MX2014009662A - Formulacion de anticuerpo beta amiloide. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con una formulación farmacéutica que comprende aproximadamente 50 mg/ml-200 mg/ml de un anticuerpo Abeta, aproximadamente 0.01%-0.1% de poloxámero, aproximadamente 5 mM-50mM de una solución amortiguadora, aproximadamente 100 mM-300 mM de un estabilizador a un pH de aproximadamente 4.5-7.0.

Description

FORMULACION DE ANTICUERPO BETA AMILOIDE Campo de la Invención La presente invención se refiere a una formulación farmacéutica de una molécula de anticuerpo, y/o una mezcla de moléculas de anticuerpo contra el péptido beta-amiloide (Abeta) .

Antecedentes de la Invención Las moléculas de anticuerpo, como parte del grupo de los productos farmacéuticos de proteínas, son muy susceptibles a la degradación física y química, tales como desnaturalización y agregación, desamidación, oxidación e hidrólisis. La estabilidad de la proteína está influenciada por las características de la propia proteína, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos, y por influencias externas, tales como temperatura, pH solvente, excipientes, interfaces, o velocidades de cizallamiento . Por lo tanto, es importante definir las condiciones de formulación óptimas para proteger la proteína contra las reacciones de degradación durante la fabricación, almacenamiento y administración. (Manning, M. C, K. Patel, et al (1989) "Stability of protein pharmaceuticals . " Pharm Res 6(11): 903-18., Zheng, J. Y. and L. J. Janis (2005) . "Influence of pH, buffer species, and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298." Int) _Pharm. ) . La Ref. 249709 administración de anticuerpos a través de la vía subcutánea o intramuscular requiere alta concentración de proteínas en la formulación final, debido a las altas dosis requeridas frecuentes y los volúmenes de administración limitados. (Shire, S. J. , Z. Shahrokh, et al. (2004). "Challenges in the development of high protein concentration formulations . " J Pharm Sci 93(6): 1390-402., Roskos, L. K. , C. G. Davis, et al. (2004). "The clinical pharmacology of therapeutic monoclonal antibodies." Drug Development Research 61(3): 108-120.) La fabricación a gran escala de alta concentración de proteína se puede lograr mediante procesos de ultrafiltración, proceso de secado, tales como liofilización o de secado por pulverización, y procesos de precipitación. (Shire, S.I., Z. Shahrokh, et al. (2004). "Challenges in the development of high protein concentration formulations . " J Pharm Sci 93(6): 1390-402.).

Breve Descripción de la Invención Es un objeto de la presente invención proporcionar una formulación estable altamente concentrada de un anticuerpo Abeta o de mezclas de tales anticuerpos, que permite la administración subcutánea del anticuerpo a un paciente.

La formulación de la presente invención muestra una buena estabilidad durante el almacenamiento durante 8 meses a 2-8°C y 25°C sin formación de partículas visibles. Agitar y múltiples pasos de congelación-descongelación se aplicaron a la formulación líquida para simular las condiciones de estrés físico que se producen potencialmente durante la fabricación o el transporte del producto de fármaco.

La formulación farmacéutica de la presente invención comprende un poloxámero como tensioactivo para reducir la agregación de los anticuerpos y la formación de partículas. El término "poloxámero" como se usa en el presente documento incluye un copolímero de tres bloques de polioxietileno-polioxipropileno conocido como poloxámero 188, comercializado bajo el nombre comercial PLURONIC® F68 por BASF (Parsippany, Nueva Jersey) . Otros poloxámeros que pueden utilizarse en las formulaciones de la presente invención incluyen poloxámero 403 (comercializado como PLURONIC® P123) , poloxámero 407 (comercializado como PLURONIC® P127) , poloxámero 402 (comercializado como PLURONIC® P122) , poloxámero 181 (comercializado como PLURONIC® L61) , poloxámero 401 (vendido como PLURONIC ® L121) , poloxámero 185 (vendido como PLURONIC P65 ®) , y poloxámero 338 (vendido como PLURONIC® F108) .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona una formulación de anticuerpo farmacéutico líquido estable que comprende: - aproximadamente 50 mg/ml - 200 mg/ml de un anticuerpo Abeta, aproximadamente 0.01%-0.1% de un poloxámero, preferiblemente poloxámero 188, aproximadamente 5 mM - 50 mM de una solución amortiguadora, - aproximadamente 100 mm - 300 mm de un estabilizador, a un pH de aproximadamente 4.5-7.0 En una modalidad particular de la presente invención, la concentración de anticuerpo Abeta es aproximadamente 100 mg/ml - 200 mg/ml , preferiblemente aproximadamente 150 mg/ml.

