JP2021534151A - 下流クロマトグラフィーにおける再酸化によるタンパク質断片化制御戦略 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年8月15日出願の米国仮出願62/764652および2019年6月19日出願の米国仮出願62/863467の優先権の利益を主張し、これらは引用により全体として本明細書に包含させる。
分野
本発明は、チオール基再酸化を使用して、タンパク質精製中タンパク質断片から完全タンパク質(full proteins)を産生する方法に関する。
組み換えモノクローナル抗体(mAb)は、その高い特異性および長い半減期により、最も有力な生物学的治療剤である。mAbの製法開発において、高分子量凝集体(HMW)および低分子量タンパク質断片(LMW)は、付随する免疫原性のリスク増加および薬物有効性に対する影響の可能性のために、適切なレベルまで除去されなければならない。さらに、これらの産物変化体は、保存期間を短くし、生産物の保存中の安定性に対するリスクを引き起こし得る(Rosenberg, AAPS J. 2006 8(3):E501-E507; Fan et al., Breast Cancer Res. 2012 14(4) R116)。
本発明は、出発溶液における部分分子を完全分子に変換する方法であって、部分分子を含む出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法を提供する。また提供されるのは、部分分子を含む出発溶液から完全分子を精製または単離する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法である。
組み換えタンパク質の産生および精製におけるタンパク質の還元は、チオレドキシン/チオレドキシンレダクターゼなどの細胞内成分の放出による、高い還元力により生じる(Koterba et al., J. Biotechnol. 2012, 157(1), 261-7; Handlogten et al., Biotechnol. Bioeng. 2017, 114, 1469-77)。採取中および採取後の溶解酸素(DO)レベルの維持、採取細胞培養物の冷却、採取細胞培養物の保存期間の短縮または還元阻止剤の添加を含む、還元低減戦略開発のために相当な努力がなされて来た(Trexler-Schmidt et al., Biotechnol. Bioeng. 2010, 106(3), 452-61; Saccoccia et al., Curr. Protein Pept. Sci. 2014, 15(6), 621-46; Mun et al., Biotechnol. Bioeng. 2015, 112, 734-742; Zhang et al., Expert Opin. Ther. Pat. 2017, 27, 547-556; Du et al., mAb 2018, 0(0), 1-11)。しかしながら、厳しい細胞溶解のための異常に強い還元力などがある特異な状況下での阻止的低減は、ジスルフィド還元によるタンパク質断片の蓄積回避には十分ではない可能性がある。
本発明がより容易に理解され得るように、特定の用語をまず定義する。本明細書で使用される限り、本明細書でこれと異なる定義が明示的に示されている場合を除き、次の用語の各々は、次に示す意味を有する。さらなる定義は、本明細書をとおして、示される。
本発明は、少なくとも一つの免疫グロブリン部分(例えば、Fcドメイン)を含む抗体または融合タンパク質の精製中または抗体または融合タンパク質を含む組成物の製剤または保存中、部分分子(すなわち、HHL、HHまたはHL断片などのLMW断片、ここで、HおよびLはそれぞれ抗体の重鎖および軽鎖である)の形成を防止または軽減する方法であって、抗体または融合タンパク質を含む出発溶液とレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液は部分分子の形成を防止および/または部分分子を再酸化して、完全分子(すなわち、融合タンパク質の完全抗体)を産生する、方法提供する。従って、本発明は、例えば、出発溶液中の部分分子(例えば、抗体断片)の形成を防止または低減する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子の形成を防止または低減する、方法を提供する。
ある態様において、本発明は、ここに開示する方法の何れかの適用により得られた完全分子(例えば、モノクローナル抗体または融合タンパク質)を提供する。それ故に、例えば、完全モノクローナル抗体または完全融合タンパク質を、ここに開示する方法の何れかを使用して、部分分子(例えば、抗体断片)を含むサンプルから得ることができる。ここに記載する方法により得られたタンパク質を、診断的アッセイ、免疫アッセイおよび/または医薬製品におけるその後の使用のために調製し得る。
