拌速度(或搅拌时间)导致kLa*增大。在加热和冷却步骤中能容忍连续搅拌还原混合物，这导致较高的kLa*值。在一些实施方式中，加热和冷却步骤过程中的kLa*可(分别)为约0.12h-1至约1.69h-1、约0.08h-1至约0.69h-1、约0.24h-1至约0.44h-1、约0.39h-1至约0.69h-1。在一些实施方式中，在加热或冷却步骤过程中系统内的kLa*为小于等于约0.69h-1，所述kLa*通过将饱和曲线匹配至溶解氧曲线而算得。
优选在孵育步骤过程中采用例如以低转速连续搅拌、或优选间歇搅拌来保持kLa*较低。在一些实施方式中，还原混合物孵育时保持系统中的体积氧传质系数(kLa*)为小于等于约0.37h-1、小于等于约0.27h-1、或小于等于约0.18h-1，所述kLa*通过将饱和曲线匹配至溶解氧曲线而算得。若在选择性还原反应的孵育步骤过程中系统中的kLa*小于0.37h-1，则还原剂(例如半胱氨酸):抗体的摩尔比可为46.11:1(约46:1)至118.36:1(约118:1)(同时对于较短和较长的孵育时间，例如约210至约330分钟)。若还原剂(例如半胱氨酸):蛋白质的摩尔比为69.89:1(约70:1)至118.36:1(约118:1)(对于较短的孵育时间，例如最长至约240分钟孵育)或76.85(约77:1)至118.36:1(约118:1)(对于较长的孵育时间，例如最长至约300分钟孵育)，则在选择性还原反应的孵育步骤过程中系统中的kLa*可高达小于等于0.37h-1。
若还原剂(例如半胱氨酸):抗体的摩尔比为约46:1-约118:1，则整个选择性还原过程(即，加热步骤、孵育步骤和冷却步骤)一般可使用小于0.37h-1的kLa*进行，其包括约210-约330分钟孵育时间(例如约240分钟-300分钟孵育时间)。若还原剂(例如半胱氨酸):抗体的摩尔比为约70:1-约118:1，且孵育最长为约240分钟；或若还原剂(例如半胱氨酸):抗体的摩尔比为约77:1-约118:1，且孵育最长为约300分钟，则整个选择性还原过程(即，加热步骤、孵育步骤和冷却步骤)一般可使用小于等于0.37h-1的kLa*进行。
其他工艺组分
本发明提供了选择性还原某些IL-17抗体例如苏金单抗中的CysL97的方法，其包括使该抗体与还原剂接触以形成还原混合物。应理解，还原混合物可包含除了IL-17抗体或其抗原结合片段和还原剂以外的组分。还原混合物可包含水性组分(例如缓冲剂，例如Tris缓冲剂)，以及用于增大或减小还原混合物的pH的试剂，盐，EDTA，等等。因此，虽然还原混合物必须包含IL-17抗体(例如苏金单抗)和还原剂，该还原混合物可包含或可不包含额外的组分。在一些实施方式中，还原混合物包含金属螯合剂(例如，EDTA、DMSA、DMPS)。在一些实施方式中，还原混合物包含1.3mM至约0.8mM、约1.1至约0.9mM、或约1.0mM EDTA(例如二-Na-EDTA)。
根据反应条件(温度、反应时间长度、IL-17抗体的性质、还原剂的浓度、还原剂:抗体的比例等)，特定抗体制品的pH可有不同。但是，发明人认识到，根据本文所述的反应条件，这些条件可进行变化以实现所需的选择性还原。在一些实施方式中，在与还原剂接触之前的抗体制品pH将为约6.5至约9.5，例如约7至约9。在另一些实施方式中，抗体制品的pH将为约7.4至约8.5、约7.8至约8.2、约7.9至约8.1或约8.0。在一些实施方式中，抗体制品的pH可使用缓冲剂进行调节(例如在通气以调节初始氧饱和百分比之后)，该缓冲剂为例如1MTris缓冲剂(例如1M Tris缓冲剂pH 10.8)。
包含IL-17抗体或其抗原结合片段(例如苏金单抗)的制品与还原剂接触之后，完整IL-17抗体或其抗原结合片段的含量可能有初始降低(HLLH)。术语“完整”是指具有全部保守性二硫桥的抗体(例如，在经典IgG1抗体的情况中，14个保守性二硫桥)。可使用本领域中已知的不同分析工具(例如SDS-PAGE、阳离子交换HPLC)来测定不同IL-17抗体片段即H2L、HL2、HL、H和L带以及完整H2L2(HHLL)带的形成。优选通过十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS0测定该混合物中完整IL-17抗体或抗原结合片段的含量。CE-SDS根据蛋白质分子尺寸在电场中将其分离。可使用非还原性CE-SDS来评价抗体制品中的尺寸变体。在一些实施方式中，通过CE-SDS测得，在向抗体制品中添加还原剂约1-30分钟(例如约15分钟)之内，混合物中完整IL-17抗体或其抗原结合片段的含量降低至至少约80％。在一些实施方式中，通过CE-SDS测得，混合物中完整IL-17抗体或其抗原结合片段的含量降低至至少约83％。在一些实施方式中，混合物中的完整IL-17抗体或其抗原结合片段的含量降低至约75％至约87％。在一些实施方式中，通过CE-SDS测得，混合物中的完整IL-17抗体或其抗原结合片段的含量降低至至少约38、39、40、41、45、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86或87％。
可使用贝克曼库尔特(Beckman Coulter)PA-800毛细管电泳系统进行CE-SDS。分析使用无涂层熔凝氧化硅毛细管，其内径为50μm且长度为30cm(对于还原性CE-SDS和非还原性CE-SDS分析分离范围分别为20cm和10cm)。使用UV检测器在214nm处监测该分离。对于非还原性CE-SDS分析，用水将抗体样品稀释至6.0mg/mL，与非还原性CE-SDS样品缓冲液(0.1M Tris/1.0％SDS，pH 7.0)和250mM碘乙酰胺充分混合，比例为20/75/5(v/v/v)，在70℃加热10分钟以防止二硫桥改排。分离的毛细管温度设定在25℃。在正常极性模式中以恒定的15kV电压进行20分钟电泳。
在一些实施方式中，将还原混合物加热。在一些实施方式中，在孵育步骤之前进行加热。在一些实施方式中，还原混合物被加热到约32℃至约42℃、约35℃至约39℃、至约37℃的温度。在一些实施方式中，加热进行约30至约120分钟，约45至约90分钟，约45至约75分钟，约60分钟。在加热过程中，可搅拌还原混合物，例如连续或间歇搅拌，搅拌可使用任何方式。搅拌可以是轴向的(例如使用倾斜的刀片叶轮)或辐向的(例如使用rushton涡轮)。在一些实施方式中，在加热过程中，以65-200rpm(例如，50rpm、65rpm、75rpm、85rpm、100rpm或200rpm)恒定搅拌还原混合物。
在孵育步骤过程中，通常将还原混合物孵育预定时间来选择性还原游离半胱氨酸(例如苏金单抗的游离半胱氨酸)。在一些实施方式中，在加热还原混合物之后进行孵育。根据反应条件(还原剂、温度、IL-17抗体或其抗原结合片段的量、pH等)，还原混合物的孵育预定时间有所变化。在一些实施方式中，该时间为约1至24小时(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、16、18、20或24小时)。在一些实施方式中，孵育进行约200至约500分钟，约210至约420分钟，约210至约330分钟，约240至约300分钟，约250分钟。
在孵育步骤过程中，在预定温度下进行孵育来选择性还原目标游离半胱氨酸(例如苏金单抗的抗原结合位中的CysL97)。根据反应条件(还原剂、时间、IL-17抗体或其抗原结合片段的量、pH等)，孵育温度有所变化。在一些实施方式中，预定温度为约20至约42℃。在一些实施方式中，预定温度为约32℃-约42℃、约35℃-39℃、或约37℃。
在孵育步骤过程中，在还原剂与IL-17抗体制品例如苏金单抗孵育的同时，可搅拌还原混合物以确保产物同质性。但是，在选择性还原反应过程的这一部分，容器中的氧含量应保持较低，从而允许还原剂有效地选择性还原IL-17抗体中的CysL97。在有氧条件下，可通过避免连续搅拌来实现低氧，例如通过使用间歇搅拌，例如小于等于15分钟/小时，例如小于等于2分钟/小时。在厌氧条件下，氧传递受到限制，因此搅拌可进行较长时间周期或可连续进行。而且，在厌氧条件下，严格控制氧传递(例如通过调控鼓泡)也允许施行较长的搅拌时间周期(包括连续搅拌)。
在一些实施方式中，在孵育步骤之后冷却混合物。在一些实施方式中，将混合物冷却至室温(例如约16℃至约28℃的温度)。在一些实施方式中，冷却约30至约120分钟，约45至约90分钟，约45至约75分钟，约60分钟。在冷却过程中，可搅拌还原混合物，例如使用任何搅拌方式连续或间歇进行。搅拌可以是轴向的(例如使用倾斜的刀片叶轮)或辐向的(例如使用rushton涡轮)。在一些实施方式中，在冷却过程中，以65-200rpm(例如50rpm、65rpm、75rpm、85rpm、100rpm或200rpm)恒定搅拌还原混合物。
例如可使用碘乙酰胺或正磷酸(例如使用0.3M正磷酸储备溶液)终止选择性还原反应。在一些实施方式中，在冷却步骤之后进行终止。在一些实施方式中，通过将混合物的pH调节到约5.0至约5.5、约5.1到约5.3、约5.2来终止选择性还原反应。可使用正磷酸来实现pH调节。
“经纯化制品”是指已经接受了选择性还原的IL-17抗体或其抗原结合片段的混合物。选择性还原完成之后，经纯化制品中的完整IL-17抗体的含量将增大。可经由各种众所周知的技术(例如，非还原性SDS PAGE、CE-SDS PAGE、尺寸排除色谱(SEC)、HPLC)来测定选择性还原之后经纯化制品中的完整抗体含量。在一些实施方式中，通过CE-SDS来测定完整抗体的含量。在一些实施方式中，选择性还原完成之后(例如冷却步骤之后)，通过CE-SDS测得，经纯化制品中的完整IL-17抗体或其抗原结合片段的含量为至少约80％。在一些实施方式中，通过CE-SDS测得，在选择性还原之后，经纯化制品中的完整IL-17抗体或其抗原结合片段的含量为至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或约100％。在一些实施方式中，通过CE-SDS测得，在选择性还原之后，经纯化制品中的完整IL-17抗体或其抗原结合片段的含量为至少90％。
可经由各种众所周知的技术测定制品中在选择性还原之前、在选择性还原过程中或在选择性还原之后(即在经纯化制品中)的抗体活性(例如亲和性、生物活性等)(参见例如WO2006/013107；WO2007/117749；Shen和Gaffen(2008)Cytokine.41(2):92-104)。在一些实施方式中，使用基于ELISA的检测或基于细胞的检测来测定活性(例如，对来自例如C-20/A4软骨细胞或BJ细胞系的GROα或IL-6的IL-17依赖性释放的抑制)。在一些实施方式中，通过胱胺-CEX(阳离子交换色谱)方法测定活性。胱胺-CEX方法包括用胱胺(2,2′-二硫代二(乙胺))对抗体衍生化，然后使用阳离子交换色谱(CEX)进行分析分离。因为若CysL97为氧化形式则本发明抗体(例如苏金单抗)的活性降低，所以用胱胺对CysL97进行衍生化起到了测定抗体活性的代理作用，即，若选择性还原成功，则胱胺可以对被还原的CysL97进行衍生化，而若选择性还原失败，则胱胺无法使氧化态CysL97衍生化。通过胱胺进行衍生化导致每个游离Cys97残基增加一个正电荷。然后可以将所得苏金单抗衍生化形式(例如+2、+1电荷)与未衍生化形式相分离，并通过CEX定量。在理论上可以认为，在两个轻链上都具有两个与不成对Cys97结合的胱胺的胱胺衍生化苏金单抗分子具有100％生物活性。可以认为，在一个轻链上加有一个与不成对Cys97结合的胱胺的胱胺衍生化苏金单抗分子具有50％生物活性。分子上没有结合任何胱胺的胱胺衍生化苏金单抗分子可视为生物惰性。然后可使用抗体制品(例如苏金单抗抗体制品)中的胱胺衍生化含量相对于该制品中的胱胺衍生化理论最大含量的比值(例如以理论最大值的百分比表示)来测定该制品的活性。
简单来说可如下进行胱胺-CEX。首先用羧肽酶B(1:40，w:w)处理抗体样品(50μg)以除去重链中的C-端赖氨酸，然后用4mM胱胺在5mM乙酸钠、0.5mM EDTA中于pH 4.7和室温条件下进行2小时衍生化。通过加入2μL的1M磷酸停止衍生化。使用ProPacTM WCX-10分析柱(4mm×250mm，Dionex)对胱胺衍生化抗体样品进行CEX。使用25mM磷酸钠中12.5mM至92.5mM的氯化钠梯度在pH 6.0条件下以1.0ml/分钟的速率进行分离。用UV检测器(安捷伦(Agilent)HPLC1200)记录220nm处的吸收。
一些具有氧化态游离半胱氨酸的IL-17抗体原始制品具有低至45％的活性。在一些实施方式中，在开始选择性还原过程之前，制品中IL-17抗体或抗原结合片段的活性水平小于约80％，小于约75％，小于约70％，小于约65％，小于约60％，小于约55％，小于约50％，或小于约45％(例如通过胱胺-CEX方法测得)。在选择性还原过程中，纯化制品中的IL-17抗体活性水平将增大。在一些实施方式中，在使抗体制品与还原剂接触以形成还原混合物之后约60分钟内，抗体制品中的IL-17抗体或抗原结合片段的活性水平增大至少约15％(例如从约60％增至至少约75％)、至少约20％(例如从约60％增至至少约80％)、至少约25％(例如从约60％增至至少约85％)或至少约30％(例如从约60％增至至少约90％)(例如通过胱胺-CEX方法测定)。
选择性还原之后，经纯化制品中的具有CysL97还原形式的IL-17抗体得以富集，并表现出相对于原始制品增大的活性水平。在一些实施方式中，选择性还原完成之后，通过胱胺-CEX、ELISA或基于细胞的结合检测(例如胱胺-CEX检测)测得，经纯化制品中IL-17抗体或其抗原结合片段的活性水平为至少约80％(相对于理论最大值)。在一些实施方式中，选择性还原完成之后，通过CEX、ELISA或基于细胞的结合检测(例如胱胺-CEX检测)测得，经纯化制品中IL-17抗体或其抗原结合片段的活性水平为至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或约100％。在一些实施方式中，选择性还原完成之后，通过胱胺-CEX、ELISA、或基于细胞的结合检测(例如胱胺-CEX检测)测得，纯化制品中IL-17抗体或其抗原结合片段的活性水平为至少约93％。
因此，本发明揭示了选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的IL-17抗体制品中的CysL97的方法，其包括:
a)使该制品在某体系中接触至少一种还原剂以形成还原混合物；和
b)孵育该还原混合物同时保持该体系中的体积氧传质系数(kLa*)小于等于约0.37h-1，所述kLa*通过将饱和曲线匹配至溶解氧曲线而算得；
其中该IL-17抗体各自包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该VH包含如SEQ ID NO:8所示VH的三个互补决定区(CDR)，该VL包含如SEQ ID NO:10所示VL的三个CDR，而且其中在步骤a)之前，使用在25℃校准的氧探针测得，该制品中的初始氧饱和百分比为至少约60％。
本发明还揭示了选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的IL-17抗体制品中的CysL97的方法，其包括:
a)使该制品接触一组选自半胱氨酸/胱氨酸和半胱氨酸/胱胺的氧化/还原试剂以形成还原混合物；和