En una modalidad particular de la presente invención, el poloxámero está presente en una concentración de aproximadamente 0.02%-0.06%, preferiblemente aproximadamente 0.04%.

En una modalidad particular de la presente invención, la solución amortiguadora es una solución amortiguadora de acetato de sodio o una solución amortiguadora de histidina, preferiblemente una solución amortiguadora de histidina/histidina-HCl .

En una modalidad particular de la presente invención, la solución amortiguadora tiene una concentración de aproximadamente 10 a 30 mm, preferiblemente aproximadamente 20 mM.

En una modalidad particular de la presente invención, el pH de la formulación es aproximadamente 5-6, preferiblemente solución amortiguadora 5.5.

En una modalidad particular de la presente invención, el estabilizador es seleccionado de azúcares y aminoácidos.

En una modalidad particular de la presente invención, el estabilizador es seleccionado de trehalosa y arginina .

En una modalidad particular de la presente invención, el estabilizador tiene una concentración de aproximadamente 100 mM hasta 300 mM.

En una modalidad particular de la presente invención, el estabilizador es trehalosa y tiene una concentración de aproximadamente 150 mM a 250 mM, preferiblemente aproximadamente 200 mM.

En una modalidad particular de la presente invención, el estabilizador es arginina y tiene una concentración de aproximadamente 100 mM hasta 150 mM, preferiblemente aproximadamente 135 mM.

En una modalidad particular de la presente invención, el anticuerpo Abeta es un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada y una cadena ligera.

En una modalidad particular de la presente invención, la cadena pesada del anticuerpo Abeta comprende un dominio VH que comprende : - Una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la Sec. Id. N°4, - Una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. N°5, - Una secuencia CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la Sec. Id. N°6.

En una modalidad particular de la presente invención, la cadena ligera del anticuerpo Abeta comprende un dominio VL que comprende : - Una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. N°7, - Una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la sec. Id. N°8, - Una secuencia CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. N°9.

En una modalidad particular de la presente invención, el dominio VH del anticuerpo Abeta comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. N°2 y el dominio VL del anticuerpo Abeta comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. N° 3.

En una modalidad particular de la presente invención, la cadena pesada del anticuerpo Abeta comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. N°10.

En una modalidad particular de la presente invención, la cadena ligera del anticuerpo Abeta comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. N°ll.

En una modalidad particular de la presente invención, el anticuerpo Abeta monoclonal es una mezcla de anticuerpos Abeta mono-glieosilados y anticuerpos Abeta doble-glicosilados , en donde el anticuerpo mono-glicosilado comprende una asparagina glicosilada (Asn) en la posición 52 de la Sec. Id. N°2 en el dominio VH de un único sitio de unión al anticuerpo y en donde el anticuerpo doble glicosilado comprende una asparagina glicosilada (Asn) en la posición 52 de la Sec . Id. N°2 en el dominio VH de ambos sitios de unión de anticuerpos y en el que la mezcla comprende menos de 5% de un anticuerpo que es no glicosilado en la posición 52 de la Seq. Id. N° 2 en el dominio VH.

En una modalidad particular, la presente invención proporciona el uso de la formulación farmacéutica de la presente invención para la administración subcutánea del anticuerpo Abeta .

Los términos "anticuerpo Abeta" y "un anticuerpo que se une a Abeta" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unir el péptido ?ß con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en la orientación de péptido ?ß .