ジスルフィド結合再酸化を使用する高純度モノクローナル抗体(mAb)の産生
ジスルフィド結合再酸化は、高純度mAb産物を産生するために別のアプローチとして適用されている。再酸化は、遊離チオールを再接続して、ジスルフィド結合を形成する翻訳後修飾である(Thies et al., J. Mol. Biol. 2002, 319, 1267-1277)。まず、溶液中のジスルフィド結合再酸化に影響し得るプロセスパラメータを研究した。これらのパラメータは、プロテインA樹脂存在下および非存在下での、温度、pH、電導度、酸化剤である。次に、再酸化機構に基づく反応の動力学的特性(kinetic charateristics)を定量化するための動力学モデルを数学的に構築した。経験的モデルと比較して、動力学モデル化は、反応動力学に関係する基本的要素を反映する。最後に、溶液研究および動力学モデリング予測からの知見を、下流精製に適用した。
2.1. 細胞培養
細胞培養液(CCF)を、CHO細胞を使用して、使い捨てバッグバイオリアクター中、500Lパイロットフェドバッチで、特製の基本および追加培地を使用して産生した。一次深部濾過、続いて浄化濾過および0.2μm 滅菌濾過を使用して採集を実施して、採集細胞培養液(HCCF)を得た。HCCFを、使い捨て滅菌バッグに入れ、プロテインA精製まで2〜8℃に維持した。
15mL試験管で、先に精製したmAb−TサンプルとプロテインA樹脂およびシステイン、シスチンおよびグルタチオンを含む緩衝液を混合することにより、試験を実施した。十分に混合した後、試験管を水浴に入れて、一定反応温度を維持した。時間の関数としてサンプルを集めた。プロテインA樹脂を使用したサンプルについて、混合物を1分間、1000RCFで遠心分離して、上清を除き、産物を酢酸緩衝液(pH3.5)で溶出した。次いで、溶離液をtris緩衝液でpH5.5に中和した。最後に、全サンプルを、分析まで凍結保存した。
MabSelect SuRe LX樹脂(GE Healthcare, Piscataway, NJ)が充填された1cm×20cmカラムを備えるAKTA Avant 150系(GE Healthcare, Piscataway, NJ)で精製を実施した。標準プロテインAクロマトグラフィー操作として、カラムに精製する物質を乗せ、連続洗浄段階が続いた。産物は低pH緩衝液で溶出し、続いてpH5.5に中和した。サンプルを集め、分析まで凍結保存した。
Poros XS樹脂(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)が充填された1cm×20cmカラムを備えるAKTA Avant 150系(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を使用して、精製を実施した。標準カチオン交換クロマトグラフィー操作として、カラムに精製する物質を負荷し、次いで連続洗浄を実施た。産物を、高イオン強度の緩衝液を使用して、溶出した。サンプルを集め、分析まで凍結保存した。
SDS Microchipベースのキャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム(CE−SDS)を、非還元条件下、LabChip GXII(Perkin Elmer)で実施した。ヨードアセトアミド(IAM)を、おおよそ5mMの最終IAM濃度までHT Protein Express Sample Buffer(Perkin Elmer)に加えた。おおよそ1mg/mLの計5μL抗体サンプルを100μLのIAM含有サンプル緩衝液と混合した。サンプルを75℃で10分間インキュベートした。変性タンパク質を「HT Protein Express 200」プログラムで分析した。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、Waters ACQUITY UPLC系(Milford, MA)で280nmでモニターする等張勾配でWaters BEHカラム(4.6mm×150mm、200Å、1.5μm)を使用して実施した。サンプルを、0.1Mリン酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム、pH6.8の移動相を使用する0.4mL/分の等張流速系に注入した。
チャージバリアント分析を、Protein Simple iCE3装置(Bio-Techne)上でAlcott 720 NVオートサンプラー(San Jose, CA)を用いて実施したImaged Capillary Isoelectric Focusing(iCIEF)によりアッセイした。サンプルを適切なpIマーカー、両性電解質および尿素と混合し、フッ化炭素被覆キャピラリーカートリッジに注入した。高電圧を適用し、チャージバリアントは、各pIに移動した。UVカメラは280nmで画像を取得した。主ピークが同定され、酸性範囲および塩基性範囲に移動したピークが合計され、定量され、相対的面積パーセントとして示された。