b)在约37℃温度下在厌氧条件下孵育该还原混合物至少约4小时，或在约18-24℃的温度下孵育该还原混合物约16-24小时；
其中该IL-17抗体各自包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该VH包含如SEQ ID NO:8所示VH的三个互补决定区(CDR)，该VL包含如SEQ ID NO:10所示VL的三个CDR。
本发明还揭示了选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的苏金单抗抗体制品中的CysL97的方法，其包括:
a)将该制品中的苏金单抗浓度调节到为约4mg/ml-约19.4mg/ml，例如约10mg/ml-约19.4mg/ml，例如约10-约15.4，例如约12mg/ml-约15mg/ml，例如约13.5mg/ml；
b)将该制品中的氧饱和百分比调节到至少约60％，例如至少约80％；
c)将该制品的pH调节到约7.4-约8.5，例如约7.8-约8.2，例如约7.9-约8.1，约8.0；
d)使该制品与半胱氨酸在某容器中接触以形成还原混合物，其中该还原混合物中的半胱氨酸浓度为约4.0mM-约8.0mM，例如约4.8mM-约8.0mM，例如约5.5mM-约6.7mM，例如约6.0mM；
e)将该还原混合物加热到约32℃-约42℃、例如到约35℃-约39℃、例如到约37℃的温度，所述加热进行约45-约90分钟，例如约45-约75分钟，例如约60分钟；
f)将来自步骤e)的还原混合物在约20℃-约42℃、例如32℃-约42℃、例如约35℃-约39℃、例如约37℃的温度下孵育，所述孵育进行约210-约420分钟，例如约210-约330分钟，例如约240-约300分钟，例如约250分钟，同时保持该容器中的体积氧传质系数(kLa*)小于等于0.37h-1，所述kLa*通过将饱和曲线匹配至溶解氧曲线而算得，
g)将来自步骤f)的混合物冷却到约16℃-约28℃的温度，所述冷却进行约45-约90分钟，例如约45-约75分钟，例如约60分钟；和
h)将从步骤g)得到的混合物的pH调节到约5.1-约5.3，例如约5.2。
本发明还揭示了苏金单抗的经纯化制品，按十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)测得，该制品中的完整苏金单抗含量为至少约90％，并且按胱胺-CEX测得，该制品中苏金单抗的活性水平为至少约90％，
概述
在以上方法的一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段包含：i)免疫球蛋白重链可变区(VH)，该VH包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；ii)免疫球蛋白轻链可变区(VL)，该VL包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；iii)包含如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的免疫球蛋白VH区和包含如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的免疫球蛋白VL区；iv)序列中包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示高变区的免疫球蛋白VH区；v)序列中包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示高变区的免疫球蛋白VL区；vi)序列中包含如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示高变区的免疫球蛋白VH区；vii)序列中包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示高变区的免疫球蛋白VH区和序列中包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示高变区的免疫球蛋白VL区；和viii)序列中包含如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示高变区的免疫球蛋白VH区和序列中包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示高变区的免疫球蛋白VL区。在本发明方法的一些实施方式中，IL-17抗体或其抗原结合片段是人类IgG1同种型抗体。在本发明方法的一些实施方式中，该抗体是苏金单抗。
在以上说明书中提出了本发明一种或多种实施方式的细节。虽然可使用与本文所述类似或相同的任何方法和材料来实施或测试本发明，但是以下描述优选的方法和材料。通过说明书和权利要求书，本发明的其他特点、目的和优点将是显而易见的。在说明书和权利要求书中，单数形式包括复数指代物的情况，除非上下文中有清楚的另外指明。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员所理解的一般含义。说明书中引用的所有专利和出版物都通过引用纳入。提出以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方式。这些实施例不应以任何方式理解为限制本发明的范围，本发明的范围由权利要求书限定。
实施例
实施例1：由不同巯基试剂还原苏金单抗蛋白质A中间体
实施例1.1
对多种含巯基的还原剂(例如二硫代苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、2-巯基乙酸、半胱氨酸、半胱胺、谷胱甘肽)在选择性还原苏金单抗轻链中氧化态Cys97的用途进行筛选。在第一组实验中，自早起发酵过程在蛋白质A捕获步骤后获得的1mL分量的无活性起始材料在37℃不同pH条件下用各浓度的β-巯基乙醇、半胱氨酸和谷胱甘肽进行孵育。某些时间点之后，样品通过凝胶过滤到20mM乙酸盐pH 6缓冲液中来脱盐，并通过ELISA测定活性恢复。还通过Ellman测试测定游离巯基基团的含量(巯基基团的去封闭应导致每摩尔抗体具有2摩尔游离-SH的值)。结果如下表2中所列。
Figure GDA0002469027060000301
Figure GDA0002469027060000311
表2：在给定条件下反应之后样品的活性和游离SH。
o：2-巯基乙醇(2-ME)
*：相对于参比的％
这些研究的结果是，发现巯基乙醇和半胱氨酸在pH 7-9范围在1至20mM的浓度和20-40℃的温度下是最合适的。
在进一步调查的过程中，发明人认识到，还原剂暴露过程中抗体可能被过度还原，形成具有被部分还原的链间二硫桥的抗体。这种过度还原在从反应混合物中分离抗体时(例如通过如上所述的透滤法或通过色谱法)于大气条件下是可逆的，因为缓冲液中存在的溶解氧导致自发再氧化和再形成完整抗体。
L-ss-HH-ss-L→L-SH+HS-HH-ss-L→L-ss-HH-ss-L
(完整抗体)(链间二硫桥被还原)(完整抗体)
实施例1.2(厌氧条件)
在第二组实验中，在厌氧条件下进行了蛋白质A捕获步骤之后所得苏金单抗抗体的处理，使用已除气的溶液和氩或氮气氛以排除溶解氧对还原成果的影响。简言之，来自蛋白质A捕获步骤的苏金单抗溶液通过添加Tris碱储备溶液调节到pH 8.0。然后通过添加半胱氨酸/EDTA储备溶液(例如200mM/12.5mM EDTA，pH 8)将该溶液调节到浓度为8mM半胱氨酸和1mM EDTA。还原溶液中的苏金单抗浓度为4mg/mL(半胱氨酸:抗体的摩尔比为约296:1)。该混合物在室温下孵育24小时。在不同的时间点，取样品并掺入过量的碘乙酰胺，通过淬灭还原剂和抗体的巯基基团而停止反应。
使用相同的设定对2-巯基乙醇、2-巯基乙酸、半胱氨酸、半胱胺和谷胱甘肽进行实验。对于DTT，使用1mM的浓度。
通过毛细管电泳用SDS以非还原模式(CE-SDS)分析终止的样品。这种分析方法将抗体的不同还原产物(HHL、HH、HL、H和L物质)与完整抗体(LHHL)分离，并通过在线UV检测和所得信号的面积积分对它们进行定量。
在图1中，来自0、3、15分钟，1h，2h，4h和20-24h还原处理的完整抗体(LHHL)数据显示，DTT和β-巯基乙酸完全还原抗体而不存在向完整抗体的再平衡。谷胱甘肽和β-巯基乙醇也显示显著还原，但能诱导向完整抗体(LHHL)的再平衡。半胱氨酸还原抗体至约50％，然后直接再平衡至完整抗体。半胱氨酸的数据显示，这种试剂几乎不产生还原，或者导致非常快速地(在小于3分钟的时间内)至再平衡。
发现的还原顺序(即，DTT＞β-巯基乙酸＞β-巯基乙醇＞谷胱甘肽)与氧化还原电势或二硫交换的公开数据相关联。参见T.Liu，《蛋白质》(The Proteins)第三版第三卷(1977)第239页，其给出以下注释和数据:
氧化还原电势E＝E0+0.059×log[R-SS-R]/[R-SH]
标准氧化还原电势(以伏特为单位的E0)不能直接测定，因为电极通过硫来平衡。因此，不得不从间接测定推算氧化还原电势：
二硫代苏糖醇DTT/DTTox：E0～-0.33V(pH 7，25℃)
谷胱甘肽GSH/GSSG：E0～-0.24V(pH 7，25℃)
半胱氨酸CSH/CSSC：E0～-0.22V(pH 7，25℃)
实施例2：半胱氨酸在有氧和厌氧条件下选择性还原苏金单抗。
在室温(RT)(约25℃)或37℃下用8mM半胱氨酸、4mg/ml苏金单抗、pH 8(半胱氨酸:抗体的摩尔比为约295.88:1)进行另外的实验。在有氧(即，溶液制备和处理在大气中进行)或厌氧(即，溶液制备和处理在通过除气并随后在氩或氮气氛下工作来排除或减少氧的条件下进行)条件下进行反应。
在厌氧条件下(例如，具有0％溶解氧的氮或氩气氛)，在处理的早期，抗体显著降解并形成抗体片段——过度还原的信号。完整抗体(LHHL)的降低最大值为约40％，这发生在RT(图2A)或37℃(图2C)下进行约15分钟实验后。于20小时再平衡至完整抗体显示，RT样品中保留了约17.1％的过度还原变体，在37℃样品中保留了12.1％的过度还原变体。
在有氧条件下，即在溶解氧存在条件下，反应更温和。完整抗体(LHHL)的降低最大值达到约80％残余含量，这发生于RT实验约15分钟之后(图2B)，而在37℃进行约15分钟实验之后，完整抗体(LHHL)的降低最大值达到约73％残余含量(图2D)。再平衡至完整抗体显示，RT样品中20小时之后只保留了5.8％的过度还原变体，在37℃样品中8小时之后只保留了9.3％的过度还原变体。
因此，在厌氧条件下的初始还原较大并且再平衡至完整抗体不如有氧条件下那样完全。
实施例3：溶解氧和胱氨酸对选择性还原的影响
由于半胱氨酸(Cys-SH)在空气存在下氧化成胱氨酸(Cys-SS-Cys)，在有氧和厌氧条件下观察到的差异可能是由有氧条件下制备半胱氨酸溶液时和在用半胱氨酸实际处理苏金单抗时形成了少量胱氨酸所导致。为了评价dO2和胱氨酸(或胱胺)含量对苏金单抗选择性还原的影响，发明人对抗体分离进行了一些另外的制备实验。
对于一些样品，4mg/ml苏金单抗的选择性还原用8mM半胱氨酸(半胱氨酸:抗体的摩尔比为295.88:1)在pH 8.0的溶液中于37℃下进行，条件为：有氧条件下的100％dO2(无氮熏蒸)、50％和20％dO2(在环境气氛中搅拌伴以氮熏蒸使得整个实验中的溶解氧保持在目标水平)，及厌氧(0％dO2)条件下(已除气溶液，完全氮气氛)无胱氨酸，以及在100％dO2下存在约0.1mM胱氨酸[半胱氨酸:胱氨酸的比值＝80:1]。在一个实验中，先在厌氧条件下用8mM半胱氨酸进行初始30分钟孵育，然后加入0.3mM胱氨酸。在另一个实验中，在厌氧条件下使用7.7mM半胱氨酸和0.3mM胱氨酸[半胱氨酸:胱氨酸比值＝25.66:1]进行选择性还原。在另一个样品中，加入0.1mM胱胺代替胱氨酸。
在所有这些实施例中，在不同的时间点取样品。在处理结束时(240分钟37℃)，通过调节本体溶液的pH至5.0并上样到结合抗体的阳离子交换柱来分离抗体。洗去还原剂之后，用盐和/或pH-梯度洗脱抗体并通过CE-SDS、SE-HPLC和CEX分析。
图3显示在不同的处理时间取出用碘乙酰胺终止的样品的CE-SDS分析。较低dO2导致早期还原较多并且在选择性还原后期的平衡较慢。在全部厌氧条件下(0％dO2)，处理结束时的完整抗体含量明显较低(70％)。当在50％或更高溶解氧条件下进行反应时，完整抗体的含量提高至超过90％。加入少量胱氨酸(或半胱胺)降低了抗体的初始还原。
表3显示对来自不同反应处理(厌氧和有氧条件)的样品使用后续色谱法在SP-琼脂糖凝胶FF上纯化所获得抗体的活性和纯度。
Figure GDA0002469027060000341
表3:不同反应处理之后的抗体活性和纯度
关于生物活性，在所有情况中都获得全面活性的材料(理论最大值的86-108％)，而非选择性还原的苏金单抗起始材料只具有45％的活性。对于CE-SDS纯度，在完全厌氧处理无胱氨酸条件下获得的抗体中发现纯度受损(82.3％)，这可能是因为在这些条件下发生了过度还原(注意：向厌氧反应添加胱氨酸会提高CE-SDS测得的样品纯度，因为还原电势较小并且因此较不可能发生过度还原)。但是，所有其他的选择性还原处理都导致类似的高的抗体品质和活性。发明人还注意到，在SP-琼脂糖凝胶色谱步骤之前的一些CE-SDS纯度值略低于在色谱步骤之后获得的值(例如，之前为65％而之后为82％)(数据未显示)，这提示可能在色谱步骤过程中发生了额外的再氧化。在各种有氧条件下的CEX活性一般较低，因为有更多的氧来减弱半胱氨酸的还原力。在有氧条件下添加氧化剂胱氨酸和胱胺会进一步降低CEX活性。
实施例1-3的概要和结论
发明人确定，苏金单抗的CysL97可于溶液中得以还原，而不需要整个抗体结构的部分解折叠，例如使用胍HCl。而且，苏金单抗总体而言能经受选择性还原作用，在受控条件下，这会允许抗体活化而不发生明显降解。
发明人发现，半胱氨酸能对于选择性还原苏金单抗特别理想，其只显示中等的过度还原，配以快速平衡。在使用半胱氨酸进行选择性还原的第一小时中，抗体被部分还原，例如在厌氧条件下为最多60％，在完全有氧条件下为最多约30％。随后，苏金单抗缓慢地再氧化成完整抗体。接受了半胱氨酸选择性还原的样品的再氧化在室温下进行的速度比在37℃进行的反应要慢得多(在室温下再平衡21小时，而在37℃平衡8小时)。室温样品一般还显示出比在37℃进行选择性还原反应更小的完整抗体最大值降低。
在厌氧条件下，发明人注意到，抗体的初始还原较大并且再平衡至完整苏金单抗不如有氧条件完全。但是，向厌氧反应添加少量胱氨酸导致纯度和活性相比在无胱氨酸条件下进行的厌氧反应有所提高。由此可在存在少量摩尔比的还原试剂的被氧化形式(例如，在以半胱氨酸作为还原剂的情况下，为胱氨酸)时在厌氧条件下模仿有氧反应过程。而且，发明人注意到添加胱氨酸加快了完整抗体的平衡，即使当孵育的初始30分钟过程中不存在胱氨酸时也能如此。因此，可在空气存在下、以及在通过使用惰性气氛(例如氮或氩)而不存在溶解氧的条件下进行选择性还原。若在完全厌氧条件下进行，则加入小摩尔比的还原试剂氧化形式是有用的。
实施例4：半胱氨酸选择性还原步骤开发研究：概念验证(DoE1)
实施例4.1-研究设计和方法