Se debe observar que ?ß tiene varias formas de origen natural, por lo que las formas humanas se conocen como las ?ß39, ?ß40, ?ß41, ?ß42 y ?ß43 mencionadas anteriormente. La forma más prominente, ?ß42, tiene la secuencia de aminoácidos (a partir de N-terminal) : DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA (Sec ID N° 1). En ?ß41, ?ß 40, ?ß 39, los aminoácidos C-terminal A, IA y VIA están desaparecidos, respectivamente. En la forma ?ß 43 un residuo de treonina adicional está compuesto en el extremo C-terminal de la secuencia representada anteriormente (Sec Id N° 1) .

El término "anticuerpo Abeta mono-glicosilado" se refiere a una molécula de anticuerpo que comprende una N-glicosilación en la posición 52 de la Sec. Id. N° 2 en una región (VH) de una molécula de anticuerpo individual. El término "anticuerpos Abeta de doble-glicosilación" define una molécula de anticuerpo que es N-glicosilada en la posición 52 de la Sec. Id. N° 2 en ambas regiones variables de la cadena pesada de anticuerpos no glicosilados" . Las moléculas de anticuerpo que carecen de una de N-glicosilación en ambos dominios (VH) de cadena pesada son llamados anticuerpos no-glicosilados" , el anticuerpo mono-glicosilado", el anticuerpo doble glicosilado y el anticuerpo no glicosilado pueden comprender las secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes secuencias de aminoácidos. El anticuerpo mono-glicosilado y el anticuerpo doble glicosilado son referidos aquí como "isoformas de anticuerpos glicosilados" . Una molécula de anticuerpo purificado caracterizada en que por lo menos un sitio de unión de antígeno comprende una glicosilación en la región variable de la cadena pesada (VH) es un anticuerpo mono-glicosilado que está libre de o en un grado muy bajo asociado con una isoforma seleccionada de un anticuerpo doble-glicosilado y un anticuerpo no glicosilado, en este caso, un "anticuerpo mono-glicosilado purificado" . Un anticuerpo doble glicosilado en el contexto de la presente invención está libre de o en un grado muy bajo asociado con una isoforma seleccionada de un anticuerpo mono-glicosilado y un anticuerpo no glicosilado, en este cuerpo, un "anticuerpo doble glicosilado purificado" .

El término "anticuerpo" abarca las diversas formas de estructuras de anticuerpo, incluyendo pero no limitándose a anticuerpos completos y fragmentos de anticuerpos. El anticuerpo de acuerdo con la invención es preferiblemente un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, o anticuerpo manipulado genéticamente, siempre y cuando se conserven las propiedades características de acuerdo con la invención .

"Fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, preferiblemente el dominio variable del mismo, o por lo menos el sitio de unión al antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen diacuerpos, moléculas de anticuerpo de una sola cadena, y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpos. Anticuerpos scFv, por ejemplo, se describen en Houston, JS, Methods in Enzymol . 203 (1991) 46-96). Además, los fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos de una sola cadena que tienen las características de un dominio VH, es decir, es capaz de ensamblarse junto con un dominio VL, o de un dominio VL que se une a ?ß, es decir, es capaz de ensamblarse junto con un dominio VH a un sitio de unión del antígeno funcional y por lo tanto proporciona la propiedad.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza aquí, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición de un solo aminoácido.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, en este caso, región de unión, de una fuente o especie y por lo menos una porción de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, habitualmente preparada por técnicas de ADN recombinante . Se prefieren los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable de murina y una región constante humana. Otras formas preferidas de "anticuerpos quiméricos" abarcados por la presente invención son aquellos en los que la región constante se ha modificado o cambiado de la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente en lo que se refiere a la unión de Clq y/o unión del receptor Fe (FcR) . Tales anticuerpos quiméricos también son referidos como "anticuerpos de cambio de clase.". Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas de transfección de genes de ADN recombinante y convencionales son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Morrison, SL, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; Patentes Estadounidenses Nos. 5,202,238 y 5,204,244.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los que han sido modificados el marco o "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) para comprender la CDR de una inmunoglobulina de diferente especificidad en comparación con la de la inmunoglobulina original. En una modalidad preferida, una CDR de murina se injerta en la región marco de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo humanizado" . Ver por ejemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327.; y Neu-Berger, MS, et al., Nature 314 (1985) 268-270. CDRs particularmente preferidas corresponden a las que representan secuencias que reconocen los antígenos observados anteriormente para los anticuerpos quiméricos. Otras formas de "anticuerpos humanizados" abarcados por la presente invención son aquellos en los que la región constante se ha modificado adicionalmente o cambiado de la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente en lo que se refiere a la unión de Clq y/o unión de receptor Fe (FcR) .