遊離チオールアッセイは、不対システイン残基の遊離チオール基レベルの測定により、タンパク質におけるジスルフィド結合の完全性を評価する。サンプルを、遊離チオールと結合し、着色チオラートイオンを放出する5,50−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸(DTNB)と天然および変性条件下インキュベートさせる。着色チオラートイオンをUV可視分光光度計で検出する。遊離チオールの濃度を標準曲線から内挿し、遊離チオール対抗体モル比が示される。
3.1. 下流プロセス全体のインタクトmAb純度の増加
3種のモノクローナル抗体(mAb−T、mAb−XおよびmAb−N)のプラットフォームmAb精製プロセスを使用する大規模ラン中(図3)、ジスルフィド結合還元に起因する低インタクト単量体純度が観察された。ランのプロテインAプールのインタクト単量体は、4.5%〜51%の範囲であった。興味深いことに、インタクト単量体純度は、下流プロセスに進むに連れて徐々に増加し(図4)、最終的に90%近くに達した。表1は、これら4ランの採集パラメータを要約する。
3.2.1. ジスルフィド再酸化の基本的反応
種々のタイプの断片がIgG溶液に存在し得る。CE分析に基づき、初期溶液の主要成分は、軽鎖(L)、重鎖(H)、重−重断片(HH)、半量体(HL)、重−重−軽断片(HHL)およびインタクト単量体(Mono)である。再酸化反応の機構は、断片の遊離チオールが再酸化されてジスルフィド結合を形成し、インタクトIgG分子に至ることである(White, Methods Enzymol. Academic Press 1972, 25B 387; Petersen and Dorrington, J. Biol. Chem. 1974, 249, 5633-41; Sears et al., 1975)。再酸化速度論は温度、pH、電導度などを含む複数因子によるが、単純化反応経路を図5のとおり説明し得る。それ故に、反応動力学は次のとおり、表し得る。
式中、ri(i=1,..6)は、各素反応の反応速度であり、ki(i=1,..6)は、対応する反応の速度定数である。
プロテインAは、採集後IgGを捕捉するための樹脂として使用される、42kDa表面タンパク質である(Pathak and Rathore, J. Chromatogr. A 2016, 1459, 78-88; Gagnon, J. Chromatogr. A 2012, 1221, 57-70; Low et al., J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2007, 848(1), 48-63)。重鎖のFc領域への高結合親和性により、IgG型抗体に対する高選択性を有する(Pathak and Rathore, J. Chromatogr. A 2016, 1459, 78-88; Gagnon, J. Chromatogr. A 2012, 1221, 57-70; Alabi et al., Mol. Immunol. 2017, 92, 161-168)。本試験において、精製mAb−Tサンプルを、pH8の炭酸緩衝液で約5g/Lの濃度に希釈した。
システイン、シスチンおよびグルタチオン(GSH)は、部分的に還元された断片を再酸化して単量体を回復させるために有効な組み合わせとして報告されている(Poole, Free Radic. Biol. Med. 2015, 80, 148-57; Suzuki et al., Mol. Bio. Cell 2017, 28(8), 1123-31)。シスチンは、再酸化反応のための酸化剤およびチオールドナーとして認識されているが、システインおよびGSHの機構は不明のままである(Oliyai and Borchardt, Pharm. Res. 1993, 10(1), 95-102; Vlasak and Ionescu, mAbs 2011, 3(3), 253-63; Heimer et al., Anal. Chem. 2018, 90, 3321-7)。
電導度は、緩衝液の一つの重要な特徴である。それは単位操作において十分に制御される必要がある。本試験において塩化ナトリウムを、緩衝液の電導度調整に使用した。次いで、種々の電導度での速度論を測定して、影響を評価した。