半胱氨酸处理步骤的主要目的是，通过掩蔽轻链97位置中半胱氨酸的-SH基团来重新获得苏金单抗抗体的完全生物活性，这可在细胞培养、收获和/或蛋白质A色谱期间发生。在以下实施例中，通过监控抗体完整性的非还原性CE-SDS方法来分析抗体纯度(称为“CE-SDS纯度”)并通过胱胺-CEX色谱法分析抗体的生物活性(称为“CEX活性”)。在胱胺-CEX色谱法中，向抗体样品添加胱胺并允许苏金单抗中的任何游离半胱氨酸衍生化。然后通过阳离子交换色谱对样品进行分析分离，从而半胱氨酸衍生化的抗体物质在未衍生化的抗体物质之后洗脱，因为其携带额外的正电荷。然后将该色谱与未处理的样品的色谱进行比较。洗脱位置的经处理样品色谱中洗脱位置有移动的物质部分就是原始样品中游离CysL97-SH丰度的直接衡量，并可用作活性的代理标志。
概念验证研究(DoE1)的主要目的是，检查实验研究设计对改善半胱氨酸处理步骤的适用性，以测试第一组参数范围从而识别主要影响因子并支持操作范围限定。另外，若实验设定适合于检测输入参数对输出参数的影响，则进行DoE1来进行评价。使用Modde 9.0(Umetrics)软件来分析概念研究。
输入参数如表4中所示。胱氨酸(氧化形式)的添加作为额外的输入参数进行测试，因为氧化还原电势受到还原形式/氧化形式比例的影响，在这种情况中是指半胱氨酸/胱氨酸比例。对半胱氨酸/胱氨酸比例和半胱氨酸浓度各研究3个水平，对抗体浓度(“ALC含量”)研究2个水平。对产物品质输出参数，测定CEC活性和CE-SDS纯度。
名称 单位 较低水平 中等水平 较高水平
半胱氨酸/胱氨酸比例 [-] 2.00 6.00 10.0
半胱氨酸浓度 [mM] 0.50 5.25 10.0
ALC含量 [mg/mL] 3.25 n.a. 6.5
表4：输入参数。
设计为32×2多水平因子设计，没有中心点试验。选择该设计来为改善半胱氨酸处理步骤获取数据和工艺理解。这种设计支持以线性、相互作用和二次项形式对半胱氨酸/胱氨酸比例和半胱氨酸浓度这些输入参数进行数字模型计算。实验设计计划在表5中给出。
Figure GDA0002469027060000361
Figure GDA0002469027060000371
表5：实验设计计划。基于氨基酸序列的苏金单抗相对分子量为147944道尔顿，其用于计算半胱氨酸相对于蛋白质的摩尔比。
选择性还原反应在15mL的密闭聚丙烯试管中进行，将该试管置于水浴中并温热至37℃。用WFI将蛋白质溶液稀释到目标浓度并用1M Tris将pH调节到pH 8.0。加入半胱氨酸和胱氨酸溶液之后，将试管回火并在水浴中孵育4h。然后取样品通过ALC测定含量。对样品进行CE-SDS，这些样品在孵育之后直接取出并通过加入10倍过量(相对于半胱氨酸浓度)的碘乙酰胺停止反应。将剩余溶液冷却到环境温度，将pH调节到pH 5.0-5.5，取样品进行CEX和SEC分析。
根据表6中的实际实验设计进行设计。
Figure GDA0002469027060000372
表6：实际实验设计。基于氨基酸序列的苏金单抗相对分子量为147944Da，其用于计算半胱氨酸/蛋白质摩尔比。
实施例4.2-概念验证研究的结果
输出参数的值和输入参数一同列入表7。试验以CEX活性值升序列出。可以看到，所有以0.5mM半胱氨酸浓度进行的试验都具有较低的活性——可能是因为这种半胱氨酸浓度太低而不能实现Cys97的完全脱掩蔽。在这组中，当半胱氨酸/抗体比例从约11:1增加到21:1时，注意到CEX活性略增大(反应00_17、_14和_12)。在这三个试验中，具有较高半胱氨酸/胱氨酸比例的试验(反应007_14和_12)(可能代表半胱氨酸的还原力略有减弱)也具有良好的CE-SDS纯度参数。然后是一系列活性输出参数稍有差异的试验(92.4至93.1％)，这些差异可能在分析准确性之内，使得难以解读这组。最后的一组4个试验具有最高的活性(93.7至95.1％)。值得注意，这些试验不含最高的半胱氨酸/蛋白质比例(462.33)。
Figure GDA0002469027060000381
表7：按CEX活性升序列出的输入和输出参数值。
由于良好的模型匹配，可以使用等高线图来理解该体系的主要影响参数。模型的品质用4种工具来代表，即R2、Q2、模型有效性和重复测定的标准偏差(SD)。与数据具有良好一致性的模型的R2和Q2接近于1.0并且模型有效性超过0.25。具有较低统计学显著性的模型具有较低的R2和Q2值。对品质输出参数的模型诊断指出，模型对CEX活性和CE-SDS纯度具有高统计学显著性(对CEX活性，R2＝0.88且Q2＝0.73，对CE-SDS纯度，R2＝0.84且Q2＝0.63)。对CEX活性的等高线图(图4A)指出，若输入参数半胱氨酸浓度为4.0mM和9.0mM之间，则能实现等于或大于93.0％的CEX活性值。而且，将输入因子半胱氨酸/胱氨酸比例设定为其中心点6时，输入因子ALC含量会从低水平(3.25mg/mL)变化至高水平(6.5mg/mL)。要改善CEX活性，模型指出，输入因子ALC含量应高于调查的较高水平6.5mg/mL。
在表8中，按CE-SDS纯度升序列出试验。可看到三组：较低纯度(小于等于70％)的试验，高摩尔比462的试验属于这组；中等纯度(70-83％)的试验；和较高纯度(大于83％)的试验。由于良好的模型匹配，也可使用等高线图来理解输入参数如何影响表8中所示CE-SDS纯度值。根据图4B中的CE-SDS等高线图，最接近理论最佳的区域位于右侧下方。这意味着半胱氨酸/胱氨酸比例应设定为较高水平并且半胱氨酸浓度应设定为较低水平。另外，可使用较高的ALC含量来提高CE-SDS纯度。
Figure GDA0002469027060000391
表8：CE-SDS纯度升序列出的输入和输出参数。
实施例4.3-概念验证研究的概要
概念验证研究证实，可使用该实验设定来评价和改进半胱氨酸处理步骤的输入参数。发明人注意到，高的半胱氨酸/蛋白质摩尔比会导致低的CE-SDS纯度值。该模型还提示，提高蛋白质和半胱氨酸浓度可能增大CE-SDS纯度和CEX活性。因此，在以下研究(响应面设计1)中更详细地评估了半胱氨酸浓度以及提高的ALC含量参数范围对CEX活性和CE-SDS纯度这些产品品质属性的影响。
实施例5：半胱氨酸选择性还原步骤开发研究：响应面设计1
实施例5.1-研究设计和方法
根据来自实施例4的数据，调节选择性还原步骤的输入参数。使用Modde9.0(Umetrics)软件来分析开发研究。输入参数在表9中列出。各在三个水平研究这些因子。该设计是概念验证研究的经过调节的版本，其中输入参数ALC含量和半胱氨酸浓度为经过调节的水平。输入参数“半胱氨酸/胱氨酸比例”被参数“胱氨酸浓度”替换，以简化实验设定和进一步的数据评估。
名称 单位 较低水平 中等水平 较高水平
胱氨酸浓度 [mM] 0.0 0.5 1.0
半胱氨酸浓度 [mM] 4.0 9.0 14.0
ALC含量 [mg/mL] 3.8 11.6 19.5
表9：输入参数。
该设计为23中心复合面(CCF)设计，具有4个在中心点条件下的中心试验。这种设计支持以线性、相互作用和二次项形式对数学模型进行计算。实验设计计划在表10中给出。
Figure GDA0002469027060000401
Figure GDA0002469027060000411
表10：实验设计计划。1)中心点。基于氨基酸序列的苏金单抗相对分子量为147944Da，其用于计算半胱氨酸/蛋白质摩尔比。
在15mL的密闭聚丙烯试管中进行选择性还原反应，将该试管置于水浴中并温热至37℃。根据表11中的实际实验设计进行该设计。
Figure GDA0002469027060000412
表11：实际实验设计。1)中心点；2)这个实验不作为已使用的DoE软件的中心点，因为与最初计划的中心点偏差超过10％蛋白质浓度。基于氨基酸序列的苏金单抗相对分子量为147944Da，其用于计算半胱氨酸/蛋白质摩尔比。
实施例5.2-响应表面设计1的结果
输入参数以及输出参数的值在表12中列出。按照CEX活性升序列出试验。可以看到，具有高CEX活性的试验采用了较高的半胱氨酸浓度。具有较低活性的单个试验(反应016＿13)具有高蛋白质浓度、低半胱氨酸浓度和高胱氨酸浓度。
对于产品品质输出参数的模型诊断为，对CEX活性，R2＝0.95，Q2＝0.76，SD＝0.20，并且模型有效性＝0.78，对于CE-SDS纯度，R2＝0.79，Q2＝0.53，SD＝2.91，并且模型有效性＝0.83，指示对于两个输出参数而言都是显著性模型。计算了等高线图(图5)，以更深入了解输入参数设定的影响和对CEX活性的影响。
Figure GDA0002469027060000421
表12：按照CEX活性升序列出输入和输出参数。1)中心点；2)这个实验不作为已用的DoE软件的中心点，因为与最初计划的中心点偏差超过10％蛋白质浓度。
如图5中的等高线图所示，要获得高CEX活性，最有影响的输入参数是半胱氨酸浓度，应设定为其高水平。但是，即使是在低水平的半胱氨酸浓度下，若ALC含量和胱氨酸浓度未处于上限，也能达到高CEX活性(大于93％)。输入参数ALC含量和胱氨酸浓度也对输出参数CEX活性具有影响，不过影响程度较小。
在表13中，按照CE-SDS纯度升序列出试验。可将这些试验分成三组。有一系列六个试验(主要是14mM试验)具有低纯度(小于80％)，一系列试验具有中等纯度(85-91％)，一系列试验具有较高的纯度(大于91％)，后者都是4mM半胱氨酸试验。
Figure GDA0002469027060000431
表13：按照CE-SDS纯度升序列出输入和输出参数。1)中心点；2)这个实验不作为已用的DoE软件的中心点，因为与最初计划的中心点偏差超过10％蛋白质浓度。
根据这些结果，半胱氨酸浓度应较低，并且ALC含量和胱氨酸浓度应设定为较高，从而实现较高的CE-SDS纯度值。
反应016＿6、反应016＿7、反应016＿8和反应016＿11这些实验的两个品质输出参数值都较高。为基于由这个DoE所建立模型评估半胱氨酸处理步骤的失效风险，进行了使用蒙特卡罗模拟(Monte Carlo simulation)的设计空间估计器。设计空间估计器提供了因子可在其内变化的范围，同时输出参数不超过产品品质和工艺性能输出参数的目标范围。其提示，ALC含量应理想地设定为12mg/mL。在这个特定实验中，半胱氨酸的理想浓度为4.0mM。对于胱氨酸浓度，理想值为0.32mM。
根据这个研究的结果，半胱氨酸处理步骤主要受到半胱氨酸浓度的影响。高半胱氨酸浓度促进高CEX活性，但同时导致低CE-SDS纯度。根据设计空间估计器，半胱氨酸浓度应保持为4mM，并且ALC含量应设定为12mg/mL(半胱氨酸/蛋白质比例为约49)。
为了验证该统计学设计的结果，在具有空气覆盖和开放顶部空间的带搅拌2L生物反应器中进行目标试验。在孵育过程中不施加搅拌。工艺参数在表14中列出，分析结果如表15中所示。
Figure GDA0002469027060000441
表14：目标试验的工艺参数。基于氨基酸序列的苏金单抗相对分子量为147944Da，其用于计算半胱氨酸/蛋白质摩尔比。
Figure GDA0002469027060000442
表15：目标试验的分析结果。
所有三个试验都导致类似的关于CEX活性的结果。这对应于之前DoE研究的结果，指示4.0mM半胱氨酸足以重获抗体活性。在第3次目标试验(反应021)中，省略了胱氨酸，导致与试验1(反应019)相当的CE-SDS纯度结果，并证明，在所测试的条件下，胱氨酸对半胱氨酸处理步骤的性能只产生次要影响。将半胱氨酸浓度增大至8.0mM(半胱氨酸/蛋白质比例为约91)没有导致更高的CEX活性值，而是导致原液中较低的CE-SDS纯度，落在开发目标90％以下。虽然胱氨酸在统计学设计中显示出了显著性，但是没有在目标试验中检测到正向效果。此外，在统计学设计中对CEX活性的影响是次要的(参见图5)，由于胱氨酸在非碱性缓冲液中的低溶解性，难以制备含胱氨酸的缓冲液。因此，在半胱氨酸处理缓冲液中可省略胱氨酸。
实施例6：半胱氨酸选择性还原步骤开发研究：响应面设计2
实施例6.1-研究设计和方法
响应面设计2(DoE3)的主要目的是调查除了半胱氨酸浓度以外的工艺参数温度、时间和pH对半胱氨酸处理步骤的影响。数据还用于支持限定操作范围和识别主要影响因子。使用Modde 9.0(Umetrics)软件来分析开发研究。输入参数如表16中所示。
名称 单位 较低水平 中等水平 较高水平
温度 [℃] 32.0 37.0 42.0
时间 [h] 1.0 4.0 7.0
pH [-] 7.5 8.0 8.5
半胱氨酸浓度 [mM] 2.0 5.0 8.0
表16：输入参数。
该设计是具有3个中心点试验的中心复合面(CCF)设计。实验设计计划在表17中给出。选择该设计来评估另外的工艺参数的影响，如同在之前的实验中改进了半胱氨酸处理溶液。再次分析了半胱氨酸浓度，因为它是对半胱氨酸处理步骤影响最大的输入参数，并预计其与输入参数的相互作用。这种设计支持以线性、相互作用和二次项形式对数学模型进行计算。
Figure GDA0002469027060000451
Figure GDA0002469027060000461
表17：实验设计计划。1)中心点。基于氨基酸序列的苏金单抗相对摩尔比为147994Da，其用于计算半胱氨酸/蛋白质摩尔比。
在15mL的密闭聚丙烯试管中进行该选择性还原反应，将该试管置于水浴中并温热至37℃。
实施例6.2-响应面设计2的结果
按照表18中的实际实验设计进行该研究。
Figure GDA0002469027060000462
表18：实际实验设计计划。1)中心点。2)不作为已用软件的中心点。基于氨基酸序列的苏金单抗相对分子量为147994Da，其用于计算半胱氨酸/蛋白质摩尔比。
表19中以CEX活性结果升序列出产品品质输出参数的值。产品品质输出参数的模型诊断为：对于CEX活性，R2＝0.93，Q2＝0.80，模型有效性＝0.79并且SD＝0.42；对于CE-SDS纯度，R2＝0.96，Q2＝0.89，模型有效性＝0.67并且SD＝0.00。
Figure GDA0002469027060000471
表19：按照CEX活性升序列出的输入和输出参数值。1)中心点。2)不作为已用软件的中心点。
表19显示可将试验主要分成三组：较低活性(小于93％)，中等活性(93-95％)和高活性(大于95％)。由于良好的模型匹配，可以使用等高线图(图6)来识别该体系的主要影响参数。图6显示，中等至高的孵育时间(例如4至7小时)和高半胱氨酸浓度有利于提高CEX活性。孵育温度和工艺pH对输出参数CEX活性的影响较小。尽管如此，作图中pH 8.0和8.5于37℃条件下的纯度等于或大于95％的面积是最大的，暗示这是最佳的操作范围。
在表20中，按照CE-SDS纯度升序列出试验。试验可分成三组：具有低纯度(小于82％)的试验，具有中等纯度的试验和具有高纯度(大于90％)的试验。所有具有高CD-SDS纯度的试验都采用2mM半胱氨酸。
Figure GDA0002469027060000481
表20：按照CE-SDS纯度增大列出的输入和输出参数。1)中心点。2)不作为已用软件的中心点。
由于良好的模型匹配，可使用等高线图(图7)来理解该工艺以及起主要影响的输入参数。图7显示，中等至高孵育时间和低半胱氨酸浓度提高CE-SDS纯度。输入参数孵育温度和工艺pH对CE-SDS纯度具有次要影响。
实施例6的概要和结论