El término "anticuerpo humano" , como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variable y constante derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos en el arte previo (van Dijk, M.A. , and van de Winkel, J.G., Curr . Opin. Chem. Biol . 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, durante la inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos durante la exposición al antígeno (ver, por ejemplo, Jakobovits, A., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol . 7 (1993) 33-40). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en bibliotecas de expresión en fagos (Hoogenboom, H.R., and inter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks , J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597) . Las técnicas de Colé et al. y Boerner et 1 al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); and Boerner, P., et al., J. Immunol . 147 (1991) 86-95). Como ya se ha mencionado para los anticuerpos quiméricos y humanizados de acuerdo con la invención, el término "anticuerpo humano" , como se usa en el presente documento también comprende tales anticuerpos que están modificados en la región constante para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente en lo que se refiere a la unión de Clq y/o unión de FcR, por ejemplo, por "cambio de clase" , en este caso el cambio o mutación de partes Fe (por ejemplo, de IgGl a IgG4 y/o mutación IgGl/lgG4. ) .

El término "epítopo" incluye cualquier determinante de polipéptido capaz de unión específica a un anticuerpo. En ciertas modalidades, epítopo determinante incluye agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activa tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, fosforilo o sulfonilo, y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que está unido por un anticuerpo .

El "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL) , dominio variable de una cadena pesada (VH) ) tal como se utiliza aquí significa cada uno del par de dominios de cadena ligera y pesada que están implicados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios de cadena pesada y ligera variables tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias están ampliamente conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDRs) . Las regiones marco adoptan una conformación de lámina ß y las CDRs pueden formar bucles que conectan la estructura de lámina ß. Las CDRs en cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional por las regiones marco y forman junto con las CDRs de la otra cadena el sitio de unión de antígeno. Las regiones CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo juegan un papel particularmente importante en la especificidad de unión/afinidad de los anticuerpos de acuerdo con la invención y por lo tanto proporcionan un objeto adicional de la invención.

El término "porción de unión al anticuerpo" cuando se usan aquí, se refieren a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno" . La porción de unión al antígeno de un anticuerpo comprende los residuos de aminoácidos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" . Regiones "marco" o "FR" son aquellas regiones de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se definen aquí. Por lo tanto, los dominios variables de cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo comprenden desde extremo N-terminal a extremo C- terminal de los dominios FRl, CDR1 , FR2 , CDR2, FR3 , CDR3 , y FR4. Especialmente, la CDR3 de la cadena pesada es la región que más contribuye a la unión del antígeno y define las propiedades del anticuerpo. Las Regiones CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición estándar de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" .

El término "estabilizador" significa un excipiente farmacéuticamente aceptable, que protege el ingrediente farmacéutico activo y/o la formulación de la degradación química y/o física durante la fabricación, almacenamiento y aplicación. Vías de degradación química y física de productos farmacéuticos de proteínas son revisados por J. L . , M. F. Powell, et al. (1993) . "The development of stable protein formulations : a cióse look at protein aggregation, deamidation, and oxidation." Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4) : 307-77, Wang, W. (1999) . "Instability , stabi-lization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals . " Int J Pharm 185(2) : 129-88., Wang, W. (2000) . "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals . " Int J Pharm 203 (1-2) : 1-60. and Chi , E. Y . , . S. Krishnan, et al . (2003) . "Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregat ion . " Pharm Res 20(9) : 1325-36. Los estabilizadores incluyen, pero no se limitan a azúcares, aminoácidos, polioles, tensioact ivos , antioxidantes, conservantes, ciclodextrinas , polietilenglicoles, por ejemplo PEG 3000, 3350, 4000, 6000, albúmina, por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA) , albúmina de suero de bovinos (BSA) , sales, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, quelantes, por ejemplo EDTA como se define más adelante. Como se ha mencionado anteriormente, los estabilizadores pueden estar presentes en la formulación en una cantidad de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 500 mM, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 300 mM y más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 300 mM.