電導度は再酸化速度論に負の影響を有することが判明した(図7Aおよび7B)。すなわち、高い再酸化速度は低い電導度で観察された。逆に、遅い再酸化速度は高い電導度で観察された。再酸化速度と溶液電導度間のこのような逆相関は、分子相互作用が塩濃度により負に影響されるとの事実によるものであり得る(Huguet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2010, 107, 15431-6; Roberts et al., Mol. Pharmaceutics 2015, 12(1), 179-93)。
温度は、反応動力学上の重大な因子である。この試験を、3個の異なる温度レベル(4℃、20℃および34℃)および2個の異なるシステインレベル(0.5mMおよび1.0mM)で実施した。シスチンは、その限定的な溶解度のために、全条件で0.3mMの一定濃度に制御した(Carta, J. Chem. Eng. Data, 1996, 41, 414-417)。図8Aおよび8Bに示すとおり、両0.5mMおよび1.0mMシステインレベルで、温度を下げると、反応速度の減少が観察された。
4個の主要タイプのIgGがヒトで天然に存在する。異なるIgGタイプは、通常異なるジスルフィド結合を含み、故に異なる再酸化速度論を有し得る(Wypych et al., J. Biol. Chem. 2008, 283(23), 16194-205; Liu and May, mAbs 2012, 4(1), 17-23)。本試験において、2個のモデル分子、mAb−T(IgG1)およびmAb−X(IgG4)を使用した。mAb−Xのk3およびk6値はmAb−Tより有意に大きく(表4)、IgG4ジスルフィドがIgG1より迅速に回復され得ることを示唆する。
上記に基づき、次の因子が再酸化反応に好ましいと結論づけられ得る:プロテインA樹脂の存在、低電導度、高pH(8〜10)、システイン&シスチンおよび高温度(20〜34℃)。製造におけるプロセス実行可能性を考慮して、最適化条件は、次のとおり提案された:1mMシステイン、0.3mMシスチン、pH8、20℃で電導度<7.3mS/cm、プロテインA樹脂存在。この条件下、mAb−Tを使用する動力学を試験し、図9Aに示すとおり模倣した。単量体純度は、1時間処理後57%から94%に改善した。
ジスルフィド再酸化を、pH、電導度、温度およびプロテインA樹脂存在の条件について評価している。最適条件は、1mMシステイン、0.3mMシスチン、pH8、20℃で電導度<7.3mS/cm、プロテインA樹脂存在と提案された。再酸化性能を予測するために動力学モデルを構築した。しかしながら、最適化条件は、妥当性を確認するため、実際の操作上のシナリオを適用する必要がある。この目的のため、プロテインA樹脂充填1cm×20cmプロテインAカラム(MabSelect SuReまたはMabSelect SuRe LX、GE Healthcare)を使用し、部分的に還元されたタンパク質を負荷した。負荷後、カラムを、規定した接触時間レドックス洗浄緩衝液で洗浄し、続いてブリッジング洗浄および低pH溶出した。ブリッジング洗浄は、生成物溶出前にpHを下げ、レドックス成分を除去するために必要である。想起できるプロテインAクロマトグラフィーワークフローを図10に示す。
カラム上のレドックス緩衝液系を使用する再酸化の有効性をさらに評価するため、時間経過試験を実施した。mAb−T 500LランからのHCCFを2個の1L Flexboyバッグに、各500mLで入れた。バッグ1は無気条件に維持し、バッグ2は、シリンジおよび防止汚染のためのフィルターを使用して50%空気で膨張させた。バッグ1およびバッグ2両者とも室温に維持し、それぞれ1cm×20cm MabSelect SuRe LXカラムを備えたAvant系に接続した。両サンプルを、0時間、4時間および18時間の時間経過で同時にカラムに負荷した。負荷後、カラムを2種の緩衝液で洗浄した:対照としてのPBS洗浄ならびに1mMシステインおよび0.3mMシスチンを含む緩衝液。両緩衝液はpH7.2を有した。プロテインA溶離液を集め、分析するまで凍結させた。
この試験を、500LパイロットランからのIgG4分子mAb−Xを使用して実施した。図10に示すとおり、プロテインAランを、35g/L樹脂充填で1cm×20cm MabSelect SuReカラムを使用して実施した。HCCFを水浴を使用して、4℃に維持した。出発緩衝液として1×PBSを使用して、一連の洗浄緩衝液を、システイン、シスチンまたはグルタチオンの組み合わせを加え、pH7.2の最終pHへの滴定により調製した。負荷および洗浄後、溶離液を非還元CE、SECおよびiCIEF分析のために集めた。選択したサンプルを、RPLC−FLR−MSペプチドマッピングによる不対チオール分析に供した。
a. CE−NRにより分析。
b. SE−UPLCにより分析。
c. 生成物接触時間は、生成物が洗浄緩衝液と接触していた時間として示す。