当半胱氨酸浓度保持低水平时满足了开发目标，而温度可从中心到高水平不等，pH可从中心到高水平不等，并且时间可从中心到高水平不等。为帮助估计导致高产品品质的输入参数范围，进行了使用蒙特卡罗模拟的设计空间估计器。对于这种模拟，设定CEX活性目标大于93％并且CE-SDS纯度目标大于90％。蒙特卡罗模拟预计，当理想温度为39.1℃时能满足这些性质目标，不过温度可在38.6℃至39.7℃之间变化。理想的孵育时间为5.0h，不过可在4.0h至6.0h之间变化。对于pH，理想值为8.2，可在8.15至8.25之间变化。对于最后的输入参数半胱氨酸浓度，预计的理想值为2.4mM，并可在2.2mM至2.5mM之间变化。在这些范围之内，设计空间估计器发现，对于产品品质输出参数CEX活性，估计的DPMO(每百万次操作缺陷)值为110，对于CE-SDS纯度，DPMO值为20。这表示，对于CEX活性，一百万次中有110次达不到目标限定，对于CE-SDS纯度，一百万次中有20次达不到目标限制。
根据等高线图的结果，并考虑到之前的开发研究(DoE1和DoE2)的结果，将孵育温度的目标设定为37℃。将孵育时间目标设定为4小时(240分钟)，由于本发明实验设定不包括加热和冷却时间，它们将在制造规模应用时进行考虑。结合加热和冷却时间，将施行约6小时的总体工艺时间。没有检测到pH对CE-SDS纯度的影响，并且pH对CEX活性的影响是次要的。因此，目标设定为8.0，因为其充分在所测试的范围之内，能安全地达到对CEX活性的开发目标，并且降低由CEX形成酸性变体(因碱性条件而强化)的风险。输入参数半胱氨酸浓度的结果指示，最佳的低水平为2.4mM；但采用2mM半胱氨酸的大多数实验得到低于所需的CEX活性。这个结果结合目标试验结果提示，在验证试验中，半胱氨酸浓度的目标应较高，即4mM。
实施例7：工艺比较和连续搅拌的分析
实施例7.1-工艺B2和工艺C的比较
实施例6中所述的考虑提示，可优选在比目前为止制造规模(本文的工艺B2)所用更高的蛋白质浓度和更低的半胱氨酸浓度(4-6mM)条件下进行选择性还原。表21比较了较早的工艺B2和提议的工艺C的输入参数。以重复样在聚丙烯试管中以50mL规模进行比较试验，将试管置于水浴中并温热至37℃。结果如表22中所示。
单位 工艺B2 提议的工艺C
半胱氨酸浓度 [mM] 8.00 4.00
蛋白质浓度<sup>1)</sup> [mg/mL] 4.30 13.50
半胱氨酸/蛋白质大致摩尔比 [M/M] 275.24 43.84
pH [-] 8.00 8.00
孵育时间 [h] 4.00 4.00
温度 [℃] 37.00 37.00
表21：工艺B2和提议的工艺C的输入参数。1)pH调节和半胱氨酸加入之前。基于氨基酸序列的苏金单抗相对分子量为147944Da，其用于计算半胱氨酸/蛋白质摩尔比。
试验 步骤性能 单位 CEX活性 CE-SDS纯度
反应030 提议的工艺C [％] 95.5 95
反应031 提议的工艺C [％] 95.0 95
反应032 工艺B2 [％] 96.7 79
反应033 工艺B2 [％] 97.0 79
表22：工艺B2和提议的工艺C的输出参数。
表22显示工艺C的经过改进的半胱氨酸处理步骤导致CE-SDS纯度明显提高，而CEX活性只有非常小的降低。在选择性还原步骤过程中，通过提高蛋白质浓度和降低半胱氨酸浓度(即，半胱氨酸/蛋白质摩尔比较小)实现了较高的CE-SDS纯度值。这导致较低但仍足以确保充分的苏金单抗活性的还原力。
实施例7.2-测试孵育过程中进行连续搅拌
在按照工艺B2的临床用制造过程中，在37℃的孵育期间，施行间歇混合(2分钟每小时)以避免异质。在2L生物反应器中测试了使用连续搅拌来确保孵育期间同质性的可行性(反应029的试验)。实验装置和工艺条件如表23中所示。
单位 反应029
半胱氨酸浓度 [mM] 4.00
蛋白质浓度<sup>1)</sup> [mg/mL] 13.50
半胱氨酸/蛋白质大致摩尔比 [M/M] 43.84
孵育期间的搅拌器速度 [rpm] 200.00
填充体积 [L] 1.20
孵育时间 [h] 4.00
表23：用于测试反应期间进行连续搅拌的输入参数。1)pH调节和半胱氨酸加入之前。基于氨基酸序列的苏金单抗相对分子量为147944Da，其用于计算半胱氨酸/蛋白质摩尔比。
对于反应029，CE-SDS纯度为96％且CEX活性为92.7％，其显示的CEX活性低于在不搅拌条件下以小规模进行的反应030和反应031(提议的工艺C)的试验。因此，由连续混合导致的传递到半胱氨酸处理溶液中的氧增加会消减半胱氨酸的还原力。尽管如此，半胱氨酸处理原液中的CEX活性接近品质目标。由于氧传递和表面/体积比随着规模放大到制造规模而降低，发明人认为这个实验是考虑到高氧传递的最差情况。因此在中试试验(“工艺C”)中采用连续混合，从而确保工艺溶液的同质性。
实施例5-7的概要和结论
发明人确定，半胱氨酸处理过程中的蛋白质浓度可提至三倍，从而显著减小工艺体积。发明人还证明，较低的半胱氨酸浓度能在半胱氨酸处理之后提供类似的产品活性和提高的产品CE-SDS纯度。因此，较低的半胱氨酸/蛋白质比例能确保产品的品质。
数据还显示，温度和pH对半胱氨酸处理步骤具有次要影响，并且添加半胱氨酸的氧化形式-胱氨酸-对于获得产品性质而言不是必须的。虽然所显示的理想孵育时间为5小时，但是发明人设定目标为4小时，因为本发明的实验设定不包括加热和冷却时间，这些时间在制造规模应用中必须加以考虑。在开放但无积极通气的条件下进行连续搅拌对于选择性还原方法而言似乎是可行的；但是如发明人在以后的实施例中所显示的，应限制传递到溶液中的氧(例如使用低/慢搅拌)。
实施例8：中试规模的工艺验证
通过7L中试规模的工艺验证来测试经过工艺改进之后所提出的纯化条件，从而进行第一次规模放大并获得对该工艺的重现性和稳定性的第一印象。在中试规模实验(反应035)中采用按照工艺C(表21)的选择性还原步骤。施行连续搅拌。用pO2探针测定溶解氧浓度。
根据验证试验1，在选择性还原步骤之后，反应035的CEX活性仅为90.4％。溶解氧曲线(参见图8)分析显示，在该处理的前三个小时中pO2稳定降低，表明在溶液中发生的氧消耗快于通过搅拌引起的到溶液中的氧传递。发明人假设氧消耗是由于半胱氨酸试剂(Cys-SH)氧化成胱氨酸或磺基丙氨酸(Cys-SO3)而导致的。然后该反应最后一个小时中氧含量增加表明，半胱氨酸试剂已消耗并且因搅拌而被溶液吸收的氧显现。这意味着，在该处理的最后阶段中，半胱氨酸的还原力不再有效，这能解释从这个试验中获得的活性受损。
实施例8.1-验证试验1过程中的半胱氨酸步骤的调查
为了调查第一次中试规模试验反应035中导致CEX活性降低(90.4％)的根源原因，要评估可能的影响因子。如上所述，低的半胱氨酸浓度、通过反应期间的延长搅拌而引入氧、以及规模改变(反应体积增大)都会导致还原力不够。因此，评价了孵育期间的搅拌器速度和半胱氨酸浓度。
实验计划和输出参数CEX活性如表24中所示。在这个实验中，用pO2探针来测定溶解氧浓度。
Figure GDA0002469027060000521
表24：调查搅拌和半胱氨酸浓度对半胱氨酸处理步骤的影响。1)验证试验1，在20L生物反应器中以7L填充体积进行。2)在2L生物反应器中以1.7L填充体积进行。3)以50rpm每小时混合2分钟。基于氨基酸序列的苏金单抗相对分子量为147944Da，其用于计算半胱氨酸/蛋白质摩尔比。
所有三个较小规模的反应(反应038、反应039、和反应040)显示CEX活性比验证试验1(反应035)有所提高(表24)。但是，与反应039相比，在具有升高的半胱氨酸浓度(反应040)的实验中或在孵育期间没有连续混合(反应038)的实验中，相应的CEX活性没有增大。因此，半胱氨酸浓度和孵育期间搅拌都不能由此被识别为主要影响因子。尽管如此，中试规模的验证试验1(反应035)的溶解氧(dO2)曲线(图8)显示大约3小时孵育之后dO2增大，表明半胱氨酸的还原力已经耗尽。在进行连续搅拌的两个较小规模的实验反应039和反应040的dO2图中，显示直到处理结束dO2都没有增大(数据未显示)，表明半胱氨酸的还原力在这些较小规模实验中尚未耗尽。
实施例8.2-验证试验2过程中的半胱氨酸步骤的调查
不同于验证试验1中7L的填充体积，本实施例中的填充体积为14L，并使用两个搅拌器进行搅拌(位于底部的辐向搅拌器和附加的位于顶部的轴向搅拌器)。半胱氨酸浓度(4mM)和搅拌器速度(100rpm)与验证试验1反应035相同。选择性还原之后，通过CEX测得的抗体溶液活性仅为85.5％。根据图9显示的dO2图，半胱氨酸还原力的耗尽甚至早于验证试验1(图8)，暗示通过连续搅拌传递到溶液中的氧比验证试验1更明显。
图8-9中的dO2曲线趋势提示，通过连续搅拌跨越顶部空间传递的氧是验证试验1和2过程中选择性还原步骤之后活性较低的主要根源原因。对于验证试验1中的7L填充体积，只有一个搅拌器(位于底部的辐向搅拌器)浸没在半胱氨酸处理步骤的工艺溶液中。对于验证试验2的14L填充体积，有两个搅拌器(位于底部的辐向搅拌器和位于顶部的轴向搅拌器)浸没在工艺溶液中，导致更进一步提高氧传递到溶液中。因此，验证试验2的甚至更差的结果最可能是由于有增多的氧传递到工艺溶液中，可通过dO2曲线(图9)观察到。由于验证试验2具有较高的到溶液中的氧传递，半胱氨酸的还原力更早耗尽，导致CEX活性较低。因此，应限制到工艺介质中的氧传递，例如通过调节孵育期间的混合(速度、持续时间、频率)。
实施例8.3-验证试验3过程中的半胱氨酸步骤的调查
填充体积为16L而非验证试验2中的14L，并调整搅拌情况。不同于半胱氨酸处理过程中的连续搅拌，每小时仅施行2分钟混合，对应于较早的工艺B2。选择性还原步骤之后通过CEX测定的抗体溶液活性为92.5％。
由于在半胱氨酸处理步骤中省略了连续混合，氧传递受到限制，确保了足够的还原力，并导致高CEX活性。图10的dO2图显示氧含量的急剧降低-在处理开始时几乎到零％。这个实验证明，在半胱氨酸处理过程中调节引入的氧量可确保恰当的反应条件并因此得到高CEX活性。
实施例8.4-验证试验4过程中的半胱氨酸步骤的调查
基于验证试验3的结果，进行第4次中试规模的验证试验(反应040)，采用与验证试验3相同的设定和工艺条件。但是，原液中的半胱氨酸处理从4mM增大至6mM，使得验证试验4的工艺能应对更高的到溶液中的氧传递。这种增大的还原力必须针对可能的抗体过度还原加以平衡。尽管如此，基于反应040的结果(参见表24)，这种改进代表了一种低失败风险的改变。选择性还原步骤之后反应040的CEX活性为91.9％。
在图11中显示了验证试验4的dO2图。类似于验证试验3，加入半胱氨酸之后dO2降低并保持低含量，表明这个实验中的半胱氨酸还原力没有耗尽，同时满足了通过CE-SDS测定的产品纯度要求。
在图12中，对验证试验3和验证试验4的反应动力学就CEX活性和CE-SDS纯度进行比较。两个实验的CEX活性动力学具有可比性；大约2h之后达到平台，此后，在后续2小时处理中的活性增大比较小。CE-SDS纯度曲线于反应早期略有不同，其中，较高半胱氨酸浓度(6mM)的试验中纯度降低较明显。但是，这两种过程都在半胱氨酸处理结束时导致可比的产品品质，两者都适当地确保了充分的产品品质。然而，考虑到工艺溶液中升高的氧含量的影响，在验证试验4中施行的具有提高的半胱氨酸浓度的工艺预计在半胱氨酸处理过程中到工艺溶液中的氧传递变化方面更为稳定。最后，为制造规模的半胱氨酸处理步骤选择6mM的半胱氨酸浓度(与13.5mg抗体＝65.75:1摩尔比的半胱氨酸:抗体[即，约66:1])，与验证试验4的条件相同。发明人还注意到，在以约275:1(半胱氨酸:蛋白质)的摩尔比进行的试验中(数据未显示)获得了更快的CEX活性动力学(1小时内平台)。
实施例8的概要和结论
发明人确定，半胱氨酸处理步骤过程中升高的氧含量会对CEX活性产生有害影响，这可能是因为氧消除了半胱氨酸的还原力，导致苏金单抗C97的还原不足。当以生产规模工作时，通过改变半胱氨酸/蛋白质比例、使用限定的搅拌速度、或甚至采用搅拌中断，能管控从大气吸收的氧。
基于验证试验的结果，将半胱氨酸浓度从4mM(半胱氨酸/蛋白质摩尔比为43.84)增大至6mM(半胱氨酸/蛋白质摩尔比为65.75)，应能抗衡反应溶液中存在的氧。而且，要在选择性还原反应的孵育期间降低存在的溶解氧含量，在孵育期间用每小时混合2分钟的方式来代替连续混合。虽然在工艺验证期间改变了选择性还原过程，但识别了清晰的根源原因(在选择性还原过程中传递到溶液中的氧含量)，确保了经过调节的半胱氨酸处理步骤在药物物质中具有充分的CEX活性。
实施例9：选择性还原步骤的表征
在统计学设计中评价选择性还原步骤的输入参数蛋白质浓度、半胱氨酸浓度和搅拌器速度的影响。使用输出参数CEX活性和CE-SDS纯度来评估选择性还原步骤之后的产品品性并限定经过证明的输入参数的可接受范围。根据较早的设计工艺限定输出参数范围。使用这些限制来限定输入参数范围。
另外，使用三个规模缩小的模型定性试验和以制造规模进行的七个选择性还原循环的结果，对研究还原力的最差/最好情况以及专注孵育时间和孵育温度的试验来评估选择性还原之后的产品性质。
实施例9.1-工艺表征：响应面设计
实施例9.1.1-实验设计和方法。
对于响应面设计，选择蛋白质含量、半胱氨酸浓度和孵育期间搅拌模式(无搅拌、以50或100rpm连续搅拌)作为输入参数，参见表25。
Figure GDA0002469027060000541
Figure GDA0002469027060000551
表25：输入参数。1)对应于选择性还原过程中限定的半胱氨酸浓度。“ALC含量”是指抗体浓度。
采用以“加入TITR3的稀释因子”表示的各种半胱氨酸浓度，其反映工艺条件和潜在变化，例如因称量不准确、溶液加入不准确等引起。抗体浓度对半胱氨酸/蛋白质比例作出贡献，也在本设计之内进行测试以检测潜在的相互作用。另外，孵育期间的搅拌器速度作为输入参数进行测试，因为如实施例8中所示，从顶部空间传递到溶液中的氧影响了选择性还原步骤。
使用具有3个中心点试验的中心复合面设计。这种设计支持以线性、相互作用和二次项形式计算数学模型。使用源自制造规模试验B012307的苏金单抗INAKT.F(储存在低于-60℃)。用于工艺表征的缓冲液是滴定缓冲液AIN457-TITR1(1M Tris碱，pH 10.8[pH范围大于等于10.0，电导率0.10-0.30mS/cm])、滴定缓冲液AIN457-TITR2(0.3M正磷酸，pH 1.4[pH范围小于等于2.0；电导率范围19.5-22.7mS/cm])、滴定缓冲液AIN457-TITR3(120mM半胱氨酸-HCl+20mM二-Na-EDTA，pH 8.0[pH范围7.8-8.2；电导率范围14.7-18.3mS/cm])。
在带搅拌生物反应器(最大2L体积)中在环境气氛和自由空气交换条件下以合格的规模缩小模型(如实施例10中详细描述)进行实验，并监控pH、溶解氧、搅拌器速度和温度。实验设计计划如表26中所示。所有非独立研究部分的输入参数都如表27保持恒定为各自目标值。
Figure GDA0002469027060000552
Figure GDA0002469027060000561
表26：实验设计计划。1)中心点。
Figure GDA0002469027060000562
表27：选择性还原步骤的工艺参数。1)每小时以50rpm速度搅拌2分钟。