Una "formulación de anticuerpo farmacéutica líquido estable" es una formulación de anticuerpo líquido sin cambios significativos observados a una temperatura refrigerada (2-8°C) durante por lo menos 12 meses, en particular de 2 años, y más particularmente 3 años. Los criterios de estabilidad son los siguientes: no más de 10%, particularmente 5%, de monómero de anticuerpo se degrada mientras se mide por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) . Además, la solución es incolora o de clara a ligeramente opalescente mediante análisis visual. La concentración de proteína de la formulación tiene no más de +/- 10% de cambio. No más de 10%, particularmente 5% de agregación es formada. La estabilidad se mide por métodos conocidos en el arte previo, tales como espectroscopia UV, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) , cromatografía de intercambio iónico (IE-HPLC) , turbidimetría e inspección visual .

Métodos y composiciones recombinantes Los anticuerpos pueden ser producidos utilizando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente Estadounidense No 4,816,567. En una modalidad, se proporciona el ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo se proporciona anti- [ [PRO] ] se describe en el presente documento. Tal ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo) . En una modalidad adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden tal ácido nucleico. En una modalidad adicional, se proporciona una células hospedadora que comprende tal ácido nucleico. En una de tales modalidades, una células hospedadora que comprende (por ejemplo, ha sido transformada con) : (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácido que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una modalidad, la células hospedadora es eucariótica, por ejemplo una célula de ovario de hámster chino (CHO) o células linfoides (por ejemplo, YO, NSO, células SP20) . En una modalidad, se proporciona un método de fabricación de un anticuerpo anti- [ [PRO] ] , en donde el método comprende cultivar una células hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, en lo indicado anteriormente, bajo condiciones apropiadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la células hospedadora (o medio de cultivo de la células hospedadora) .

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-Abeta, ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describió anteriormente, se aisla y se inserta en uno o más vectores para su posterior clonación y/o expresión en una células hospedadora. Tal ácido nucleico se puede aislar fácilmente y es secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo) .

Las células hospedadoras apropiadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procarióticas o eucarióticas descritas en este documento. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando no son necesarias la glicosilación y la función efectora de Fe. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses No 5,648,237, 5,789,199, y 5,840,523. (Ver también Charlton, Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), p . 245-254. Después de la expresión, el anticuerpo puede ser aislado de la pasta celular bacteriana en una fracción soluble y se puede purificar aún más.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son huéspedes de clonación o expresión apropiados para los vectores que codifican el anticuerpo, incluyendo hongos y cepas de levadura cuyas vías de glicosilación han sido "humanizadas", lo que resulta en la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcialmente o completamente humano. Ver Gerngross, Nat . Biotech. 22: 1409-1414 (2004), y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) .

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpo glicosilado también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados) . Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Numerosas cepas de baculovirus se han identificado que se pueden usar junto con células de insectos, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda .

Cultivos de células de plantas también se pueden utilizar como hospedadoras. Ver, por ejemplo, las patentes Estadounidenses Nos 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, y 6,417,429 (que describe la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas ) .