この試験を、500Lパイロットランからの精製mAb−N(IgG1)を使用して、実施した。単量体純度は、非還元CE−SDS方法で4.5%であると試験された。プロテインAランを、40g/L樹脂充填で1cm×20cm MabSelect SuRe LXカラムを使用して実施した(図10)。負荷は、中和プロテインA溶出、pH7.2であった。洗浄2緩衝液は、20mM tris、1mMシステインおよび0.3mMシスチンをpH8.0で含んだ。出発物質の極めて低い単量体純度を考慮して、洗浄2の露出時間を2時間および4時間で評価した。負荷および洗浄後、溶離液を非還元CE−SDS、SECおよびiCIEF、遊離チオールおよび結合分析のために集めた。
a. Caliper−NRにより分析。
b. SE−UPLCにより分析。
c. 生成物接触時間は、生成物が洗浄緩衝液と接触していた時間として示す。
d. オフカラム試験は、システインおよびシスチンを出発物質に転嫁し、pHを8に調節することにより実施した。添加したサンプルを室温で15時間維持した。
MabSelect SuRe LX樹脂を充填した30cm×20cmプロテインAカラムを、再酸化戦略の実行可能性を評価するためのパイロットプラントで使用した。同じmAb−N PAVIBを負荷物として使用し、洗浄2は20mM tris、1mMシステインおよび0.3mMシスチンをpH8.0で含んだ。出発物質の極めて低い単量体純度および続きのプロセシングにより産生される物質の潜在的有用性を考慮して、洗浄2の接触時間を4.5時間に設定した。並行して、縮小ランを、同じバッチの緩衝液を使用して、1cm×20cmプロテインAカラムで実施した。大型および小規模で溶離したプロテインAを集め、CE−NR、SEC、iCEおよび効力について分析した。再加工物質を、拡張生物物理学的特徴づけに付す
a. Caliper−NRにより分析。
b. SE−UPLCにより分析。
c. 生成物接触時間は、生成物が洗浄緩衝液と接触していた時間として示す。
プロテインAクロマトグラフィーカラム上でのインビトロ再酸化の妥当性をさらに示すため、種々のレベルのLMWを含む3個のmAb薬物物質を1cmx20cmプロテインAカラムに負荷し、続いて洗浄緩衝液(対照としてPBSおよびレドックス洗浄緩衝液)、ブリッジング緩衝液および溶出緩衝液が続いた。再加工プロテインA溶離液を非還元カリパスにより分析し、結果を図20に示した。図21は、全3個のmAbについて負荷、対照としてのPBS洗浄およびレドックス洗浄の詳細な電気泳動図を示す。結果は、レドックス洗浄が還元mAbの完全分子への変換に有効であったことを示す。
下流プロセスが進歩し、プラットフォームが実行されるにつれて、プロテインAクロマトグラフィー段階は、生成物負荷、プロセス不純物除去のための洗浄1、ブリッジングとしての洗浄2および生成物の最終低pH溶出を含むよう単純化されてきている。近年、洗浄1における高pH緩衝液がHCPおよびDNAを効率的に除去することが示され、故に高純度プロテインA溶出プールが得られ、その後の仕上げクロマトグラフィー段階におけるプロセス負担が軽減される。レドックス緩衝液がmAbジスルフィド結合のインビトロ再酸化として既にプロテインAカラムにおいて使用されているため、レドックス成分を現在の高pH洗浄レジメに統合し、それにより高単量体純度のプロテインAプールを形成し、高プロセス関連不純物除去能を維持することが可能である。
異なる洗浄レジメを使用した3個のmAbからのプロテインAプールの純度および凝集を図23に示した。全3個のmAbについてGood CBは何れの洗浄レジメを使用しても高純度を維持し、空気通気および冷蔵保存温度が鎖間ジスルフィド結合還元を防止できたことを示した。その後のレドックス洗浄(レジメ2)または同時のレドックス洗浄(レジメ3)は、分子完全性に負の影響はなかった。しかしながら、対照洗浄条件(レジメ1:レドックス系がない高pH)を使用したN2通気CBは、全3個のmAbで低単量体純度(<50%)を示した。レドックス洗浄(レジメ2または3)を使用して高純度単量体生成物が産生され、親和性カラム上での鎖間ジスルフィド結合再形成の有効性が証明された。さらに、種々の洗浄レジメ間の同等なHMWレベルは、レドックス洗浄がタンパク質安定性に負の影響を有しなかったことを示した。
プロセス関連不純物(HCP、DNAおよび残存プロテインA)のレベルを、レドックス系が不純物除去に何らかの影響を有するか否かを評価するために、「Good CB」および「Bad CB」でモニターした。図24(AおよびB)および25は、3個の洗浄レジメを使用する、空気通気(酸化条件)およびN2通気(還元条件)下の全3個のmAbのHCP、DNAおよび残存プロテインA(rPrA)を示した。3個の洗浄レジメは全3個の分子をとおしてHCP除去に何ら区別可能な差異をもたらさなかった。しかしながら、「Bad CB」から産生されたPAEで低HCPが観察されたのは注目すべきである。低HCPを引き起こす正確な理由は不明である。対照的に、レドックス洗浄の統合は、「Good CB」および「Bad CB」でPAEにおける残存DNAおよびrPrAレベルを減少させ、鎖間ジスルフィド再形成に加えて、その優れたDNAおよびrPrA除去能が示唆された。