在手感温热的水浴中解冻INAKT.F并用WFI稀释到目标浓度。pH调节之后，将1L该溶液转移到合格的配备有dO2探针和搅拌器的2L生物反应器中。通过加入计算体积的半胱氨酸储备溶液(TITR3缓冲液)到实现表28中所列的半胱氨酸目标浓度来开始选择性还原。在60分钟之内在50rpm搅拌条件下将溶液加热到37℃的孵育温度。然后，以50或100rpm的连续搅拌或者不搅拌(0rpm)，按照实验设计计划将溶液在37℃孵育300分钟。300分钟反应时间(60分钟加热和240分钟孵育)之后，取样品(反应PT300)。在37℃额外孵育60分钟之后(60分钟加热和300分钟孵育)，在60分钟之内以50rpm的搅拌器速度将溶液冷却到环境温度并取另一个样品(反应P，总反应时间420分钟)。通过这个过程就能在两个时间点评价设计(称为“反应PT300”和“反应P”)并评价孵育时间的潜在影响。
实施例9.1.2-响应面设计的输出参数
样品反应PT300和反应P的产品品质输出参数值在表28(按照反应PT300样品中CEX活性上升排序)和表29(按照反应P样品中CEX活性上升排序)中列出。一般来说，数据显示，所有试验都具有高的CE-SDS纯度(大于90％)，但是一些试验具有较低的CEX活性(小于90％)。对于反应PT300样品中的CEX活性(表28)，有一个试验具有低活性(89.4％)。在这个试验(反应085)中，半胱氨酸浓度处于下限，抗体浓度高(因此半胱氨酸/蛋白质摩尔比为最低)，并且搅拌速度为最高(最高的氧传递率)。而且，可以看到，有一组八个试验具有高活性(超过96％)，它们包括了所有不进行搅拌的试验。
Figure GDA0002469027060000571
表28：按照反应PT300样品的CEX上升排序的反应PT300和反应P的输入参数和性质输出参数值。1)中心点。
如表29中所示，对于反应P样品中的CEX活性，有一组六个试验得到较低的活性(小于94％)，该组包括所有具有高搅拌器速度的试验。值得注意的是，所有无搅拌的试验都得到最高的CEX活性(超过96％)。同样可从表29中看出，在以100rpm进行的试验中，反应P样品的CEX下降(与反应PT300样品中的CEX活性相比)，在以50rpm进行的试验中也是如此(较不明显)。半胱氨酸摩尔比处于下端时在这些试验中观察到最多的下降(例如，在反应085中摩尔比为约46:1，从89.4％下降到84.0％，在反应075、反应084和反应072中也类似)。
Figure GDA0002469027060000581
表29：按照反应P样品的CEX上升排序的反应PT300和反应P的输入参数和性质输出参数值。1)中心点。
统计学诊断(表30)指出对两个时间点的CE-SDS纯度和对在选择性还原结束时的反应P的CEX活性的统计学显著性模型。对反应PT300的CEX活性的模型显示出较低的统计学显著性(Q2为0.15)。
Figure GDA0002469027060000582
Figure GDA0002469027060000591
表30：对反应PT300和反应P的产品品质输出参数的模型诊断。与数据良好一致的模型的R2和Q2接近于1.0，并且模型有效性超过0.25。具有低统计学显著性的模型具有低R2和Q2值。
实施例9.1.2.1-时间点1(反应PT300)的产品品质输出参数的模型评价
时间点反应PT300的CEX活性的系数图和等高线图证明，输入参数孵育期间的搅拌器速度(stir)影响了CEX活性(数据未显示)。参数蛋白质浓度(contA)和半胱氨酸浓度(dil-c)在调查范围内显示对CEX活性没有统计学显著的影响。为了实现高CEX活性，孵育期间的搅拌器速度应较低。
如表29中所示，时间点反应PT300的所有实验都具有至少90％的CE-SDS纯度。系数图(数据未显示)证明，所有三个输入参数都会影响CE-SDS纯度。还存在对于ALC含量(contA)和搅拌器速度(stir)的二次项。存在对于TITR3加入的稀释因子(dil-c代表半胱氨酸浓度)和搅拌器速度的相互作用项，以及对TITR3加入的稀释因子和ALC含量的相互作用项。在等高线图中(数据未显示)，形象化的模型系数表明，高的搅拌器速度、高的TITR3加入稀释因子(相应为低的半胱氨酸浓度)、和中等至高的ALC含量会对CE-SDS纯度产生正面影响。所有这些设定都会降低半胱氨酸的还原力并对抗体完整性产生正面影响。不过，由于所有试验都具有高的CE-SDS纯度，整个调查的输入参数范围都适合于确保选择性还原之后得到充分的CE-SDS纯度。
实施例9.1.2.2-时间点2(反应P)的产品性质输出参数的建模
关于时间点反应P的CEX活性的图13A的系数图和图13B的等高线图证实，尤其是输入参数搅拌器速度(stir)会影响CEX活性。因此，为了实现高CEX活性，在孵育过程中应进行最少的搅拌以限制到溶液中的氧传递。而且，低的TITR3加入稀释因子(dil-c，相应为高的半胱氨酸浓度)对于选择性还原之后的CEX活性是有益的。另外，搅拌器速度和TITR3加入稀释的相互作用对CEX活性具有明显、但较小的影响，而ALC含量和TITR3加入的稀释因子的相互作用是边界性的。ALC含量的影响不明显。这些结果清楚表明，增大还原力的那些条件，例如通过最小的搅拌速度使氧传递受限以及通过较小的稀释得到较高的半胱氨酸浓度，都导致较高的CEX活性。
如表29中所示，时间点反应P的所有实验都具有至少90％的CE-SDS纯度。对于CE-SDS纯度的系数和等高线图(数据未显示)证明，输入参数ALC含量(代表蛋白质浓度)、TITR3加入的稀释因子(dil-c，代表半胱氨酸浓度)、和搅拌器速度(搅拌，代表氧传递)对CE-SDS纯度仅产生较小影响。搅拌器速度表现出二次项效果，TITR3稀释因子和搅拌器速度的相互作用是统计学显著的。通过中等至高的搅拌器速度和高的TITR3加入稀释因子，能提高CE-SDS纯度。这些设定降低了半胱氨酸的还原力并对抗体完整性产生正面影响。不过，由于所有试验都符合对CE-SDS纯度的规定范围，整个调查的输入参数范围都适合于确保选择性还原步骤之后的充分的CE-SDS纯度。
实施例9.1.2.1-溶解氧含量与输出参数的关系
对表26中所示的反应的氧曲线进行分析以确定输入参数搅拌速度、抗体含量和半胱氨酸浓度对氧含量的影响。这些氧曲线的图在图14中提供(注意：x轴上的0至1.00对应于1h加热阶段，此时所有试验中都以50rpm进行搅拌；1.00至6.00对应于5h孵育阶段，此时以0rpm[即，无搅拌]、50、或100rpm进行搅拌；6.00至7.00对应于1h冷却阶段，此时在所有试验中都以50rpm进行搅拌)。所有试验都显示，在早期阶段中溶解氧降低至低含量。值得注意的是，这种降低在具有低抗体含量的试验(参见0rpm系列中的试验反应090和反应080(图14A)，50rpm系列中的反应086(图14B)和100rpm系列中的反应084和反应081(图14))中较不明显，而在具有高抗体含量的试验中最为明显(参见图14中15.4mg/mL图的试验的曲线)。
在孵育期间不搅拌的所有试验中(图14A)，孵育和冷却阶段期间的dO2含量都保持低于约20％。而且，除了反应086以外，在孵育期间采用50rpm搅拌的试验中(图14B)，尽管在孵育阶段中通过50rpm搅拌允许氧传递，但孵育和冷却步骤期间的dO2含量都保持低于约20％。但是，在试验反应072中，半胱氨酸浓度较低(4.8mM)，在最终冷却阶段发现氧含量略微增大。在孵育期间采取100rpm搅拌的试验(图14C)显示出非常不同的曲线。首先，如上所述，具有低抗体含量(10mg/mL)的试验(反应084和反应091)显示出较慢的dO2降低，这种趋势在孵育阶段期间持续。但是，在试验反应084中，半胱氨酸浓度较低(4.8mM)，dO2含量然后在孵育的最后时段5.00和6.00小时期间升高至几乎饱和的含量。在试验反应085中甚至在较早时间(小时4.00)就观察到这样的增大。反应085也使用低半胱氨酸含量，但同时使用高抗体含量(15.4mg/mL)。同样在试验反应075中在冷却阶段期间(6.00至7.00小时)观察到dO2含量的增大。在试验反应075中，半胱氨酸浓度为中等水平(6.0mM)。
这些曲线清楚地表明，反应混合物中的氧消耗速率快于其从顶部空间传递到该混合物中的速率，在具有较高抗体浓度的试验中氧的消耗较快。从而提示，抗体本身可能触发dO2消耗。在具有低半胱氨酸含量的试验中选择性还原较后阶段的氧增加表明，氧消耗与半胱氨酸(Cys-SH)的反应相关，可能如下所示：4Cys-SH+O2→2Cys-SS-Cys+2H2O和/或2Cys-SH+3O2→2Cys-SO3H。事实上，在试验反应085中，该速率快到足以在约4h之后消耗掉所有半胱氨酸，在试验反应084中，快到足以在5h之后消耗掉所有半胱氨酸(图14C)。消耗掉半胱氨酸之后，dO2含量恢复到饱和含量(100％dO2)。
要研究抗体对氧消耗的影响，发明人以50mL规模使用6mM半胱氨酸和50rpm的搅拌器速度进行了两个额外的试验。在一个试验中，抗体浓度为12.7mg/ml(半胱氨酸:抗体摩尔比＝69.89:1，即约70:1)；在另一个试验中，抗体浓度为零。如图14D中所示，在没有抗体的试验中，在第一小时中dO2降低到大约75％，期间反应温度从20℃上升到37℃。这种75％的dO2降低非常符合所报告的dO2饱和浓度从20℃时的8.9mg/L降低到37℃时的6.6mg/L(U.S.Geological Survey TWRI Book 9，April，98)。在孵育阶段的剩余期间dO2含量保持恒定。一旦开始冷却阶段(6小时之后)，dO2含量就会因为温度从37℃降低至20℃而增大。因此，在无抗体时，溶液中没有氧消耗，或者通过半胱氨酸进行的氧消耗以低速率发生，使得因搅拌导致的从顶部空间的氧传递立即对该消耗加以补偿。相反，在具有抗体的试验中，dO2含量稳定降低长达约5.5小时。在孵育阶段的最后0.5小时中，dO2含量略增大，然后在冷却阶段期间dO2含量的增大趋势更强(即，从6至7小时)。因此，在这种包含抗体的试验中，在5.5小时之后，可能大部分(或甚至全部)半胱氨酸都被消耗掉。事实上，对这个试验的氨基酸分析显示(数据未显示)升高的胱氨酸含量，对应于半胱氨酸几乎完全消耗。
结合这个信息，就能将一些试验中出现的低CEX活性与其dO2曲线联系起来。试验反应085(图14C)(半胱氨酸:抗体摩尔比为约46:1)在反应PT300(来自5.00小时时间点的样品)具有89.4％的CEX活性(参见表28)，因为半胱氨酸在4.00时间点以后已经被消耗，导致抗体还原不完全。反应085(图14C)在之后的时间点反应P(来自终点7.00小时的样品)具有甚至更小的CEX活性(84.0％，参见表29)，因为在反应最后阶段具有高氧含量，在无半胱氨酸的情况下，导致抗体发生氧化降解。试验反应084(图14C)半胱氨酸:抗体摩尔比为约71:1)和反应075(图14C)(半胱氨酸:抗体摩尔比为约71:1)是另两个在之后的时间点反应P具有较低活性的试验(都为88.9％)，尽管在较早的反应PT300时间点具有高活性。在这些试验中，抗体的还原似乎在时间点5.00(反应PT300时间点)完全；但是，在之后的时间点反应P因为dO2含量升高且不含半胱氨酸而发生降解。类似地，对于试验反应072(图14B)(半胱氨酸:抗体摩尔比为约56:1)发现的在之后时间点反应P的较低活性(90.2％)可通过反应冷却阶段期间氧含量升高来解释。在0rpm试验中获得高活性(甚至在试验反应082中，其具有高抗体含量和低半胱氨酸浓度[半胱氨酸:抗体摩尔比为约46:1])的原因在于，氧传递速率低并且因此半胱氨酸消耗是微不足道的，确保在还原的后期冷却阶段期间发生完全还原(并且同时保护)避免氧化降解。
总之，在还原体系中应保持氧传递较低，因为氧会消耗还原剂(半胱氨酸)，该消耗由抗体本身介导(或加速)。因此这种半胱氨酸消耗存在双重影响：1)半胱氨酸还原力的损失导致在较早的时间点反应PT300发生CysL97-SH的不完全解封闭；和2)若没有可用的残余半胱氨酸在反应P300和反应P之间的时间段内保护解封闭的Cys97L-SH，则会发生解封闭Cys97L-SH的再氧化。
实施例9.2-工艺表征：最差/最好的情况
最差/最好情况研究的主要目的是表征在实验设计(DOE)研究期间没有测试但在工艺风险分析中被评估为可能重要的选择性还原步骤的输入因子。还使用这些数据来限定被证明可接受的范围并支持基于其对产品属性的影响效果的输入参数分级。
实施例9.2.1-实验设计和方法。
延长加热时间被评估为可能有显著性，因为其由于延长搅拌持续时间而提高氧向选择性还原溶液中的传递，从而导致半胱氨酸转化成胱氨酸的还原力降低，从而减少抗体的选择性还原。出于同样原因，提高初始dO2含量也评估为可能的显著性输入参数。
半胱氨酸巯基基团的氧化是H依赖性的。因此，也将pH的影响评估为可能的显著性输入参数。
高还原力可能导致过度还原抗体并且延长的冷却时间可能促进抗体重新组装。因此，也将延长冷却时间也评估为可能的显著性输入参数。
虽然已经在较早的工艺开发过程中测试了温度(32-42℃)，将其评估为可能有显著性。通常，温度降低时化学反应的速率也降低。因此，在专注试验中测定上限和下限处动力学。
还调查了孵育时间。短的孵育时间可能导致选择性还原原液中的过度还原的产品含量增大。相反，延长的孵育时间可能导致如响应面设计结果中所示的较低CEX活性(参见表29，反应PT300和反应P样品的CEX活性)。
限定了三个最差/最好情况系列以评估上述参数对选择性还原步骤的影响。在最差/最好情况系列中评估还原力的输入参数如表30中所示。设计第二个最差/最好情况系列以评价温度对选择性还原步骤的影响(表31)。在第三个最差/最好情况研究中按照表32中列出的输入参数评价孵育时间的影响。用于评估最差/最好情况研究结果的产品性质输出参数是CEX活性和CE-SDS纯度。
名称 单位 下限 上限
包括搅拌的加热时间 [分钟] 45 90
包括搅拌的冷却时间 [分钟] 45 90
开始的溶解氧 [％] 60 100
工艺pH [-] 7.8 8.2
表30：评估还原力量的影响的输入参数。
名称 单位 下限1 下限2 <sup>1)</sup> 上限
孵育温度 [℃] 18 32 42
表31：用以评估孵育温度的影响的输入参数。1)测试了32℃，由于18℃时的选择性还原的反应速率不够，导致反应不完全。
名称 单位 下限 上限
孵育时间 [分钟] 210 330
表32：用以评估孵育时间的影响的输入参数。
进行专注试验以评价另外可能的重要参数的影响。使用来自制造规模试验B008530的INAKT.F(储存在低于-60℃)苏金单抗。缓冲剂AIN457-TITR1、AIN457-TITR2和AIN457-TITR3如实施例10中所述。以合格的规模缩小模型(如实施例10中详细描述)在开放的带搅拌生物反应器(最大2L体积)中进行实验，同时监控pH、溶解氧、搅拌器速度和温度。对于所有试验，施行表27的工艺参数。不作为独立研究一部分的所有输入参数都在标准程序的操作范围之内保持恒定为表27中的目标值。
实施例9.2.2-最差/最好情况的结果
用于调查加热时间、冷却时间、起始dO2和工艺pH的影响的实验设计计划和输出参数(CE-SDS纯度和CEX活性)在表33中示出。用于调查孵育温度的影响的实验设计计划和输出参数(CS-SDS纯度和CEX活性)在表34中示出。用于调查孵育时间的实验设计计划和输出参数(CE-SDS纯度和CEX活性)在表35中示出。
如表33中所示，具有低还原力和高还原力的重复样试验产生高的CEX活性和CE-SDS纯度。因此，该工艺能涵盖落在测试范围之内的输入参数加热时间和冷却时间(包括搅拌)、起始dO2含量和工艺pH的各种变化。
Figure GDA0002469027060000641
表33：用于调查加热时间、冷却时间、起始dO2和工艺pH的实验设计计划和输出参数。1)因较高pH、较高起始dO2含量以及较长加热和冷却时间而具有较低还原力的重复样试验。2)因较高pH、较低起始dO2含量以及较短加热和冷却时间而具有较高还原力的重复样。