Las células de vertebrados también pueden ser utilizadas como hospedadoras. Por ejemplo, líneas celulares de mamíferos que están adaptadas para crecer en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7) ; línea de riñon embrionario humano (293 ó 293 células, como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol 36:59 (1977).); células de riñon de cría de hámster (BHK) ; células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describió, por ejemplo, en Mather, Biol . Reprod 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1) ; Células de riñon de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical de humano (HELA) ; células de riñón canino (MDCK, células de hígado de rata búfalo (BRL 3A) , células pulmonares humanas (W138) , células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (M T 060562); Células TRI , como se describió, por ejemplo, en Mather et al., Annals NY. Acad. SCi . 383:44-68 (1982); Células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células hospedadoras de mamíferos útiles incluyen células (CHO) , incluyendo células CHO DHFR (Urlaub et al, Proc Nati Acad Sci USA 77:4216 (1980)), y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de las líneas de células hospedadoras de mamífero ciertas apropiadas para la producción de anticuerpos, ver, por ejemplo, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, vol . 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ) , pp 255-268 (2003) .

Ej emplos Formulaciones de productos de fármacos líquidos para la administración subcutánea de acuerdo con la invención se desarrollaron de la siguiente manera.

Ejemplo 1: Preparación de formulaciones líquidas Las siguientes formulaciones líquidas de Abeta se prepararon a una concentración de proteína de 150 mg/ml: Anticuerpo Abeta preparado y obtenido como se describe en WO2007/068429 se proporcionó a una concentración de aprox. 50-60 mg/ml en una solución amortiguadora de 10 mM de histidina a un pH de aprox. 5.5. El anticuerpo Abeta utilizado en los ejemplos comprende las CDRs, dominio VH, dominio VL, cadena pesada y cadena ligera especificadas en la lista de secuencias de la presente solicitud (Sec Id N°2 11) .

Para la preparación de las formulaciones líquidas Abeta se intercambió de solución amortiguadora frente a una solución amortiguadora de diafiltración que contiene la composición de solución amortiguadora anticipada y se concentró por ultrafiltración a una concentración de anticuerpo de aprox. 200 mg/ml. Después de la terminación de la operación de ultrafiltración, se agregaron los excipientes (por ejemplo, trehalosa) como soluciones madre a la solución de anticuerpo. A continuación, el tensioactivo se agregó como una solución madre 50 a 125 veces. Finalmente la concentración de proteína se ajustó con una solución amortiguadora a la concentración final de Abeta de aprox. 150 mg/mi .

Todas las formulaciones fueron esterilizadas por filtración a través de filtros de unión bajo de proteína de 0.22 µp? y asépticamente llenadas en frascos de vidrio de 6 mi estériles cerrados con tapones de caucho recubiertos con ETFE (copolímero de etileno y tetrafluoroetileno) y tapas de alucrimp. El volumen de llenado era aprox. 2.4 mi. Estas formulaciones se almacenaron en diferentes condiciones climáticas (5°C, 25°C y 40°C) para diferentes intervalos de tiempo y acentuados por agitación (1 semana a una frecuencia de agitación de 200 min-1 a 5°C y 25°C) y de métodos de tensión de congelación-descongelación (cinco ciclos a 80°C/5°C) . Las muestras se analizaron antes y después de la aplicación de las pruebas de tensión, así como después del almacenamiento por los siguientes métodos analíticos: • Espectroscopia UV • Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) • Cromatografía de intercambio iónico (IEC) • Claridad y opalescencia de la solución • Inspección visual Espectroscopia por UV, utilizada para la determinación del contenido de proteína, se llevó a cabo en un espectrofotometro UV Perkin Elmer ?35 en un rango de longitud de onda de 240 nm hasta 400 nm. Muestras de proteínas puras se diluyeron hasta aprox. 0.5 mg/ml con la solución amortiguadora de formulación correspondiente. La concentración de proteínas se calculó de acuerdo con la ecuación 1.

Ecuación 1: Contenido de proteínas= La absorción de luz UV a 280 nm se corrigió para la dispersión de luz a 320 nm y multiplicada por el factor de dilución, que se determina a partir de las masas y densidades pesadas de la muestra pura y la solución amortiguadora de dilución. El numerador se divide por el producto de la longitud de la trayectoria de la cubeta d y el coeficiente de extinción e.