レドックス洗浄緩衝液を使用するプロテインAクロマトグラフィーは、再酸化により部分的に還元されたタンパク質を完全分子に効率的に変換することが示されている。採集物質の浄化またはすでに還元された物質の再加工に使用され得る。再加工目的で、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)およびカチオン交換クロマトグラフィー(CEX)は、同じ結果を達成できる(図19)。しかしながら、プロテインAクロマトグラフィーと比較して、HICまたはCEXクロマトグラフィー上でのレドックス洗浄緩衝液の使用は、CEXまたはHICクロマトグラフィーで一般に望ましくないアルカリおよび低電導度条件下で、再酸化がより容易に起こるため、より困難である。表8の予備的結果は、CEXクロマトグラフィーまたはHICクロマトグラフィーが鎖間ジスルフィド結合再形成にプロテインAクロマトグラフィーほど有効ではないことを示す。
ジスルフィド結合は、タンパク質の天然構造を安定化するための重要な因子である。不適切なジスルフィド結合形成およびジスルフィド結合還元は、プロセス性能およびタンパク質安定性および機能性に影響し得る(Liu and May, mAbs 2012, 4(1), 17-23; Trivedi et al., Curr. Protein Pept. Sci. 2009, 10(6), 614-25; Wang et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 2015, 102, 519-28; Chung et al., Biotechnol. Bioeng. 2017, 114, 1264)。全体的LMW制御戦略に加えて、還元ジスルフィド結合の再酸化は、現在の防止戦略に別の方法を提供する。見かけ上損傷した分子の還元タンパク質から完全分子への変換によるレスキューのための現実的アプローチを提供することが示されている。インビトロ再酸化が有効な戦略であり得ることを証明するために、再酸化薬物生成物と対照物質の比較性を示すために、拡張された特徴づけを実施する必要がある。この目的のため、PAVIBにおける還元mAb−Nタンパク質断片をプロテインAカラムに再負荷し、続いてレドックス洗浄し、さらに、残りの下流プロセス(AEX−HIC−UF/DF−製剤)を実施して、「レスキューされたmAb−N DS」を産生し、これは、次のアッセイ:SEC、iCIEF、CE−SDS、円偏光二色性(CD)、DSC、トリプシンペプチドマッピング(TMP)、非還元インタクト質量、LC−MSによるジスルフィド完全性を使用して、「mAb−N対照」に対して特徴づけされた。
レスキューされたDSおよび通常バッチDSの結果を表9に示す。対照物質と比較して、レスキューされたDSは同等な単量体純度、凝集プロファイル、荷電プロファイルおよび結合効力を示す。
レスキューされたDSおよび通常バッチDS(対照物質)を、熱変性プロファイルついて示差走査熱量測定(DSC)および円偏光二色性(CD)スペクトロスコピーで分析して、遠UVでの二次構造および近UVで三次構造を比較した。図26に示すとおり、レスキューされたDSおよび対照物質は、同一の熱変性プロファイルを有した。レスキューされたDSおよび対照物質は、それぞれ遠UV CDおよび近UV CDで測定して、同等な二次および三次構造も示した(図27)。
レスキューされたDSおよび通常バッチDS(対照物質)を、トリプシン消化ペプチドマッピング方法を使用して特徴づけした。表10に示すとおり、全体的低酸化レベルおよび一貫した脱アミド化レベルが、レスキューされたDSと対照物質で示された。
鎖間ジスルフィド結合再形成を介してレスキューされた物質が特徴づけされ、対照物質と同等であることが示されている。レスキュー戦略がDS製造のために実行可能な選択肢であり得るかを示すために、レスキューされた物質を熱安定性について評価した。レスキューされた物質を、還元またはレドックス洗浄処理を受けていないDS物質と共に試験した。試験方法は、SEC、CEX−HPLC、CE−SDS、トリプシン性ペプチドマッピングおよび遊離チオールを含む。全物質を、0、4週間および8週間の時点まで40℃に維持した。熱安定性試験計画を表11に示した。特徴づけ結果を表12〜14および図29〜32に示す。
レスキューされたmAb−N DSは、十分に特徴づけされている。レスキューされた物質が、次の態様においてジスルフィド結合還元を受けていないDSと同等であることが示された:
I. 高次構造、二次および三次構造に差異なし;
II. 熱変性およびTm値;