用以评价孵育温度的影响的实验结果在表34中示出。可以看到，CE-SDS纯度总是较高，而高的CEX活性只在32℃及以上的试验中获得。
Figure GDA0002469027060000642
表34：用于调查孵育温度的影响的实验设计计划和输出参数。1)另外的中心点试验。
另外，在不同的孵育温度下确定CEX活性的动力学。这些结果如图15中所示。可以看到，42℃时的动力学比32℃时更快，尤其是在较后的阶段中(60分钟和更长时间)。但是，在两个温度下，都在240分钟和反应P达到相同的平台。在18℃，反应速率较慢，导致在测试的步骤持续时间内，CEX活性的增大较慢。
用以评价孵育时间的影响的实验结果如表35中所示。在所有情况中都获得了高的活性和纯度。
Figure GDA0002469027060000651
表35：用于调查孵育时间的影响的实验设计计划和输出参数。1)短孵育时间。2)长孵育时间。
实施例9.3-工艺参数的分级和理由
实施例9.3.1-响应面设计研究：可接受的范围
在所有实验中，时间点1(反应PT300)和选择性还原结束时(反应P)的CE-SDS纯度都至少为90％。要实现高水平的CE-SDS纯度，输入参数TITR3加入稀释因子应设定为较高且搅拌器速度应设定为中等至高水平。这些条件对应于低的还原力，因为半胱氨酸浓度较低且跨越顶部空间的氧传递增大。在选择性还原步骤期间，输入参数ALC含量即抗体浓度在时间点1(反应PT300)具有显著影响，理想值在中心点附近。在调查的范围之内，抗体浓度(ALC含量)对CE-SDS纯度绝对值的影响是次要的。但是，在所有实验中都达到了规定的纯度值，并且对参数ALC含量(抗体浓度)、TITR3加入稀释因子(半胱氨酸浓度)和搅拌器速度(氧传递)调查的所有范围都能适当地确保在选择性还原之后获得充分的CE-SDS纯度。
对于除了反应085以外的所有试验，在时间点1(反应PT300)的CEX活性都至少为90％(参见表28)。这个实验以高水平的搅拌器速度进行，代表较高的氧传递。除了例外试验，较长的孵育时间(即，额外的60分钟，时间点反应P)对于输出参数CEX活性不是特别有益的，因为另两个实验(反应075和反应084，参见表29)显示出低于93％的CEX活性。这些实验都具有高搅拌器速度或高TITR3加入稀释因子，代表低的半胱氨酸浓度和增大的跨越顶部空间的氧传递。这些结果提示，要实现最高的CEX活性，输入参数搅拌器速度应设定为低水平，意味着低的氧传递，并且TITR3加入稀释因子应设定为中心点或低水平，意味着较高的半胱氨酸浓度。输入参数ALC含量，代表抗体浓度，对这些实验中的CEX活性没有显著影响。
输入参数搅拌器速度介导了从顶部空间到溶液中的氧传递，对于选择性还原步骤很重要，应设定为其下限以确保充分的CEX活性。根据另外的制造规模试验(B018838，数据未显示)测试了最多每小时15分钟搅拌，导致在选择性还原步骤之后获得可接受的产品品质。但是，实施例8的结果显示，对于各种规模和设定，通过搅拌传递到溶液中的氧都是独特的，并且是间接控制的。因此，在例如工艺改变或规模放大时，应评估孵育期间的搅拌条件。孵育期间的搅拌间接代表了传递到反应溶液中的dO2含量，从工艺角度将其分级为显著性输入参数。
输入参数ALC含量(称为抗体浓度)和TITR3加入稀释因子(称为半胱氨酸浓度)显示出统计学显著性效果，但是它们被充分控制并对选择性还原步骤产生次要影响。因此从工艺角度考虑，将它们分级为非关键的。只要孵育期间的混合时间落在可接受的范围之内，在对半胱氨酸浓度和抗体浓度进行调查的范围之内的变化就都会在选择性还原步骤之后给出充分的工艺性能和产品性质。关于这些输入参数的经过证明的可接受范围的列表如表36中所示。
Figure GDA0002469027060000661
表36：关于孵育期间搅拌器速度、ALC含量和TITR3加入稀释因子(半胱氨酸浓度)的可接受范围。1)按照制造规模的表征试验，批次B018838，SITE A，孵育时间4h。
实施例9.3.2-最差/最好情况研究：可接受的范围
在如表37中所示的调查范围之内，输入参数加热时间和冷却时间(包括搅拌)、起始dO2含量以及工艺pH对产品品质属性CEX活性和CE-SDS纯度没有显著影响。但是，由于响应面设计的经验，应避免有太多氧传递到选择性还原溶液中，因为这将降低还原力。氧传递对于各种规模和设定都是特定的，但在有氧工艺中，间接受其他工艺条件例如搅拌和进入顶部空间的气流的控制。因此，加热和冷却过程中的搅拌会影响氧传递，必须进行仔细评价，尤其是在例如工艺变化、工艺转移或规模放大的情况中。因此，从工艺角度考虑将加热和冷却时间(包括搅拌)分级为显著性参数。虽然测试了45-90分钟范围的加热和冷却时间(包括搅拌)，但可接受的范围被设定为小于等于90分钟，因为90分钟的加热和冷却时间(包括搅拌)反映了就氧传递导致合适的CEX活性和CE-SDS纯度而言的最差情况。
名称 单位 下限 上限
包括搅拌的加热时间 [分钟] 45 90
包括搅拌的冷却时间 [分钟] 45 90
起始溶解氧 [％] 60 100
工艺pH [-] 7.8 8.2
表37：加热时间、冷却时间、起始溶解氧和工艺pH的测试范围。
调查了输入参数孵育温度的实验结果证明，18℃的孵育温度导致产生不充分反应的慢反应动力学。低温不足以使CEX活性在240分钟的孵育时间内增大至高于93.0％的水平。因此，将18-42℃的测试范围缩小到32-42℃以确保在选择性还原步骤之后得到充分的CEX活性，尽管在18-42℃的孵育温度范围内能实现产品品质属性CE-SDS纯度。因此可接受的孵育温度范围是，下限32℃且上限42℃。
最后，测试的210-330分钟孵育时间范围能确保在选择性还原步骤之后得到充分的CEX活性和CE-SDS纯度。
实施例9的概要和结论
根据工艺表征研究的结果，限定了所调查的工艺输入参数的可接受范围。通过两个产品品质输出参数CE-SDS纯度和CEX活性来表征选择性还原步骤。参数分级和可接受范围概括在表38中。对于PAR的半胱氨酸:抗体比例为约46:1至约118:1。对于SOR的半胱氨酸:抗体比例为约54:1至约83:1。
Figure GDA0002469027060000671
表38：包括分级的选择性还原步骤的输入参数。1)用WFI稀释之后且pH调节和TITR3加入之前，2)加热之前。3)孵育期间。4)按照制造规模的表征试验，批次B018838，孵育时间4h。5)与加入WFI并用TITR1调节pH之后的介质体积有关。
在选择性还原步骤开始时，氧使半胱氨酸的还原力变温和，而向溶液中的连续氧传递导致氧含量增加并使抗体的CEX活性减小。但是，在选择性还原步骤结束时，氧的引入会强化抗体中二硫键的形成，这些二硫键在反应开始还原力较强时发生解离，因此氧对确保充分的非还原性CE-SDS纯度很重要。通过响应面设计研究的结果证明了氧传递对抗体活性的重要性，其中观察到搅拌器速度对氧传递、进而对产品的CEX活性的显著影响(参见表28和29)。但是，搅拌器速度对dO2含量的不同影响取决于容器尺寸、搅拌器尺寸、搅拌器类型等。因此，重要的是识别能用于比较各物理设定之间向溶液中传递氧的差异的变量。
实施例10：规模缩小模型的氧传递率(kLa*)
在之前的实施例中，发明人指出的内容包括：选择性还原期间、尤其是孵育步骤期间存在的dO2量强烈影响苏金单抗的性质和活性。在有氧条件下进行选择性还原时，反应中的氧含量不受直接控制，而是经由其他操作条件例如搅拌速度和向顶部空间的气流进行控制。各反应的物理设定也会影响反应混合物中存在的氧含量(设备和操作条件一起形成“系统”)。可使用“kLa*”比较各物理设定和特定抗体处理步骤期间之间的传递到溶液中的氧量(参见例如Garcia-Ochoa和Gomez(2009)Biotechnology Advances 27:153-176；Bandino等(2001)Biochem.Engineering J.8:111-119；Juzrez和Orejas(2001)LatinAm.Appl.Res.31:433-439；Yange和Wang(1992)Biotechnol.Prog.8:244-61)。KLa*表示随时间经由顶部空间在不鼓泡条件下传递到溶液中的氧量。这个值对于各设定和规模都是特定的，并取决于搅拌器类型、搅拌器速度、填充体积和溶液与顶部空间接触的表面积，受到各容器单独的几何形状影响。虽然各物理设定的kLa*不同，但由于选择性还原步骤期间溶液中的氧含量显著影响苏金单抗的活性和完整性，所以发明人预期，在表现出类似kLa*范围的系统中进行的选择性还原步骤将得到具有类似品质的苏金单抗制品。
无法在氧传递实验中直接确定kLa*。而是用氮替换测试溶液中的dO2，并使用经校准的dO2探针来监控dO2随时间的增大，从而产生实验dO2曲线。然后，通过根据下示等式将饱和曲线匹配至实验dO2曲线(例如使用
Figure GDA0002469027060000681
)，对具体系统计算kLa*值：
DO＝C×(1-e-kLa*×(t-t0))，其中DO＝溶解氧测得值，C是氧的饱和值(表示当无限搅拌并达到饱和时的100％)，e＝2.718281…，t＝对应于DO值的时间点，t0＝开始时间点。
该等式代表为确定向溶液中的氧传递(kLa*值)而建立的经验式的积分形式。该式已由不同作者在不同实验中验证(Doran，P.M.1995.Bioprocess EngineeringPrinciples，Academic Press，San Diego，California，9.10.2章，210-213页)。
实施例10.1-实验和统计学设计方法
由于溶解氧含量是影响氧化还原反应的重要因子，所以对氧传递进行评估以对规模缩小模型定性并与制造规模进行比较。
使用统计学设计来确定kLa*值对输入参数体积、进入顶部空间的气流、搅拌器速度和搅拌器类型的依赖性。输入参数在表39中列出。以各自根据统计学设计计划的3个水平调查各因子。输出参数是kLa*值。
Figure GDA0002469027060000691
表39-规模缩小模型的kLa*值确定的输入参数。
要确定各样品的kLa*值，在2L生物反应器中填充水并加热到37℃。通过质量流量计控制气流并施加于顶部空间。然后，向溶液鼓泡氮气以从水中除去dO2。然后，使用rushton涡轮(辐向)施加恒定搅拌。一段时间过后，使用氧探针(经过约18-25℃室温校准)记录水中的dO2含量直到dO2达到90％。然后，通过如上所述将饱和曲线匹配至实验dO2曲线，计算kLa*值。
使用具有3个中心点试验的中心复合面居中设计(CCF)。选择该设计以确定最重要的工艺参数与其对kLa*影响之间的关系。这种设计支持以线性、相互作用和二次项形式计算数学模型。
实施例10.3-输出参数(kLa*)值
实验条件和工艺性能输出参数kLa*的值在表40中列出。
Figure GDA0002469027060000692
Figure GDA0002469027060000701
表40-统计学设计-进行的顺序和实验条件。
实施例10.4-对于输出参数kLa*的统计学诊断
通过4种工具来代表模型的性质；即，R2、Q2、模型有效性和重复样的标准偏差(SD)。能良好解释数据的模型将具有接近于1.0的R2和Q2以及超过0.25的模型有效性。在一种模型分析中，发明人认识到，没有变换的kLa*结果的评价得到残差不符合正态分布要求的模型。这表明，kLa*值的变换对以恰当方式描述结果为必须，这在生物反应器中普遍的kLa*观察中时有所见。对工艺性能输出参数的模型诊断是，R2＝0.98、Q2＝0.91(-0.5幂次变换之后)、模型有效性＝0.56且重复样的标准偏差＝0.06，表明模型具有高的统计学显著性。
实施例10.5-数学模型的说明
在残差的N-图中，将标准化残差(响应的残差除以标准偏差)绘于横轴，将正态概率绘于纵轴。偏离点(outlier)将在其位于±4标准化残差以外时通过图表识别。同样，非线性图可指示需要进行输出参数变换的模型(《实验设计-原理和应用》(Design ofExperiments-Principles and Applications)，(1999-2008)MKS Umetrics AB，Eriksson等编辑)。工艺输出参数kLa*的残差N-图(数据未显示)指出，实验结果与模型良好匹配。数值密切拟合回归线的值，表示该模型变换是充分的(标准化残差符合正态分布的要求)。另外，所有实验值都落在±3标准化残差范围内，表明这些测得值不包括任何偏离点。
工艺输出参数的系数图(数据未显示)指出，输入参数气流、体积和搅拌器速度对工艺参数kLa*具有显著影响。等高线图(数据未显示)说明气流、体积和搅拌器速度对kLa*的作用——气流越高、体积越小(即顶部空间越大)且搅拌器速度越快，则以kLa*表示的跨越顶部空间的氧传递越大。
使用等高线图和系数图，通过使用统计学模型以MODDE 8.02对实验条件的相应kLa*值进行预测。结果在表41中示出，证明了在工艺表征过程中(参见实施例9)使用规模缩小模型测试的kLa*范围。
Figure GDA0002469027060000711
表41-在工艺表征研究期间使用的参数设定和相应的kLa*值。
实施例11：制造规模的氧传递率(kLa*)
确定了在制造规模中(1800L容器)在恒定搅拌期间(即，在选择性还原工艺的加热和冷却阶段期间采用的搅拌类型)的kLa*。
实施例11.1-在制造规模中在站点A确定kLa*值
实施例11.1.1-实验和统计学设计方法
使用统计学设计来确定所测试的输入参数范围内的kLa*的依赖性。输入参数在下表42中列出。按照统计学设计计划各因子以3个水平进行调查。输出参数是kLa*值。
Figure GDA0002469027060000712
表42：在制造规模中在站点A测定kLa*值的输入参数。
在最大工作体积1800L、高度2.7m且直径1.0m的不锈钢容器中进行站点A的这些实验。要确定各样品的kLa*值，在容器中填充水并加热到指定温度。然后向顶部空间施加氮气从水中除去dO2。然后施加恒定搅拌(使用底部的螺旋桨搅拌器)。一段时间过后，使用氧探针(经过例如18-25℃的室温校准)记录水中的dO2含量直到dO2达到90％。然后，如上所述通过将饱和曲线匹配至实验dO2曲线，计算kLa*值。输入参数和相应结果在表43中显示。
使用具有4个中心点的中心复合面居中(CCE)设计。选择该设计来确定最重要的输入参数与其对氧传递的影响之间的关系。这种设计支持以线性、相互作用和二次项形式计算数学模型。
实施例11.1.2-输出参数(kLa*)值
实验条件和工艺性能输出参数kLa*的值在表43中列出。
Figure GDA0002469027060000721
表43：统计学设计-进行顺序和实验条件。
实施例11.1.3-输出参数kLa*的统计学诊断
通过4种工具表示模型性质，即，R2、Q2、模型有效性和重复样的标准偏差(SD)。能良好解释数据的模型将具有接近于1.0的R2和Q2以及大于0.25的模型有效性。具有低的统计学显著性的模型具有低的R2和Q2值。发明人认识到，对没有变换的kLa*结果的评价会得到残差不符合正态分布要求的模型。这表明，必须对kLa*进行变换才能以适当的方式描述这些结果。要获得稳定的模型，输出参数进行-0.5幂级变换。对工艺性能的模型诊断为，R2＝0.95，Q2＝0.88，模型有效性＝0.82，SD＝0.15，表明模型具有高的统计学显著性。
实施例11.1.4-数学模型的说明