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) se utilizó para detectar las especies de alto peso molecular solubles (agregados) y productos de hidrólisis de bajo peso molecular (LMW) en las formulaciones. El método se realizó en un instrumento de HPLC aters Alliance 2695 con un Detector de Absorbancia dual Waters W2487 y equipado con una columna TosoHaas TSK-Gel de G3000SWXL. Monómero intacto, agregado y productos de la hidrólisis se separaron por un perfil de elución isocrático, usando K2HP04 0.2 M/KC1 0.25 M, pH 7.0 como fase móvil, y se detectaron a una longitud de onda de 280 nm .

La cromatografía de intercambio iónico (IEC, por sus siglas en inglés) se realizó para detectar productos de degradación química que alteran la carga neta de Abeta en las formulaciones. El método utilizó un instrumento de HPLC Waters Alliance 2695 con un detector de Absorbancia dual Waters W2487 y equipado (longitud de onda de detección de 280 nm) y una columna Mono S TM 5/50GL (Amersham Biosciences) . 50 mM de Ácido malónico/malonato pH 5.3 y acetato de Na 1M en la fase móvil A pH 5.3 se utilizaron como fases móviles A y B, respectivamente, con una velocidad de flujo de 1.0 ml/min.

Programa de gradiente: La claridad y el grado de opalescencia se midieron como Unidades de Turbidez de Formacina (FTU) por el método de nefelometría. La muestra pura se transfirió en un tubo de cristal transparente de 11 mm de diámetro y se coloca en un turbidímetro HACH 2100AN.

Las muestras se inspeccionaron para la presencia de partículas visibles mediante el uso de un instrumento de inspección visual Seidenader V90-T.

Composiciones y datos de estabilidad de formulaciones de productos de fármacos Abeta líquidos de acuerdo con esta invención Fl es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de 5 acetato de sodio, 200 mM de trehalosa, 0.02% de polisorbato 20, a pH 5.5 F2 es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de acetato de sodio, 210 mM de sorbitol, 0.02% de polisorbato 20, a pH 5.5 5 10 15 F3 es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de acetato de sodio, 135 mM de Arginina, 0.02% de polisorbato 20, a pH 5.5 5 10 F4 es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de acetato de sodio, 200 mM de trehalosa, 0.02% de polisorbato 80, a pH 5.5 5 10 15 F5 es una formulación liquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de acetato de sodio, 210 mM de sorbitol, 0.02% de polisorbato 80, a pH 5.5 F6 es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de ac etato de sodio, 135 mM de Arginina, 0.02% de polisorbato 80, a pH 5.5 10 15 F7 es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de acetato de sodio, 200 mM de trehalosa, 0.04% de poloxámero 188, a pH 5.5 5 10 15 F8 es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abet a, 20 mM de acetato de sodio, 135 mM de Arginina, 0.04% de poloxámero 188, a pH 5.5 5 10 15 F9 es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de hidtidina, 200 mM de Trehalosa, 0.02% de polisorbato 20, a pH 5.5 5 10 FIO es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de hist idina, 210 mM de sorbitol, 0.02% de polisorbato 20, a pH 5.5 5 10 Fll es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de histidina, 135 mM de Arginina, 0.02% de polisorbato 20, a pH 5.5 5 10 15 F12 es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de hist idina, 210 mM de trehalosa, 0.02% de polisorbato 80, a pH 5.5 5 10 F13 es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de acetato de sodio, 210 mM de sorbitol, 0.02% de polisorbato 80, a pH 5.5 5 15 F14 es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de histidina, 135 mM de Arginina, 0.02% de polisorbato 80, a pH 5.5 5 10 F15 es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 m de histidina, 200 mM de trehalosa, 0.04% de poloxámero, a pH 5.5 5 10 15 F16 es una formulación líquida con la composición de 150 mg/ml de Abeta, 20 mM de histidina, 135 mM de Arginina, 0.04% de poloxámero 188, a pH 5.5 5 10 15 Los datos de estabilidad presentados anteriormente muestran que todas las formulaciones que contienen polisorbato 20 y polisorbato 80 están desarrollando partículas visibles después de 8 meses de almacenamiento a 5°C, 25°C o 40°C. Por otro lado, formulaciones que contienen el poloxámero están prácticamente libres de partículas visibles después del almacenamiento durante 8 meses a 5°C, 25°C y 40°C. Por lo tanto el poloxámero es capaz de prevenir la formación de partículas visibles en formulaciones de anticuerpos Abeta. Secuencias de aminoácidos descritas en la solicitud Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1 Una formulación de anticuerpo farmacéutica líquida estable caracterizada porque comprende: - aproximadamente 50 mg/ml - 200 mg/ml de un anticuerpo Abeta, aproximadamente 0.01% - 0.1% de un poloxámero, preferiblemente poloxámero 188, aproximadamente 5 mM - 50 mM de una solución amortiguadora, - aproximadamente 100 mm - 300 mm de un estabilizador, a un pH de aproximadamente 4.5-7.0

2. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración de anticuerpo Abeta es aproximadamente 100 mg/ml - 200 mg/ml, preferiblemente aproximadamente 150 mg/ml.

3. La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el poloxámero está presente en una concentración de aproximadamente 0.02%-0.06%, preferiblemente aproximadamente 0.04%.

4. La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la solución amortiguadora es una solución amortiguadora de acetato de sodio o una solución amortiguadora de histidina, preferiblemente una solución amortiguadora de histidina/histidina-HCl .

5. La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4( caracterizada porque la solución amortiguadora tiene una concentración de aproximadamente 10 a 30 rara, preferiblemente aproximadamente 20 mM.

6. La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el pH de la formulación es de aproximadamente 5 - 6, preferiblemente aproximadamente 5.5.

7. La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el estabilizador es seleccionado de azúcares y aminoácidos.

8. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el estabilizador es seleccionado de trehalosa y arginina .

9. La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 7 u 8, caracterizada porque el estabilizador tiene una concentración de aproximadamente 100 mM hasta 300 mM .

10. La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 8 o 9, caracterizada porque el estabilizador es trehalosa y tiene una concentración de aproximadamente 150 mM hasta 250 mM, preferiblemente aproximadamente 200 mM.

11. La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 8 o 9, caracterizada porque el estabilizador es arginina y tiene una concentración de aproximadamente 100 mM hasta 150 mM, preferiblemente de aproximadamente 135 mM.

12. La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque el anticuerpo Abeta es un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada y una cadena ligera.

13. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la cadena pesada del anticuerpo Abeta comprende un dominio VH que comprende: - una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. No 4, - una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. No 5, una secuencia CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. No 6.

14. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterizada porque la cadena ligera del anticuerpo Abeta comprende un dominio VL que comprende: - Una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. No 7, - una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. No 8, - una secuencia de CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec . Id. No 9.

15. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, caracterizada porque el dominio VH del anticuerpo Abeta comprende la secuencia de aminoácidos de la Seq. Id. No 2 y el dominio VL del anticuerpo Abeta comprende la secuencia de aminoácidos de la Seq. Id. No 3.

16. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizada porque la cadena pesada del anticuerpo Abeta comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. No 10.

17. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizada porque la cadena ligera del anticuerpo Abeta comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. Id. No 11.

18. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizada porque el anticuerpo monoclonal Abeta es una mezcla de anticuerpos Abeta mono-glicosilados y anticuerpos Abeta doble glicosilados, en donde el anticuerpo mono-glieosilado comprende una asparagina glicosilada (Asn) en la posición 52 de la Sec. Id. No 2 en el dominio VH de un sitio de unión del anticuerpo y en donde el anticuerpo doble glicosilado comprende una asparagina glicosilada (Asn) en la posición 52 de la Sec. Id. No 2 en el dominio VH de ambos sitios de unión de anticuerpos y en el que la mezcla comprende menos de 5% de un anticuerpo que es no glicosilado en la posición 52 de la Sec. Id. No 2 en el dominio VH.