III. 生成物関連バリアント(酸化、脱アミド化、末端バリアント、イソ−Asp);
IV. レベルの不対システインチオール;
V. 熱安定性プロファイル;
VI. ELISA効力による生物学的性質。
全体として、レスキューされたDSは、通常のDSと比較して、同等な生物物理学的および生物学的性質を示している。
還元タンパク質の再酸化を、溶液中およびクロマトグラフィーカラム上で、酸化的環境にさらすことにより実施した。アルカリでシステインおよびシスチンを含むレドックスペアおよび低電導度条件は、還元ジスルフィド結合の酸化に有効であり、高インタクト単量体純度を有する完全分子をもたらした。さらに、親和性プロテインA樹脂存在下で再酸化が加速されることが判明し、これは、この方法の幅広い適用をもたらす。プロテインA洗浄段階においてレドックス成分を含む洗浄を実施することにより、還元タンパク質を、純度<5%から約>90%にしてインタクト単量体変換することができた。レドックス洗浄は、有効な不純物除去およびジスルフィド結合再形成の可能性を伴い、親和性プラットフォームと統合され得る。
Claims (53)
- 出発溶液における部分分子を完全分子に変換する方法であって、部分分子を含む出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法。
- 部分分子を含む出発溶液から完全分子を精製または単離する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法。
- 出発溶液における部分分子の形成を防止または低減する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子の形成を防止または低減する、方法。
- 部分分子を含む出発溶液を再加工する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤および少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法。
- 出発溶液中、
(i)遊離チオールの濃度の決定;
(ii)部分分子の濃度の決定;
(iii)完全分子の純度または濃度の決定;
(iv)ジスルフィド還元を引き起こす酵素の存在または活性の決定;または
(v)これらの何れかの組み合わせ
をさらに含む、請求項1〜4の何れかに記載の方法。 - 遊離チオール濃度が約100μMより高いならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する、請求項5に記載の方法。
- 非還元条件(CE−NR)下、キャピラリー電気泳動(CE)ベースのアッセイを使用して決定して、部分分子の濃度が約10%より高いならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する、請求項5に記載の方法。
- 非還元条件(CE−NR)下、キャピラリー電気泳動(CE)ベースのアッセイを使用して決定して、完全分子の純度または濃度が90%未満であるならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する、請求項5に記載の方法。
- ジスルフィド還元を引き起こす酵素が、チオレドキシン/チオレドキシンレダクターゼおよび/またはグルタチオン/グルタチオンレダクターゼなどの細胞内成分である、請求項5に記載の方法。
- (i)チオレドキシン/チオレドキシンレダクターゼの濃度が所定の閾値を超える;
(ii)チオレドキシン/チオレドキシンレダクターゼ活性が所定の閾値を超える;
(iii)グルタチオン/グルタチオンレダクターゼの濃度が所定の閾値を超える;
(iv)グルタチオン/グルタチオンレダクターゼ活性が所定の閾値を超える;または
(v)これらの何れかの組み合わせ
であるならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する、請求項9に記載の方法。 - 再酸化を溶液中で実施する、請求項1〜10の何れかに記載の方法。
- 再酸化を基質上で実施する、請求項1〜11の何れかに記載の方法。
- 基質がクロマトグラフィー媒体である、請求項12に記載の方法。
- クロマトグラフィー媒体がクロマトグラフィー樹脂である、請求項13に記載の方法。
- クロマトグラフィー樹脂が親和性樹脂である、請求項14に記載の方法。
- 親和性樹脂がプロテインA親和性樹脂である、請求項15に記載の方法。
- プロテインA親和性樹脂がMabSelect SuRe樹脂である、請求項16に記載の方法。
- 基質がカチオン交換基質である、請求項12に記載の方法。
- カチオン交換基質がカチオン交換クロマトグラフィー(CEX)樹脂である、請求項18に記載の方法。
- 基質が疎水性相互作用基質である、請求項12に記載の方法。