工艺输出参数kLa*值的残差N-图(数据未显示)指出，实验结果与模型良好匹配。数值密切拟合回归线，表示该模型转换是合适的(标准化残差符合正态分布的要求)。另外，所有实验值都落在±3标准化残差范围的内侧，表明这些测得值不包括偏离点。
系数图(数据未显示)指出，由于误差范围(error bar)不切割x轴，所有输入参数即搅拌速度、体积和温度对工艺参数kLa*值都具有显著影响。另外，搅拌器速度和体积的相互作用是显著的。KLa*值的等高线图(数据未显示)说明温度、体积和搅拌器速度对kLa*的作用，即，温度越高、体积越小且搅拌器速度越快，则以kLa*表示的跨越顶部空间的氧传递越大。
实施例11.1.5-制造规模的专注试验的结果
在专注实验中确定kLa*值并与通过MODDE 8.02计算的模型的预测进行比较。预测和专注试验的结果在表44中示出。根据这些结果，数学模型能以充分方式预测kLa*值。
Figure GDA0002469027060000731
表44：制造规模(位置A)的标准工艺条件的kLa*值(预测值和测得值)。
实施例11.1.6-对站点A的工艺条件预测的kLa*
使用通过MODDE 8.02计算的模型预测站点A AT493021活动期间所用工艺条件的kLa*。结果在表45中示出，施加恒定搅拌时，预测的kLa*值为0.05h-1至0.69h-1。该值表明，在从不同工艺体积得到的宽泛kLa*值范围内，工艺步骤是稳健的。应当在工艺稳健性的最终评估中考虑对kLa*产生影响(并进而对氧传递产生影响)的参数，例如总体搅拌时间显著影响氧传递。
Figure GDA0002469027060000732
表45：制造规模下(站点A)工艺条件的kLa*值。1)体积超过评价范围。外推法会导致不准确的值。
实施例12：合格试验以及规模缩小模型与制造规模在位置A的比较
实施例12.1-方法
在标准条件下进行三个规模缩小的模型合格试验(反应065、反应066和反应067)，并与在制造规模下进行的七个代表性试验进行比较。对于规模缩小的合格试验，使用来自制造规模试验B008530(AT493021活动，站点A)的INAKT.F苏金单抗(储存在低于-60℃)。在使用前将装载物(INAKT.F)在手感温热的水浴(15-35℃)中解冻。全部选择性还原程序的步骤在表46中示出。
Figure GDA0002469027060000741
表46：选择性还原程序的说明。*加入WFI的计算：体积(WFI)＝(体积(INAKT.F)*c(INAKT.F)/13.5mg/mL)-体积(INAKT.F)；**加入TITR3的计算：体积(TITR3)＝(体积(INAKT.F)+体积(WFI)+体积(TITR1))*因子(TITR3)，其中因子(TITR3)＝0.05/0.95＝0.05263(6mM半胱氨酸在反应溶液中)。
对规模缩小的模型合格试验施行在表47中列出的工艺参数。对应于制造规模(站点A)的工艺条件的参数进行了适当的规模缩小。
Figure GDA0002469027060000742
Figure GDA0002469027060000751
表47-选择性还原步骤的工艺参数。1每小时以50rpm搅拌2分钟。
取样品，用0.3M磷酸调节pH，pH在5分钟之内从1.4(AIN457-TITR2)调节至5.2(可接受的范围5.0-5.4)，然后将样品转移到分析实验室。所有保留的样品都冷冻并储存在小于等于-60℃。如上所述，通过比较产品品质属性CEX活性和CE-SDS纯度，从而评估规模缩小模型的合格性。测试以下时间间隔：0，10，20，30，45，60，120，240分钟。
实施例12.2-结果
来自三个代表性制造规模试验(数据未显示)和规模缩小模型合格试验(图16)的溶解氧图表显示了选择性还原步骤的特征形状。曲线显示，通过半胱氨酸的氧化从体系中除去了溶解氧。根据开发经验，延长搅拌导致更多的氧传递并得到不充分的CEX活性。因此，选择性还原溶液在孵育期间每小时仅搅拌2-15分钟，从而限制到溶液中的氧传递并在选择性还原停止之前一直保持低的溶解氧含量。在冷却阶段期间，氧含量因为通过连续混合引起氧传递到溶液中而略微增大，当特定量的半胱氨酸被氧化时，使其无法作为还原剂来应付溶解氧。
对于在站点A AT493021活动的制造规模试验3-6，平均CEX活性为96.3％，标准偏差为0.8％，而平均CE-SDS纯度为92％，标准偏差为1％。各试验结果在表48中示出，还包括来自表45的预测kLa*值。
Figure GDA0002469027060000752
Figure GDA0002469027060000761
表48：制造规模试验的实验结果。
对于规模缩小的模型合格试验，CEX活性平均值为95.0％，标准偏差为1.6％，而CE-SDS纯度平均值为94％，标准偏差为1％(表49)。
Figure GDA0002469027060000762
表49：规模缩小的模型合格试验的实验结果。
除了在选择性还原步骤结束时的产品品质评估，还要监控CEX活性的动力学，并比较规模缩小的模型试验(反应065、66和67的平均值)和站点A制造规模的结果。结果在图17中示出。来自规模缩小的模型的数据落在制造规模的变化之内，证明大规模(站点A)和小规模的动力学具有可比性。
实施例13-实施例9-12的kLa*值的综合分析
由于选择性还原反应期间溶液中的溶解氧含量具有重要性，所以来自容器顶部空间的受控氧传递对于选择性还原步骤而言是很重要的。对于各系统，可将这些变量捕获为kLa*值。KLa*受到各容器独立几何形状影响，取决于搅拌器速度、搅拌器类型、填充体积、温度以及与顶部空间接触的溶液表面积而变化。虽然kLa*会根据各设定变化，但通过以上实验可以看出，可接受一定范围的kLa*值以确保选择性还原工艺过程中的苏金单抗品质和活性。
通过使用统计学模型确定了相对于规模缩小研究的实验条件的预测kLa*范围为0.18h-1-0.37h-1(表41)。对于给定的体积，随着搅拌速度减小，kLa*值减小。由于实施例9中的响应面设计实验条件和设定与实施例10中规模缩小模型所用的相同，所以可将表41的预测kLa*值与表28中的条件和结果相关联。这个分析在表50中示出。
Figure GDA0002469027060000771
表50-对反应PT300和反应P输出参数值的kLa*分析。摩尔比圆整至最接近的整数。基于氨基酸序列的苏金单抗相对分子量为147944道尔顿，其用于计算第4栏中的半胱氨酸/蛋白质摩尔比。
对于具有240分钟孵育周期(反应PT300)的实验，除了反应085以外的所有反应都得到非常高的选择性还原性能以及通过CEX和CE-SDS(表50)测定的充分产品品质。反应085的搅拌速度为100rpm，孵育期间的kLa*值为0.37h-1，并且半胱氨酸/抗体摩尔比非常低(约46:1)。低的半胱氨酸/抗体摩尔比，以及高的到容器中的氧传递(由高kLa*值表示)，可能导致反应不充分。
对于具有300分钟孵育周期(反应P)的实验，除了反应085、反应075和反应084的所有反应都得到非常高的选择性还原性能以及通过CEX和CE-SDS(表50)测定的充分产品品质。反应085、反应075和反应084的搅拌速度为100rpm，孵育期间的kLa*值为0.37h-1，并且半胱氨酸/抗体摩尔比为低至中等(约46:1和约71:1)。低至中等的半胱氨酸/抗体摩尔比以及到高的到容器中的氧传递(由高kLa*值表示)可能导致反应不充分。增加的孵育时间(相对于反应PT300样品)似乎对一些反应P试验中的较差CEX值有贡献。
从表50中可以看出，CEX活性大于90％的反应就选择性还原反应的孵育部分期间体系中的kLa*而言具有以下特性：
1)若选择性还原反应的孵育步骤期间体系中的kLa*小于0.37h-1，则半胱氨酸:抗体摩尔比可以在约46:1至约118:1的范围内变化(对于孵育时间较短和较长的情况都是如此，例如为约210至约330分钟，例如240-300分钟)；和
2)若半胱氨酸:蛋白质摩尔比为约56:1至约118:1(对于孵育时间较短的情况，例如最长至约240分钟孵育)或为约77:1至约118:1(对于孵育时间较长的情况，例如最长至约300分钟孵育)，则选择性还原反应的孵育步骤期间体系中的kLa*可高达0.37h-1。
当然加热和冷却阶段期间的kLa*可以比孵育阶段期间的kLa*高得多，例如表54示出，在加热/冷却阶段期间可施行高达0.69h-1的kLa*并仍然产生高品质的产品。
实施例9(工艺表征研究)使用规模缩小的模型，在孵育阶段期间施加恒定的搅拌，检查输出参数CEX活性和CE-SDS纯度。实施例10检查同样施加恒定搅拌的规模缩小模型的kLa*值。实施例11以制造规模使用连续搅拌来检查kLa*值。在实际制造过程中，只在选择性还原反应的加热和冷却阶段期间施加连续搅拌，而在选择性还原反应的孵育阶段期间施加间歇搅拌(例如每小时2-15分钟)。因此，在制造过程中，选择性还原反应步骤的孵育阶段期间体系的kLa*将比实施例10和11中观察到的kLa*值低得多。而且，结合实施例9-11的结果可以看出，若半胱氨酸:抗体摩尔比在约46:1至约118:1之间，则整个选择性还原步骤(即，加热阶段、孵育阶段和冷却阶段)一般可采用小于0.37h-1的kLa*进行，包括约240至约300分钟的孵育阶段。
实施例9的最差/最好情况实验使用相同的合格规模缩小模型进行，所用半胱氨酸:抗体摩尔比为约66:1，在孵育阶段期间(kLa*小于0.18h-1)进行可忽略的搅拌(即每小时2分钟)。由于在实施例9的最差/最好情况实验中，孵育210至330分钟的反应都产生了高性质的产品，所以发明人预计，若kLa*较低且半胱氨酸:抗体的摩尔比为中等(例如约66:1)，则可将孵育时间扩展至约210-约330分钟。
实施例14-优选的选择性还原工艺参数和程序
优选的选择性还原步骤的工艺参数在表51中列出。设定点的半胱氨酸:抗体摩尔比为约66:1，建议的操作范围为约54:1至约83:1，经过证明的可接受范围为约46:1至约118:1。
Figure GDA0002469027060000791
表LLLLL：选择性还原-工艺参数列表。
选择性还原程序的各独立步骤在表52中示出。首先，通过加入WFI至13.5mg/mL的目标浓度来调节起始材料的蛋白质浓度。接着，通过加入1M Tris将pH调节至8.0。检查dO2，若不符合操作范围则调节(例如至大于等于60％)，例如通过进一步混合、浸没通气等。加入半胱氨酸至6mM开始反应，然后将溶液加热(约一小时)至孵育温度(约37℃)。将溶液孵育约250分钟，每小时进行约2分钟搅拌以限制在孵育时间期间从顶部空间到溶液中的氧传递。最后，将溶液冷却至室温(约一小时)，并将pH调节至约5.2，例如用0.3M正磷酸，来停止反应。
Figure GDA0002469027060000792
Figure GDA0002469027060000801
表52：选择性还原程序的说明。*计算加入WFI：体积(WFI)＝(体积(INAKT.F)*c(INAKT.F)/13.5mg/mL)-体积(INAKT.F)；**计算加入TITR3：体积(TITR3)＝(体积(INAKT.F)+体积(WFI)+体积(TITR1))*因子(TITR3)，其中因子(TITR3)＝0.05/0.95＝0.05263(6mM半胱氨酸在反应溶液中)。
序列表
<110> 诺华股份有限公司（Novartis AG）
M·黑兹曼（Heitzmann, Markus）
J·温克勒（Winkler, Johann）
<120> IL-17抗体中半胱氨酸残基的选择性还原
<130> 56418 FF
<140> 在此附随
<141> 在此附随
<150> 62/095361
<151> 2014-12-22
<160> 15
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1 = AIN457重链的高变区1
<400> 1
Asn Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2 = AIN457重链的高变区2
<400> 2
Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR3 = AIN457重链的高变区3
<400> 3
Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp Tyr Phe
1 5 10 15
Asp Leu
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR1' = AIN457轻链的高变区1
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR2' = AIN457轻链的高变区2
<400> 5
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR3' = AIN457轻链的高变区3
<400> 6
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Cys Thr
1 5
<210> 7
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<400> 7
gag gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt agt aac tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
tgg atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aaa ggg ctg gag tgg gtg 144
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc gcc ata aac caa gat gga agt gag aaa tac tat gtg ggc tct gtg 192
Ala Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly Ser Val
50 55 60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga gtc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gtg agg gac tat tac gat att ttg acc gat tat tac atc cac tat tgg 336
Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp
100 105 110
tac ttc gat ctc tgg ggc cgt ggc acc ctg gtc act gtc tcc tca 381
Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 8
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp
100 105 110
Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 9
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<400> 9
gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc agc 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag tat ggt agc tca ccg 288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
tgc acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa cga 327
Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 10
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR1-x = AIN457重链的高变区x
<400> 11
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR2-x = AIN457重链的高变区x
<400> 12
Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR3-x = AIN457重链的高变区x
<400> 13
Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr
1 5 10 15
Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
20
<210> 14
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 15
<211> 457
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp
100 105 110
Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
130 135 140
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
195 200 205
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
210 215 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225 230 235 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
275 280 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
325 330 335
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
340 345 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455

Claims (35)

1.一种选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的苏金单抗抗体制品中的CysL97的方法，其包括：
a)使该制品与至少一种还原剂在体系中接触以形成还原混合物，其中，所述至少一种还原剂是含硫醇的还原剂，通过硫醇-二硫化物交换测得，其在pH 7.0时的标准氧化还原电势E0为-0.20V至-0.23V，并且该还原混合物中的还原剂:抗体摩尔比为46:1至118:1之间；和
b)孵育该还原混合物同时保持该体系中的体积氧传质系数(kLa*)≤0.37h-1，所述kLa*通过将饱和曲线匹配至溶解氧曲线而算得；
其中，在步骤a)之前，使用在25℃校准的氧探针测得，该制品中的初始氧饱和百分比为至少60％，
在孵育步骤之前进行加热，且加热时间≤90分钟；
在孵育步骤之后冷却混合物，且冷却时间≤90分钟；
按照步骤b)将该还原混合物在20℃至42℃之间的温度下孵育210至420分钟，并且
在与还原剂接触之前的抗体制品pH为7.4至8.5。
2.一种选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的苏金单抗抗体制品中的CysL97的方法，其包括：
a)使该制品与半胱氨酸在体系中接触以形成还原混合物，所述还原混合物中半胱氨酸:抗体摩尔比为46:1至118:1之间；和
b)孵育该还原混合物同时保持该体系中的体积氧传质系数(kLa*)≤0.37h-1，所述kLa*通过将饱和曲线匹配至溶解氧曲线而算得，
其中，在步骤a)之前，使用在25℃校准的氧探针测得，该制品中的初始氧饱和百分比为至少60％，
在孵育步骤之前进行加热，且加热时间≤90分钟；
在孵育步骤之后冷却混合物，且冷却时间≤90分钟；
按照步骤b)将该还原混合物在20℃至42℃之间的温度下孵育210至420分钟，并且
在与还原剂接触之前的抗体制品pH为7.4至8.5。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤b)期间该体系中的kLa*为：
a.≤0.37h-1，并且其中该还原混合物中的半胱氨酸:抗体摩尔比为56:1至118:1之间，并且其中按照步骤b)将该还原混合物孵育多至240分钟；
b.≤0.37h-1，并且其中该还原混合物中的半胱氨酸:抗体摩尔比为77:1至118:1之间，并且其中按照步骤b)将该还原混合物孵育多至300分钟；
c.＜0.37h-1，并且其中该还原混合物中的半胱氨酸:抗体摩尔比为46:1至118:1之间；
d.＜0.37h-1，并且其中该还原混合物中的半胱氨酸:抗体摩尔比为54:1至82:1之间；或
e.≤0.27h-1。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述还原混合物中的半胱氨酸:抗体摩尔比为66:1。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述还原混合物中的半胱氨酸浓度为4.0mM至8.0mM。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a)和步骤b)之间，将该还原混合物加热至32℃至42℃之间的温度用时45至90分钟，其中在加热期间该体系中的kLa*≤0.69h-1，所述kLa*通过将饱和曲线匹配至溶解氧曲线而算得。
7.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，不将该还原试剂的氧化形式加入还原混合物中。
8.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，不将变性剂加入还原混合物中。
9.一种选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的苏金单抗抗体制品中的CysL97的方法，其包括：
a)使该制品在体系中与浓度为4.0mM至8.0mM的半胱氨酸接触以形成还原混合物；
b)将该还原混合物加热至32℃至42℃之间的温度用时45至90分钟，其中在加热期间该体系中的体积氧传质系数kLa*＜0.69h-1；
c)在32℃至42℃之间的温度下孵育该还原混合物同时将该体系中的kLa*维持为：
i.≤0.37h-1，并且其中该还原混合物中的半胱氨酸:抗体摩尔比为56:1至118:1之间，并且该还原混合物孵育多至240分钟；
ii.≤0.37h-1，并且其中该还原混合物中的半胱氨酸:抗体摩尔比为77:1至118:1之间，并且该还原混合物孵育多至300分钟；
iii.＜0.37h-1，并且其中该还原混合物中的半胱氨酸:抗体摩尔比为46:1至118:1之间；
iv.＜0.37h-1，并且其中该还原混合物中的半胱氨酸:抗体摩尔比为54:1至82:1之间；或
v.≤0.27h-1；
在孵育步骤之后冷却混合物，且冷却时间≤90分钟；
所述kLa*通过将饱和曲线匹配至溶解氧曲线而算得；并且，在步骤a)之前，使用在25℃校准的氧探针测得，该制品中的初始氧饱和百分比为至少60％；在与还原剂接触之前的抗体制品pH为7.4至8.5。
10.如权利要求1～5、9中任一项所述的方法，其特征在于，通过胱胺-CEX测得，在步骤b)之后60分钟之内，该制品中的IL-17抗体的活性水平升高至少10％。
11.一种选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的苏金单抗抗体制品中的CysL97的方法，其包括:
a)将该制品中的苏金单抗抗体浓度调节至4mg/ml-19.4mg/ml之间；
b)将该制品中的氧饱和百分比调节到至少60％；
c)将该制品的pH调节至7.4-8.5；
d)使该制品与半胱氨酸在容器中接触以形成还原混合物，其中该还原混合物中的半胱氨酸浓度为4.0mM-8.0mM；
e)将该还原混合物加热至32℃-42℃之间的温度，且加热时间≤90分钟；
f)将来自步骤e)的还原混合物在32℃-42℃之间的温度下孵育，所述孵育进行210-420分钟，同时保持该容器中的体积氧传质系数(kLa*)≤0.37h-1，所述kLa*通过将饱和曲线匹配至溶解氧曲线而算得，
g)将从步骤f)得到的混合物冷却至16℃-28℃的温度，所述冷却进行45-90分钟；和
h)将从步骤g)得到的混合物的pH调节至5.1-5.3之间。
12.通过如权利要求3-10中任一项的方法产生的苏金单抗抗体的纯化制品，其中通过十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)测得的该制品中的完整苏金单抗含量为至少90％，并且其中通过胱胺-CEX测得的该制品中的苏金单抗活性水平为至少90％。
13.一种苏金单抗抗体纯化制品，其中，苏金单抗抗体轻链第97位的半胱氨酸被选择性还原，通过十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)测得的该制品中的完整苏金单抗含量为至少90％，并且其中通过胱胺-CEX测得的该制品中的苏金单抗的活性水平为至少90％。
14.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，所述苏金单抗抗体存在于液体组合物中。
15.如权利要求14所述的苏金单抗抗体纯化制品，所述液体组合物是柱洗脱液、来自下游过滤步骤的抗体原液或渗析缓冲液。
16.如权利要求15所述的苏金单抗抗体纯化制品，所述苏金单抗抗体是由哺乳动物细胞重组产生的。
17.如权利要求16所述的苏金单抗抗体纯化制品，所述哺乳动物是CHO细胞。
18.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，选择性还原之前，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平小于80％。
19.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，选择性还原之前，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平小于75％。
20.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，选择性还原之前，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平小于70％。
21.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，选择性还原之前，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平小于65％。
22.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，选择性还原之前，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平小于60％。
23.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，选择性还原之前，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平小于55％。
24.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，选择性还原之前，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平小于50％。
25.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，选择性还原之前，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平小于45％。
26.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，选择性还原之后，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平增大至少15％。
27.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，选择性还原之后，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平增大至少20％。
28.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，选择性还原之后，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平增大至少25％。
29.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，选择性还原之后，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平增大至少30％。
30.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平为至少92％。
31.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平为至少93％。
32.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，所述制品中通过胱胺-CEX测得的苏金单抗活性水平为至少96％。
33.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，所述制品中通过CE-SDS测得的完整苏金单抗含量为至少92％。
34.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，所述制品中通过CE-SDS测得的完整苏金单抗含量为至少93％。
35.如权利要求13所述的苏金单抗抗体纯化制品，所述制品中通过CE-SDS测得的完整苏金单抗含量为至少96％。
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