- 疎水性相互作用基質が疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂である、請求項20に記載の方法。
- 部分分子の少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%または100%が、再酸化後完全分子に変換される、請求項1〜21の何れかに記載の方法。
- 完全分子および部分分子が組み換えタンパク質である、請求項1〜22の何れかに記載の方法。
- 組み換えタンパク質が哺乳動物細胞で発現される、請求項23に記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HEK293細胞、マウス骨髄腫(NS0)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、サル腎線維芽細胞(COS−7)、メイディン・ダービー・ウシ腎臓細胞(MDBK)またはこれらの何れかの組み合わせである、請求項24に記載の方法。
- 完全分子が抗体または融合タンパク質である、請求項1〜25の何れかに記載の方法。
- 融合タンパク質抗体またはその一部を含むイムノコンジュゲートである、請求項26に記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項26または27に記載の方法。
- モノクローナル抗体がIgG1、IgG2またはIgG4である、請求項28に記載の方法。
- 出発溶液が採集細胞培養液上清、ライセート、濾液または溶離液を含む、請求項1〜29の何れかに記載の方法。
- 出発溶液が精製した物質を含む、請求項1〜29の何れかに記載の方法。
- 精製した物質が医薬製品である、請求項31に記載の方法。
- 出発溶液が抗体断片を含む、請求項1〜32の何れかに記載の方法。
- 抗体断片がHHL、HH、HL、H、Lまたはこれらの何れかの組み合わせを含む、請求項33に記載の方法。
- レドックスペアがクロマトグラフィー緩衝液に存在する、請求項1〜34の何れかに記載の方法。
- クロマトグラフィー緩衝液が洗浄緩衝液である、請求項35に記載の方法。
- レドックスペアが「システイン、シスチン、グルタチオン(GSH)、酸化グルタチオン(GSSG)、システイン誘導体、グルタチオン誘導体またはこれらの何れかの組み合わせを含む、請求項1〜36の何れかに記載の方法。
- レドックスペアがシステインおよびシスチンを含む、請求項1〜37の何れかに記載の方法。
- レドックスペアが
(i)0〜10mMシステイン、
(ii)0〜0.5mMシスチン、
(iii)0〜10mMグルタチオンまたは
(iv)これらの何れかの組み合わせ
を含み、ここで、シスチンの濃度または還元グルタチオンが少なくとも0.1mMである、請求項1〜38の何れかに記載の方法。 - チオール還元剤対チオール酸化剤の比が0:1〜10:1である、請求項1〜39の何れかに記載の方法。
- レドックス緩衝液のpHが約5〜約10である、請求項1〜40の何れかに記載の方法。
- pHが約7〜約9である、請求項41に記載の方法。
- pHが約8である、請求項41に記載の方法。
- レドックス緩衝液が電導度<100mS/cm、<95mS/cm、<90mS/cm、<85mS/cm、<80mS/cm、<75mS/cm、<70mS/cm、<65mS/cm、<60mS/cm、<55mS/cm、<50mS/cm、<45mS/cm、<40mS/cm、<35mS/cm、<30mS/cm、<25mS/cm、<20mS/cm、<15mS/cmまたは<10mS/cmを有する、請求項1〜43の何れかに記載の方法。
- レドックス緩衝液が電導度<5mS/cmを有する、請求項44に記載の方法。
- 方法が約4℃〜34℃の範囲の温度で操作される、請求項1〜45の何れかに記載の方法。
- 方法が室温で操作される、請求項1〜46の何れかに記載の方法。
- レドックス緩衝液が約0.5mMシステインおよび約0.3mMシスチンを含む、請求項1〜47の何れかに記載の方法。
- レドックス緩衝液が約1mMシステインおよび約0.3mMシスチンを含む、請求項1〜48の何れかに記載の方法。
- 再酸化時間が約30分〜約8時間である、請求項1〜49の何れかに記載の方法。
- レドックス緩衝液が、1mMシステイン、0.3mMシスチン、pH8、20℃で電導度<7.3mS/cmを含む、請求項1〜50の何れかに記載の方法。
- 完全分子の濃度が、再酸化後少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または100%増加する、請求項1〜51の何れかに記載の方法。
- 方法1〜52の何れかにより製造される、組成物。
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